JP3124969B2 - 温度勾配ゲル電気泳動による混合物成分の分離・検出方法および装置 - Google Patents
温度勾配ゲル電気泳動による混合物成分の分離・検出方法および装置Info
- Publication number
- JP3124969B2 JP3124969B2 JP02511457A JP51145790A JP3124969B2 JP 3124969 B2 JP3124969 B2 JP 3124969B2 JP 02511457 A JP02511457 A JP 02511457A JP 51145790 A JP51145790 A JP 51145790A JP 3124969 B2 JP3124969 B2 JP 3124969B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- temperature
- nucleic acid
- temperature gradient
- heating
- mutation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44708—Cooling
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D57/00—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C
- B01D57/02—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C by electrophoresis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）による混合
物成分の分離・検出方法に関する。特に、本発明は、突
然変異を起こした（突然変異体）核酸フラグメントと突
然変異を起こしていない（野生型）核酸フラグメントと
のハイブリッド形成によって生じたヘテロ二重鎖の分析
による核酸フラグメントの突然変異の検出方法、オリゴ
ヌクレオチドそれ自身とそのオリゴヌクレオチドを用い
た試料の調製方法、および温度勾配ゲル電気泳動を行う
装置に関するものである。
物成分の分離・検出方法に関する。特に、本発明は、突
然変異を起こした（突然変異体）核酸フラグメントと突
然変異を起こしていない（野生型）核酸フラグメントと
のハイブリッド形成によって生じたヘテロ二重鎖の分析
による核酸フラグメントの突然変異の検出方法、オリゴ
ヌクレオチドそれ自身とそのオリゴヌクレオチドを用い
た試料の調製方法、および温度勾配ゲル電気泳動を行う
装置に関するものである。
遺伝物質の突然変異を検出したり、あるいは遺伝的な
突然変異による表現型の発現を検出することは、生物学
の研究、医学面での応用、生物光学による生産、あるい
は犯罪学といった多くの分野において重要な分析目標で
ある。遺伝子のレベルでは、突然変異とは、少なくとも
一つのヌクレオチドまたは塩基対がDNAあるいはRNAのレ
ベルで交換するということである。ハイブリッド形成あ
るいはシークエンス技術を用いた、いわゆる「遺伝子工
学」の潜在力は、クローンDNAまたはRNAの突然変異を検
出することを可能とする。しかしながら、このような技
術は研究開発に関連した用途に限られている。経常的な
用途に用いるには、免疫学的方法（ELISAなど）に匹敵
するほどの技術的基準を達成することができなかった。
突然変異による表現型の発現を検出することは、生物学
の研究、医学面での応用、生物光学による生産、あるい
は犯罪学といった多くの分野において重要な分析目標で
ある。遺伝子のレベルでは、突然変異とは、少なくとも
一つのヌクレオチドまたは塩基対がDNAあるいはRNAのレ
ベルで交換するということである。ハイブリッド形成あ
るいはシークエンス技術を用いた、いわゆる「遺伝子工
学」の潜在力は、クローンDNAまたはRNAの突然変異を検
出することを可能とする。しかしながら、このような技
術は研究開発に関連した用途に限られている。経常的な
用途に用いるには、免疫学的方法（ELISAなど）に匹敵
するほどの技術的基準を達成することができなかった。
DE−OS3622591に記載されている温度勾配ゲル電気泳
動法（TGGE）は、核酸あるいは蛋白質といった生物学的
巨大分子の僅かな構造的な差異や特徴を検出する方法で
ある。しかしながら、この技術は、例えば、遺伝子病の
分析といった臨床分野や法廷での分析で、個々の試料を
数多く測定するのに必要とされる自動化分析には不向き
である。TGGE技術を用いることによって、面倒な特異ハ
イブリッド形成を行なうことなしに、突然変異を明らか
にすることが可能となった（Riesnerほか、Electrophor
esis第10巻377−389頁）けれども、この技術は、研究分
析用のフラット・ベッド型ゲル電気泳動でのみ行なわれ
ている。また、これと同様な結果は、フラット・ベッド
型ゲル電気泳動と化学変性勾配とを組み合わせても得ら
れるが、再現性のある形で化学変性勾配を形成すること
ができないので、自動化は問題外である。
動法（TGGE）は、核酸あるいは蛋白質といった生物学的
巨大分子の僅かな構造的な差異や特徴を検出する方法で
ある。しかしながら、この技術は、例えば、遺伝子病の
分析といった臨床分野や法廷での分析で、個々の試料を
数多く測定するのに必要とされる自動化分析には不向き
である。TGGE技術を用いることによって、面倒な特異ハ
イブリッド形成を行なうことなしに、突然変異を明らか
にすることが可能となった（Riesnerほか、Electrophor
esis第10巻377−389頁）けれども、この技術は、研究分
析用のフラット・ベッド型ゲル電気泳動でのみ行なわれ
ている。また、これと同様な結果は、フラット・ベッド
型ゲル電気泳動と化学変性勾配とを組み合わせても得ら
れるが、再現性のある形で化学変性勾配を形成すること
ができないので、自動化は問題外である。
たとえ単一の突然変異でも、TGGEによって高感度で検
出するためには、電気泳動が進行する方向に対して垂直
な方向、すなわち、電位の等しい位置のゲルが均一な温
度となっている必要がある。例えば、このことは、D.R.
ThatcherおよびB.Hodson、Biochemistry 197巻105−109
頁に述べられているダブル・サイド・サーモスタット垂
直電気泳動を用いたのでは、充分に実現することができ
ない。それは、互いに向き合うサーモスタット板が熱的
に不充分な連絡しかしないために、電位が等しい位置で
固有の温度を持つことができないからである。
出するためには、電気泳動が進行する方向に対して垂直
な方向、すなわち、電位の等しい位置のゲルが均一な温
度となっている必要がある。例えば、このことは、D.R.
ThatcherおよびB.Hodson、Biochemistry 197巻105−109
頁に述べられているダブル・サイド・サーモスタット垂
直電気泳動を用いたのでは、充分に実現することができ
ない。それは、互いに向き合うサーモスタット板が熱的
に不充分な連絡しかしないために、電位が等しい位置で
固有の温度を持つことができないからである。
生体の特徴の発現は、RNAあるいはDNA鎖状分子によっ
て構成される核酸の形で、遺伝子レベルでプログラムさ
れている。遺伝子情報の変更は突然変異と呼ばれ、進化
論的な発展、遺伝的要因によって起こる病気、他の遺伝
的要因によって起こるビールスおよび他の生命体の生物
学的な性質の基礎となるものである。発生する突然変異
のほとんどは、システム全体に特に目立った変化を与え
るものではない。このような突然変異は中立と呼ばれ
る。遺伝子工学の技術が導入されて以来、突然変異を発
見すること、いつそれが起こったかを決定すること、お
よび、それの生体機能への影響を測定することが可能と
なってきた。
て構成される核酸の形で、遺伝子レベルでプログラムさ
れている。遺伝子情報の変更は突然変異と呼ばれ、進化
論的な発展、遺伝的要因によって起こる病気、他の遺伝
的要因によって起こるビールスおよび他の生命体の生物
学的な性質の基礎となるものである。発生する突然変異
のほとんどは、システム全体に特に目立った変化を与え
るものではない。このような突然変異は中立と呼ばれ
る。遺伝子工学の技術が導入されて以来、突然変異を発
見すること、いつそれが起こったかを決定すること、お
よび、それの生体機能への影響を測定することが可能と
なってきた。
塩基配列の比較分析技術（シークエンス技術）を用い
て、相同塩基配列を分析することで、突然変異を識別す
ることができる。突然変異という術語は、一つのヌクレ
オチドの交換、一つから多数に至るヌクレオチドの欠失
または挿入を意味する。近年の大きな進歩にもかかわら
ず、塩基配列の分析は高価な装置を必要とする費用のか
かる技術であり、経常的難分析には適していない。た
だ、例えば、α−１−アンチトリプシン欠失［U.L.Kid
d,R.B.Wallace,K.Hakura,S.L.C.Woo,Nature 304（198
3）］のような特定の遺伝子病として知られている突然
変異の検出だけが、合成オリゴヌクレオチドの利用によ
って技術的に簡単になってきた。しかしながら、研究に
よって生じる問題の多くは、例えば、制限フラグメント
長の多型現象（RFLP）と関連しない長い遺伝子部分に生
じた未知の突然変異の検出とか、医学的遺伝学、集団分
析、進化関係分析、ビールス変異の分析などで重要な経
常的な検査といったような実験的な方法で解決すること
が、極めて難しい問題である。
て、相同塩基配列を分析することで、突然変異を識別す
ることができる。突然変異という術語は、一つのヌクレ
オチドの交換、一つから多数に至るヌクレオチドの欠失
または挿入を意味する。近年の大きな進歩にもかかわら
ず、塩基配列の分析は高価な装置を必要とする費用のか
かる技術であり、経常的難分析には適していない。た
だ、例えば、α−１−アンチトリプシン欠失［U.L.Kid
d,R.B.Wallace,K.Hakura,S.L.C.Woo,Nature 304（198
3）］のような特定の遺伝子病として知られている突然
変異の検出だけが、合成オリゴヌクレオチドの利用によ
って技術的に簡単になってきた。しかしながら、研究に
よって生じる問題の多くは、例えば、制限フラグメント
長の多型現象（RFLP）と関連しない長い遺伝子部分に生
じた未知の突然変異の検出とか、医学的遺伝学、集団分
析、進化関係分析、ビールス変異の分析などで重要な経
常的な検査といったような実験的な方法で解決すること
が、極めて難しい問題である。
核酸鎖（RNAおよびDNA）は、いわゆる相補適配列を持
つ二重らせん構造をとることができ、DNA/DNA、RNA/RN
A、およびDNA/RNA二重鎖構造を形成する。これらの構造
の特徴的な性質は二重鎖の温度依存変性（融解）であ
る。融解は非常に狭い温度範囲で起こり、二重鎖構造の
大きな部分が一段階の反応で変性する。従って、この反
応は、極めて協同的に進行する物理反応である。連続的
な二重鎖構造が失われると、その核酸の移動度に明らか
な変化が生じる（ほとんどの場合、移動度は減少す
る）。このような移動度の変化は、異なった融点を持つ
核酸を分離するための電気泳動分離法に利用できる可能
性がある。つまり、熱力学的により不安定な核酸は、ゆ
っくりと動くために、安定な構造を持つものよりも、遠
くに動くことはない。そこで、分離に用いられる媒体に
は、例えば、変性剤の濃度を増加させる等の方法で、変
性勾配が造られていなければならない。塩基対の内部領
域での安定性は、G/C含量と配列に依存している。な
お、これらの効果については詳細に研究されてきた［S.
Meinkoth,G.Wahl Analytical Biochem.138（1984）267
−284］。
つ二重らせん構造をとることができ、DNA/DNA、RNA/RN
A、およびDNA/RNA二重鎖構造を形成する。これらの構造
の特徴的な性質は二重鎖の温度依存変性（融解）であ
る。融解は非常に狭い温度範囲で起こり、二重鎖構造の
大きな部分が一段階の反応で変性する。従って、この反
応は、極めて協同的に進行する物理反応である。連続的
な二重鎖構造が失われると、その核酸の移動度に明らか
な変化が生じる（ほとんどの場合、移動度は減少す
る）。このような移動度の変化は、異なった融点を持つ
核酸を分離するための電気泳動分離法に利用できる可能
性がある。つまり、熱力学的により不安定な核酸は、ゆ
っくりと動くために、安定な構造を持つものよりも、遠
くに動くことはない。そこで、分離に用いられる媒体に
は、例えば、変性剤の濃度を増加させる等の方法で、変
性勾配が造られていなければならない。塩基対の内部領
域での安定性は、G/C含量と配列に依存している。な
お、これらの効果については詳細に研究されてきた［S.
