JPH05503351A - 温度勾配ゲル電気泳動による混合物成分の分離・検出方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 温度勾配ゲル電気泳動による 混合物成分の分離・検出方法および装置本発明は、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧ ＧＥ）による混合物成分の分離・検出方法に関する。特に、本発明は、突然変異 を起こした（突然変異体）核酸フラグメントと突然変異を起こしていない（野生 型）核酸フラグメントとのハイブリッド形成によって生じたヘテロ二重鎖の分析 による核酸フラグメントの突然変異の検出方法、オリゴヌクレオチドそれ自身と そのオリゴヌクレオチドを用いた試料の調製方法、および温度勾配ゲル電気泳動 を行う装置に関するものである。

遺伝物質の突然変異を検出したり、あるいは遺伝的な突然変異による表現型の発 現を検出することは、生物学の研究、医学面での応用、生物工学による生産、あ るいは犯罪学といった多くの分野において重要な分析目標である。遺伝子のレベ ルでは、突然変異とは、少な（とも一つのヌクレオチドまたは塩基対がＤＮＡあ るいはＲＮＡのレベルで交換するということである。ハイブリッド形成あるいは シーフェンス技術を用いた、いわゆる「遺伝子工学」の潜在力は、クローンＤＮ ＡまたはＲＮＡの突然変異を検出することを可能とする。しかしながら、このよ うな技術は研究開発に関連した用途に限られている。経常的な用途に用いるには 、免疫学的方法（ＥＬＩＳＡなど）に匹敵するほどの技術的基準を達成すること ができなかった。

ＤＥ−Ｏ３３６２２５９１に記載されている温度勾配ゲル電気泳動性（ＴＧＧＥ ）は、核酸あるいは蛋白質といった生物学的巨大分子の僅かな構造的な差異や特 徴を検出する方法である。しかしながら、この技術は、例えば、遺伝子病の分析 といった臨床分野や法廷での分析で、個々の試料を数多く測定するのに必要とさ れる自動化分析には不向きである。ＴＧＧＥ技術を用いることによって、面倒な 特異ハイブリッド形成を行なうことなしに、突然変異を明らかにすることが可能 となった（Ｒｉｅｓｎｅｒほか、　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ第１０巻３ ７７−３８９頁）けれども、この技術は、研究分析用のフラット・ベッド型ゲル 電気泳動でのみ行なわれている。また、これと同様な結果は、フラット・ベッド 型ゲル電気泳動と化学変性勾配とを組み合せても得られるが、再現性のある形で 化学変性勾配を形成することができないので、自動化は問題外である。

たとえ単一の突然変異でも、ＴＧＧＥによって高感度で検出するためには、電気 泳動が進行する方向に対して垂直な方向、すなわち、電位の等しい位置のゲルが 均一な温度となっている必要がある。例えば、このことは、Ｄ、Ｒ，Ｔｈａｔｃ ｈｅｒおよびＢ、　Ｈｏｄｓｏｎ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９７巻１ ０５−１０９頁に述べられているダブル・サイド・サーモスタット垂直電気泳動 を用いたのでは、充分に実現することができない。それは、互いに向い合うサー モスタット板が熱的に不充分な連絡しかしないために、電位が等しい位置で固有 の温度を持つことができないからである。

生体の特徴の発現は、ＲＮＡあるいはＤＮＡ鎖状分子によって構成される核酸の 形で、遺伝子レベルでプログラムされている。遺伝情報の変更は突然変異と呼ば れ、進化論的な発展、遺伝的要因によって起こる病気、他の遺伝的要因によって 起こるビールスおよび他の生命体の生物学的な性質の基礎となるものである。

発生する突然変異のほとんどは、システム全体に特に目立った変化を与えるもの ではない。このような突然変異は中立と呼ばれる。遺伝子工学の技術が導入され て以来、突然変異を発見すること、いつそれが起こったかを決定すること、およ び、それの生体機能への影響を測定することが可能となってきた。

塩基配列の比較分析技術（シーフェンス技術）を用いて、相同塩基配列を分析す ることで、突然変異を″［＋１することができる。突然変異という術語は、一つ のヌクレオチドの交換、一つから多数に至るヌクレオチドの欠失または挿入を意 味する。近年の大きな進歩にもかかわらず、塩基配列の分析は高価な装置を必要 とする賢用のかかる技術であり、経営的な分析には適していない。ただ、例えば 、α−１−アンチトリプシン欠失［Ｕ、Ｊ、　Ｋｉｄｄ、　Ｒ，Ｂ、　Ｗａｌｌ ａｃｅ、　Ｋ、　Ｈａｋｕｒａ、　Ｓ、Ｌ、Ｃ。

■ｏｏ、　Ｎａｔｕｒｅ　３０４　（１９８３１］のような特定の遺伝子病とし て知られている突然変異の検出だけが、合成オリゴヌクレオチドの利用によって 技術的に簡単になってきた。しかしながら、研究によって生じる問題の多くは１ 例えば、制限フラグメント長の冬型現象（ＲＦＬＰ）と関連しない長い遺伝子部 分に生じた未知の突然変異の検出とか、医学的遺伝学、集団分析、進化関係分析 、ビールス変異の分析などで重要な経常的な検査といったような実験的な方法で 解決することが、極めて難しい問題である。

核酸鎖（ＲＮＡおよびＤＮＡ）は、いわゆる相補的配列を持つ二重らせん構造を とることができ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡ二重 鎖構造を形成する。これらの構造の特徴的な性質は」鎖の温度依存変性（融解） である。融解は非常に狭い温度範囲で起こり、二重鎖構造の大きな部分が一段階 の反応で変性する。従って、この反応は、極めて協同的に進行する物理反応であ る。連続的な二重鎖構造が失われると、その核酸の移動度に明らかな変化が生じ る（はとんどの場合、移動度は減少する）。このような移動度の変化は、異なっ た融点を持つ核酸を分離するための電気泳動分離法に利用できる可能性がある。

つまり、熱力学的により不安定な核酸は、ゆっくりと動くために、安定な構造を 持つものよりも、遠（に動くことはない。そこで、分離に用いられる媒体には、 例えば、変性剤の濃度を増加させる等の方法で、変性勾配が造られていなければ ならない。塩基対の内部領域での安定性は、Ｇ／Ｃ含量と配列に依存している。

なお、これらの効果については詳細に研究されてきた［Ｓ、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ、 　Ｇ、ＷａｈｌＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ！１．１３８　（１９８４ ）　２６７−２８４　）。

ここで、突然変異によって注目する領域に充分な変化が起こったとすると、突然 変異が起こった核酸は、突然変異が起こらなかった核酸とは異なった融解の仕方 を示す。ところが、突然変異は５しばしば、たった一つの塩基対が弛のものと交 換することで起こる（トランスバージョン変異またはトランジション変異）。

従って、突然変異を起こした核酸鎖は、それ自身では極めて安定であり、−１１ ９に突然変異を起こしていないものと同じような温度で融解するため識別は不可 能である。しかしながら、このような突然変異は、突然変異を起こした核酸とそ の突然変異を起こしていない核酸（野生型）とを同程度の濃度で混合し、鎖の分 離を含む変性を行い、引き続いて再生することによって明らかににすることがで きる。このようにすることで、注目する核酸の一本鎖のあらゆる組合せが形成さ れ、突然変異を起こした一本鎖と突然変異を起こしていない一本鎖との、いわゆ るヘテロ二重鎖も形成される。さて、このようなヘテロ二重鎖のそれぞれのヌク レオチドは、突然変異の起きた部分で相補的なヌクレオチドを有していないため に、その近傍の二重らせん構造は顕著に不安定となる。従って、このようなヘテ ロ二重鎖は、野生型あるいは突然変異体二重鎖よりも、より迅速に融解する。