Meinkoth,G.Wahl Analytical Biochem.138（1984）267
−284］。
ここで、突然変異によって注目する領域に充分な変化
が起こったとすると、突然変異が起こった核酸は、突然
変異が起こらなかった核酸とは異なった融解の仕方を示
す。ところが、突然変異は、しばしば、たった一つの塩
基対が他のものと交換することで起こる（トランスバー
ジョン変異またはトランジション変異）。従って、突然
変異を起こした核酸鎖は、それ自身では極めて安定であ
り、一般に突然変異を起こしていないものと同じような
温度で融解するため識別は不可能である。しかしなが
ら、このような突然変異は、突然変異を起こした核酸と
その突然変異を起こしていない核酸（野生型）とを同程
度の濃度で混合し、鎖の分離を含む変性を行い、引き続
いて再生することによって明らかににすることができ
る。このようにすることで、注目する核酸の一本鎖のあ
らゆる組合せが形成され、突然変異を起こした一本鎖と
突然変異を起こしていない一本鎖との、いわゆるヘテロ
二重鎖も形成される。さて、このようなヘテロ二重鎖の
それぞれのヌクレオチドは、突然変異の起きた部分で相
補的なヌクレオチドを有していないために、その近傍の
二重らせん構造は顕著に不安定となる。従って、このよ
うなヘテロ二重鎖は、野生型あるいは突然変異体二重鎖
よりも、より迅速に融解する。
が起こったとすると、突然変異が起こった核酸は、突然
変異が起こらなかった核酸とは異なった融解の仕方を示
す。ところが、突然変異は、しばしば、たった一つの塩
基対が他のものと交換することで起こる（トランスバー
ジョン変異またはトランジション変異）。従って、突然
変異を起こした核酸鎖は、それ自身では極めて安定であ
り、一般に突然変異を起こしていないものと同じような
温度で融解するため識別は不可能である。しかしなが
ら、このような突然変異は、突然変異を起こした核酸と
その突然変異を起こしていない核酸（野生型）とを同程
度の濃度で混合し、鎖の分離を含む変性を行い、引き続
いて再生することによって明らかににすることができ
る。このようにすることで、注目する核酸の一本鎖のあ
らゆる組合せが形成され、突然変異を起こした一本鎖と
突然変異を起こしていない一本鎖との、いわゆるヘテロ
二重鎖も形成される。さて、このようなヘテロ二重鎖の
それぞれのヌクレオチドは、突然変異の起きた部分で相
補的なヌクレオチドを有していないために、その近傍の
二重らせん構造は顕著に不安定となる。従って、このよ
うなヘテロ二重鎖は、野生型あるいは突然変異体二重鎖
よりも、より迅速に融解する。
不都合なことに、従来の方法は操作が比較的面倒で、
推定できる突然変異を、いつも発見出来るとは限らなか
った。
推定できる突然変異を、いつも発見出来るとは限らなか
った。
従って、本発明が基礎とする技術的課題の一つは、TG
GEを経常的な分析操作として実際に用いようとするとき
の問題を克服した方法を提供し、TGGEを全体として、扱
い易いものとすることにある。さらに、自動TGGE測定が
可能な装置を提供する。この装置はまた、構造的に大き
く異なる核酸を同時に分析することもできる。もう一つ
別の技術的課題は、特に、突然変異および／または変異
体遺伝子の定量的／訂正的な検出の向上も目指すもので
ある。さらにまた、特別な態様によって、簡単で安全に
試料の調製ができるような改良をすることにある。
GEを経常的な分析操作として実際に用いようとするとき
の問題を克服した方法を提供し、TGGEを全体として、扱
い易いものとすることにある。さらに、自動TGGE測定が
可能な装置を提供する。この装置はまた、構造的に大き
く異なる核酸を同時に分析することもできる。もう一つ
別の技術的課題は、特に、突然変異および／または変異
体遺伝子の定量的／訂正的な検出の向上も目指すもので
ある。さらにまた、特別な態様によって、簡単で安全に
試料の調製ができるような改良をすることにある。
上記のような技術的課題は、請求項１に記載された下
記の特徴を有する方法によって解決される。すなわち、 −空間的に離れた少なくとも二つの温度レベルによっ
て、分離に用いられる電解方向に空間的な温度勾配を形
成するか、または、 −全時間にわたって温度レベルを変化させることによっ
て、時間的な温度勾配を形成するか、あるいは、 −空間的な温度勾配と時間依存的な温度勾配とを組合せ
て、時間的な温度勾配を形成し、 −その温度勾配を、伝導手段によってゲル・マトリック
スに伝え、 −調節可能な加熱もしくは冷却装置によって、電位が等
しい位置で同一の温度を持つ空間的な温度勾配が形成さ
れるように温度レベルを調整するか、または、 −場合によっては、一つまたは複数の調節可能な加熱も
しくは冷却装置を用いて、分離媒体中の分離経路の各点
で時間的な温度勾配が形成されるように、時間依存的に
温度レベルを調整し、可能であれば −分離経路の末端で分離された成分を検知する。
記の特徴を有する方法によって解決される。すなわち、 −空間的に離れた少なくとも二つの温度レベルによっ
て、分離に用いられる電解方向に空間的な温度勾配を形
成するか、または、 −全時間にわたって温度レベルを変化させることによっ
て、時間的な温度勾配を形成するか、あるいは、 −空間的な温度勾配と時間依存的な温度勾配とを組合せ
て、時間的な温度勾配を形成し、 −その温度勾配を、伝導手段によってゲル・マトリック
スに伝え、 −調節可能な加熱もしくは冷却装置によって、電位が等
しい位置で同一の温度を持つ空間的な温度勾配が形成さ
れるように温度レベルを調整するか、または、 −場合によっては、一つまたは複数の調節可能な加熱も
しくは冷却装置を用いて、分離媒体中の分離経路の各点
で時間的な温度勾配が形成されるように、時間依存的に
温度レベルを調整し、可能であれば −分離経路の末端で分離された成分を検知する。
本発明に従う方法の有用な態様はサブクレームに記載
されている。請求項12の方法は、核酸の突然変異を定量
的かつ定性的に検知するのに好ましい態様に関するもの
である。すなわち、分析対象の突然変異を有する（突然
変異体）核酸フラグメントと突然変異を有していない
（野生型）核酸フラグメントとのハイブリダイゼーショ
ンによって、熱力学的に不安定な領域に突然変異が位置
するように形成されたヘテロ二重鎖を分析する。さら
に、請求項13から36は、この方法の好ましい態様に関す
るものである。
されている。請求項12の方法は、核酸の突然変異を定量
的かつ定性的に検知するのに好ましい態様に関するもの
である。すなわち、分析対象の突然変異を有する（突然
変異体）核酸フラグメントと突然変異を有していない
（野生型）核酸フラグメントとのハイブリダイゼーショ
ンによって、熱力学的に不安定な領域に突然変異が位置
するように形成されたヘテロ二重鎖を分析する。さら
に、請求項13から36は、この方法の好ましい態様に関す
るものである。
請求項47から50の方法は、核酸の定量分析が可能な定
量検査の特殊な態様に関するものである。サブクレーム
48から50は、この方法の好ましい態様である。
量検査の特殊な態様に関するものである。サブクレーム
48から50は、この方法の好ましい態様である。
装置についての請求項51には、温度勾配ゲル電気泳動
を行う装置が記載されている。この装置は、二つ以上の
加熱もしくは冷却装置によって温度勾配を形成するため
の、熱溜め（４、５）を有する少なくとも二つの加熱も
しくは冷却装置（１、２）があり、最も離れた加熱もし
くは冷却装置の間に、中空体（６）が前記加熱もしくは
冷却装置を貫いて配置され、この中空体内部に分離に用
いられる分離媒体が充填されていて、さらに、この中空
体（６）が熱伝導性の温度制御用カバー（７）で覆われ
ていることを特徴としている。
を行う装置が記載されている。この装置は、二つ以上の
加熱もしくは冷却装置によって温度勾配を形成するため
の、熱溜め（４、５）を有する少なくとも二つの加熱も
しくは冷却装置（１、２）があり、最も離れた加熱もし
くは冷却装置の間に、中空体（６）が前記加熱もしくは
冷却装置を貫いて配置され、この中空体内部に分離に用
いられる分離媒体が充填されていて、さらに、この中空
体（６）が熱伝導性の温度制御用カバー（７）で覆われ
ていることを特徴としている。
サブクレーム52から62は、上記装置の好ましい態様で
ある。これらの利点について以下に記載する。
ある。これらの利点について以下に記載する。
本発明の方法の空間的な温度勾配は、以下のようにし
て形成してもよい。すなわち、調節可能な加熱もしくは
冷却装置を用いて、試料側を特定の温度レベルに調整
し、次に、空間的に離れた温度レベルを反対側の電気泳
動槽の温度で決定する。このような簡単な操作は、電気
泳動槽を温度が一定になるように配置すれば可能とな
る。そのようにするには、電気泳動槽を充分に大きくす
る必要がある。しかしまた、第二の温度レベルも、例え
ば、ペルチエ素子、加熱ワイヤー、あるいはサーモスタ
ットを付けた湯浴などによって調節できるようにしてし
ておくことが好ましい。
て形成してもよい。すなわち、調節可能な加熱もしくは
冷却装置を用いて、試料側を特定の温度レベルに調整
し、次に、空間的に離れた温度レベルを反対側の電気泳
動槽の温度で決定する。このような簡単な操作は、電気
泳動槽を温度が一定になるように配置すれば可能とな
る。そのようにするには、電気泳動槽を充分に大きくす
る必要がある。しかしまた、第二の温度レベルも、例え
ば、ペルチエ素子、加熱ワイヤー、あるいはサーモスタ
ットを付けた湯浴などによって調節できるようにしてし
ておくことが好ましい。
試料を加えると、分離しようとする混合物成分は、分
離媒体中を電界方向に移動して行く。それらが最初の温
度レベルに到達すると構造転換を起こし、移動速度が激
減する。この効果は、温度を調整することでも、また、
部分的に変性を起こさせる変性剤と組合せることでも起
こすことができる。例えば、分離する成分が核酸であっ
た場合、二重鎖の一部は部分的な変性によって巻かれ、
大きなループを形成するため、分離媒体中で事実上動け
なくなり、もはや、それ以降の電気泳動が出来なくな
る。ここで、温度を下げると、ループになった部分は、
その部分の熱力学的安定性に応じて再生され、分離媒体
中での核酸の移動度は再び増加する。この温度は、それ
ぞれの核酸に特徴的なものである。このようにして、温
度によって、異なる成分の分離を行うことが出来る。移
動度の増した分子は分離経路を移動して行き、電気泳動
ターゲット・ポールで検出することが出来る。
離媒体中を電界方向に移動して行く。それらが最初の温
度レベルに到達すると構造転換を起こし、移動速度が激
減する。この効果は、温度を調整することでも、また、
部分的に変性を起こさせる変性剤と組合せることでも起
こすことができる。例えば、分離する成分が核酸であっ
た場合、二重鎖の一部は部分的な変性によって巻かれ、
大きなループを形成するため、分離媒体中で事実上動け
なくなり、もはや、それ以降の電気泳動が出来なくな
る。ここで、温度を下げると、ループになった部分は、
その部分の熱力学的安定性に応じて再生され、分離媒体
中での核酸の移動度は再び増加する。この温度は、それ
ぞれの核酸に特徴的なものである。このようにして、温
度によって、異なる成分の分離を行うことが出来る。移
動度の増した分子は分離経路を移動して行き、電気泳動
ターゲット・ポールで検出することが出来る。
同様にして、電気泳動方向に温度が増加する温度勾配
を形成することも可能である。この温度勾配では、最
初、分子は、各々に固有の熱力学的、部分的な融解の仕
方に応じて分離媒体中で分離する。定温では、熱力学的
に最も不安定な構造が最初に、一部、熱変性する。例え
ば、核酸ではループ部分が形成される。これらの核酸の
移動度は劇的に減少し、分離媒体中で「引っ掛かって」
しまったり、あるいは、少なくとも、ずっと遅くなった
りする。他の成分は、各々に固有の変性が起こって分離
媒体中での移動度が激減してしまうまで、分離媒体中を
移動して行く。特定の分離用ゲルのメッシュ・サイズを
選択して、時間をかければ−非常に長い時間だけれども
−事実上固定した生体分子の残り移動で、混合物のすべ
ての成分を分離経路で異動させて分離することができ
る。このことは、一本鎖に分かれてしまうような完全な
変性が起こると、部分的に変性した核酸の移動度は、単
なる一本鎖が分離媒体柱を移動するだけになるために、
再び劇的に増加するという事実によっている。すなわ
ち、低温で、すでに移動度を失ってしまった、熱力学的
に最も不安定な核酸は、ゲル中を、なおも、極めてゆっ
くりと移動して行くけれども、結局、高い温度レベルの
位置まで到達し、完全な変性を起して二重鎖は一本鎖に
なってしまう。このため、上記のような移動速度の増加
が生じる。
を形成することも可能である。この温度勾配では、最
初、分子は、各々に固有の熱力学的、部分的な融解の仕
方に応じて分離媒体中で分離する。定温では、熱力学的
に最も不安定な構造が最初に、一部、熱変性する。例え
ば、核酸ではループ部分が形成される。これらの核酸の
移動度は劇的に減少し、分離媒体中で「引っ掛かって」
しまったり、あるいは、少なくとも、ずっと遅くなった
りする。他の成分は、各々に固有の変性が起こって分離
媒体中での移動度が激減してしまうまで、分離媒体中を
移動して行く。特定の分離用ゲルのメッシュ・サイズを
選択して、時間をかければ−非常に長い時間だけれども
−事実上固定した生体分子の残り移動で、混合物のすべ
ての成分を分離経路で異動させて分離することができ
る。このことは、一本鎖に分かれてしまうような完全な
変性が起こると、部分的に変性した核酸の移動度は、単
なる一本鎖が分離媒体柱を移動するだけになるために、
再び劇的に増加するという事実によっている。すなわ
ち、低温で、すでに移動度を失ってしまった、熱力学的
に最も不安定な核酸は、ゲル中を、なおも、極めてゆっ
くりと移動して行くけれども、結局、高い温度レベルの
位置まで到達し、完全な変性を起して二重鎖は一本鎖に
なってしまう。このため、上記のような移動速度の増加
が生じる。
このような効果は、電気泳動全体を、より有用にする
ことに利用できる。各成分が部分的な変性によって移動
度を失い、互いに分離したところで、温度レベルを、す
べての二重鎖が一本鎖になる融点以上に上昇させる。こ
うすると、すべての成分は再び移動度を回復する。しか
しながら、この操作を行うに当っては、温度が分離媒体
全体で、極めて迅速に平衡になるようにするか、もしく
は、温度平衡が達成されるまで、例えば、電界のスイッ
チを切るなどして電気泳動を中止する必要がある。分離
する分子は、同程度の大きさであることが好ましい。上
記の条件の操作を、高い温度レベルを用いて等温的な電
気泳動で行えば、分離された成分は、電気泳動がさらに
進んでも、その相対的な距離を維持する。
ことに利用できる。各成分が部分的な変性によって移動
度を失い、互いに分離したところで、温度レベルを、す
べての二重鎖が一本鎖になる融点以上に上昇させる。こ
うすると、すべての成分は再び移動度を回復する。しか
しながら、この操作を行うに当っては、温度が分離媒体
全体で、極めて迅速に平衡になるようにするか、もしく
は、温度平衡が達成されるまで、例えば、電界のスイッ
チを切るなどして電気泳動を中止する必要がある。分離
する分子は、同程度の大きさであることが好ましい。上
記の条件の操作を、高い温度レベルを用いて等温的な電
気泳動で行えば、分離された成分は、電気泳動がさらに
進んでも、その相対的な距離を維持する。
もう一つ別の操作では、材料混合物成分を分離するた
めの時間的温度勾配を形成するのに、時間制御温度可変
プログラムを、好ましくは、電気泳動の試料導入部で用
いる。最初、分離する試料を、電気泳動で移動させて分
離媒体中に導入する。試料導入部の温度レベルは、例え
ば核酸であれば、ループが形成されるが、融解は起こら
ないように設定する。ループの形成は適当な試薬を用い
てもよい。こうすることによって、成分を電気泳動の最
初の位置に、いわば固定しておく。温度が段階的に低く
なっていくにつれて、まず、熱力学的に最も安定な二重
鎖が再生され、その核酸は移動度を回復して、分離ゲル
中を移動し始める。温度は引き続いて変化するので、次
に熱力学的に安定な核酸が、続いて動き始める。空間的
な分離の効果が大きくなるように、温度を低くする段階
を制御して、有利に行ってもよい。動き始めた分子は、
分離媒体上を移動しているあいだに、実質的に空間的な
差をつけて行く。熱力学的な安定性が充分に違っていれ
ば、温度勾配を比較的速く、連続的に減少させることも
可能である。この操作を用いる場合、電気泳動の末端に
調節可能な加熱および冷却装置を設けることで、有利に
行ってもよい。
めの時間的温度勾配を形成するのに、時間制御温度可変
プログラムを、好ましくは、電気泳動の試料導入部で用
いる。最初、分離する試料を、電気泳動で移動させて分
離媒体中に導入する。試料導入部の温度レベルは、例え
ば核酸であれば、ループが形成されるが、融解は起こら
ないように設定する。ループの形成は適当な試薬を用い
てもよい。こうすることによって、成分を電気泳動の最
初の位置に、いわば固定しておく。温度が段階的に低く
なっていくにつれて、まず、熱力学的に最も安定な二重
鎖が再生され、その核酸は移動度を回復して、分離ゲル
中を移動し始める。温度は引き続いて変化するので、次
に熱力学的に安定な核酸が、続いて動き始める。空間的
な分離の効果が大きくなるように、温度を低くする段階
を制御して、有利に行ってもよい。動き始めた分子は、
分離媒体上を移動しているあいだに、実質的に空間的な
差をつけて行く。熱力学的な安定性が充分に違っていれ
ば、温度勾配を比較的速く、連続的に減少させることも
可能である。この操作を用いる場合、電気泳動の末端に
調節可能な加熱および冷却装置を設けることで、有利に
行ってもよい。
本発明に従うすべての操作では、分離媒体を、熱伝導
性の温度制御用カバーで覆って、再現性のある温度勾配
または再現性のある等温状態を形成することが必要であ
る。再現性のある温度勾配または再現性のある等温状態
を形成するためには、温度制御用カバーのエネルギーの
出入が、加熱および冷却装置のエネルギーの出入に比べ
て、小さいことが絶対に必要である。
性の温度制御用カバーで覆って、再現性のある温度勾配
または再現性のある等温状態を形成することが必要であ
る。再現性のある温度勾配または再現性のある等温状態
を形成するためには、温度制御用カバーのエネルギーの
出入が、加熱および冷却装置のエネルギーの出入に比べ
て、小さいことが絶対に必要である。
温度勾配ゲル電気泳動に用いる温度は、好ましくは、
０から100℃の間である。分離媒体は、ポリアクリルア
ミド・ゲルで構成されることが好ましい。
０から100℃の間である。分離媒体は、ポリアクリルア
ミド・ゲルで構成されることが好ましい。
材料混合物、特に、たった一つの突然変異を示す核酸
からなる混合物成分を検出する際の技術的課題は、請求
項12による方法で解決することができる。サブクレーム
13から25は、本発明による方法の好ましい態様である。
請求項26から30にクレームされたオリゴヌクレオチド
は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の、いわゆるプライ
マーとして、好ましく用いられるものである［Saiki
他、Sience 230（1985）pp.1530−1534］。本発明によ
方法の特別な態様が、請求項32から36に記載されてい
る。請求項37から43は、本発明による方法の用途に関す
るものである。請求項37から43は、本発明による方法を
実施するための好ましい手段に関するものである。
からなる混合物成分を検出する際の技術的課題は、請求
項12による方法で解決することができる。サブクレーム
13から25は、本発明による方法の好ましい態様である。
請求項26から30にクレームされたオリゴヌクレオチド
は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の、いわゆるプライ
マーとして、好ましく用いられるものである［Saiki
他、Sience 230（1985）pp.1530−1534］。本発明によ
方法の特別な態様が、請求項32から36に記載されてい
る。請求項37から43は、本発明による方法の用途に関す
るものである。請求項37から43は、本発明による方法を
実施するための好ましい手段に関するものである。
本発明による、核酸混合物中の突然変異の検出方法に
ついて、以下にさらに詳細に説明する。
ついて、以下にさらに詳細に説明する。
まず最初に、突然変異分析を行なおうとする核酸フラ
グメントを、突然変異の起こった部分が熱力学的に不安
定な領域になるように切断する。この領域は、実験的に
決定しても、計算によって決定してもよい。もし必要で
あれば、核酸フラグメントをPCR（ポリメラーゼ連鎖反
応）によって増幅して、熱力学的により安定な領域を、
分析実験中、最大の変性条件にあっても安定性を維持で
きるように、さらに安定化しておいてもよい。次に、核
酸フラグメントが、完全に一本鎖に融解してしまわない
で、低い電気泳動移動度を示すＹ字形構造を形成するよ
うにする。特に、このような安定化は、安定的なG/Cヌ
クレオチドまたは非荷電ヌクレオチドを加えることで得
ることができる。40以上のG/C塩基対の影響による安定
化については、V.C.SheffieldらによってProc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.86（1989）pp.232−236に記載されてい
る。しかしながら、驚べきことには、20から30のG/C塩
基対でも、充分な安定化が得られる。温度勾配ゲル電気
泳動法は、本発明によるものを用いることが好ましい。
あるいは、DE−OS3622591に記載されている、プレート
型の電気泳動に温度勾配を形成し、プレート上に配置さ
れたゲルを用いて分離する方法を用いてもよい。
グメントを、突然変異の起こった部分が熱力学的に不安
定な領域になるように切断する。この領域は、実験的に
決定しても、計算によって決定してもよい。もし必要で
あれば、核酸フラグメントをPCR（ポリメラーゼ連鎖反
応）によって増幅して、熱力学的により安定な領域を、
分析実験中、最大の変性条件にあっても安定性を維持で
きるように、さらに安定化しておいてもよい。次に、核
酸フラグメントが、完全に一本鎖に融解してしまわない
で、低い電気泳動移動度を示すＹ字形構造を形成するよ
うにする。特に、このような安定化は、安定的なG/Cヌ
クレオチドまたは非荷電ヌクレオチドを加えることで得
ることができる。40以上のG/C塩基対の影響による安定
化については、V.C.SheffieldらによってProc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.86（1989）pp.232−236に記載されてい
る。しかしながら、驚べきことには、20から30のG/C塩
基対でも、充分な安定化が得られる。温度勾配ゲル電気
泳動法は、本発明によるものを用いることが好ましい。
あるいは、DE−OS3622591に記載されている、プレート
型の電気泳動に温度勾配を形成し、プレート上に配置さ
れたゲルを用いて分離する方法を用いてもよい。
核酸フラグメントを、いわゆるPCR（ポリメラーゼ連
鎖反応）などの増幅反応によって増やす場合、オリゴヌ
クレオチドを、いわゆるプライマーとして用いる。この
ようなプライマーは、調べようとする核酸の一部分とハ
イブリッド形成が出来るように選択される。調べようと
する核酸の末端領域でハイブリッド形成が行われるよう
にすると、有利である。さらに、増幅部分をベクターに
組み込むことができるような制限領域をプライマーが有
していることが望まれる。また、プライマーは、末端
に、親和的な配位子となる化学基を有していることが好
ましい。
鎖反応）などの増幅反応によって増やす場合、オリゴヌ
クレオチドを、いわゆるプライマーとして用いる。この
ようなプライマーは、調べようとする核酸の一部分とハ
イブリッド形成が出来るように選択される。調べようと
する核酸の末端領域でハイブリッド形成が行われるよう
にすると、有利である。さらに、増幅部分をベクターに
組み込むことができるような制限領域をプライマーが有
していることが望まれる。また、プライマーは、末端
に、親和的な配位子となる化学基を有していることが好
ましい。
第１図には、PCRのプライマーとして特に好ましいオ
リゴヌクレオチドを模式的に示している。プライマーHn
p1は、約18から25のヌクレオチドのハイブリッド配列１
からなっている。フリー端末に向って、好ましくは18か
ら25のクヌレオチドのG/C部と、制限領域と一つまたは
それ以上の親和的な配位子となる化学基が続いている。
プライマーp2も同様に、ハイブリッド配列２、０から20
のヌクレオチド長のA/T高含有部および制限領域R2から
なっている。非常に多型的な領域で突然変異の分析を行
う場合、唯一の多型的位置を検出するために、Ｃ、Ｄ領
域（第10図）を可能な限り少なく、極端な場合には０本
のヌクレオチドに保っておくとよい。このことは、実施
例に示したβ−グロビン・サラセミア「Yugo」（IVS−
１−６、Ｔ−Ｃ）を検出する検査システムによって例示
されている。
リゴヌクレオチドを模式的に示している。プライマーHn
p1は、約18から25のヌクレオチドのハイブリッド配列１
からなっている。フリー端末に向って、好ましくは18か
ら25のクヌレオチドのG/C部と、制限領域と一つまたは
それ以上の親和的な配位子となる化学基が続いている。
プライマーp2も同様に、ハイブリッド配列２、０から20
のヌクレオチド長のA/T高含有部および制限領域R2から
なっている。非常に多型的な領域で突然変異の分析を行
う場合、唯一の多型的位置を検出するために、Ｃ、Ｄ領
域（第10図）を可能な限り少なく、極端な場合には０本
のヌクレオチドに保っておくとよい。このことは、実施
例に示したβ−グロビン・サラセミア「Yugo」（IVS−
１−６、Ｔ−Ｃ）を検出する検査システムによって例示
されている。
β−グロビン・サラセミアの重要なタイプに、β−グ
ロビンの遺伝子座上でのスプライシング突然変異体があ
る。この突然変異があると、エキソン１とエキソン２と
の間で、正確なスプライシングができなくなる。IVS−
１−６の位置にある突然変異体の周囲を第２図に示し
た。示したものは、イントロン突然変異体IVS−１−６
と本発明によるプライマーによるヒトβgbの配位子座62
200から62350（遺伝子バンク配列 HUM HBB_PREMRNA）
の部分である。
ロビンの遺伝子座上でのスプライシング突然変異体があ
る。この突然変異があると、エキソン１とエキソン２と
の間で、正確なスプライシングができなくなる。IVS−
１−６の位置にある突然変異体の周囲を第２図に示し
た。示したものは、イントロン突然変異体IVS−１−６
と本発明によるプライマーによるヒトβgbの配位子座62
200から62350（遺伝子バンク配列 HUM HBB_PREMRNA）
の部分である。
第３図には、G.Stegerらによって開発された計算法
［G.Steger,T.Po,J.Kaper and D.Riesner Nucleic Acid
s Res.15（1987）pp.5085−5103］を用いて得られた、
この核酸の融解挙動を示した。第２図に示した部分に
は、イントロン１−β＋突然変異IVS−１−６が含まれ
ている。番号は遺伝子バンク配列 HUM HBB_PREMRNAに
対応している。変性ゲルに最適なプローブは、62233−6
2340部分を増幅するものである。プライマー1a＊は、い
わゆるG/C末端につながっている。制限領域BamH1とEcoR
1は、ベクターpBR322に組み込まれるように選らばれて
いる。1MのNaCl中で、β−グロビン部分が、異なる温度
で異なるDNA変性を起こす様子を計算し、その結果を図
示した。第３図に示した融解ダイヤグラムについて、以
下に説明する。横軸は核酸の位置を示し、縦軸は、特定
のヌクレオチドの位置で鎖がとける可能性を表わしてい
る。また、三次元グラフの第三の軸は温度軸に対応して
いる。ここで注目すべきことは、融点は媒体のイオン強
度にも、また、依存していることである。塩基対の鎖が
ほどける可能性は、0.5℃刻みで計算されている。この
三次元グラフは、様々な位置で協同的な変性が連続的に
起こっていることを示している。第４図に示したよう
に、62302の位置に生じた一塩基対の大きさのループの
ために、この領域は最も不安定となり、融点が減少して
いる。
［G.Steger,T.Po,J.Kaper and D.Riesner Nucleic Acid
s Res.15（1987）pp.5085−5103］を用いて得られた、
この核酸の融解挙動を示した。第２図に示した部分に
は、イントロン１−β＋突然変異IVS−１−６が含まれ
ている。番号は遺伝子バンク配列 HUM HBB_PREMRNAに
対応している。変性ゲルに最適なプローブは、62233−6
2340部分を増幅するものである。プライマー1a＊は、い
わゆるG/C末端につながっている。制限領域BamH1とEcoR
1は、ベクターpBR322に組み込まれるように選らばれて
いる。1MのNaCl中で、β−グロビン部分が、異なる温度
で異なるDNA変性を起こす様子を計算し、その結果を図
示した。第３図に示した融解ダイヤグラムについて、以
下に説明する。横軸は核酸の位置を示し、縦軸は、特定
のヌクレオチドの位置で鎖がとける可能性を表わしてい
る。また、三次元グラフの第三の軸は温度軸に対応して
いる。ここで注目すべきことは、融点は媒体のイオン強
度にも、また、依存していることである。塩基対の鎖が
ほどける可能性は、0.5℃刻みで計算されている。この
三次元グラフは、様々な位置で協同的な変性が連続的に
起こっていることを示している。第４図に示したよう
に、62302の位置に生じた一塩基対の大きさのループの
ために、この領域は最も不安定となり、融点が減少して
いる。
第５図は、融解の温度依存曲線に関するものである。
積分形（5a）と微分形（5b）を示した。記号（＊）でプ
ロットした曲線は野生型ホモ二重鎖であり、記号（＋）
でプロットした曲線はA/Cのミス・ペアリングによるヘ
テロ二重鎖のものである。
積分形（5a）と微分形（5b）を示した。記号（＊）でプ
ロットした曲線は野生型ホモ二重鎖であり、記号（＋）
でプロットした曲線はA/Cのミス・ペアリングによるヘ
テロ二重鎖のものである。
第5a図には、ホモ二重鎖とヘテロ二重鎖（A/C）の両
方について、理論的に求めた、核酸二重鎖の光学的融解
曲線を示した。第5b図は、第5a図で計算した融解曲線の
一階微分を示した。注目すべきことは、熱力学的に不安
定な領域のヘテロ二重鎖（＋＋＋）が、いわゆる不適合
で生じた内部ループのために、ホモ二重鎖（＊＊＊）よ
りも、突然変異によって極めて不安定化されていること
である。この場合、この熱力学的に不安定な領域で、融
点はホモ二重鎖に比べて約４℃降下している。
方について、理論的に求めた、核酸二重鎖の光学的融解
曲線を示した。第5b図は、第5a図で計算した融解曲線の
一階微分を示した。注目すべきことは、熱力学的に不安
定な領域のヘテロ二重鎖（＋＋＋）が、いわゆる不適合
で生じた内部ループのために、ホモ二重鎖（＊＊＊）よ
りも、突然変異によって極めて不安定化されていること
である。この場合、この熱力学的に不安定な領域で、融
点はホモ二重鎖に比べて約４℃降下している。
第６図には、第２図に示したプライマー1a＊とプライ
マー1bとによって増幅された突然変異体と、同じく増幅
された野生型について、10から60℃の直線的な傾斜をも
った垂直型温度勾配ゲル電気泳動法を用いて分析した結
果が示されている。等モルで混合されたフラグメントを
連続的に変性／再生した。ヘテロ二重鎖（Mv,Vm）とホ
モ二重鎖（Vv,Mm）は、模式的に示したように分裂し
た。ホモ接合した野生型DNAプローブは、上記したよう
にプライマー1a＊によってPCR増幅した。フラグメント
は、pBR322のBamH1/EcoR1の間に組み込まれた。ホモ接
合した突然変異体IVS−１−６のDNA試料は、BamH1とEco
R1によって増幅し、切断、変性、そして野生型gb配列の
BamH1/EcoR1クローン・フラグメントを用いてハイブリ
ッド形成した。得られたホモ二重鎖（２バンド）とヘテ
ロ二重鎖（２バンド）は、４本の異ったバンドとして示
された。Ｙ字形配置は、検査する核酸の最も安定な末端
にあるG/C高含有オリゴヌクレオチド鎖によって安定化
された［R.M.Myers et al.Nucleic Acids Res.13（198