不都合なことに、従来の方法は操作が比較的面倒で、推定できる突然変異を、い つも発見出来るとは限らなかった。

従って、本発明が基礎とする技術的課題の一つは、ＴＧＧＥを経常的な分析操作 として実際に用いようとするときの問題を克服した方法を提供し、ＴＧＧＥを全 体として、扱い易いものとすることにある。さらに、自動ＴＧＧＥ測定が可能な 装置を提供する。この装置はまた、構造的に大きく異なる核酸を同時に分析する こともできる。もう一つ別の技術的課題は、特に、突然変異および／または変異 体遺伝子の定量的／定性的な検出の向上も目指すものである。さらにまた、特別 な！ｆｆｌによって、簡単で安全に試料の調製ができるような改良をすることに ある。

上記のような技術的課題は、請求項１に記載された下記の特徴を有する方法によ って解決される。すなわち、 一空間的に離れた少な（とも二つの温度レベルによって、分離に用いられる電解 方向に空間的な温度勾配を形成するか、または、−全時間にわたって温度レベル を変化させることによって、時間的な温度勾配を形成するか、あるいは、 一空間的な温度勾配と時間依存的な温度勾配とを組合せて、時間的な温度勾配を 形成し、 −その温度勾配を、伝導手段によってゲル・マトリックスに伝え、−調節可能な 加熱もしくは冷却装置によって、電位が等しい位置で固有の温度を持つ空間的な 温度勾配が形成されるように温度レベルを調整するか、または、−場合によって は、一つまたは複数の調節可能な加熱もしくは冷却装置を用いて１分離媒体中の 分離経路の各点で時間的な温度勾配が形成されるように、時間依存的に温度レベ ルを調整し、可能であれば一分離経路の末端で分離された成分を検知する。

本発明に従う方法の有用な態様はサブクレームに記載されている。請求項１２の 方法は、核酸の突然変異を定量的かつ定性的に検知するのに好ましい態様に関す るものである。すなわち、突然変異を起こした（突然変異体）核酸フラグメント と突然変異を起こしていない（野生型）核酸フラグメントと検査しようとする核 酸フラグメントとでハイブリッド形成を行なって得られる、熱力学的に不安定な 領域に突然変異が位置するようにされたヘテロ二重鎖を分析する。さらに、請求 項１３から３６は、この方法の好ましい態様に関するものである。

請求項４７から５０の方法は、核酸の定量分析が可能な定量検査の特殊な態様に 関するものである。サブクレーム４８から５０は、この方法の好ましい態様であ る。

装置についての請求項５１には、温度勾配ゲル電気泳動を行う装置が記載されて いる。この装置は、二つ以上の加熱もしくは冷却装置によって温度勾配を形成す るための、熱溜め（４，５）を有する少なくとも二つの加熱もしくは冷却装置Ｃ １，２）があり、最も離れた加熱もしくは冷却装置の間に、中空体（６）が前記 加熱もしくは冷却装置を貫いて配置され、この中空体内部に分離に用いられる分 離媒体が充填されていて、さらに、この中空体（６）が熱伝導性の温度制御用カ バー（７）で覆われていることを特徴としている。

サブクレーム５２から６２は、上記装置の好ましい態様である。これらの利点に ついて以下に記載する。

本発明の方法の空間的な温度勾配は、以下のようにして形成してもよい。すなわ ち、調節可能な加熱もしくは冷却装置を用いて、試料側を特定の温度レベルに調 整し、次に、空間的に離れた温度レベルを反対側の電気泳動槽の温度で決定する 。このような簡単な操作は、電気泳動槽を温度が一定になるように配置すれば可 能となる。そのようにするには、電気泳動槽を充分に太き（する必要がある。

しかしまた、第二の温度レベルも、例えば、ベルチェ素子、加熱ワイヤー、ある いはサーモスタットを付けた湯浴などによって調節できるようにしてしておくこ とが好ましい。

試料を加えると、分離しようとする混合物成分は、分離媒体中を電界方向に移動 して行く。それらが最初の温度レベルに到達すると構造転換を起こし、移動速度 が激減する。この効果は、温度を調整することでも、また、部分的に変性を起こ させる変性剤と組合せることでも起こすことができる。例えば、分離する成分が 核酸であった場合、二重鎖の一部は部分的な変性によって巻かれ、大きなループ を形成するため、分離媒体中で事実上動けなくなり、もはや、それ以降の電気泳 動が出来なくなる。ここで、温度を下げると、ループになった部分は、その部分 の熱力学的安定性に応じて再生され、分離媒体中での核酸の移動度は再び増加す る。この温度は、それぞれの核酸に特徴的なものである。このようにして、温度 によって、異なる成分の分離を行うことが出来る。移動度の増した分子は分離経 路を移動して行き、電気泳動ターゲット・ボールで検出することが出来る。

同様にして、電気泳動方向に温度が増加する温度勾配を形成することも可能であ る。この温度勾配では、最初、分子は、各々に固有の熱力学的、部分的な融解の 仕方に応じて分離媒体中で分離する。低温では、熱力学的に最も不安定な構造が 最初に、一部、熱変性する。例えば、核酸ではループ部分が形成される。これら の核酸の移動度は劇的に減少し、分離媒体中で「引っ掛かって」しまったり、あ るいは、少なくとも、ずっと遅くなったりする。他の成分は、各々に固有の変性 が起こって分離媒体中での移動度が激減してしまうまで、分離媒体中を移動して 行（。特定の分離用ゲルのメツシュ・サイズを選択して、時間をかければ一非常 に長い時間だけれども一事実上固定した生体分子の残り移動で、混合物のすべて の成分を分離経路で移動させて分離することができる。このことは、一本鎖に分 れてしまうような完全な変性が起こると、部分的に変性した核酸の移動度は、単 なる一本鎖が分離媒体中を移動するだけになるために、再び劇的に増加するとい う事実によっている。すなわち、低温で、すでに移動度を失ってしまった、熱力 学的に最も不安定な核酸は、ゲル中を、なおも、極めてゆっくりと移動して行く けれども、結局、高い温度レベルの位置まで到達し、完全な変性を起して二重鎖 は一本鎖になってしまう。このため、上記のような移動速度の増加が生じる。

このような効果は、電気泳動全体を、より有用にすることに利用できる。各成分 が部分的な変性によって移動度を失い、互いに分離したところで、温度レベルを 、すべての二重鎖が一本鎖になる融点以上に上昇させる。こうすると、すべての 成分は再び移動度を回復する。しかしながら、この操作を行うに当っては、温度 が分離媒体全体で、極めて迅速に平衡になるようにするか、もしくは、温度平衡 が達成されるまで、例えば、電界のスイッチを切るなどして電気泳動を中止す　 ゝる必要がある。分離する分子は、同程度の大きさであることが好ましい。上記 の条件の操作を、高い温度レベルを用いて等温的な電気泳動で行えば、分離され た成分は、電気泳動がさらに進んでも、その相対的な距離を維持する。

もう一つ別の操作では、材料混合物成分を分離するための時間的温度勾配を形成 するのに、時間制御温度可変プログラムを、好ましくは、電気泳動の試料導入部 で用いる。最初、分離する試料を、電気泳動で移動させて分離媒体中に導入する 。試料導入部の温度レベルは５例えば核酸であれば、ループが形成されるが、融 解は起こらないように設定する。ループの形成は適当な試薬を用いてもよい。

こうすることによって、成分を電気泳動の最初の位置に、いわば固定しておく。

温度が段階的に低くなっていくにつれて、まず、熱力学的に最も安定な二重鎖が 再生され、その核酸は移動度を回復して、分離ゲル中を移動し始める。温度は引 き続いて変化するので、次に熱力学的に安定な核酸が、続いて動き始める。空間 的な分離の効果が大きくなるように、温度を低くする段階を制御して、有利に行 ってもよい。動き始めた分子は、分離媒体上を移動しているあいだに、実質的に 空間的な差をつけて行く。熱力学的な安定性が充分に遣っていれば、温度勾配を 比較的速く、連続的に減少させることも可能である。この操作を用いる場合、電 気泳動の末端に調節可能な加熱および冷却装置を設けることで、有利に行っても よい。