5）pp.3131参照］。突然変異IVS−１−６を含む試料
を、平衡温度勾配ゲル電気泳動を用いて分析すると第７
図に示した図が得られる。
マー1bとによって増幅された突然変異体と、同じく増幅
された野生型について、10から60℃の直線的な傾斜をも
った垂直型温度勾配ゲル電気泳動法を用いて分析した結
果が示されている。等モルで混合されたフラグメントを
連続的に変性／再生した。ヘテロ二重鎖（Mv,Vm）とホ
モ二重鎖（Vv,Mm）は、模式的に示したように分裂し
た。ホモ接合した野生型DNAプローブは、上記したよう
にプライマー1a＊によってPCR増幅した。フラグメント
は、pBR322のBamH1/EcoR1の間に組み込まれた。ホモ接
合した突然変異体IVS−１−６のDNA試料は、BamH1とEco
R1によって増幅し、切断、変性、そして野生型gb配列の
BamH1/EcoR1クローン・フラグメントを用いてハイブリ
ッド形成した。得られたホモ二重鎖（２バンド）とヘテ
ロ二重鎖（２バンド）は、４本の異ったバンドとして示
された。Ｙ字形配置は、検査する核酸の最も安定な末端
にあるG/C高含有オリゴヌクレオチド鎖によって安定化
された［R.M.Myers et al.Nucleic Acids Res.13（198
5）pp.3131参照］。突然変異IVS−１−６を含む試料
を、平衡温度勾配ゲル電気泳動を用いて分析すると第７
図に示した図が得られる。
第７図には、増幅および検査を終えた異なるDNA検体
を、野生型（第６図および第２図参照）を標準としてオ
ートラジオグラフィーで分析した様子が示されている。
IVS−１−６突然変異を含むDNA検体は、第二のバンドを
示す。すなわち、DNA検体は標識された鎖をただ一つだ
け含むので、これら４本のバンドのうち、２本だけが放
射性標識を含むことになる（第７図の挿入図参照）。こ
の平衡温度勾配は25から65℃の間で形成されている。
を、野生型（第６図および第２図参照）を標準としてオ
ートラジオグラフィーで分析した様子が示されている。
IVS−１−６突然変異を含むDNA検体は、第二のバンドを
示す。すなわち、DNA検体は標識された鎖をただ一つだ
け含むので、これら４本のバンドのうち、２本だけが放
射性標識を含むことになる（第７図の挿入図参照）。こ
の平衡温度勾配は25から65℃の間で形成されている。
さらに、この実験は、この突然変異検出システムが定
性分析だけでなく定量分析にも適していることを示して
いる。（放射性の）標識を付けた標識フラグメント（野
生型）を少量モル加えると、この標識フラグメントは、
変性／再生を終えた対立遺伝子の両者に比例して分布す
る。一つの対立遺伝子の突然変異は、標識の1:1という
分布には影響を及ぼさない（第７図）。標識それ自体
も、実験誤差（±10％）の範囲内でしか1:1という分布
を変動させない。対立遺伝子が等しく分布しているよう
な、増幅する混合物内部に内部標準が存在しない場合、
外部から標準を加えることができる。もし、一つの突然
変異によって標準とは異なる鋳型が生じれば、複製の数
を内部標準として鋳型を定量的に検出することができ
る。完全に同一のプライマーを用いているため、プラト
ー効果、プライマーの異なる濃度あるいは低い複製効率
などは、両方の成分に全く対称的に影響を及ぼす。測定
する標準および目的の配列が、100、好ましくは10未満
の違いしかない場合、信号の比によって複製の数を正確
に決定してもよい（第９図）。実験に際しては、ポリメ
ラーゼ連鎖反応（PCR）は制御しなければ、飽和するま
で進行するので、この方法は極めて簡単なものとなる。
性分析だけでなく定量分析にも適していることを示して
いる。（放射性の）標識を付けた標識フラグメント（野
生型）を少量モル加えると、この標識フラグメントは、
変性／再生を終えた対立遺伝子の両者に比例して分布す
る。一つの対立遺伝子の突然変異は、標識の1:1という
分布には影響を及ぼさない（第７図）。標識それ自体
も、実験誤差（±10％）の範囲内でしか1:1という分布
を変動させない。対立遺伝子が等しく分布しているよう
な、増幅する混合物内部に内部標準が存在しない場合、
外部から標準を加えることができる。もし、一つの突然
変異によって標準とは異なる鋳型が生じれば、複製の数
を内部標準として鋳型を定量的に検出することができ
る。完全に同一のプライマーを用いているため、プラト
ー効果、プライマーの異なる濃度あるいは低い複製効率
などは、両方の成分に全く対称的に影響を及ぼす。測定
する標準および目的の配列が、100、好ましくは10未満
の違いしかない場合、信号の比によって複製の数を正確
に決定してもよい（第９図）。実験に際しては、ポリメ
ラーゼ連鎖反応（PCR）は制御しなければ、飽和するま
で進行するので、この方法は極めて簡単なものとなる。
第９図は、第７図に記載した方法を模式的に示したも
のである。増幅するDNAに、既知の濃度（複製数）の標
準を加える。この標準は、分析しようとする核酸と、少
なくとも一つの突然変異、例えば、一点での突然変異、
のみが異なるものである。この混合物を、飽和するまで
酵素を用いて増幅する。続いて、増幅された混合物に、
標識を付けた標準を少量加える。少なくとも１回の変性
／再生サイクルに続いて、定量する目標配列に対する内
部標準の量の比に応じて、標識を対応するホモ二重鎖と
ヘテロ二重鎖へ変換する。ホモ二重鎖とヘテロ二重鎖の
分離をTGGEを用いて行い、標準の複製数の増加に応じて
得られたバンドの信号強度の比から、目標配列の量を決
定することができる。
のである。増幅するDNAに、既知の濃度（複製数）の標
準を加える。この標準は、分析しようとする核酸と、少
なくとも一つの突然変異、例えば、一点での突然変異、
のみが異なるものである。この混合物を、飽和するまで
酵素を用いて増幅する。続いて、増幅された混合物に、
標識を付けた標準を少量加える。少なくとも１回の変性
／再生サイクルに続いて、定量する目標配列に対する内
部標準の量の比に応じて、標識を対応するホモ二重鎖と
ヘテロ二重鎖へ変換する。ホモ二重鎖とヘテロ二重鎖の
分離をTGGEを用いて行い、標準の複製数の増加に応じて
得られたバンドの信号強度の比から、目標配列の量を決
定することができる。
親和性のある基を有するプライマーを用いれば、核酸
を分析して調べる際に、特に、簡単で効果的な試料を調
製することができる。親和性基としては、例えばヒスチ
ジル残基、ビオチニル残基などを用いることができる。
ヒスチジル残基を用いる場合、２から８個のヒスチジル
残基を用いることができるが、６個用いるのが特に好ま
しい。次に、化学修飾されたプライマーは、対応する親
和性基によってポリマー支持体に固定される。ヒスチジ
ル残基によって化学修飾されたプライマーを用いて、銅
やニッケルといった２価遷移金属イオンとニトリロ三酢
酸とのキレート錯体をポリマー支持体に連結させること
が好ましい。遷移金属イオンの空になっている二つの配
座が、二つのヒスチジル残基に占められることになる。
プライマーとヒスチジル残基とは互いに共有結合してい
るので、プライマーは、このようにしてポリマー支持体
に連結する。錯体については、組換え蛋白（EP−Ａ−O
282 042,EP−Ａ−O 186 069）、NTA樹脂（EP−Ａ−O 25
3 303）でも記載されてきた。例えば、ビオチニル残基
とプライマーとが共有結合した場合は、アビジン分子が
共有結合しているポリマー支持体を用いることが好まし
い。
を分析して調べる際に、特に、簡単で効果的な試料を調
製することができる。親和性基としては、例えばヒスチ
ジル残基、ビオチニル残基などを用いることができる。
ヒスチジル残基を用いる場合、２から８個のヒスチジル
残基を用いることができるが、６個用いるのが特に好ま
しい。次に、化学修飾されたプライマーは、対応する親
和性基によってポリマー支持体に固定される。ヒスチジ
ル残基によって化学修飾されたプライマーを用いて、銅
やニッケルといった２価遷移金属イオンとニトリロ三酢
酸とのキレート錯体をポリマー支持体に連結させること
が好ましい。遷移金属イオンの空になっている二つの配
座が、二つのヒスチジル残基に占められることになる。
プライマーとヒスチジル残基とは互いに共有結合してい
るので、プライマーは、このようにしてポリマー支持体
に連結する。錯体については、組換え蛋白（EP−Ａ−O
282 042,EP−Ａ−O 186 069）、NTA樹脂（EP−Ａ−O 25
3 303）でも記載されてきた。例えば、ビオチニル残基
とプライマーとが共有結合した場合は、アビジン分子が
共有結合しているポリマー支持体を用いることが好まし
い。
ポリマー支持体としては、対応する化学修飾をした
膜、あるいは対応する化学修飾をした粒子を用いること
ができる。ポリマー支持体は、実験の間に生じる圧力変
化に耐えて、流れを妨げないようにするために、充分な
機械的安定性を有していなければならない。今、突然変
異を有する核酸が、上記したプライマーによって増幅さ
れると、一方の端末に前記の親和性基を（プライマーを
介して）持つ二重鎖が形成される。充分に増幅した後、
反応混合物はポリマー支持体と反応し、親和性部分はニ
ッケル・キレートやアビジン分子のところで連結する。
このようにして、プライマーによって増幅された配列
は、固体の支持体表面に特異的に結合する。これはバッ
チ処理でもカラムによる処理でも可能である。この方法
を用いることで、増幅に必要な酵素や試薬の内、余分な
ものを簡単に、かつ穏やかに除去することができる。支
持体に結合した核酸フラグメントは、標識を付けた、野
生型から誘導した核酸プローブを用いた簡単な方法で成
長させることができる。一回またはそれ以上の変性／再
生サイクルを用いてヘテロ二重鎖を形成し、それから、
バッファーの条件を変えたり、あるいは拮抗剤を用いて
ポリマー支持体から溶離させて、直接、分析してもよ
い。このようにして得られた試料は、例えば、すぐに温
度勾配電気泳動によって分析してもよい。
膜、あるいは対応する化学修飾をした粒子を用いること
ができる。ポリマー支持体は、実験の間に生じる圧力変
化に耐えて、流れを妨げないようにするために、充分な
機械的安定性を有していなければならない。今、突然変
異を有する核酸が、上記したプライマーによって増幅さ
れると、一方の端末に前記の親和性基を（プライマーを
介して）持つ二重鎖が形成される。充分に増幅した後、
反応混合物はポリマー支持体と反応し、親和性部分はニ
ッケル・キレートやアビジン分子のところで連結する。
このようにして、プライマーによって増幅された配列
は、固体の支持体表面に特異的に結合する。これはバッ
チ処理でもカラムによる処理でも可能である。この方法
を用いることで、増幅に必要な酵素や試薬の内、余分な
ものを簡単に、かつ穏やかに除去することができる。支
持体に結合した核酸フラグメントは、標識を付けた、野
生型から誘導した核酸プローブを用いた簡単な方法で成
長させることができる。一回またはそれ以上の変性／再
生サイクルを用いてヘテロ二重鎖を形成し、それから、
バッファーの条件を変えたり、あるいは拮抗剤を用いて
ポリマー支持体から溶離させて、直接、分析してもよ
い。このようにして得られた試料は、例えば、すぐに温
度勾配電気泳動によって分析してもよい。
第８図には、本発明に従って、TGGを調節することで
試料を調製する方法を模式的に示した。プライマーHnp1
はオリゴヒスチジル残基を結合側鎖の５′位に有してお
り、そのため、中性もしくはアルカリ性で、NTA配位子
を持つ固相の母体と結合できる。この段階で、混入した
酵素や試薬は除かれる。試薬、および、必要であれば内
部標準を加えて、変性／再生サイクルを行う。このよう
にして、TGGE分析に用いることのできるMmとMvの基本的
構造（標識されたホモ二重鎖／標識されたヘテロ二重
鎖）を得ることができる。すなわち、分析試料の第二の
鎖を、連続的なTGGE分析によって検出できる。
試料を調製する方法を模式的に示した。プライマーHnp1
はオリゴヒスチジル残基を結合側鎖の５′位に有してお
り、そのため、中性もしくはアルカリ性で、NTA配位子
を持つ固相の母体と結合できる。この段階で、混入した
酵素や試薬は除かれる。試薬、および、必要であれば内
部標準を加えて、変性／再生サイクルを行う。このよう
にして、TGGE分析に用いることのできるMmとMvの基本的
構造（標識されたホモ二重鎖／標識されたヘテロ二重
鎖）を得ることができる。すなわち、分析試料の第二の
鎖を、連続的なTGGE分析によって検出できる。
請求項51から62でクレームした本発明の装置は、本発
明の方法を、特に好適に行うことができるものである。
この装置は、温度勾配を形成するための、少なくとも二
つの加熱もしくは冷却装置、または、一つの加熱装置と
一つの加熱装置からなっている。加熱もしくは冷却装置
は、本発明の方法で必要とされるエネルギーの出入を確
保するための熱溜めに連結されている。熱溜めと、加熱
もしくは冷却装置とは、分離媒体が充填されている中空
体を完全に包むように設計されている。この中空体の管
の中には、分離のための分離媒体もしくは支持体からの
溶離のための分離媒体が充填されている。再現性のある
温度勾配を形成するため、もしくは、等温的な操作の場
合は、再現性のある分離媒体の温度レベルを確保するた
めに、中空体は温度制御用カバーで覆われている。温度
制御用カバーは、熱溜め、あるいは加熱もしくは冷却装
置と熱が伝導するように連絡していることが好ましい。
明の方法を、特に好適に行うことができるものである。
この装置は、温度勾配を形成するための、少なくとも二
つの加熱もしくは冷却装置、または、一つの加熱装置と
一つの加熱装置からなっている。加熱もしくは冷却装置
は、本発明の方法で必要とされるエネルギーの出入を確
保するための熱溜めに連結されている。熱溜めと、加熱
もしくは冷却装置とは、分離媒体が充填されている中空
体を完全に包むように設計されている。この中空体の管
の中には、分離のための分離媒体もしくは支持体からの
溶離のための分離媒体が充填されている。再現性のある
温度勾配を形成するため、もしくは、等温的な操作の場
合は、再現性のある分離媒体の温度レベルを確保するた
めに、中空体は温度制御用カバーで覆われている。温度
制御用カバーは、熱溜め、あるいは加熱もしくは冷却装
置と熱が伝導するように連絡していることが好ましい。
温度制御用カバーは金属板製で、その中を、好ましく
はガラスもしくはプラスチック製の管である中空体が貫
いている態様が好ましい。温度制御用カバーは、平行に
溝が切ってある２枚の金属板からなっており、その溝が
組立てた時に、分離に用いる中空体の外形に対応した凹
部を形成するようにされていて、その金属板が直接熱に
接するようにされていることが好ましい。
はガラスもしくはプラスチック製の管である中空体が貫
いている態様が好ましい。温度制御用カバーは、平行に
溝が切ってある２枚の金属板からなっており、その溝が
組立てた時に、分離に用いる中空体の外形に対応した凹
部を形成するようにされていて、その金属板が直接熱に
接するようにされていることが好ましい。
第10図には、本発明による装置の好ましい態様が組立
てられたところを模式的に示した。第10a図には、内側
には分離媒体が充填され、周りを温度制御用カバーで囲
まれている中空体のＡ−Ａ線での断面を示した。
てられたところを模式的に示した。第10a図には、内側
には分離媒体が充填され、周りを温度制御用カバーで囲
まれている中空体のＡ−Ａ線での断面を示した。
第11図には、時間的温度勾配を形成する、本発明によ
るもう一つ別の装置の好ましい態様を示した。
るもう一つ別の装置の好ましい態様を示した。
第12図には、多数の分離用中空体が利用できるように
改良した、本発明による装置の態様を模式的に示した。
改良した、本発明による装置の態様を模式的に示した。
第13図は、第11図に示した装置を用いた本発明の方法
を、模式的に説明したものである。
を、模式的に説明したものである。
第14図および第14a図には、第12図に示した本発明の
装置の好ましい態様を示した。ここでは、温度制御用カ
バーは二つの部分からなる金属板で構成されている。分
離媒体が充填された管状の中空体は、両方の金属板の平
行な溝に挟まっている。
装置の好ましい態様を示した。ここでは、温度制御用カ
バーは二つの部分からなる金属板で構成されている。分
離媒体が充填された管状の中空体は、両方の金属板の平
行な溝に挟まっている。