本発明に従うすべての操作では１分離媒体を、熱伝導性の温度制御用カバーで覆 って、再現性のある温度勾配または再現性のある等温状態を形成することが必要 である。再現性のある温度勾配または再現性のある等温状態を形成するためには 、温度制御用カバーのエネルギーの出入が、加熱および冷却装置のエネルギーの 出入に比べて、小さいことが絶対に必要である。

温度勾配ゲル電気泳動に用いる温度は、好ましくは、０から１００℃の間である 。分離媒体は、ポリアクリルアミド・ゲルで構成されることが好ましい。

材料混合物、特に、たった一つの突然変異を示す核酸からなる混合物成分を検出 する際の技術的課題は、請求項１２による方法で解決することができる。サブク レーム１３から２５は、本発明による方法の好ましい態様である。請求項２６か ら３０にクレームされたオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）の、いわゆるプライマーとして、好ましく用いられるものである［５ａｉｋｉ 他、　５ｉｅｎｃｅ　２３０（１９８５１ｐｐ、Ｌ５３０−１５３４１　、本発 明による方法の特別な態様が、請求項３２から３６に記載されている。請求項３ ７から４３は、本発明による方法の用途に関するものである。請求項３７から４ ３は、本発明による方法を実施するための好ましい手段に関するものである。

本発明による、核Ｗ！混合物中の突然変異の検出方法について、以下にさらに詳 細に説明する。

まず最初に、突然変異分析を行なおうとする核酸フラグメントな、突然変異の起 こった部分が熱力学的に不安定な領域になるように切断する。この領域は、実験 的に決定しても、計算によって決定してもよい。もし必要であれば、核酸フラグ メントをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって増幅して、熱力学的により安 定な領域を、分析実験中、最大の変性条件にあっても安定性を維持できるように 、さらに安定化しておいてもよい。次に、核酸フラグメントが、完全に一本鎖に 融解してしまわないで、低い電気泳動移動度を示すＹ字形構造を形成するように する。特に、このような安定化は、安定的なＧ／Ｃヌクレオチドまたは非荷電ヌ クレオチドを加えることで得ることができる。４０以上のＧ／Ｃ塩基対の影響に よる安定イヒについては、Ｖ、　Ｃ，５ｈｅｆｆｉｅｌｄらによってＰｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、Ａ、競　ｆ１９８９１　ｐｐ 、２３２−２３６に記載されている。しカルながら、驚くべきことには、２０か ら３０のＧ／Ｃ塩基対でも、充分な安定化が得られる。温度勾配ゲル電気泳動法 は、本発明によるものを用いることが好ましい。あるいは、ＤＥ−Ｏ３３６２２ ５９１に記載されている、プレート型の電気泳動に温度勾配を形成し、プレート 上に配置されたゲルを用いて分離する方法を用いてもよい。

核酸フラグメントな、いわゆるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの増幅反応 によって増やす場合、オリゴヌクレオチドを、いわゆるプライマーとして用いる 。このようなプライマーは、調べようとする核酸の一部分とハイブリッド形成が 出来るように選択される。調べようとする核酸の末端領域でハイブリッド形成が 行われるようにすると、有利である。さらに、増幅部分をベクターに組み込むこ とができるような制限領域をプライマーが有していることが望まれる。また、プ ライマーは、末端に、親和的な配位子となる化学基を有していることが好まし第 １図には、ＰＣＨのプライマーとして特に好ましいオリゴヌクレオチドを模式的 に示している。プライマーＨｎｐｌは、約１８から２５のヌクレオチドのハイブ リッド配列１からなっている。フリ一端末に向って、好ましくは１８から２５の ヌクレオチドのＧ／Ｃ部と、制限領域と一つまたはそれ以上の親和的な配位子と なる化学基が続いている。プライマーｐ２も同様に、ハイブリッド配列２．０か も２０のヌクレオチド長のＡ／Ｔ高含高含右部び制限領域Ｒ２からなっている。

非常に冬型的な領域で突然変異の分析を行う場合、唯一の冬型的位置を検出する ために、Ｃ，Ｄ領域（第１０図）を可能な限り少なく、極端な場合には０本のヌ クレオチドに保っておくとよい。このことは、実施例に示したβ−グロビン・サ ラセミアｒＹｕｇｏＪ　（ＩＶＳ−１−６、Ｔ−Ｃ）を検出する検査システムに よって例示されている。

β−グロビン・サラセミアの重要なタイプに、β−グロビンの遺伝子座上でのス プライシング突然変異体がある。この突然変異があると、エキソン１とエキソン ２との間で、正確なスプライシングができなくなる。ＩＶＳ−１−６の位置にあ る突然変異体の周囲を第２図に示した。示したものは、イントロン突然変異体Ｉ ＶＳ−１−６と本発明によるプライマーによるヒトβｇｂの配位子鹿６２２００ から６２３５０　（遺伝子バンク配列　ＨＵＭ　ＨＢＢ　ＰＲＥＭＲＮＡ）の部 分である。

第３図には、Ｇ、　Ｓｔｅｇｅｒらによって開発された計算法［Ｇ、Ｓｔｅｇｅ ｒ、　Ｔ、Ｐｏ、　Ｊ、Ｋａｐｅｒ　ａｎｄ　Ｄ、Ｒｉｅｓｎｅｒ　Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５（１９８７１ｐｐ、　５０８５−５１０３３ を用いて得られた、この核酸の融解挙動を示した。第２図に示した部分には、イ ントロン１−β０突然変異ＩＶＳ−１−６が含まれている０番号は遺伝子バンク 配列　ＨＵＭＨＢＢ　ＰＲＥＭＲＮＡに対応している。変性ゲルに最適なプロー ブは、６２２３３−６２３４０部分を増幅するものである。プライマー１ａ＊は 、いわゆるＧ／Ｃ末端につながっている。制限領域ＢａｍＨ１とＥｃｏＲｌは、 ベクターｐＢＲ３２２に組み込まれるように選らばれている。ＩＭのＮａＣ１中 で、β−グロビン部分が、異なる温度で異なるＤＮＡ変性を起こす様子を計算し 、その結果を図示した。第３図に示した融解ダイヤグラムについて、以下に説明 する。横軸は核酸の位置を示し、縦軸は、特定のヌクレオチドの位置で鎖がとけ る可能性を表わしている。また、三次元グラフの第三の軸は温度軸に対応しでい る。ここで注目すべきことは、融点は媒体のイオン強度にも、また、依存してい ることである。塩基対の鎖がほどける可能性は、０．５℃刻みで計算されている 。この三次元グラフは、様々な位置で協同的な変性が連続的に起こっていること を示している。第４図に示したように、６２３０２の位置に生じたー塩基対の大 きさのループのために、この領域は最も不安定となり、融点が減少している。

第５図は、融解の温度依存曲線に関するものである。積分形（５ａ）と微分形（ ５ｂ）を示した。記号（＊）でプロットした曲線は野生型ホモ二重鎖であり、記 号（＋）でプロットした曲線はＡｌ６のミス・ベアリングによるヘテロ二重鎖の ものである。

第５ａ図には、ホモ」鎖とへテロ二重鎖（Ａｌ６）の両方について、理論的にめ た、核酸二重鎖の光学的融解曲線を示した。第５ｂ図は、第５ａ図で計算した融 解曲線の一階微分を示した。注目すべきことは、熱力学的に不安定な領域のへテ ロ二重鎖（＋＋＋）が、いわゆる不適合で生じた内部ループのために、ホモ二重 鎖（＊＊＊）よりも、突然変異によって極めて不安定化されていることである。