第14a、15a、ｂ図は、第14図の装置のＢ−Ｂ線での側
断面図であり、第15a図は、試料を導入した瞬間の図で
ある。第15b図は、分離に用いる中空体が装置の上部と
下部にあるバッファー溜め50の両方に浸されて、実験の
準備が整った装置を示したものである。
断面図であり、第15a図は、試料を導入した瞬間の図で
ある。第15b図は、分離に用いる中空体が装置の上部と
下部にあるバッファー溜め50の両方に浸されて、実験の
準備が整った装置を示したものである。
第10図に示した好ましい態様は、温度T2および温度T1
にそれぞれ対応する二つの加熱および冷却装置１、２か
らなっている。これらの加熱および冷却装置は、伝達手
段によって熱溜め４、５に連絡している。熱溜め同様、
加熱および冷却装置も、中心に穴が開けられていること
が好ましい。この穴を通って、好ましくは両側を貫い
て、中空体６が配置されている。中空体６のすべての側
面は、温度制御用カバー７で覆われている。中空体６
は、その内部の管腔に分離を用いられる媒体が充填され
ている。温度制御用カバー７は、熱伝導性の材料で造ら
れていることが好ましく、熱溜めと同じ材料で造られて
いることが特に好ましい。温度レベル１、２は、それぞ
れ、加熱、冷却によって維持される。この操作には、ペ
ルチエ素子、あるいはサーモスタットを付けた液浴、あ
るいは電気的な加熱手段９を利用することが好ましい。
分離経路の末端には、検出器10が備えられている。第10
a図には、Ａ−Ａ線での断面が示されている。中空体６
の外壁と温度制御用カバー７の内壁の間の空間には、粘
性の高い液体８が充填されていることが好ましい。分離
媒体は、中空体６の断面に完全に満たされている。中空
体６は円筒の形状であることが好まし、細管であること
が特に好ましい。分離媒体中のどの位置の温度も、次式
によって計算すことができる。
にそれぞれ対応する二つの加熱および冷却装置１、２か
らなっている。これらの加熱および冷却装置は、伝達手
段によって熱溜め４、５に連絡している。熱溜め同様、
加熱および冷却装置も、中心に穴が開けられていること
が好ましい。この穴を通って、好ましくは両側を貫い
て、中空体６が配置されている。中空体６のすべての側
面は、温度制御用カバー７で覆われている。中空体６
は、その内部の管腔に分離を用いられる媒体が充填され
ている。温度制御用カバー７は、熱伝導性の材料で造ら
れていることが好ましく、熱溜めと同じ材料で造られて
いることが特に好ましい。温度レベル１、２は、それぞ
れ、加熱、冷却によって維持される。この操作には、ペ
ルチエ素子、あるいはサーモスタットを付けた液浴、あ
るいは電気的な加熱手段９を利用することが好ましい。
分離経路の末端には、検出器10が備えられている。第10
a図には、Ａ−Ａ線での断面が示されている。中空体６
の外壁と温度制御用カバー７の内壁の間の空間には、粘
性の高い液体８が充填されていることが好ましい。分離
媒体は、中空体６の断面に完全に満たされている。中空
体６は円筒の形状であることが好まし、細管であること
が特に好ましい。分離媒体中のどの位置の温度も、次式
によって計算すことができる。
Ｔ＝T2−（T2−T1）・d2/（d1＋d2） ここで、d1は、その位置の温度T1からの距離を表わ
し、d2は、その位置の温度T2からの距離を表わし、T1、
T2は、それぞれ温度レベル１、２での温度を表わす。
し、d2は、その位置の温度T2からの距離を表わし、T1、
T2は、それぞれ温度レベル１、２での温度を表わす。
第11図には、時間温度勾配が設定された電気泳動によ
る本発明の方法を実施するのに好適な態様が示されてい
る。これは、好ましくは熱溜めに連結された三つの温度
レベル１、２、３よりなっている。各部、すなわち、中
空体６、温度制御用カバー７、検出器10、加熱冷却装置
９は、第10図の装置と同様に設計されているが、温度制
御用カバー７が温度レベル２の加熱冷却装置の熱溜めと
熱伝導しないように連絡している点のみが異なってい
る。
る本発明の方法を実施するのに好適な態様が示されてい
る。これは、好ましくは熱溜めに連結された三つの温度
レベル１、２、３よりなっている。各部、すなわち、中
空体６、温度制御用カバー７、検出器10、加熱冷却装置
９は、第10図の装置と同様に設計されているが、温度制
御用カバー７が温度レベル２の加熱冷却装置の熱溜めと
熱伝導しないように連絡している点のみが異なってい
る。
第13aから13d図には、例えば、第11図の装置を用いた
方法の手順を示している。分離に用いる電界の傾斜を横
軸にとり、同時に、通過した分離経路の位置を表わし
た。また、位置による温度レベルを、縦軸の正方向にと
った（第13a図）。試料成分が分離する移動速度は、温
度曲線に従った段階関数で表現される。例えば、T
1（t0）での移動速度（Ｖ）は、ほぼ０である。温度レ
ベルT0に導入された試料は、この場合、単純に、電気泳
動分離経路の末端では温度レベルT2になる。ひとたび試
料が導入されると、物質１および２はスポットとなっ
て、一定の位置を占める。試料は、分離媒体中を電界の
傾斜に沿って移動して行き、温度レベルT1に到達する。
ここで、例えば、試料が核酸であれば、変性を起こして
二重鎖が巻かれ、いわゆるループを形成する。その結
果、移動速度が減少する。T0とT1との間で試料は濃縮さ
れる。この様子は、第13b図で形が小さくなっているこ
とで表わしている（時間t1）。ここで、温度レベルT1の
温度を時間の関数で降下させる。第13C図のNo.2として
示したような、熱力学的により安定な成分は、二重らせ
んを閉じて、高い移動度を回復する。その結果、この成
分は分離媒体中を動きはじめる。第13d図に示した図
は、温度Ｔを下げて行って、第13C図のNo.1として示し
たような、熱力学的により不安定な成分も分離媒体中を
動きはじめるような温度になった時間t3の様子を示した
ものである。この時間の間、No.2成分は、分離経路の相
当な部分をずっと移動し続け、場合によっては、分離経
路の長さを動いて、すでに末端で検出さているかもしれ
ない。
方法の手順を示している。分離に用いる電界の傾斜を横
軸にとり、同時に、通過した分離経路の位置を表わし
た。また、位置による温度レベルを、縦軸の正方向にと
った（第13a図）。試料成分が分離する移動速度は、温
度曲線に従った段階関数で表現される。例えば、T
1（t0）での移動速度（Ｖ）は、ほぼ０である。温度レ
ベルT0に導入された試料は、この場合、単純に、電気泳
動分離経路の末端では温度レベルT2になる。ひとたび試
料が導入されると、物質１および２はスポットとなっ
て、一定の位置を占める。試料は、分離媒体中を電界の
傾斜に沿って移動して行き、温度レベルT1に到達する。
ここで、例えば、試料が核酸であれば、変性を起こして
二重鎖が巻かれ、いわゆるループを形成する。その結
果、移動速度が減少する。T0とT1との間で試料は濃縮さ
れる。この様子は、第13b図で形が小さくなっているこ
とで表わしている（時間t1）。ここで、温度レベルT1の
温度を時間の関数で降下させる。第13C図のNo.2として
示したような、熱力学的により安定な成分は、二重らせ
んを閉じて、高い移動度を回復する。その結果、この成
分は分離媒体中を動きはじめる。第13d図に示した図
は、温度Ｔを下げて行って、第13C図のNo.1として示し
たような、熱力学的により不安定な成分も分離媒体中を
動きはじめるような温度になった時間t3の様子を示した
ものである。この時間の間、No.2成分は、分離経路の相
当な部分をずっと移動し続け、場合によっては、分離経
路の長さを動いて、すでに末端で検出さているかもしれ
ない。
この態様は、分離媒体を充填した細管を用いることが
好ましく、また、互いに熱的に分離された三領域（T0、
T1、T2）はサーモスタットで制御してもよい。T0とT1と
の間の温度で起こる部分的な変性、例えば、核酸ならば
内部ループの形成、は適当な試薬を利用することもでき
る。
好ましく、また、互いに熱的に分離された三領域（T0、
T1、T2）はサーモスタットで制御してもよい。T0とT1と
の間の温度で起こる部分的な変性、例えば、核酸ならば
内部ループの形成、は適当な試薬を利用することもでき
る。
個々の温度レベルの境界では、温度の境界は、ぼやけ
てしまう。従って、第12図に示した図は、温度と移動速
度についての単なる理論上の矩形図である。このことに
もかかわらず、温度レベルの境界を出来るだけ鮮明にす
るために、温度レベルT0/T1/T2は、熱が伝わらないよう
に連結されていることが好ましい。
てしまう。従って、第12図に示した図は、温度と移動速
度についての単なる理論上の矩形図である。このことに
もかかわらず、温度レベルの境界を出来るだけ鮮明にす
るために、温度レベルT0/T1/T2は、熱が伝わらないよう
に連結されていることが好ましい。
ドイツ特許出願第P3622591号に記載されている、温度
制御された単純な空間温度勾配を持つフラットな分離媒
体を用いても、本発明の方法を実施することができる。
制御された単純な空間温度勾配を持つフラットな分離媒
体を用いても、本発明の方法を実施することができる。
第12図には、それぞれに対応する熱溜め４、５を有す
る加熱冷却装置１、２が多数の中空体６を収納するよう
に配置され、前記装置１、２および４、５がブロック−
4a、5a−の形状をとるように設計され、多数の穴11が中
空体６が突き出た形で、好ましくは、端面から突き出し
て配置されるように設けられていることを特徴とする、
好適な装置が示してある。この装置は、一つの装置を使
用して、既知もしくは未知の突然変異を検出するために
多数の分析を行う場合に有利である。この装置では、互
いに共通な加熱冷却システムを持つ、種々のサーモスタ
ット素子によって温度制御することで、いくつかの試料
を同時に分析することができる。多重分析システム、好
ましくは、８または12、あるいは96試料の同時分析が可
能であるので、マイクロ力価の決定（96本の中空体）に
適用するのも好ましい態様である。読取りシステムとし
ては、蛍光標識された核酸プローブを利用することが好
ましい。このプローブは、温度制御装置の前および／ま
たは終端の位置を分離時間の関数として、光学的に記録
することができ、市販の検出システムを利用することが
出来るので好ましい。従って、適当な試薬を利用するこ
とで、遺伝物質の突然変異を自動的に測定することがで
きる。
る加熱冷却装置１、２が多数の中空体６を収納するよう
に配置され、前記装置１、２および４、５がブロック−
4a、5a−の形状をとるように設計され、多数の穴11が中
空体６が突き出た形で、好ましくは、端面から突き出し
て配置されるように設けられていることを特徴とする、
好適な装置が示してある。この装置は、一つの装置を使
用して、既知もしくは未知の突然変異を検出するために
多数の分析を行う場合に有利である。この装置では、互
いに共通な加熱冷却システムを持つ、種々のサーモスタ
ット素子によって温度制御することで、いくつかの試料
を同時に分析することができる。多重分析システム、好
ましくは、８または12、あるいは96試料の同時分析が可
能であるので、マイクロ力価の決定（96本の中空体）に
適用するのも好ましい態様である。読取りシステムとし
ては、蛍光標識された核酸プローブを利用することが好
ましい。このプローブは、温度制御装置の前および／ま
たは終端の位置を分離時間の関数として、光学的に記録
することができ、市販の検出システムを利用することが
出来るので好ましい。従って、適当な試薬を利用するこ
とで、遺伝物質の突然変異を自動的に測定することがで
きる。
加熱もしくは冷却装置の温度平衡は、加熱ワイヤーを
用いて、電気的に均一にすることができるが、ペルチエ
素子を用いることが好ましい。同様に、温度制御した液
浴を使用した液体加熱装置も使用することができる。し
かしながら、細管の温度制御カバーに連絡している加熱
もしくは冷却装置は、温度制御カバーのすべての位置
が、その各移動地点に、各々ほとんど固有の温度を持つ
ように注意しなくてはならない。このことは、対照的に
組立てられたペルチエ加熱／冷却装置によって可能とな
る。また、逆方向にも液体を流すことができるようにし
た液体温度制御装置によって、逆流の温度との和で細管
の各位置に、各々ほとんど固有の温度を形成してもよ
い。
用いて、電気的に均一にすることができるが、ペルチエ
素子を用いることが好ましい。同様に、温度制御した液
浴を使用した液体加熱装置も使用することができる。し
かしながら、細管の温度制御カバーに連絡している加熱
もしくは冷却装置は、温度制御カバーのすべての位置
が、その各移動地点に、各々ほとんど固有の温度を持つ
ように注意しなくてはならない。このことは、対照的に
組立てられたペルチエ加熱／冷却装置によって可能とな
る。また、逆方向にも液体を流すことができるようにし
た液体温度制御装置によって、逆流の温度との和で細管
の各位置に、各々ほとんど固有の温度を形成してもよ
い。
本発明に従って設計された温度勾配ゲル電気泳動法
は、温度勾配が空間的に離れているのではなく、次緩匂
配として時間変動するようにされている方法に、特に適
している。このことは、時間依存温度プログラムによっ
て、加熱もしくは冷却の熱溜めが制御されることを意味
している。このプログラムによって、分離しようとする
分子の移動度は、最終的に時間の関数として制御され
る。従って、例えば、開いてしまった核酸や部分的に変
性した二重鎖は、高温でゲル中に事実上「固定」されて
しまうが、少し時間が経って、可逆的な構造が再生され
る温度まで下がれさえすれば、分離媒体柱を移動するに
なる。これは、細管中の分離でも、また水平な支持体の
上での分離でも行うことができる。この技術の利点は、
きわめて短い分離経路でも実施できることである。
は、温度勾配が空間的に離れているのではなく、次緩匂
配として時間変動するようにされている方法に、特に適
している。このことは、時間依存温度プログラムによっ
て、加熱もしくは冷却の熱溜めが制御されることを意味
している。このプログラムによって、分離しようとする
分子の移動度は、最終的に時間の関数として制御され
る。従って、例えば、開いてしまった核酸や部分的に変
性した二重鎖は、高温でゲル中に事実上「固定」されて
しまうが、少し時間が経って、可逆的な構造が再生され
る温度まで下がれさえすれば、分離媒体柱を移動するに
なる。これは、細管中の分離でも、また水平な支持体の
上での分離でも行うことができる。この技術の利点は、
きわめて短い分離経路でも実施できることである。
第15a、ｂ図の模式図は、12本の試料を同時に分析す
ることができる第14図の本発明の方法を実施するのに、
好適な態様を示したものである。注目すべきことは、T0
からTaの全部で４の温度レベルが、可変的に制御できる
ことである。この好ましい態様を用いれば、空間的、時
間的、および空間的、時間的の組合せのよる温度勾配の
どれでも、形成することができる。この発明の装置は、
分析しようとする試料の分離に必要な変数を、実験室に
おいて決定するのに特に適している。
ることができる第14図の本発明の方法を実施するのに、
好適な態様を示したものである。注目すべきことは、T0
からTaの全部で４の温度レベルが、可変的に制御できる
ことである。この好ましい態様を用いれば、空間的、時
間的、および空間的、時間的の組合せのよる温度勾配の
どれでも、形成することができる。この発明の装置は、
分析しようとする試料の分離に必要な変数を、実験室に
おいて決定するのに特に適している。
第14図には、本発明による装置の好ましい態様を示し
た。この装置には、全部で４基の制御可能な加熱冷却装
置（35から38）が、それぞれ設けられている。T0からT3
の温度レベルは、独立に制御される。温度は、適当な温
度に制御された液体を流入口40から、ここでは金属ブロ
ックになっている熱溜めに導入することで調節される。
流入口40の反対側には、温度制御に用いた液体を外へ出
すために流出口が設けられている（図には描いていな
い）。温度レベルを形成する金属ブロック35には、分離
に用いる中空体６が差し込めるような穴があけられてい
る。温度制御カバーを形成する金属板７は、好ましく
は、互いに、ねじ込みになっている二つの部分から組立
てられている。この金属板には、互いに向い合う位置
に、中空体６の直径に合せた溝が切り込んである。それ