この場合、この熱力学的に不安定な領域で、融点はホモ二重鎖に比べて約４℃降 下している。

第６図には、第２図に示したプライマー１ａ本とプライマーｉｂとによって増幅 された突然変異体と、同じく増幅された野生型について、１０から６０℃の直線 的な傾斜をもった垂直型温度勾配ゲル電気泳動法を用いて分析した結果が示され ている。等モルで混合されたフラグメントを連続的に変性／再生した。ヘテロ二 重鎖（Ｍｖ、Ｖｍ）とホモ二重鎖（Ｖｖ、Ｍｍ）は、模式的に示したように分裂 した。ホモ接合した野生型ＤＮＡプローブは、上記したようにプライマー１ａ本 によってＰＣＲ増幅した。フラグメントは、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１／Ｅｃｏ Ｒ１の間に組み込まれた。ホモ接合した突然変異体ＩＶＳ−１−６のＤＮＡ試料 は、ＢａｍＨｌとＥｃｏＲｌによって増幅し、切断、変性、そして野生型ｇｂ配 列のＢａｍＨ１／ＥｃｏＲ１クローン・フラグメントを用いてハイブリッド形成 した。得られたホモ二重鎖（２バンド）とへテロ二重鎖（２バンド）は、４本の 異ったバンドとして示された。Ｙ字形配置は、検査する核酸の最も安定な末端に あるＧ／Ｃ高含有オリゴヌクレオチド鎖によって安定化された［Ｒ，ｋｌ、Ｍｙ ｅｒａ　ｅｔａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３（１９８５ ）　ｐｐ、３１３１参照］。突然変異ＩＶＳ−１−６を含む試料を、平行温度勾 配ゲル電気泳動を用いて分析すると第７図に示した図が得られる。

第７図には、増幅および検査を終えた異なるＤＮＡ検体を、野生型（第６図およ び第２図誉照）を標準としてオートラジオグラフィーで分析した様子が示されて いる。ＩＶＳ−１−６突然変異を含むＤＮＡ検体は、第二のバンドを示す。すな わち、ＤＮＡ検体は標識された鎖をただ一つだけ含むので、これら４本のバンド のうち、２本だけが放射性Ｆ１ａ１ｌを含むことになる（第７図の挿入７参＠） 。この平行温度勾配は２５から６５℃の間で形成されている。

さらに、この実験は、この突然変異検出システムが定性分析だけでなく定量分析 にも適していることを示している。（放射性の）標識を付けた標識フラグメント （野生型）を少量モル加えると、この標識フラグメントは、変性／再生を終えた 対立遺伝子の両者に比例して分布する。一つの対立遺伝子の突然変異は、標識の １＝１という分布には影響を及ぼさない（第７図）、標識それ自体も、実験誤差 ｃ±１０％〕の範囲内でしか１：１という分布を変動させない。対立遺伝子が等 しく分布しているような、増幅する混合物内部に内部標準が存在しない場合、外 部から標準を加えることができる。もし、一つの突然変異によって標準とは異な る鋳型が生じれば、複製の数を内部標準として鋳型を定量的に検出することがで きる。完全に同一のプライマーを用いているため、プラトー効果、プライマーの 異なる１度あるいは低い複製効率などは、両方の成分に全く対称的に影響を及ぼ す。測定する標準および目的の配列が、１００、好ましくは１０未満の違いしか ない場合、信号の比によって複製の数を正確に決定してもよい（第９図）。実験 に際しては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は制御しなければ、飽和するまで 進行するので、この方法は極めて簡単なものとなる。

第９図は、第７図に記載した方法を模式的に示したものである。増幅するＤＮＡ に、既知の濃度（’ｌ’ＪＩ製数）の標準を加＾る。この標準は１分析しようと する核酸と、少なくとも一つの突然変異、例えば、一点での突然変異、のみが異 なるものである。この混合物を、飽和するまで酵素を用いて増幅する。続いて、 増幅された混合物に、Ｆ識を付けた標準を少量加える。少なくとも１回の変性／ 再生サイクルに続いて、定量する目標配列に対する内部標準の量の比に応じて、 Ｓ＊を対応するホモ二重鎖とへテロ」鎖へ変換する。ホモ二重鎖とへテロ」鎖の 分離をＴＧＧＥを用いて行い、標準の複製数の増加に応じて得られたバンドの信 号強度の比から、目標配列の量を決定することができる。

親和性のある基を有するプライマーを用いれば、核酸を分析して調べる際に、特 に、簡単で効果的な試料を調製することができる。親和性基としては、例えばヒ スチジル残基、ビオチニル残基などを用いることができる。ヒスチジル残基を用 いる場合、２から８個のヒスチジル残基を用いることができるが、６個用いるの が特に好ましい。次に、化学修飾されたプライマーは、対応する親和性基によっ てポリマー支持体に固定される。ヒスチジル残基によって化学修飾されたプライ マーを用いて、銅やニッケルといった２価遷移金属イオンとニトリロ三酢酸との キレート錯体をポリマー支持体に連結させることが好ましい。遷移金属イオンの 空になっている二つの配座が、二つのヒスチジル残基に占められることになる。

プライマーとヒスチジル残基とは互いに共有結合しているので、プライマーは、 このようにしてポリマー支持体に連結する。錯体については、組換え蛋白（ＥＰ −Ａｍ０２８２０４２．　ＥＰ−Ａ−０１８６０６９）　、　ＮＴＡ樹脂ｆＥＰ −Ａ−０２５３３０３１でも記載されてきた。例えば、ビオチニル残基とプライ マーとが共有結合した場合は、アビジン分子が共有結合しているポリマー支持体 を用いることが好ましい。

ポリマー支持体としては、対応する化学修飾をした膜、あるいは対応する化学修 飾をした粒子を用いることができる。ポリマー支持体は、実験の間に生じる圧力 変化に耐えて、流れを妨げないようにするために、充分な機械的安定性を有し、 　ていなければならない。今、突然変異を有する核酸が、上記したプライマーに よって増幅されると、一方の端末に前記の親和性基を（プライマーを介して）持 つ二重鎖が形成される。充分に増幅した後、反応混合物はポリマー支持体と反応 し、親和性部分はニッケル・キレートやアビジン分子のところで連結する。この ようにして、プライマーによって増幅された配列は、固体の支持体表面に特異的 に結合する。これはバッチ処理でもカラムによる処理でも可能である。この方法 を用いることで、増幅に必要な酵素や試薬の内、余分なものを簡単に、かつ穏や かに除去することができる。支持体に結合した核酸フラグメントは、８Ｊ識を付 けた、野生型から誘導した核酸プローブを用いた簡単な方法で成長させることが できる。−回またはそれ以上の変性／再生サイクルを用いてヘテロ二重鎖を形成 し、それから、バッファーの条件を変えたり、あるいは拮抗剤を用いてポリマー 支持体から溶離させて、直接、分析してもよい。このようにして得られた試料は 、例えば、すぐに温度勾配電気泳動によって分析してもよい。

第８図には、本発明に従って、ＴＧＧを調節することで試料を調製する方法を模 式的に示した。プライマーＨｎｐｌはオリゴヒスチジル残基を結合側鎖の５゜位 に有しており、そのため、中性もしくはアルカリ性で、ＮＴＡ配位子を持つ固相 の母体と結合できる。この段階で、混入した酵素や試薬は除かれる。試薬、およ び、必要であれば内部標準を加えて、変性／再生サイクルを行う。このようにし て、ＴＧＧＥ分析に用いることのできるＭｍとＭｖの基本的構造（標識されたホ モ二重Ｍ／標識されたヘテロ二重鎖）を得ることができる。すなわち１分析試料 の第二の鎖を、連続的なＴＧＧＥ分析によって検出できる。

請求項５１から６２でクレームした本発明の装置は、本発明の方法を、特に好適 に行うことができるものである。この装置は、温度勾配を形成するための、少な くとも二つの加熱もしくは冷却装置、または、一つの加熱装置と一つの加熱装置 からなっている。加熱もしくは冷却装置は、本発明の方法で必要とされるエネル ギーの出入を確保するための熱情めに連結されている。熱情めと、加熱もしくは 冷却装置とは、分離媒体が充填されている中空体を完全に包むように設計されて いる。この中空体の管の中には、分離のための分離媒体もしくは支持体からの溶 離のための分離媒体が充填されている。再現性のある温度勾配を形成するため、 もしくは、等温的な操作の場合は、再現性のある分離媒体の温度レベルを確保す るために、中空体は温度制御用カバーで覆われている。温度制御用カバーは、熱 情め、あるいは加熱もしくは冷却装置と熱が伝導するように連絡していることが 好ましい。