ぞれに対応する温度レベルを作る金属ブロック35から38
は、連結材43を介して温度制御カバー７にねじで連結さ
れている。
た。この装置には、全部で４基の制御可能な加熱冷却装
置（35から38）が、それぞれ設けられている。T0からT3
の温度レベルは、独立に制御される。温度は、適当な温
度に制御された液体を流入口40から、ここでは金属ブロ
ックになっている熱溜めに導入することで調節される。
流入口40の反対側には、温度制御に用いた液体を外へ出
すために流出口が設けられている（図には描いていな
い）。温度レベルを形成する金属ブロック35には、分離
に用いる中空体６が差し込めるような穴があけられてい
る。温度制御カバーを形成する金属板７は、好ましく
は、互いに、ねじ込みになっている二つの部分から組立
てられている。この金属板には、互いに向い合う位置
に、中空体６の直径に合せた溝が切り込んである。それ
ぞれに対応する温度レベルを作る金属ブロック35から38
は、連結材43を介して温度制御カバー７にねじで連結さ
れている。
第14a図は、第14図に示した装置のＢ−Ｂ線での断面
図である。分離を行う中空体６は、温度制御カバーを構
成する中空体７の中を完全に貫いて通っている。中空体
６と温度制御カバー７との間の空間には、粘性のある液
体が満たされていることが好ましい。金属ブロック37と
38は、板の平な面が直接接触することで、温度制御カバ
ー７と熱が伝導するように連絡されている。金属ブロッ
ク37、38は、温度制御カバーと同じ材料で作られている
ことが好ましい。特別な態様では、本発明の装置のこれ
ら部品は一体に作られる。例えば、温度レベルT0、T1を
形成する金属ブロックを、中空体６を予め作り付けてお
いた温度制御カバーと一緒に、一体で作る。温度レベル
T0、T1を形成する金属ブロック35、36には穴があけられ
る。金属ブロックおよび温度制御カバーにあける穴は、
個々の部品35、36、37および38を組立てた時に、分離を
行う中空体６が装置を貫通することができるように、あ
けなくてはならない。金属ブロック35から38には、各々
の温度レベルを形成するための液体が流れる穴15（断
面）が設けられている。
図である。分離を行う中空体６は、温度制御カバーを構
成する中空体７の中を完全に貫いて通っている。中空体
６と温度制御カバー７との間の空間には、粘性のある液
体が満たされていることが好ましい。金属ブロック37と
38は、板の平な面が直接接触することで、温度制御カバ
ー７と熱が伝導するように連絡されている。金属ブロッ
ク37、38は、温度制御カバーと同じ材料で作られている
ことが好ましい。特別な態様では、本発明の装置のこれ
ら部品は一体に作られる。例えば、温度レベルT0、T1を
形成する金属ブロックを、中空体６を予め作り付けてお
いた温度制御カバーと一緒に、一体で作る。温度レベル
T0、T1を形成する金属ブロック35、36には穴があけられ
る。金属ブロックおよび温度制御カバーにあける穴は、
個々の部品35、36、37および38を組立てた時に、分離を
行う中空体６が装置を貫通することができるように、あ
けなくてはならない。金属ブロック35から38には、各々
の温度レベルを形成するための液体が流れる穴15（断
面）が設けられている。
第２図および第３図の説明で述べたヘテロ二重鎖（１
塩基不適合）とホモ二重鎖とに代表される、標識を付け
たハイブリッド体混合物を、どのようにして分離したか
を以下に述べる。第２図および第３図の説明で述べた、
２本のクローン挿入体（野生型とIVS−１−６）は、Eco
R1/BamH1プラスミドの形で混合されていた（各々45n
g）。これに、放射性標識した挿入体を限界量（プラス
ミドに対して9nm）を混入した。放射性標識は、ポリメ
ラーゼＩ・クレノウ・フラグメントを用いて、32P−dAT
P、dCTP、dGTP、dTTPに結合させた。制限部分での比活
性は、約106cpm/pmoleであった。混合物を、55μｌの10
mMのトリス、1mMのEDTAでpH7.5、98℃、２分間の条件で
変性した。250mMのNaClを加えてから、50℃、１時間で
再生した。2.5倍の体積のエタノールを用いて、−20℃
で30分かけてDNAを沈殿させ、80％エタノールで洗い、
乾燥した。試料は0.01TBEブロモフェノール・ブルーで
処理した。白金の板電極（第15a図）上に３μｌ、13000
cpmで40滴を置いた。試料を陰極側の細管に浸してか
ら、接地した白金電極30（第15a図）に対して100Vの電
圧をかけて、２分間、電気泳動を行った。TBE緩衝液（8
5mMのトリス、85mMのホウ酸、2.5mMのEDTA、pH8.3）
は、高pH領域で高い緩衝能を有しているために、低い緩
衝液濃度（0.01・TBE）にもかかわらず、試料のアルカ
リ性は1pH単位以上増加しない（pH8.3から9.3）。この
ようにして、約50％の標識を付けた核酸がゲルによって
処理される。
塩基不適合）とホモ二重鎖とに代表される、標識を付け
たハイブリッド体混合物を、どのようにして分離したか
を以下に述べる。第２図および第３図の説明で述べた、
２本のクローン挿入体（野生型とIVS−１−６）は、Eco
R1/BamH1プラスミドの形で混合されていた（各々45n
g）。これに、放射性標識した挿入体を限界量（プラス
ミドに対して9nm）を混入した。放射性標識は、ポリメ
ラーゼＩ・クレノウ・フラグメントを用いて、32P−dAT
P、dCTP、dGTP、dTTPに結合させた。制限部分での比活
性は、約106cpm/pmoleであった。混合物を、55μｌの10
mMのトリス、1mMのEDTAでpH7.5、98℃、２分間の条件で
変性した。250mMのNaClを加えてから、50℃、１時間で
再生した。2.5倍の体積のエタノールを用いて、−20℃
で30分かけてDNAを沈殿させ、80％エタノールで洗い、
乾燥した。試料は0.01TBEブロモフェノール・ブルーで
処理した。白金の板電極（第15a図）上に３μｌ、13000
cpmで40滴を置いた。試料を陰極側の細管に浸してか
ら、接地した白金電極30（第15a図）に対して100Vの電
圧をかけて、２分間、電気泳動を行った。TBE緩衝液（8
5mMのトリス、85mMのホウ酸、2.5mMのEDTA、pH8.3）
は、高pH領域で高い緩衝能を有しているために、低い緩
衝液濃度（0.01・TBE）にもかかわらず、試料のアルカ
リ性は1pH単位以上増加しない（pH8.3から9.3）。この
ようにして、約50％の標識を付けた核酸がゲルによって
処理される。
細管としては、内径45mmのガラス製細管に５％のポリ
アクリルアミド・ゲルを充填したものを用いた。緩衝液
は、01TBE、4Mの尿素を用いた。第15b図には、本発明の
装置で電気泳動を行っているところを模式的に示した。
試料が泳動しはじめると、細管６の両端は、それぞれ10
0mlのバッファー溜め50に継なげられる。
アクリルアミド・ゲルを充填したものを用いた。緩衝液
は、01TBE、4Mの尿素を用いた。第15b図には、本発明の
装置で電気泳動を行っているところを模式的に示した。
試料が泳動しはじめると、細管６の両端は、それぞれ10
0mlのバッファー溜め50に継なげられる。
ａ）試料を空間的な勾配（T3＝30℃、T2＝70℃）によっ
て分離した。
て分離した。
表には、ホモ二重鎖の移動距離を、それぞれのヘテロ
二重鎖の移動距離と比較して得られた差をcm単位で示し
た。設定温度差は40℃から50℃で、実験上必要な信号の
分離が得られる。
二重鎖の移動距離と比較して得られた差をcm単位で示し
た。設定温度差は40℃から50℃で、実験上必要な信号の
分離が得られる。
ｂ）第13aからｄ図に示したような方法で、試料をT0側
に導き（Ｔ＝T237＝T3＝30℃）、4mmの温度T1の分離経
路で分離を行った。温度範囲（40＜T1＜50）でT1を通過
してきた試料だけが分離される。
に導き（Ｔ＝T237＝T3＝30℃）、4mmの温度T1の分離経
路で分離を行った。温度範囲（40＜T1＜50）でT1を通過
してきた試料だけが分離される。
本発明によれば、電気泳動の間、T1の温度レベルは直
線的に降下する。分解が起こって一本鎖になってしまう
温度（50℃）よりも、ほんの少しだけ低い温度T1に到達
した試料は、T1部分36（分離経路4mm）で分離して相対
距離が、1cm以上のバンドとなる。
線的に降下する。分解が起こって一本鎖になってしまう
温度（50℃）よりも、ほんの少しだけ低い温度T1に到達
した試料は、T1部分36（分離経路4mm）で分離して相対
距離が、1cm以上のバンドとなる。
静的な化学変性勾配システムでは作ることのできな
い、空間的な温度勾配と時間依存的な温度勾配との組合
せは、いくつかの応用面で、実用上極めて重要である。
二つの応用を、以下に例として挙げる。第16図は、これ
らを模式的に説明したものである。
い、空間的な温度勾配と時間依存的な温度勾配との組合
せは、いくつかの応用面で、実用上極めて重要である。
二つの応用を、以下に例として挙げる。第16図は、これ
らを模式的に説明したものである。
ａ）例えば、大きさが極端に異なるなどの理由で、本来
の移動速度が非常に違うフラグメント同志を、なんとか
一緒に分析することができる。速い移動速度を持つ小さ
なフラグメント60（フラグメントと、フラグメントに対
応するゲル上の位置は、小さなバーで表してある）は、
大きなフラグメント70が最初の変性が起こる温度に到達
するまでの間に、すでに、鎖の分離を起こしてしまう場
合がある。本発明によれば、最も安定な二重らせん部分
やG:C結合の分離が起こらないように高温T2を調整す
る。一方、電気泳動の間、温度T1を低温から着実に、最
大値T1＝T2になるまで上昇させる。このようにすれば、
どの分子も、移動速度や大きさに関係なく、温度勾配中
を移動して行くことができる。
の移動速度が非常に違うフラグメント同志を、なんとか
一緒に分析することができる。速い移動速度を持つ小さ
なフラグメント60（フラグメントと、フラグメントに対
応するゲル上の位置は、小さなバーで表してある）は、
大きなフラグメント70が最初の変性が起こる温度に到達
するまでの間に、すでに、鎖の分離を起こしてしまう場
合がある。本発明によれば、最も安定な二重らせん部分
やG:C結合の分離が起こらないように高温T2を調整す
る。一方、電気泳動の間、温度T1を低温から着実に、最
大値T1＝T2になるまで上昇させる。このようにすれば、
どの分子も、移動速度や大きさに関係なく、温度勾配中
を移動して行くことができる。
ｂ）第16bおよびｃ図に模式的に示した再生実験では、
空間的なだけの温度勾配のみを通過させたのでは、鮮明
なバンドを得ることができない。この場合、実際、バン
ド幅の拡がりが起こってしまい、変性曲線が急激であれ
ばあるほど、より測定の妨げになる。この時、バンドの
先端部では、低温の部分があるので、後端部に比べて強
く加速される。結果として、ぼやけたバンドになってし
まう。反対に、バンドの移動方向の先端が比較的高温で
移動する場合が、非常に望ましい。これは、本発明によ
る、空間的な温度勾配と時間的な温度勾配とを組合せた
再生実験で達成することができる。第１図に示したよう
な装置を用いて直線的な温度勾配で再生を行うかわり
に、時間的t0からt3（第16bおよびｃ図）の間に、T1とT
2（第10図）の間で相対的に増加する温度勾配で、電気
泳動をして分析する。このとき、T1とT2の両方一緒に
（第16b図）、またはT1だけ（第16c図）でも、比較的短
い移動時間の試料が低温に曝されるように温度を下げな
くてはならない。ただし、バンドの先端は、後端に比べ
て、いつも高い温度になっていなくてはならない。この
ように、本発明によってバンドを鮮明にすることができ
る。
空間的なだけの温度勾配のみを通過させたのでは、鮮明
なバンドを得ることができない。この場合、実際、バン
ド幅の拡がりが起こってしまい、変性曲線が急激であれ
ばあるほど、より測定の妨げになる。この時、バンドの
先端部では、低温の部分があるので、後端部に比べて強
く加速される。結果として、ぼやけたバンドになってし
まう。反対に、バンドの移動方向の先端が比較的高温で
移動する場合が、非常に望ましい。これは、本発明によ
る、空間的な温度勾配と時間的な温度勾配とを組合せた
再生実験で達成することができる。第１図に示したよう
な装置を用いて直線的な温度勾配で再生を行うかわり
に、時間的t0からt3（第16bおよびｃ図）の間に、T1とT
2（第10図）の間で相対的に増加する温度勾配で、電気
泳動をして分析する。このとき、T1とT2の両方一緒に
（第16b図）、またはT1だけ（第16c図）でも、比較的短
い移動時間の試料が低温に曝されるように温度を下げな
くてはならない。ただし、バンドの先端は、後端に比べ
て、いつも高い温度になっていなくてはならない。この
ように、本発明によってバンドを鮮明にすることができ
る。
本発明による方法および装置は、材料混合物から成分
を調製するだけでなく、定性分析や定量分析にも用いる
ことができる。分析や調製は、多数の試料を同時に行う
ことができ、検出や評価は自動的に行うことができる。
特に、本発明の方法と装置は、ウイロイド、ビールス核
酸およびサテライトRNAの分析と調製、核酸の突然変異
の分析、蛋白質の突然変異の分析、および、核酸と蛋白
質との複合体の分析に適している。
を調製するだけでなく、定性分析や定量分析にも用いる
ことができる。分析や調製は、多数の試料を同時に行う
ことができ、検出や評価は自動的に行うことができる。
特に、本発明の方法と装置は、ウイロイド、ビールス核
酸およびサテライトRNAの分析と調製、核酸の突然変異
の分析、蛋白質の突然変異の分析、および、核酸と蛋白
質との複合体の分析に適している。
TGGEプローブは変異体の調製に、特に有利であり、予
めクローン化することなく、直接、変異体の配列を行う
ことが可能である。すなわち、酵素によって増幅、配列
した、特定の極めて少量の突然変異体を溶離すること
で、上記のようなことが可能になる。増幅に用いるベク
ター、組換え生命体などの利用が、安全措置のために妨
げられているので、このような方法は、将来、重要なも
のとなるであろう。
めクローン化することなく、直接、変異体の配列を行う
ことが可能である。すなわち、酵素によって増幅、配列
した、特定の極めて少量の突然変異体を溶離すること
で、上記のようなことが可能になる。増幅に用いるベク
ター、組換え生命体などの利用が、安全措置のために妨
げられているので、このような方法は、将来、重要なも
のとなるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ａ ３１５Ｚ (72)発明者 シュテガー、ゲールハルト ドイツ連邦共和国、デュッセルドルフ、 １ デー―4000、オプラデネル・シュト ラーセ、102 (56)参考文献 特開 昭63−27744（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−203053（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−130000（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−300（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−98499（ＪＰ，Ａ) Ｎｕｃ．Ａｃｄ．Ｒｅｓ．，18（９) 2699−2705（1990) Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，10 377−389（1989) Ｍｕｔａｎｔ Ｒｅｓ．，202（１) 77−83（1988) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 27/447 B01D 57/02 C07H 21/04 C12M 1/34 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (67)
- 【請求項１】材料混合物の成分を、温度勾配ゲル電気泳
動（TGGE）によって分離、検出する方法であって、 −空間的に離れた少なくとも二つの温度レベルによっ
て、分離に用いられる電解方向に空間的な温度勾配を形
成するか、または、 −全時間にわたって温度レベルを変化させることによっ
て、時間的な温度勾配を形成するか、あるいは、 −空間的な温度勾配と時間依存的な温度勾配とを組合せ
て、時間的な温度勾配を形成し、 −その温度勾配を、伝導手段によってゲル・マトリック
スに伝え、 −調節可能な加熱もしくは冷却装置によって、電位が等
しい位置で同一の温度を持つ空間的な温度勾配が形成さ
れるように温度レベルを調節するか、または、 −ひとつまたは複数の調節可能な加熱もしくは冷却装置
を用いて、分離媒体中の分離経路の各点で時間的な温度
勾配が形成されるように、時間依存的に温度レベルを調
節することを含む分離、検出方法。 - 【請求項２】電気泳動中に混合物成分が分離媒体を通過
して分離する時間よりも、温度変化が起こる時間の方が
短いことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】温度が平衡に達するまでの時間、電気泳動
のスイッチを切ることを特徴とする請求項１または２に
記載の方法。 - 【請求項４】温度が０℃から100℃の範囲で調節可能で
あることを特徴とする請求項１から３の一つに記載の方
法。 - 【請求項５】温度レベルの温度調節を、温度制御された
液浴、ペルチエ加熱素子、もしくは電気的加熱装置によ
って行うことを特徴とする請求項１から４の一つに記載
の方法。 - 【請求項６】分離媒体が、円筒状の中空体の中、もしく
は水平な支持体上に配置されていることを特徴とする請
求項１から５の一つに記載の方法。 - 【請求項７】分離媒体が、ガラスまたはプラスチック製
の管内に配置されているか、もしくは前記水平な支持体
が、フィルムをその上に設けてある金属板であることを
特徴とする請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】成分の検出が、自動的に行われることを特
徴とする請求項１から７の一つに記載の方法。 - 【請求項９】分離される成分が、電荷を有する生体高分
子であることを特徴とする請求項１から８の一つに記載
の方法。 - 【請求項１０】分離される成分が、核酸もしくは蛋白質
であることを特徴とする請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】電気泳動が、高分子媒体構造物、好まし
くはポリアクリル・アミドの分離媒体、もしくは支持体
のない媒体中で行われることを特徴とする請求項１から
10の一つに記載の方法。 - 【請求項１２】核酸の突然変異の定性的および定量的分
析方法であって、分析対象の突然変異を有する（突然変
異体）核酸フラグメントと突然変異を有していない（野
生型）核酸フラグメントとのハイブリダイゼーションに
よって、熱力学的に不安定な領域に突然変異が位置する
ように形成されたヘテロ二重鎖を分析することを特徴と
する分析方法。 - 【請求項１３】突然変異を有する、熱力学的に不安定な
領域を、計算によって選択することを特徴とする請求項
12に記載の方法。 - 【請求項１４】検査する核酸フラグメントを、突然変異
が熱力学的に最も不安定な領域に位置するように設計す
ることを特徴とする請求項12および／または13の一つに
記載の方法。 - 【請求項１５】核酸フラグメントの、熱力学的に比較的
安定な領域に、末端オリゴＧおよび／またはオリゴＣヌ
クレオチドが存在することを特徴とする請求項12から14
の一つに記載の方法。 - 【請求項１６】Ｇおよび／またはＣクヌレオチドの数が
20から30であることを特徴とする請求項15に記載の方
法。 - 【請求項１７】核酸が、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
によって増幅されることを特徴とする請求項12から16の
一つに記載の方法。 - 【請求項１８】用いる二本のオリゴヌクレオチドがハイ
ブリッド形成して、隣接した近傍で増幅されたDNAを形
成することを特徴とする請求項12から17の一つに記載の
方法。 - 【請求項１９】試料を調製した後、温度勾配ゲル電気泳
動（TGGE）によってヘテロ二重鎖を検査することを特徴
とする請求項12から18の一つに記載の方法。 - 【請求項２０】温度勾配が、電界方向に対して垂直な方
向に形成されていることを特徴とする請求項19に記載の
方法。 - 【請求項２１】温度勾配が、電界方向に対して平行な方
向に形成されていることを特徴とする請求項19に記載の
方法。 - 【請求項２２】温度勾配が、時間によって変動すること
を特徴とする請求項21に記載の方法。 - 【請求項２３】温度勾配が、ヘテロ二重鎖の熱力学的に
不安定な領域の融点よりも高い温度レベルにある電界の
陰極側から始まっていて、陽極側の低い温度レベルを調
節することで時間制御されることを特徴とする請求項22
に記載の方法。 - 【請求項２４】静的な温度勾配の陽極側の温度レベル
が、陰極側の温度レベルよりも高いことを特徴とする請
求項21に記載の方法。 - 【請求項２５】静的な温度勾配の陰極側の温度レベル
が、陽極側の温度レベルよりも高いことを特徴とする請
求項21に記載の方法。 - 【請求項２６】５′−末端にヒスチジン残基もしくはビ
オチニル残基から選ばれる親和性基をを有するオリゴヌ
クレオチド。 - 【請求項２７】２から８個のヒスチジン残基が５′−末
端の親和性基であることを特徴とする請求項26に記載の
オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２８】ヒスチジン残基の数が６個であることを
特徴とする請求項27に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２９】ビオチニル残基が５′−末端の親和性基
であることを特徴とする請求項26に記載のオリゴヌクレ
オチド。 - 【請求項３０】さらに、制限領域および／またはG/C高
含有部および／またはA/T高含有部、および、検査する
核酸の塩基配列とハイブリッド形成をする塩基配列を有
することを特徴とする請求項26から29の一つに記載のオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項３１】請求項26から30の一つに記載したオリゴ
ヌクレオチドを用いることを特徴とする、検査する核酸
を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応および／または
請求項12から25の一つに記載した方法。 - 【請求項３２】突然変異を有する核酸を、請求項26から
30の一つに記載したオリゴヌクレオチドを用いて増幅
し、請求項26から30の一つに記載したオリゴヌクレオチ
ドの親和性基に対して親和性を持っていて、固相に固着
している材料に連結させてから、もし必要であれば、標
識を付けた、突然変異を有していない核酸の一本鎖また
は二本鎖とともに、少なくとも１回の変性／再生サイク
ルを行い、溶離させた後に、分離操作を行うことを特徴
とする請求項12から25の一つに記載の方法。 - 【請求項３３】請求項26に記載したオリゴヌクレオチド
の親和性基に対して親和性を持っている材料が、キレー
ト試薬遷移金属からなるキレートを有する高分子支持体
であることを特徴とする請求項32に記載の方法。 - 【請求項３４】オリゴヌクレオチドの親和性基に対して
親和性を持っている材料が、高分子支持体であり、該高
分子支持体が、２価ニッケルと該支持体とに共有結合し
ているニトリロトリ酢酸のキレートを有していることを
特徴とする請求項33に記載の方法。 - 【請求項３５】請求項26から30の一つに記載したオリゴ
ヌクレオチドの親和性基に対して親和性を持っている材
料が、アビヂンまたはストレプタビヂンとの共有結合を
有する高分子支持体であることを特徴とする請求項32に
記載の方法。 - 【請求項３６】高分子支持体が、膜もしくは粒子状の材
料であることを特徴とする請求項32から35の一つに記載
の方法。 - 【請求項３７】点変異、欠失、挿入、および核酸鎖の再
配列などのDNAもしくはRNAの突然変異を発見、研究する
ために用いることを特徴とする請求項12から25および／
または請求項32から36の一つに記載の方法。 - 【請求項３８】生きた、または死んだ化石の組織、およ
び生体内では、もはや代謝活性でない組織から採取され
た試料を用いることを特徴とする請求項12から25および
／または32から36の一つに記載の方法。 - 【請求項３９】法廷分析、遺伝病の解明および／または
遺伝的特徴を持つ奇形、指紋のような個人の同定分析な
どに利用する遺伝子研究のために行なうことを特徴とす
る請求項12から25および／または請求項32から36の一つ
に記載の方法。 - 【請求項４０】工業的に利用される微生物、医学的に重
要な病原体、ビールス、特に、突然変異を起こし易いも
のとして知られているビールス、バクテリア、菌類、原
生動物の系統を詳細に調べるために行なうことを特徴と
する請求項12から25および／または請求項32から36の一
つに記載の方法。 - 【請求項４１】環境開発の研究のために行うことを特徴
とする請求項12から25および／または請求項32から36の
一つに記載の方法。 - 【請求項４２】検出器中で突然変異体に単一バンドを形
成させて、直接もしくは電位勾配の方向を変化させる電
気溶離によって単離し、直接にPCR−増幅するか、もし
くは直接に配列および／またはクローン化することで発
見した突然変異を調製するために行なうことを特徴とす
る請求項12から25および／または請求項32から36の一つ
に記載の方法。 - 【請求項４３】遺伝子的に増幅した遺伝子断片、特にゲ
ノムの単転写領域の断片を、均一な標準断片とハイブリ
ッド形成させか、対応する個人を同定するのに用いるDN
Aの均一な配列断片とハイブリッド形成させて、同様な
方法によって遺伝子的に増幅して個人の同定を行うため
に用いることを特徴とする請求項12から25および／また
は請求項32から36の一つに記載の方法。 - 【請求項４４】試薬と、一つまたはそれ以上の標識され
た核酸プローブ、標識されていない部分的もしくは完全
に相同な標準核酸、および０から100℃の温度範囲で二
重鎖構造の変性と再生を行うことのできるハイブリッド
緩衝液との混合物からなるものを用いることを特徴とす
る請求項12から25および／または請求項32から36の一つ
に記載の方法。 - 【請求項４５】少なくとも一つの標識された核酸プロー
ブと、標識されていない部分的もしくは完全に相同な標
準核酸、および０から100℃の温度範囲で二重鎖構造の
変性と再生を行うことのできるハイブリッド緩衝液との
混合物からなることを特徴とする請求項12から25および
／または請求項32から36の一つに記載の方法を実施する
ための手段。 - 【請求項４６】混合物が請求項32から36の一つに記載さ
れた固相の担体を含み、増幅された断片が反応混合物か
ら直接回収できるようにされていることを特徴とする請
求項45の手段。 - 【請求項４７】突然変異、もしくは特定の遺伝子の塩基
配列を定量分析する方法であって、一つの濃度が既知の
異った配列の混合物中に、前記異った配列の一つと同じ
配列の、標識した核酸分子を少量加え、得られた混合物
を、少なくとも一回の変性／再生サイクルを行ってから
分析することを特徴とする方法。 - 【請求項４８】標識した核酸分子の配列が、濃度が既知
の核酸の配列と同じであることを特徴とする請求項47の
方法。 - 【請求項４９】変性／再生サイクルの後に形成されたハ
イブリッド体を、温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）によっ
て分離して、分離した各々の成分の相対信号強度を測定
することを特徴とする請求項47および／または48の方
法。 - 【請求項５０】分析する核酸が、酵素による増幅で得ら
れたものであることを特徴とする請求項47から49の一つ
に記載の方法。 - 【請求項５１】温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）を実施す
る装置であって、二つより多くの加熱もしくは冷却装置
によって温度勾配を形成する、熱溜め（4,5）を有する
少なくとも二つの加熱もしくは冷却装置（1,2）があ
り、最も離れた加熱もしくは冷却装置の間に、中空体
（６）が前記加熱もしくは冷却装置を貫いて配置され、
この中空体内部に分離に用いられる分離媒体が充填され
ていて、さらに、この中空体（６）が、少なくとも一つ
の加熱および／または冷却装置（1,2）と熱伝導するよ
うにされた熱伝導性の温度制御用カバー（７）で覆われ
ていることを特徴とする装置。 - 【請求項５２】中空体（６）が円筒形であることを特徴
とする請求項51の装置。 - 【請求項５３】中空体（６）が細管であることを特徴と
する請求項51および／または52の装置。 - 【請求項５４】中空体（６）の外壁と温度制御用カバー
（７）の内壁との間に、熱交換材（８）が配置されてい
ることを特徴とする請求項51から53の一つに記載の装
置。 - 【請求項５５】熱交換材が粘性の高い液体からなってい
ることを特徴とする請求項54に記載の装置。 - 【請求項５６】加熱もしくは冷却装置が、温度制御され
た液浴およびペルチエ加熱素子（９）または電気加熱器
および／または熱溜め（４、５）を有していることを特
徴とする請求項51から55の一つに記載の装置。 - 【請求項５７】温度制御用カバー（７）が、すべての加
熱もしくは冷却装置（１、２）と熱伝導が起こるように
連結されていることを特徴とする請求項51から56の一つ
に記載の装置。 - 【請求項５８】第三の加熱もしくは冷却装置（３）が、
試料導入側に設けられていることを特徴とする請求項51
から57の一つに記載の装置。 - 【請求項５９】温度制御用カバー（７）が、第二の加熱
もしくは冷却装置（２）から熱的に分離されていること
を特徴とする請求項58に記載の装置。 - 【請求項６０】加熱もしくは冷却装置（１、２）が、時
間制御できることを特徴とする請求項51から59の一つに
記載の装置。 - 【請求項６１】対応する熱溜め（４、５）を有する加熱
もしくは冷却装置（１、２）が数の中空体（６）に適用
するようにされている装置であって、装置（１、２）と
（４、５）がブロック（4a、5a）の形にされており、中
空体（６）が貫き通って配置されるように多数の穴（1
1）があけられていることを特徴とする請求項51から60
の一つに記載の装置。 - 【請求項６２】中空体（６）の両端が、ブロック（4a、
5a）の形にされている装置から突き出していることを特
徴とする請求項61に記載の装置。 - 【請求項６３】温度勾配の温度範囲内で、少なくとも一
つの成分が熱変形を起こす混合物試料を分析するための
請求項51から60の一つに記載の装置。 - 【請求項６４】請求項１から62の一つに記載の方法を実
施するための請求項51から62の一つに記載の装置。 - 【請求項６５】ウイロイド、ビールス核酸およびサテラ
イトRNAの検出と識別、核酸の突然変異の分析、蛋白質
の突然変異の分析、および核酸と蛋白質との複合体の分
析に用いるための請求項51から62の一つに記載の装置。 - 【請求項６６】分離する混合物試料の成分の調製に用い
るための請求項51から62の一つに記載の装置。 - 【請求項６７】ウイロイド、ビールス核酸およびサテラ
イトRNAの調製、ホモーおよびヘテロ二重鎖の突然変異
した核酸の調製、蛋白質の突然変異の調製、および核酸
と蛋白質との複合体の調製に用いるための請求項51から
62の一つに記載の装置。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3927467.5 | 1989-08-19 | ||
| DE3927467A DE3927467C2 (de) | 1989-08-19 | 1989-08-19 | Vorrichtung und Verwendung einer Vorrichtung zur Trennung und und Detektion von Komponenten eines Stoffgemisches durch Temperaturgradienten-Gelelektrophorese |
| DE4006974A DE4006974A1 (de) | 1990-03-06 | 1990-03-06 | Verfahren zur detektion von mutationen von nukleinsaeuren |