温度制御用カバーは金属板製で、その中を、好ましくはガラスもしくはプラスチ ック製の管である中空体が貫いている態様が好ましい。温度制御用カバーは、平 行に溝が切っである２枚の金属板からなっており、その溝が組立てた時に、分離 に用いる中空体の外形に対応した凹部を形成するようにされていて、その金属板 が直接熱に接するようにされていることが好ましい。

第１０図には１本発明による装置の好ましい態様が組立てられたところを模式的 に示した。第１０ａ図には、内側には分離媒体が充填され、周りを温度制御用カ バーで囲まれている中空体のＡ−Ａｌｊ！での断面を示した。

第１１図には、時間的温度勾配を形成する、本発明によるもう一つ別の装置の好 ましい態様を示した。

第１２図には、多数の分離用中空体が利用できるように改良した、本発明による 装置の態様を模式的に示した。

第１３図は、第１１図に示した装置を用いた本発明の方法を、模式的に説明した ものである。

第１４図および第１４ａ図には、第１２図に示した本発明の装置の好ましい態様 を示した。ここでは、温度制御用カバーは二つの部分からなる金属板で構成され ている。分離媒体が充填された管状の中空体は５両方の金属板の平行な溝に挟ま っている。

第１４ａ、１５ａ、ｂ図は、第１４図の装置のＢ−Ｂ線での側断面図であり、第 １５ａ図は、試料を導入した瞬間の図である。第１５ｂ図は、分離に用いる中空 体が装置の上部と下部にあるバッファー溜め５０の両方に浸されて、実験の準備 が整った装置を示したものである。

第１０図に示した好ましい態様は、温度Ｔ２および温度Ｔ１にそれぞれ対応する 二つの加熱および冷却装置１．２からなっている。これらの加熱および冷却装置 は、伝達手段によって熱情め４．５に連絡している。熱情め同様、加熱および冷 却装置も、中心に穴が空けられていることが好ましい。この穴を通って、好まし くは両側を貫いて、中空体６カ昔置されている。中空体６のすべての側面は、温 度制御用カバー７で覆われている。中空体６は、その内部の管腔に分離に用いら れる媒体が充填されている。温度制御用カバー７は、熱伝導性の材料で造られて いることが好ましく、熱情めと同じ材料で造られていることが特に好ましい。

温度レベル１．２は、それぞれ、加熱、冷却によって維持される。この操作には 、ペルチェ素子、あるいはサーモスタットを付けた液浴、あるいは電気的な茂れ ている。１１！１０ａ図には、Ａ−Ａ線での断面が示されている。中空体６の外 壁と温度制御用カバー７の内壁の間の空間には、粘性の高い液体８が充填されて いることが好ましい１分離媒体は、中空体６の断面に完全に満たされている。中 空体６は円筒の形状であることが好ましく、細管であることが特に好ましい。分 離媒体中のどの位置の温度も、次式によって計算することができる。

Ｔ＝Ｔ−−（Ｔａ　Ｔ、）　・ｄｉ／　（ｄ＋　＋ｄｉ　）ここで、ｄｌは、そ の位置の温度Ｔ１からの距離を表わし、ｄ２は、その位置の温度Ｔ２からの距離 を表わし、Ｔ、、Ｔ、は、それぞれ温度レベル１．２でのれているが、温度制御 用カバー７が温度レベル２の加熱冷却装置の熱溜めと熱伝している。分離に用い る電界の傾斜を横軸にとり、同時に、通過した分離経路の位置を表わした。また 、位置による温度レベルを、縦軸の正方向にとった（第１３ａ図）。試料成分が 分離する移動速度は、温度曲線に従った階段関数で表現される。例えば、Ｔ＋　 （ｔｏ）での移動速度（Ｖ）は、はぼ０である。温度レベルＴｏに導入された試 料は、この場合、単純に、電気詠動分雌経路の末端では温度レベルＴ２になる。

ひとたび試料が導入されると、物質１および２はスポットとなって、一定の位置 を占める。試料は、分離媒体中を電界の傾斜に沿って移動し減少する。ＴｏとＴ １との間で試料はａ縮される。この様子は、第１３ｂ図で形が小さくなっている ことで表わしている（時間１＋）。ここで、温度レベルＴ１旧　の濃度を時間の 関数で降下させる。第１３Ｃ図のＮｏ、２として示したような、熱力学的により 安定な成分は、」らせんを閉じて、高い移動度を回復する。そ瞭　の結果、この 成分は分離媒体中を動きはじめる。第１３ｄ図に示した図は、温度Ｔを下げて行 って、第１３Ｃ図のＮｏ、１として示したような、熱力学的によりと　不安定な 成分も分離媒体中を動きはじめるような温度になった時間ｔ、の様子を１　示し たものである。この時間の間、Ｎｏ、２成分は、分離経路の相当な部分をずっと 移動し続け、場合によっては５分離経路の長さを動いて、すでに末端で検出さて いるかもしれない。

【　このＲ様は、分離媒体を充填した細管を用いることが好ましく、また、互い に）　熱的に分離された三領域（Ｔ、、Ｔ、、Ｔ、）はサーモスタットで制御し てもよいａＴｏとＴ１との間の温度で起こる部分的な変性、例えば、核酸ならば 内部ループの形成、は適当な試薬を利用することもできる。

個々の温度レベルの境界では、温度の境界は、ぼやけてしまう。従って、第１２ 図に示した図は、温度と移動速度についての単なる理論上の矩形図である。この ことにもかかわらず、温度レベルの境界を出来るだけ鮮明にするために、温度レ ベルＴ。／Ｔ、／Ｔ２は、熱が伝わらないように連結されていることが好ましド イツ特許出願第Ｐ３６２２５９１号に記載されている、温度制御された単純；　 な空間温度勾配を持つフラットな分離媒体を用いても、本発明の方法を実施する ことができる。

第１２図には、それぞれに対応する熱溜め４．５を有する加熱冷却装置１．２が 多数の中空体６を収納するように配置され、前記装置ｌ、２および４．５がブロ ック−４８，５ａ−の形状をとるように設計され、多数の穴１１が中空体６が突 き出た形で、好ましくは、端面から突き出して配置されるように設けられている ことを特徴とする、好適な装置が示しである。この装置は、一つの装置を使用し て、既知もしくは未知の突然変異を検出するために多数の分析を行う場合に有利 である。この装置では、互いに共通な加熱冷却システムを持つ１種々のサーモス タット素子によって温度制御することで、い（っかの試料を同時に分析すること ができる。多重分析システム、好ましくは、８または１２、あるいは９６試料の 同時分析が可能であるので、マイクロ力価の決定（９６本の中空体）に適用する のも好ましい態様である。読取りシステムとしては、蛍光標識された核酸プロー ブを利用することが好ましい。このプローブは、温度制御装置の前および／また は終端の位置を分離時間の関数として、光学的に記録することができ、市販の検 出システムを利用することが出来るので好ましい。従って、適当な試薬を利用す ることで、遺伝物質の突然変異を自動的に測定することができる。

加熱もしくは冷却装置の温度平衡は、加熱ワイヤーを用いて、電気的に均一にす ることができるが、ペルチェ素子を用いることが好ましい、同様に、温度制御し た液浴を使用した液体加熱装置も使用することできる。しかしながら、細管の温 度制御カバーに連絡している加熱もしくは冷却装置は、温度制御カバーのすべて の位置が、その各移動地点に、各々はとんど固有の温度を持つように注意しな（ ではならない。このことは、対称的に組立てられたベルチェ加熱／冷却装置によ って可能となる。また、逆方向にも液体を流すことができるようにした液体温度 制御装置によって、逆流の温度との和で細管の各位置に、各々はとんど固有のれ ているのではなく、時間勾配として時間変動するようにされている方法に、特よ うとする分子の移動度は、最終的に時間の関数として制御される。従って、例え ば、開いてしまった核酸や部分的に変性した二重鎖は、高温でゲル中に事実上「 固定」されてしまうが、少し時間が経って、可逆的な構造が再生される温度まで 下がれさえすれば、分離媒体中を移動するになる。これは、細管中の分離でも、 また水平な支持体の上での分離でも行うことができる。この技術の利点は、きわ めて短い分離経路でも実施できることである。

きことは、ＴｏからＴ、の全部で４の温度レベルが、可変的に制御できることで ある。この好ましい態様を用いれば、空間的、時間的、および空間的、時間的の 組合せのよる温度勾配のどれでも、形成することができる。この本発明の装置は 、分析しようとする試料の分離に必要な変数を、実験室において決定するのに特 に適している。

第１４図には、本発明による装置の好ましい態様を示した。この装置には、全す る温度レベルを作る金属ブロック３５から３８は、連結材４３を介して温度制御 カバー７にねじで連結されている。

第１４ａ図は、第１４図に示した装置のＢ−Ｂ線での断面図である。分離を行う 中空体６は、温度制御カバーを構成する中空体７の中を完全に貫いて通っている 。中空体６と温度制御カバー７との間の空間には、粘性のある液体が満たされて いることが好ましい。金属ブロック３７と３８は、板の平な面が直接接触するこ とで、温度制御カバー７と熱が伝導するように連絡されている。金属ブロック３ ７．３８は、温度制御カバーと同じ材料で作られていることが好ましい。特別な 態様では、本発明の装置のこれら部品は一体に作られる。例えば、温度レベルＴ ｏ、Ｔ、を形成する金属ブロックを、中空体６を予め作り付けておいた温度制御 カバーと一緒に、一体で作る。温度レベルＴ、、Ｔ、を形成する金属ブロック３ ５．３６には穴があけられる。金属ブロックおよび温度制御カバーにあける穴は 、個々の部品３５．３６．３７および３８を組立てた時に、分離を行う中空体６ が装置を貫通することができるように、あけなくてはならない。金属ブロック３ ５から３８には、各々の温度レベルを形成するための液体が流れる穴１５（断面 ）が設けられている。

第２図および第３図の説明で述べたヘテロ二重鎖（１塩基不適合）とホモ二重鎖 とに代表される、標識を付けたハイブリッド体混合物を、どのようにして分離し たかを以下に述べる。第２図および第３図の説明で述べた、２本のクローン挿入 体（野生型とＩＶＳ−１−６）は、ＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１プラスミドの形で混 合されていた（各々４５ｎｇ）。これに、放射性標識した挿入体を限界量（プラ スミドに対して９ａｇ）を混入した。放射性標識は、ポリメラーゼＩ・フレノウ ・フラグメントを用いて、３２Ｐ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰに 結合させた。制限部分での比活性は、約１０’　ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅであった。

混合物を、５５μｍの１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡでｐＨ７，５，９８ ℃、２分間の条件で変性した。２５０ｍＭのＮａＣ１を加えてから、５０℃、１ 時間で再生した。２．５倍の体積のエタノールを用いて、−２０℃で３０分かけ てＤＮＡを沈殿させ、８０％エタノールで洗い、乾燥した。試料は０．０ＩＴＢ Ｅブロモフエノール・ブルーで処理した。白金の板電極（第１５ａ図）上に３μ ｍ、１３０００ｃｐｍで４０滴を置いた。試料を陰極側の細管に浸してから、接 地した白金電極３０（第１５ａ図）に対して１００Ｖの電圧をかけて、２分間、 電気泳動を行った。ＴＢＥ緩衝液（８５ｍＭのトリス、８５ｍＭのホウ酸、２゜ ５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８，３）は、高ｐＨ領域で高い緩衝能を有しているため に、低い緩衝液濃度（０，０１・ＴＢＥ）にもかかわらず、試料のアルカリ性は １９Ｈ単位以上増加しない（ｐＨ８，３から９．３）、このようにして、約５０ ％の！識を付けた核酸がゲルによって処理される。

細管としては、内径４５ｍｍのガラス製細管に５％のポリアクリルアミド・ゲル を充填したものを用いた。緩衝液は、Ｏ，ＩＴＢＥ、４Ｍの尿素を用いた。第１ ５ｂ図には、本発明の装置で電気泳動を行っているところを模式的に示した。

試料が泳動しはじめると、細管６の両端は、それぞれ１００ｍ１のバッファー溜 め５０に継なげられる。

ａ）試料を空間的な勾配（Ｔ、＝３０’Ｃ１Ｔａ　＝７０℃）によって分離した 。

表には、ホモ二重鎖の移動距離を、それぞれのへテロ二重鎖の移動距離と比較し て得られた差をｃｍ単位で示した。設定温度差は４０℃から５０℃で、実験上必 要な信号の分離が得られる。

電気泳動時間　野生型フラグメントとＩＶＳ−１−６フラグメ（分）　ントとの 細管ゲル中での位置の遣い（ｍｍ）ｂ）第１３ａからｄ図に示したような方法で 、試料をＴ。側に導き（Ｔ＝Ｔ２３７＝Ｔ、＝３０℃）、４ｍｍの温度Ｔ１の分 離経路で分離を行った。温度範囲（４０＜Ｔ、＜５０）でＴ１を通過してきた試 料だけが分離される。

本発明によれば、電気泳動の間、Ｔ１の温度レベルは直線的に降下する。分解が 起こって一本鎖になってしまう温度（５０℃）よりも、はんの少しだけ低い温度 Ｔ１に到達した試料は、１３部分３６（分離経路４ｍｍ）で分離して相対距離が 、１ｃｍ以上のバンドとなるや 静的な化学変性勾配システムでは作ることのできない、空間的な温度勾配と時間 依存的な温度勾配との組合せは、いくつかの応用面で、実用上極めて重要である 。二つの応用を、以下に例として挙げる、第１６図は、これらを模式的に説明し たものである。

ａ）例えば、大きさが極端に異なるなどの理由で１本来の移動速度が非常に遣う フラグメント同志を、なんとか−緒に分析することができる。速い移動速度を持 つ小さなフラグメント６０（フラグメントと、フラグメントに対応するゲル上の 位置は、小さなバーで表しである）は、大きなフラグメント７０が最初の変性が 起こる温度に到達するまでの間に、すでに、鎖の分離を起こしてしまう場合があ る。本発明によれば、最も安定な二重らせん部分やＧ：Ｃ結合の分離が起こらな いように高温Ｔ２を調整する。一方、電気泳動の間、温度ＴＩを低温から着実に 、最大値Ｔ、＝Ｔ、になるまで上昇させる。このようにすれば、どの分子も、移 動速度や大きさに関係なく、温度勾配中を移動して行くことができる。

ｂ）第１６ｂおよび０図に模式的に示した再生実験では、空間的なだけの温度勾 配のみを通過させたのでは、鮮明なバンドを得ることができない。この場合。

実際、バンド幅の拡がりが起こってしまい、変性曲線が急激であればあるほど、 より測定の妨げになる。この時、バンドの先端部では、低温の部分があるので、 後端部に比べて強（加速される。結果として、ぼやけたバンドになってしまう。

反対に、バンドの移動方向の先端が比較的高温で移動する場合が、非常に望まし い。これは、本発明による、空間的な温度勾配と時間的な温度勾配とを組合せた 再生実験で達成することができる。第１図に示したような装置を用いて直線的な 温度勾配で再生を行うかわりに、時間上〇からｔｉ　（第１６ｂおよび０図）の 間に、Ｔ１とＴ、（第１０図）の間で相対的に増加する温度勾配で、電気泳動を して分析する。このとき、Ｔ１とＴ２の両方−緒に（第１６ｂ図）、またはＴＩ だけ（第１６ｃ図）でも、比較的短い移動時間の試料が低温に曝されるように温 度を下げなくてはならない。ただし、バンドの先端は、後端に比べて、しりも高 い温度になっていなくてはならない。このように、本発明によってバンドを鮮明 にすることができる。

本発明による方法および装置は、材料混合物から成分を調製するだけでな（、定 性分析や定量分析にも用いることができる。分析や調製は、多数の試料を間両に 行うことができ、検出や評価は自動的に行うことができる。特に、本発明の方法 と装置は、ウィロイド、ビールス核酸およびサテライトＲＮＡの分析と調製、核 酸の突然変異の分析、蛋白質の突然変異の分析、および、核酸と蛋白質との複合 体の分析に適している。

ＴＧＧＥプローブは変異体の調製に、特に有利であり、予めクローン化すること なく、直接、変異体の配列を行うことが可能である。すなわち、酵素によって増 幅、配列した。特定の極めて少量の突然変異体を溶離することで、上記のような ことが可能になる。増幅に用いるベクター、組換え生命体などの利用が、安全措 置のために妨げられているので、このような方法は、将来、重要なものとなるで あろう。

浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇ、　２ ｒｘｇ−３ ｏ　１００　２００　３００　４００　１ＥＦＩｔｔＦｉ９．４ 突然変異の位置　８２３０２　（＝位置　８９）：τ（、ｅｏ　１００　配列位 置 １０ｏ　ｆ！ヂ１位置 浄書（内容に変更なし） ７１ｇ、　５＆ ９０、　１００．　１１０．　＋２０．　１３０゜９０、　１ｏｏ、　＋１ｏ、 　＋２ｏ、　１３０゜ｒｉｇ、５ｂ ｌｑ、６ 浄書（内容に変更なし） ｒ鈎、７ Ｆｉｇ、９ Ｆｉｑ、１０ Ｆｉｇ、１１ マイクロ滴定フォーマットのマルチチャンネルバージョン浄書（内容に変更なし ） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇ、１５ｂ ａｌ　ｂＩ Ｆｉｇ、１６ 手続補正書（方式） 平成５年１月７日〜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．材料混合物の成分を、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）によつて分離、検 出する方法であつて、 −空間的に離れた少なくとも二つの温度レベルによって、分離に用いられる電解 方向に空間的な温度勾配を形成するか、または、−全時間にわたって温度レベル を変化させることによって、時間的な温度勾配を形成するか、あるいは、 −空間的な温度勾配と時間依存的な温度勾配とを組合せて、時間的な温度勾配を 形成し、 −その温度勾配を、伝導手段によってゲル・マトリックスに伝え、−調節可能な 加熱もしくは冷却装置によって、電位が等しい位置で固有の温度を持つ空間的な 温度勾配が形成されるように温度レベルを調整するか、または、−場合によって は、一つまたは複数の調節可能な加熱もしくは冷却装置を用いて、分離媒体中の 分離経路の各点で時間的な温度勾配が形成されるように、時間依存的に温度レベ ルを調整し、可能であれば−分離経路の末端で分離された成分を検知することを 特徴とする分離、検出方法。 ２．電気泳動中に混合物成分が分離媒体を通過して分離する時間よりも、温度変 化が起こる時間の方が短いことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．温度が平衡に達するまでの時間、電気泳動のスイッチを切ることを特徴とす る請求項１または２に記載の方法。 ４．温度が０℃から１００℃の範囲で調節可能であることを特徴とする請求項１ から３の一つに記載の方法。 ５．温度レベルの温度調整を、温度制御された液浴、ペルチエ加熱素子、もしく は電気的加熱装置によって行うことを特徴とする請求項１から４の一つに記載の 方法。 ６．分離媒体が、円筒状の中空体の中、もしくは水平な支持体上に配置されてい ることを特徴とする請求項１から５の一つに記載の方法。 ７．分離媒体が、ガラスまたはプラスチック製の管内に配置されているか、もし くは前記水平な支持体が、フィルムをその上に設けてある金属板であることを特 徴とする請求項６に記載の方法。 ８．成分の検出が、自動的に行われることを特徴とする請求項１から７の一つに 記載の方法。 ９．分離される成分が、電荷を有する生体高分子であることを特徴とする請求項 １から８の一つに記載の方法。 １０．分離される成分が、核酸もしくは蛋白質であることを特徴とする請求項９ に記載の方法。 １１．電気泳動が、高分子媒体構造物、好ましくはポリアクリル・アミドの分離 媒体、もしくは支持体のない媒体中で行われることを特徴とする請求項１から１ ０の一つに記載の方法。 １２．核酸の突然変異の定性的および定量的分析方法であって、突然変異を有す る（突然変異体）核酸フラグメントと突然変異を有していない（野生型）核酸フ ラグメントと検査しようとする核酸フラグメントとでハイブリッド形成を行なっ て得られる、熱力学的に不安定な領域に突然変異が位置するようにされたヘテロ 二重鎮を分析することを特徴とする分析方法。 １３．突然変異を有する、熱力学的に不安定な領域を、計算によって選択するこ とを特徴とする請求項１２に記載の方法。 １４．検査する核酸フラグメントを、突然変異が熱力学的に最も不安定な領域に 位置するように設計することを特徴とする請求項１２および／または１３の一つ に記載の方法。 １５．核酸フラグメントの、熱力学的に比較的安定な領域に、末端オリゴＧおよ び／またはオリゴＣヌクレオチドが存在することを特徴とする請求項１２から１ ４の一つに記載の方法。 １６．Ｇおよび／またはＣヌクレオチドの数が２０から３０であることを特徴と する請求項１５に記載の方法。 １７．核酸が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されることを特徴 とする請求項１２から１６の一つに記載の方法。 １８．用いる２本のオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成して、隣接した近傍 で増幅されたＤＮＡを形成することを特徴とする請求項１２から１７の一つに記 載の方法。 １９．試料を調製した後、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）によってヘテロ二 重鎖を検査することを特徴とする請求項１２から１８の一つに記載の方法。 ２０．温度勾配が、電界方向に対して垂直な方向に形成されていることを特徴と する請求項１９に記載の方法。 ２１．温度勾配が、電界方向に対して平行な方向に形成されていることを特徴と する請求項１９に記載の方法。 ２２．温度勾配が、時間によって変動することを特徴とする請求項２１に記載の 方法。 ２３．温度勾をが、ヘテロ二重鎖の熱力学的に不安定な領域の融点よりも高い温 度レベルにある電界の陰極側から始まっていて、陽極側の低い温度レベルを調節 することで時間制御されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。 ２４．静的な温度勾配の陽極側の温度レベルが、陰極側の温度レベルよりも高い ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。 ２５．静的な温度勾配の陰極側の温度レベルが、陽極側の温度レベルよりも高い ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。 ２６．５′一末端親和性基を有するオリゴヌクレオチド。 ２７．２から８個のヒスチジン残基が５′一末端の親和性基であることを特徴と する請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。 ２８．ヒスチジン残基の数が６個であることを特徴とする請求項２７に記載のオ リゴヌクレオチド。 ２９．ビオチニル残基が５′一末端の親和性基であることを特徴とする請求項２ ６に記載のオリゴヌクレオチド。 ３０．さらに、制限領域および／またはＧ／Ｃ高含有部および／またはＡ／Ｔ高 含有部、および、検査する核酸の塩基配列とハイブリッド形成をする塩基配列を 有することを特徴とする請求項２６から２９の一つに記載のオリゴヌクレオチド 。 ３１．検査する核酸を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応および／または請求 項１２から２５の一つに記載した方法に用いることを特徴とする請求項２６から ３０の一つに記載したオリゴヌクレオチドの用途。 ３２．突然変異を有する核酸を、請求項２６から３０の一つに記載したオリゴヌ クレオチドを用いて増幅し、請求項２６から３０の一つに記載したオリゴヌクレ オチドの親和性基に対して親和性を持っていて、固相に固着している材料に連結 させてから、もし必要であれば、標識を付けた、突然変異を有していない核酸の 一本鎖または二重鎮とともに、少なくとも１回の変性／再生サイクルを行い、溶 離させた後に、分離操作を行うことを特徴とする請求項１２から２５の一つに記 載の方法。 ３３．請求項２６に記載したオリゴヌクレオチドの親和性基に対して親和性を持 っている材料が、キレート試薬と遷移金属からなるキレートを有する高分子支持 体であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。 ３４．オリゴヌクレオチドの親和性基に対して親和性を持っている材料が、高分 子支持体であり、該高分子支持体が、２価ニッケルと該支持体とに共有結合して いるニトリロトリ酢酸のキレートを有していることを特徴とする請求項３３に記 載の方法。 ３５．請求項２６から３０の一つに記載したオリゴヌクレオチドの親和性基に対 して親和性を持っている材料が、アビヂンまたはストレブタビヂンとの共有結合 を有する高分子支持体であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。 ３６．高分子支持体が、膜もしくは粒子状の材料であることを特徴とする請求項 ３２から３５の一つに記載の方法。 ３７．点変異、欠失、挿入、および核酸鎖の再配列などのＤＮＡもしくはＲＮＡ の突然変異を発見、研究することを特徴とする請求項１２から２５および／また は請求項３２から３６の一つに記載の方法の用途。 ３８．試料が、生きたおよび死んだ化石の組織、および生体内では、もはや代謝 活性でない組織から採取されたものであることを特徴とする請求項１２から２５ および／または請求項３２から３６の一つに記載の方法の用途。 ３９．法廷分析、遺伝病の解明および／または遺伝的特徴を持つ奇形、指紋のよ うな個人の同定分析などに利用する遺伝子研究を行うことを特徴とする請求項１ ２から２５および／または請求項３２から３６の一つに記載の方法の用途。 ４０．工業的に利用される微生物、医学的に重要な病原体、ビールス、特に、突 然変異を起こし易いものとして知られているビールス、バクテリア、菌類、原生 動物の系統を詳細に調べることを特徴とする請求項１２から２５および／または 請求項３２から３６の一つに記載の方法の用途。 ４１．環境開発の研究を行うことを特徴とする請求項１２から２５および／また は請求項３２から３６の一つに記載の方法の用途。 ４２．検出器中で突然変異体に単一バンドを形成させて、直接もしくは電位勾配 の方向を変化させる電気溶離によって単離し、直接にＰＣＲ−増幅するか、もし くは直接に配列および／またはクローン化することで発見した突然変異を調製す ることを特徴とする請求項１２から２５および／または請求項３２から３６の一 つに記載の方法の用途。 ４３．遺伝子的に増幅した遺伝子断片、特にゲノムの単転写領域の断片を、均一 な標準断片とハイブリッド形成させるか、対応する個人を同定するのに用いるＤ ＮＡの均一な配列断片とハイブリッド形成させて、同様な方法によって遺伝子的 に増幅して個人の同定を行うことを特徴とする請求項１２から２５および／また は請求項３２から３６の一つに記載の方法の用途。 ４４．試薬と、一つまたはそれ以上の標識された核酸プローブ、標識されていな い部分的もしくは完全に相同な標準核酸、および０から１００℃の温度範囲で二 重鎖構造の変性と再生を行うことのできるハイブリッド緩衝液との混合物からな ることを特徴とする請求項１２から２５および／または請求項３２から３６の一 つに記載の方法を実施するための手段。 ４５．少なくとも一つの標識された核酸プローブと、標識されていない部分的も しくは完全に相同な標準核酸、および０から１００℃の温度範囲で二重鎖構造の 変性と再生を行うことのできるハイブリッド緩衝液との混合物からなることを特 徴とする請求項１２から２５および／または請求項３２から３６の一つに記載の 方法を実施するための手段。 ４６．混合物が請求項３２から３６の一つに記載された固相の担体を含み、増幅 された断片が反応混合物から直接回収できるようにされていることを特徴とする 請求項４５の手段。 ４７．突然変異、もしくは特定の遺伝子の塩基配列を定量分析する方法であって 、一つの濃度が既知の異った配列の混合物中に、前記異った配列の一つと同じ配 列の、標識した核酸分子を少量加え、得られた混合物を、少なくとも一回の変性 ／再生サイクルを行ってから分析することを特徴とする方法。 ４８．標識した核酸分子の配列が、濃度が既知の核酸の配列と同じであることを 特徴とする請求項４７の方法。 ４９．変性／再生サイクルの後に形成されたハイブリッド体を、温度勾配ゲル電 気泳動（ＴＧＧＥ）によって分離して、分離した各々の成分の相対信号強度を測 定することを特徴とする請求項４７および／または４８の方法。 ５０．分析する核酸が、酵素による増幅で得られたものであることを特徴とする 請求項４７から４９の一つに記載の方法。 ５１。温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）を実施する装置であって、二つより多 くの加熱もしくは冷却装置によって温度勾配を形成する、熱溜め（４、５）を有 する少なくとも二つの加熱もしくは冷却装置（１、２）があり、最も離れた加熱 もしくは冷却装置の間に、中空体（６）が前記加熱もしくは冷却装置を貫いて配 置され、この中空体内部に分離に用いられる分離媒体が充填されていて、さらに 、この中空体（６）が、少なくとも一つの加熱および／または冷却装置（１、２ ）と熱伝導するようにされた熟伝導性の温度制御用カバー（７）で覆われている ことを特徴とする装置。 ５２．中空体（６）が円筒形であることを特徴とする請求項５１の装置。 ５３．中空体（６）が細管であることを特徴とする請求項５１および／または５ ２の装置。 ５４．中空体（６）の外壁と温度制御用カバー（７）の内壁との間に、熱交換材 （８）が配置されていることを特徴とする請求項５１から５３の一つに記載の装 置。 ５５．熱交換材が粘性の高い液体からなっていることを特徴とする請求項５４に 記数の装置。 ５６．加熱もしくは冷却装置が、温度制御された液浴およびペルチエ加熱素子（ ９）または電気加熱器および／または熱溜め（４、５）を有していることを特徴 とする請求項５１から５５の一つに記載の装置。 ５７．温度制御用カバー（７）が、すべての加熱もしくは冷却装置（１、２）と 熱伝導が起こるように連結されていることを特徴とする請求項５１から５６の一 つに記載の装置。 ５８．第三の加熱もしくは冷却装置（３）が、試料導入側に設けられていること を特徴とする請求項５１から５７の一つに記載の装置。 ５９．温度制御用カバー（７）が、第二の加熱もしくは冷却装置（２）から熱的 に分離されていることを特徴とする請求項５８に記載の装置。 ６０．加熱もしくは冷却装置（１、２）が、時間制御できることを特徴とする請 求項５１から５９の一つに記数の装置。 ６１．対応する熱溜め（４、５）を有する加熱もしくは冷却装置（１、２）が多 数の中空体（６）に適用するようにされている装置であって、装置（１、２）と （４、５）がブロック（４ａ、５ａ）の形にされており、中空体（６）が貫き通 って配置されるように多数の穴（１１）があけられていることを特徴とする請求 項５１から６０の一つに記載の装置。 ６２．中空体（６）の両端が、ブロック（４ａ、５ａ）の形にされている装置か ら突き出していることを特徴とする請求項６１に記載の装置。 ６３．温度勾配の温度範囲内で、少なくとも一つの成分が熱変形を起こす混合物 試料を分析することを特徴とする請求項５１から６０の一つに記載の装置の用途 。 ６４．請求項１から６２の一つに記載の方法を実施することを特徴とする請求項 ５１から６２の一つに記載の装置の用途。 ６５．ウイロイド、ビールス核酸およびサテライトＲＮＡの検出と識別、核酸の 突然変異の分析、蛋白質の突然変異の分析、および核酸と蛋白質との複合体の分 析に用いることを特徴とする請求項５１から６２の一つに記載の装置の用途。 ６６．分離する混合物試料の成分の調製に用いることを特徴とする請求項５１か ら６２の一つに記載の装置の用途。 ６７．ウイロイド、ビールス核酸およびサテライトＲＮＡの調製、ホモーおよび ヘテロ二重鎖の突然変異した核酸の調製、蛋白質の突然変異の調製、および核酸 と蛋白質との複合体の調製に用いることを特徴とする請求項５１から６２の一つ に記載の装置の用途。