| DE4006974.5 | 1990-03-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05503351A JPH05503351A (ja) | 1993-06-03 |
| JP3124969B2 true JP3124969B2 (ja) | 2001-01-15 |
Family
ID=25884190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02511457A Expired - Lifetime JP3124969B2 (ja) | 1989-08-19 | 1990-08-18 | 温度勾配ゲル電気泳動による混合物成分の分離・検出方法および装置 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0486580B1 (ja) |
| JP (1) | JP3124969B2 (ja) |
| AT (1) | ATE145010T1 (ja) |
| DE (1) | DE59010560D1 (ja) |
| WO (1) | WO1991002815A1 (ja) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03296657A (ja) * | 1990-04-13 | 1991-12-27 | W R Grace & Co | 電気泳動用支持体およびそれを用いた電気泳動法 |
| US5196099A (en) * | 1990-04-13 | 1993-03-23 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Electrophoretic matrix and electrophoresis using same |
| GB9116042D0 (en) * | 1991-07-24 | 1991-09-11 | Royal Free Hosp School Med | Diagnostic method |
| DE69233285T2 (de) * | 1991-08-02 | 2004-11-25 | bioMérieux B.V. | Quantifikation von Nukleinsäuren |
| DE4234086A1 (de) * | 1992-02-05 | 1993-08-12 | Diagen Inst Molekularbio | Verfahren zur bestimmung von in vitro amplifizierten nukleinsaeuresequenzen |
| CA2157373C (en) * | 1993-03-05 | 2005-06-07 | Janusz B. Pawliszyn | Method and device for isoelectric focusing without carrier ampholytes |
| IT1271005B (it) * | 1994-09-12 | 1997-05-26 | Pier Giorgio Righetti | Separazione di acidi nucleici per elettroforesi capillare in gradienti termici e in soluzioni viscose di polimeri |
| GB9502660D0 (en) * | 1995-02-10 | 1995-03-29 | Univ London | Detection of mutations or variations in DNA |
| EP0871873A1 (en) * | 1995-06-06 | 1998-10-21 | Beltronics, Inc. | Automatic protein and/or dna analysis system and method |
| EP0863998A4 (en) * | 1995-11-03 | 2002-09-25 | Naxcor | ANALYSIS OF POLYMORPHISMS IN DOUBLE-STRANDED INFORMATION |
| GB9614477D0 (en) | 1996-07-10 | 1996-09-04 | Oxford Glycosystems Ltd | Assay |
| WO1998054363A1 (en) * | 1997-05-30 | 1998-12-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Application of helix-random chain thermodynamics to nucleic acid analysis |
| WO1999066078A1 (en) * | 1998-06-18 | 1999-12-23 | Mosaic Technologies | Denaturing gradient affinity electrophoresis and methods of use thereof |
| AU2001249829A1 (en) * | 2000-04-05 | 2001-10-23 | Iowa State University Research Foundation Inc. | High-throughput detection of unknown dna mutations by using multiplexed capillary electrophoresis |
| JP4527841B2 (ja) * | 2000-04-25 | 2010-08-18 | 国立大学法人埼玉大学 | ゲノムプロフィリング画像から特徴点を抽出する方法、並びに該方法で得られた特徴点群を用いた遺伝子型による種同定方法および類縁性同定方法 |
| EP1320745A4 (en) | 2000-09-01 | 2008-10-01 | Applera Corp | SYSTEM AND METHOD FOR TEMPERATURE GRADIENT CAPILLARY ELECTROPHORESIS |
| DE60039792D1 (de) * | 2000-10-23 | 2008-09-18 | Ingeny Holding Bv | Verfahren und gerät zum nachweis von mutationen in nukleinsäureproben |
| US6872530B2 (en) | 2002-04-24 | 2005-03-29 | Spectrumedix, Llc | Method for determining the presence of DNA variants using peptide nucleic acid probes |
| US7303879B2 (en) | 2003-07-31 | 2007-12-04 | Applera Corporation | Determination of SNP allelic frequencies using temperature gradient electrophoresis |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE48850T1 (de) * | 1985-03-21 | 1990-01-15 | Molecular Diagnostics Inc | Spezifische jodierung von nukleinsaeure. |
| GB2173125B (en) * | 1985-04-04 | 1989-04-19 | Mueszeripari Muevek Lab | Apparatus for overpressured thin-layer chromatographic technique |
| CA1304886C (en) * | 1986-07-10 | 1992-07-07 | Heinz Dobeli | Metal chelate resins |
| US4898658A (en) * | 1987-11-25 | 1990-02-06 | Northeastern University | Integrated temperature control/alignment system for high performance capillary electrophoretic apparatus |
-
1990
- 1990-08-18 AT AT90912431T patent/ATE145010T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-08-18 EP EP90912431A patent/EP0486580B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-18 JP JP02511457A patent/JP3124969B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-18 WO PCT/EP1990/001366 patent/WO1991002815A1/de active IP Right Grant
- 1990-08-18 DE DE59010560T patent/DE59010560D1/de not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１０ ３７７−３８９（１９８９） |
| Ｍｕｔａｎｔ Ｒｅｓ．，２０２（１）７７−８３（１９８８） |
| Ｎｕｃ．Ａｃｄ．Ｒｅｓ．，１８（９）２６９９−２７０５（１９９０） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59010560D1 (de) | 1996-12-12 |
| EP0486580A1 (de) | 1992-05-27 |
| ATE145010T1 (de) | 1996-11-15 |
| EP0486580B1 (de) | 1996-11-06 |
| WO1991002815A1 (de) | 1991-03-07 |
| JPH05503351A (ja) | 1993-06-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3124969B2 (ja) | 温度勾配ゲル電気泳動による混合物成分の分離・検出方法および装置 | |
| US5795720A (en) | Process and device for the separation and detection of components of a mixture of materials by temperature gradient gel electrophoresis | |
| US6596487B2 (en) | Mutation detection using denaturing gradients | |
| Tian et al. | Single-strand conformation polymorphism analysis by capillary and microchip electrophoresis: a fast, simple method for detection of common mutations in BRCA1 and BRCA2 | |
| Cheng et al. | Analysis of ligase chain reaction products amplified in a silicon-glass chip using capillary electrophoresis | |
| EP1645628A1 (en) | Nanopore separation devices for biopolymers | |
| AU760236B2 (en) | Denaturing gradient affinity electrophoresis and methods of use thereof | |
| US6020126A (en) | Rapid genetic screening method | |
| JP2005519642A (ja) | ４次元パラメーターを用いたｄｎａチップ上での核酸ハイブリダイゼーションを検出するための方法及び装置 | |
| US7501284B2 (en) | Apparatus and method for specific release of captured extension products | |
| US5618671A (en) | Method and system for molecular-biological diagnostics | |
| US6599704B2 (en) | Method for detecting mutated alleles | |
| Righetti et al. | Recent advances in capillary electrophoresis of DNA fragments and PCR products | |
| US7049070B2 (en) | Materials and methods for detection and characterization of nucleic acid sequence variability | |
| JP3186259B2 (ja) | キャピラリー電気泳動法を用いた遺伝子多型解析方法および解析装置 | |
| JP4445611B2 (ja) | 反復配列の多型分析用装置 | |
| O’Connell et al. | Renewable standard reference material for the detection of TP53 mutations | |
| JP4320188B2 (ja) | 一塩基置換検出方法及び一塩基置換検出用キット | |
| Righetti et al. | Gene dosage in capillary electrophoresis: prenatal diagnosis of Down’s syndrome and Rh D/d genotyping | |
| Gelfi et al. | Point mutation detection by temperature-programmed capillary electrophoresis | |
| JP2009517074A (ja) | 核酸配列変化の検出 | |
| Gupta et al. | Gel-based nonradioactive single-strand conformational polymorphism and mutation detection: limitations and solutions | |
| Rhighetti et al. | Nucleic Acids | |
| Righetti et al. | Gene Dosage in Capillary Electrophoresis | |
| Strickson et al. | Mutation Analysis of Cancer Using Automated Sequencing |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071027 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081027 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081027 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091027 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101027 Year of fee payment: 10 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |