KR101963462B1 - 재사용 가능한 자동화 평행 생물 반응 시스템 및 방법 - Google Patents

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헤사암 에스판디아르푸르
파리지 코자르 비
에프. 올드햄 마크
에스. 노르드만 에릭
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제납시스 인크.
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    • G01N2001/4038—Concentrating samples electric methods, e.g. electromigration, electrophoresis, ionisation

Abstract

방법은 생물 물질(예를 들어, DNA 단편 또는 증폭된 DNA의 형태일 수 있는 핵산)을 운반하는 비드를 자기력에 의해 기판의 특정 위치에 고정하는 단계와, 비드에 국소적으로 전기장을 인가하여 생물 물질 또는 생물 물질의 반응 생성물 또는 부산물을 격리하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 비드는 생물 물질이 회합된 기타 다른 비드로부터 격리된다. 다양한 구체예에서, 전기장은 시약을 증폭 또는 서열 결정 반응용으로 농축하고/농축하거나, 검출 가능한 반응 부산물을 농축 및 격리한다. 예를 들어 개별 비드 주위의 핵산을 격리함으로써, 전기장은 에멀젼 PCR에 대한 대안으로서 클론 증폭을 허용할 수 있다. 다른 구체예에서, 전기장은 비드에 근접하는 나노센서를 격리하여, 국소 pH 변화, 국소 전도도 변화, 국소 전하 농도 변화 및 국소 발열 중 하나 이상의 검출을 용이하게 한다. 비드는 국소화된 자기장 영역 어레이의 형태로 포집될 수 있다.

Description

재사용 가능한 자동화 평행 생물 반응 시스템 및 방법{SYSTEMS AND METHODS FOR AUTOMATED REUSABLE PARALLEL BIOLOGICAL REACTIONS}
관련 출원에 대한 상호 참조 문헌
본 출원은 명칭이 "Integrated System and Methods for Polynucleotide Extraction, Amplification and Sequencing"인 2010년 10월 4일자로 출원된 미국 가출원 일련 번호 제61/389,490호; 명칭이 "Magnetic Arrays for Emulsion-Free Polynucleotide Amplification and Sequencing"인 2010년 10월 4일자로 출원된 제61/389,484호; 명칭이 "Chamber-Free Gene Electronic Sequencing Technologies"인 2011년 2월 15일자로 출원된 제61/443,167호; 및 명칭이 "Methods and Systems for Nucleic Acid Sequencing"인 2011년 5월 27일자로 출원된 제61/491,081호의 우선원의 이익을 주장하며, 이들 문헌 각각은 본원에 전체가 참고로 포함되어 있다.
연방 정부가 후원한 연구 및 개발에 관한 진술
본 발명은 정부의 지원으로 미국 보건 복지국과 연계하여, IRS에 의해 수여되는 치료학적 발견 승인에 관한 결정(Qualifying Therapeutic Discovery Grant) 하에서 행하여졌다. 미합중국 정부는 본 발명에 대한 임의의 권리들을 갖는다.
신속하고 비용 효율적인 DNA 서열 결정 방법(예를 들어, 고 처리량 방법)은 개인 맞춤 의료 및 진단 테스트를 발전시키는데 있어서 여전히 중요한 양태이다. 몇몇 공지된 DNA 서열 결정용 시스템은 다양한 서브시스템 간에(예를 들어, 핵산 격리 서브시스템 및 증폭 서브시스템 간에) DNA 샘플이 운반될 것을 필요로 하므로, 비효율적이며 잠재적으로 오염이 일어나게 된다. 몇몇 공지된 DNA 서열 결정 방법은 까다롭고, 비용이 많이 들어가며, 처리량을 제한할 수 있는 광학 검출을 이용한다. 기타 다른 시스템은 몇 가지 유형의 전자 센싱(electronic sensing)을 이용하지만, 센서 및 서열 결정 유동 세포는 한 번만 사용될 수 있는 1회용이며 이는 한 번 사용되고 나서 폐기될 것이므로, 사용자에 대하여 비용이 상당히 증가하며, 비용 효율적으로 제조될 수 있는 센서의 복잡성을 제한한다. 몇몇 시스템은 동일한 유동 세포 내에서 증폭 방법을 사용하는데, 이 경우에 서열 결정이 수행될 때 증폭된 대상물은 유동 세포에 직접 결합되어 재사용을 방지한다. 기타 다른 시스템은 에멀전 PCR을 이용하는데, 이 경우 비드와 샘플은 낮은 농도로 사용되는, 소량의 에멀젼으로 혼합된다. 푸아송 분포로 인하여 비드와 샘플의 대부분은 에멀젼 중에서 단일 비드 및 단일 샘플로 섞이지 않으므로, 소실된다. 비드의 가격은 서열 결정에 드는 비용의 상당 부분을 차지하므로, 이러한 비용의 대부분은 임의의 유용한 데이터를 생성하지 않은 채 낭비된다. 현재 사용되고 있는 시스템은 샘플을 거의 다 사용할 수 있게 하고, 비드를 재사용 가능하게 하므로, 사용자에 대하여 비용을 감소시킨다.
현재 사용되고 있는 DNA 서열 결정 시스템은 통상적으로 충분한 샘플을 얻기 위해서 전체 게놈을 증폭할 필요가 있는데, 그 이유는 샘플이 매우 비효율적으로 사용되기 때문이다. 이와 같은 전체 게놈 증폭 방법은 통상적으로 게놈의 상이한 부분들의 증폭에 있어서 상당량의 바이어스(bias)를 도입하며, 상기 바이어스를 극복하기 위해서 높은 수준의 보상(coverage)을 필요로 한다. 샘플, 그리고 원하는 반응 또는 결합이 일어날 수 있는 공간으로 시약을 국소화하는 방법은, 전체 게놈 증폭에 대한 필요성을 없애거나 줄여주어, 필요한 보상을 감소시킬 수 있는 시스템이 구현되는 다른 양태이다.
그러므로, 폴리뉴클레오티드를 추출, 증폭 및 서열 결정하기 위한, 개선된 시스템 및 방법에 대한 필요성이 존재한다.
<발명의 내용>
<해결하려는 과제>
<과제의 해결수단>
본원에 기술된 구체예는 폴리뉴클레오티드를 추출, 증폭 및 서열 결정하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 몇몇 구체예에서, 상기 시스템 및 방법은 완전 자동화된 통합형 플랫폼을 포함할 수 있으므로, 비용을 줄일 수 있으며, 처리량을 늘릴 수 있고/있거나 사용 방법을 간편하게 할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 생물 물질, 반응물 및/또는 반응, 예를 들어 핵산 증폭 또는 서열 결정 반응에 대한 반응 부산물을 격리하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 생물 물질(예를 들어, DNA 단편 또는 증폭된 DNA의 형태일 수 있는 핵산)을 운반하는 비드를 자기력에 의해 기판의 특정 위치에 고정하는 단계와, 비드에 국소적으로 전기장을 인가하여 생물 물질 또는 생물 물질의 반응 생성물 또는 부산물을 격리하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 비드는 생물 물질이 회합된 기타 다른 비드로부터 격리된다. 다양한 구체예에서, 전기장은 시약을 증폭 또는 서열 결정 반응용으로 농축하고/농축하거나, 검출 가능한 반응 부산물을 농축 및 격리한다. 예를 들어 전기장은 개별 비드 주위의 핵산을 격리함으로써, 에멀젼 PCR에 대한 대안으로서 클론 증폭을 허용할 수 있다. 다른 구체예에서, 전기장은 비드에 근접하는 나노센서를 격리하여, 국소 pH 변화, 국소 전도도 변화, 국소 전하 농도 변화 및 국소 발열 중 하나 이상의 검출을 용이하게 한다. 비드는 국소화된 자기장 영역 어레이의 형태로 포집될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 핵산 증폭 및/또는 서열 결정을 수행하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환경에 대해 생물 물질을 감금하기 위하여 전기장을 인가하는 단계와, 상기 생물 물질을 대상으로 핵산 증폭 및/또는 핵산 서열 결정을 수행하는 단계를 포함한다. 전기장을 통한 외부 환경으로부터 환경의 감금은 생물 물질을 다수의 영역으로 격리하는 효과가 있다. 감금은 증폭 및/또는 검출을 용이하게 하는 가상의 웰(well)을 형성하며, 가상 웰들 사이에서의 오염을 방지한다. 다양한 구체예에서, 생물 물질은 다수의 비드와 회합되며, 상기 비드는 다수의 영역 각각에서 국소화된 자기장에 의해 제 위치에 고정된다. 임의의 구체예에서, 가상 웰 내의 증폭은 각각의 비드와 회합되었거나 센서 표면에 회합된 DNA의 클론 군집을 생성한다.
다른 양태에서, 본 발명은 증폭된 핵산을 운반하는 비드 군집을, 증폭된 핵산을 운반하지 않는 비드 군집으로부터 분리하는 자동화 방법을 제공한다. 상기 방법은 비드와 회합된 전하를 바탕으로 하여 비드들의 군집을 분리하는 단계를 포함한다. 분리는 전기 영동에 의해 수행될 수 있다. 비드의 분리는 관류 기구(flow-through mechanism)를 바탕으로 할 수 있으며, 비드들은, 예를 들어 비드를 처리하여 임의의 증폭된 생성물 및/또는 프라이머를 제거함으로써, 후속 증폭 반응에서 재사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생물 물질로부터 DNA 단편을 정제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유체 환경에 전기장을 인가하는 단계를 포함하는데, 상기 유체 환경은 적어도 부분적으로 필터 매질을 함유한다. 이러한 양태에서, 생물 물질이 필터 매질을 통하여 운반될 때, 상기 생물 물질로부터 DNA 단편을 분리하기 위해서 전기장이 조정된다. 다양한 구체예에서, 필터 매질은 다공성 막이거나, 나머지 생물 물질에 비하여 DNA 단편의 상이한 이동도를 제공하는 매질이다. 일단 DNA 단편이 정제되면, 상기 DNA 단편은, 예를 들어 본원에 기술된 방법과 시스템을 이용하여, DNA 라이브러리 구성, DNA 증폭, DNA 증량(enrichment) 및/또는 DNA 서열 결정에 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생물 물질로부터 격리된 DNA를 전단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 다수의 입자를 DNA 분자군을 함유하는 유체 환경에 배치하는 단계와, 상기 입자들이 유체 환경에서 흐르도록 하여 DNA 분자에 대하여 전단력이 생기도록 하여 DNA 단편을 제조하는 단계를 포함한다. 이와 같은 구체예에서, 전단력은 추후 라이브러리 구성에 있어서 도움이 되는 평활 말단(blunt end)을 생성한다.
다른 양태에서, 본 발명은 핵산 증폭 및/또는 서열 결정을 위한 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 핵산과 기판의 결합을 위한 부에 결합되는, 실질적으로 편평한 기판과, 이 기판으로부터 핵산을 분리하는 수단을 포함하므로, 상기 시스템은 핵산 증폭 및 핵산 서열 결정 중 하나 이상에 재사용될 수 있다. 증폭이 진행되는 동안, 상기 시스템은 기판 표면에 핵산 클론을 생성한다. 증폭은 가열 사이클 또는 등온 증폭 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 시스템은 서열 결정 반응에서 뉴클레오티드의 혼입을 검출하는 장치를 추가로 포함한다. 상기 검출은 국소 pH 변화, 국소 열 검출, 국소 전기 용량 변화, 국소 전하 농도 및 국소 전도도 변화 중 하나 이상을 바탕으로 할 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 생물 물질 또는 생물 반응 생성물 또는 부산물을 검출하는 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 실질적으로 편평한 센서 어레이를 포함하며, 상기 센서 어레이는 어레이 내 각각의 나노센서에 인접하는 비드를 포착하는 수단을 포함한다. 나노센서는 생물 물질 또는 생물 반응의 생성물이나 부산물을 검출할 수 있다. 상기 시스템은 비드를 해리하여 어레이의 재사용을 용이하게 하는 수단, 예를 들어 자기, 화학 및 효소 수단을 추가로 포함한다.
본원에 기술된 방법 및 시스템에 관한 몇몇 구체예에서, 장치는 기판, 다공성 부재 및 전극을 포함한다. 상기 기판은 샘플을 수용하도록 구성된 미세 유체 채널을 한정한다. 상기 다공성 부재는 적어도 부분적으로 미세 유체 채널 내에 배치된다. 상기 전극은 전기장을 생성하도록 구성되어 미세 유체 채널과 결합되므로, 다공성 부재의 적어도 일부는 전기장 내에 배치될 수 있다. 상기 다공성 부재와 전기장은, 샘플이 다공성 부재를 통과하여 운반될 때 핵산이 샘플로부터 분리될 수 있도록 협력 관계에 있도록 구성될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 장치는 기판, 다수의 입자 및 유동 기구(flow mechanism)를 포함한다. 상기 기판은 다수의 DNA 분자들을 함유하는 샘플을 수용하도록 구성된 미세 유체 채널을 한정할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 장치는 프로브로서 사용될 수 있으며, 웰이나 기타 다른 유체 환경에 삽입될 수 있다. 다수의 입자는 미세 유체 채널 내부에 배치되도록 구성될 수 있다. 유동을 생성하는 기구는 미세 유체 채널 내부에 다수의 입자와 샘플의 유동을 생성하도록 구성되어 다수의 입자가 다수의 DNA 분자에 대하여 전단력이 생기도록 하여 다수의 DNA 단편을 생성할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 직교 제어되고 유동 체널을 가지는 유체 게이트 다수 개로 이루어진 온-칩 연동 펌프(on-chip peristaltic pump)(밸브 테크놀로지(Valve Technology)) 또는 외부 압력은 상기 채널 내에서 필요로 하는 유동을 생성할 수 있다.
본 발명은 폴리뉴클레오티드 증폭 및 서열 분석을 위한 자기 어레이와 이 자기 어레이를 이용하는 방법을 제공하며, 이에 의하여 신속하면서 편리하고/편리하거나 비용이 적게 드는 DNA 서열 결정 방법을 제공한다.
<발명의 효과>
도 1a는 비드를 포착하는데 사용될 수 있는 센서를 가지는 자기 어레이 및 비드를 나타낸다.
도 1b는 센서와 1 대 1로 대응하여 자기 어레이 상에 포착된 비드를 나타낸다.
도 1c는 비드가 세정되어 다음 샘플용으로 사용될 수 있도록 준비된 후의 센서 어레이를 나타낸다.
도 1d는 구형이 아닌 자기 입자 세트와 함께 사용되는 센서 어레이를 개략적으로 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 비드가 부하된 구체예에 의한 자기 어레이의 현미경 사진을 나타낸다.
도 3 및 도 4는 뉴클레오티드를 성장 중인 DNA 가닥에 혼입하는 단계를 포함하는 반응의 개략적인 예시로서, 피로포스페이트의 해리 및 이에 수반되는 pH의 증가 및 열 방출을 나타낸다.
도 5a는 서열 결정 시스템의 미세 유체 채널과 전기적으로 소통하는 일련의 나노센서들의 개략적인 예시를 나타낸다.
도 5b는 서열 결정 장치를 통하여 수행된 서열 결정 작업의 결과를 나타내는 그래프를 도시한다.
도 6은 센서 위에 다수의 하전된 부들을 농축 또는 감금하는데 사용되는 전극 세트를 포함하는 전자 센서 어레이를 나타낸다.
도 7은 센서 위에 고정된 서열 결정용 클론 비드의 자기, 전기 또는 전자기 체류 상태를 나타낸다.
도 8a는 나노센서를 포함하는 서열 결정 시스템 일부의 이미지를 도시한다.
도 8b는 나노센서와, 서열 결정 시스템의 미세 유체 채널과 전기적으로 소통하는 일련의 나노센서들의 개략적인 예시를 나타낸다.
도 9는 서열 결정 시스템 내 나노센서 어레이의 개략적인 예시를 나타낸다. 온-칩 증폭은 선택적이다.
도 10은 예시적인 서열 결정 칩의 부품들을 도시한다.
도 11은 전기력, 개략적인 구체예 및 시뮬레이션을 통하여 얻은 농도 그래프를 나타낸다.
도 12는 시뮬레이션을 통하여 얻은, 전극 위 수평 횡단선에서의 유선 전기장 및 전위 데이터를 나타낸다.
도 13은 자기 어레이에 의해 고정된 비드 상 DNA의 형광 현미경 사진을 나타낸다.
도 14는 샘플 분자를 유인하여 증폭 반응에 감금시키기 위한 전기 영동 농도/감금 전기장을 형성하기 위한 전극을 포함하는 센서 및 증폭 반응에 있어서 상기 센서의 용도를 나타낸다.
도 15는 1 대 1로 대응하는 전기 감금 전극 어레이와 센서를 나타낸다.
도 16a는 클로날 DNA가 부착된 비드, 센서 및 자기 어레이 세트를 나타낸다.
도 16b는 포착된 비드 세트를 나타내며, 여기서 포착된 각각의 DNA로 덮인 비드는 센서 위에 고정되어 있다.
도 16c는 부분적으로 비드로 군집이 이루어져 있는, 비드, 센서 및 자기 감금 어레이의 제2 세트를 나타낸다.
도 16d는 센서에 의해 포착된 비드와, 도 16c의 자기 감금 어레이의 세트 2개를 나타낸다.
도 17은 증폭 및 서열 결정 반응에 사용되는 전기 영동 농축/감금 전기장을 형성하기 위한 전극을 포함하는 센서를 나타낸다.
도 18a 및 도 18b는 비드 분리 시스템에 관한 한 가지 구체예의 상이한 관점을 예시한다.
도 19는 구체예에 의하여 폴리뉴클레오티드를 추출, 증폭 및 서열 결정하는데 사용되는 통합형 플랫폼의 개략적인 예시이다.
도 20 내지 도 24는 폴리뉴클레오티드를 추출, 증폭 및 서열 결정하는데 사용되는 통합형 플랫폼의 미세 유체 부분에 관한 구체예를 나타낸다.
본원에 사용된 "비드 포착 특징(bead capture feature)"이란, 센서를 기준으로 고정된 위치에 단일 비드를 일시적으로 고정할 수 있고 기판 상의 국소 자기 구조, 즉 비드의 위치를 고정하는 힘으로서 외부 자석, 국소 자기 구조, 반 데르 발스 힘 또는 중력을 이용할 수 있는 함몰부를 포함할 수 있는 특징을 의미할 수 있다. 임의로, 상기 비드는 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 제 위치에 결합될 수 있다.
본원에 사용된 "클로날(clonal)"이란, 실질적으로 비드 또는 입자 군집 모두가 동일한 핵산 서열을 가지는 것을 의미할 수 있다. 몇몇 구체예에서, "반려 짝(mate pairs)", "짝 형성 말단(paired ends)" 또는 기타 다른 유사한 방법에서 요망될 바와 같이, 단일 샘플 DNA 단편과 회합되는 군집은 2개 존재할 수 있으며, 상기 군집들은 비드 또는 입자 상에 대략적으로 유사한 수만큼 존재할 수 있고, 비드 또는 입자 상에 무작위로 분포될 수 있다.
본원에 사용된 "감금(confinement)"이란, 하나의 비드 또는 입자에서 생성된 분자(예를 들어, DNA)가 동일한 비드 또는 입자와 회합된 채 머물러서, 비드들 또는 입자들의 클론 성질을 실질적으로 유지하는 경우를 의미할 수 있다.
본원에 사용된 "격리하다"란, 비드들 또는 입자들의 클론 성질을 유지하는데 필요한 바와 같이, 하나의 가상 웰로부터 또 다른 가상 웰로의 이동, 확산, 유동 또는 기타 다른 이동을 막는 것을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 "국소화된 자기 특징"이란, 실질적으로 편평한 기판 상에 개별 비드들을 고정하는, 실질적으로 편평한 기판 상에 형성되는 자기 특징을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 "국소화된 자기장"이란, 제1 자기 영역의 북극과 제2 자기 영역의 남극 사이의 일정한 공간에 실질적으로 존재하거나, 단일 자기 영역의 북극 및 남극 사이의 일정한 공간 실질적으로 존재하는 자기장을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 "국소화된 전기장"이란, 2개 이상의 전극들 사이의 일정한 공간에 실질적으로 존재하는 전기장을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 "나노센서"란, 비 구형 비드 또는 입자의 직경 또는 장축에 대하여 측정하였을 때 0.1마이크로미터, 1마이크로미터, 5마이크로미터, 10마이크로미터 또는 20마이크로미터 중 하나 미만인 비드 또는 입자를 검출하도록 고안된 센서를 의미할 수 있다. 대안적으로, 상기 센서는 상기 비드 또는 입자와 회합되는 부, 또는 반응 생성물 또는 부산물과 회합되는 부에 감수성일 수 있는데, 이때 상기 반응물은 상기 비드 또는 입자와 회합되는 부를 포함한다. 상기 부는 DNA 단편, 수소 이온, 또는 반대 이온이어서 상기 비드 또는 입자, 또는 상기 비드 또는 입자와 결합 또는 회합되는 부와 회합되는 기타 다른 이온을 포함할 수 있다.
나노센서는 "나노브릿지(NanoBridge)", "나노니들(NanoNeedle)", ISFET, 켐FET(ChemFET), 나노 열량계 또는 캔틸레버(cantilever) 기반 pH 센서 또는 이것들의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "입자"란, 비 구형 부, 예를 들어 분자, 분자들의 응집체, 고체 입자에 결합된 분자, 또는 입자와, 기타 다른 당업계에 공지된 형태의 것들을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 "단일 상 액체"는 전체적인 물리적 특성, 예를 들어 밀도, 굴절률, 비중과 같은 특성이 비교적 균일한 액체로서, 수성, 수혼화성 및 유기 혼합물을 포함할 수 있지만, 비혼화성 액체, 예를 들어 오일 및 물은 포함하지 않는다. 잠재적으로 액체가 단일 상 액체로서 간주되지 않도록 만드는 것으로 간주되지 않는 물리적 특성 중에는 pH, 전하 밀도 및 이온 농도 또는 온도의 국소 변화가 포함된다.
본원에 사용된 "실질적으로 편평한"이란, 소형의 받침대, 위로 솟은 구획, 구멍, 함몰부 또는 울퉁불퉁한 부분이 장치의 국소 평면에 대하여 50㎛를 초과하지 않도록 할 것이다. 왜곡, 뒤틀림, 커핑(cupping) 또는 기타 다른 편평형 왜곡(planar distortion)으로 인한 변형은 허용되는 오프셋의 일부를 이루는 것으로 간주되지 않는다. 본원에 기술된 바와 같이 사용됨에 있어서 필수적인 것은 아니면서 50㎛를 초과하는 돌출부 또는 함몰부는, 장치가 실질적으로 편평한 것으로 간주되는 것을 방해하지 않는다. 크기가 50㎛ 초과인 유체 채널 및/또는 상기 유체 채널을 생성하는 구조는 또한 장치가 실질적으로 편평한 것으로 간주되는 것을 방해하지 않는다.
본원에 시용된 "가상 웰(virtual well)"이란, 원하는 반응 또는 상호 작용에 필요한 기간 동안, 관심 있는 종 또는 종 세트, 통상적으로는 DNA 또는 비드가 이웃하는 "가상 웰"로 실질적으로 이동하지 않는, 국소 전기장 또는 국소 자기장 감금 대역을 말한다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 본 발명은 서열 결정 화학 과정을 수행하기 위한 자동화 재사용 가능 시스템을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 상기 시스템에 의해 수행되는 화학적 방법은 합성에 의한 서열 결정(도 3에 개략적으로 나타내어져 있음)을 포함할 수 있는데, 여기서 dNTP는 DNA 콜로니, 상보성 프라이머 및 중합 효소를 포함할 수 있는 복합체와 결합한다. 상기 중합 효소는 dNTP를 성장 중인 확장 프라이머에 혼입하여, 상기 혼입 과정의 부산물로서, 전자 센서에 의해 검출될 수 있는 수소 이온, 피로포스페이트 및 열을 형성한다. 염기 혼입이 일어났는지 여부, 또는 혼입이 다수 회 일어났는지 여부를 측정함으로써, 그리고 상기 혼입 전에 어떠한 시약이 전달되는지 파악함으로써, 상기 DNA 서열이 결정될 수 있다.
자기 어레이
본 발명은 자기 어레이와, 폴리뉴클레오티드 증폭 및 서열 분석용 자기 어레이를 사용하고, 이에 의하여 신속하며, 편리하고/편리하거나 비용이 적게 드는 DNA 서열 결정 방법을 제공한다. 상기 자기 어레이는 표면 상에 다수의 자기 영역을 가져서 어레이를 형성하는 기판을 포함할 수 있으며, 국소화된 자기장은 본원에 기술된 바와 같은 자성 비드를 포집하는데 충분하다. 국소화된 자기 특징은 영구적 자성 재료(예를 들어, 강자성 재료)로 형성될 수 있거나, 아니면 전기장에 의해 비영구적으로 자기화(및 소자화)될 수 있다.
예를 들어 본원에 참고로 포함되어 있는 미국 특허 제7,682,837호에 기술되어 있는 바와 같이, 어레이는 공지된 기판 재료들 중 임의의 것으로 형성될 수 있다. 임의의 구체예에서, 상기 기판 재료는 실리콘, 실리콘 기반 재료, 유리, 변형 또는 기능화된 유리, 플라스틱, 금속, 세라믹 플라스틱 또는 이것들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 기판은 일반적으로 비 자성 재료이다.
국소화된 자기 특징은 영구적 자성 재료(예를 들어, 강자성 재료)로 형성될 수 있거나, 또는 비영구적(예를 들어, 전자기 유도 영역)일 수 있다. 임의의 구체예에서, 다수의 국소화된 자기 특징은 자성 재료로부터 형성될 수 있고, 각각의 영역은 실질적으로 균일한 크기와 형태를 가지므로 어레이(예를 들어, 격자 유사 패턴)를 형성할 수 있으며, 이로써 국소화된 자기 특징 다수개 또는 이것의 어레이를 형성할 수 있다. 다른 구체예에서, 자기 특징은 균일하지 않을 수 있다. 예시적인 구체예에서, 자기 특징은 자기 바(magnetic bar)일 수 있는데, 이 바는 적어도 부분적으로, 예를 들어 알루미늄, 코발트, 사마륨, 네오디뮴, 붕소, 구리, 지르코늄, 백금, 크롬, 망간, 스트론튬, 철 및/또는 니켈과 이것들의 합금을 포함하는 자성 재료로 형성될 수 있으며, 기타 다른 재료 및 소자를 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 자기 특징은 적어도 부분적으로 니켈과 백금의 합금(예를 들어, 약 50%:50% 합금), 또는 코발트와 백금의 합금(Co 80%: Pt 20%), 또는 코발트, 크롬 및 백금의 합금으로 형성될 수 있다. 국소화된 자기장은 기판 상의 웰 내부에 형성될 수 있거나, 또는 대안적으로 상기 기판은 웰을 포함하지 않아서, 증폭 또는 서열 결정에 사용되는 시약들이 기판 표면을 자유롭게 흐를 수 있게 하고, 이로써 시약의 연속 첨가 및 제어(예를 들어, 서열 결정용 NTP의 연속 첨가)가 간단해 질 수 있는데, 이를 통하여 장기 판독 서열 결정시 신호 대 노이즈 비율 및 영위상화(dephasing)가 직접적으로 개선될 수 있다.
추가의 구체예에서, 웰 구조, 함몰부, 돌출부 또는 기타 다른 비드 또는 입자의 이동을 제한하는 수단은 국소화된 자기장과 결합하여 사용되어, 고정된 위치에 비드 또는 입자를 보류할 수 있으며, 그 결과 비드 포착 특징을 형성할 수 있다.
국소화된 자기 특징(예를 들어, 자기 바)을 형성하는데 다양한 제작 방법이 사용될 수 있다. 임의의 구체예에서, 국소화된 자기 특징 또는 자기 바는 모서리가 예리한데, 이는 자기 층을 대상으로 포토리소그래피와 스퍼터링을 수행함으로써 제작될 수 있다. 다른 구체예에서, 국소화된 자기 특징(예를 들어, 바)은 자기 층을 스퍼터링/코팅한 후, 포토리소그래피를 수행하고 나서, 다시 이온-밀링(ion-milling)하여 과량의 재료를 에칭하여, 예리하거나 특정 각도를 가지는 모서리를 형성함으로써 제작될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 제작은 다층 레지스트 리소그래피를 이용할 수 있다.
국소화된 자기 특징은 단일 도메인 상태로 구성될 수 있다. 상기 국소화된 자기 특징은, 강자성 재료와 다른 재료(예를 들어, 크롬)의 중간층 사이에서 교호하는 다수의 층으로 제작될 수 있어, 다층 자기 구조의 보자성을 개선할 수 있다. 교호 층들 이외에도, 재료(예를 들어, 탄탈륨, MgO 또는 기타 다른 당업계에 공지된 적당한 재료)의 시드층(seed layer) 및 보호층이 존재할 수 있다. 다수의 교호층, 예를 들어 2개 내지 40개의 층, 예를 들어 2개 내지 4개의 층, 5개 내지 10개의 층, 10개 내지 16개의 층, 16개 내지 30개의 층 또는 32개 이상의 층이 존재할 수 있다. 그레인(grain)의 배향은 국소화된 자기 특징 상 장축에 대하여 평형일 수 있다. 상기 층들의 두께는 각 층에 있어서 5㎚ 내지 15㎚ 또는 그 이상으로 다양할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 국소화된 자기 특징은 길이가 약 20마이크론이고 폭이 1마이크론 내지 2마이크론인 직사각형의 프리즘 형태일 수 있으며, 비드 또는 입자를 고정하기 위한 갭은, 상기 비드의 직경이 4.5마이크론일 때, 2마이크론 내지 3.5마이크론일 수 있다. 상기 길이, 폭 및 갭은 모두 더 크거나 더 작은 비드 또는 입자에 적절하도록 증가 또는 감소될 수 있다. 예를 들어 2.8마이크론 비드에 있어서, 국소화된 자기 특징은 길이가 10마이크론이고 폭이 1마이크론 내지 2마이크론일 수 있으며, 상기 비드 또는 입자를 고정하기 위한 갭은 1.25마이크론 내지 2.5마이크론일 수 있다.
어레이는 고밀도 또는 저밀도 어레이일 수 있다. 상기 어레이는 일반적으로 1㎟당 100개 이상의 자기 영역들을 포함하고, 임의의 구체예에서 상기 어레이는 1㎟당 1,000개 이상의 국소화 자기 특징들을 포함하며, 임의의 구체예에서 상기 어레이는 1㎟당 100,000개 이상의 국소화 자기 특징들을 포함한다. 상기 어레이는 1,000개, 2,000개, 4,000개, 5,000개, 10,000개, 100,000개, 1,000,000개, 10,000,000개 또는 100,000,000개 이상의 국소화 자기 특징들을 포함할 수 있다.
국소화 자기장은 (자기력에 의해) 크기가 50㎛ 이하인 자기 입자를 포집하기에 충분할 수 있다. 임의의 구체예에서, 국소화 자기장은 크기가 20㎛ 이하, 5㎛ 이하, 500㎚ 이하 또는 50㎚ 이하인 자기 입자들을 포집하기에 충분할 수 있다. 임의의 구체예에서, 비드는 직경이 약 3㎛ 내지 약 5㎛이며, 다른 구체예에서, 비드는 직경이 약 0.5㎛ 내지 3㎛이다. 자기 입자는 강자성, 상자성 또는 초상자성일 수 있으며, 적당한 재료는 미국 특허 제7,682,837호에 기술된 바와 같이 널리 공지되어 있다. 상기 비드는, 예를 들어 높이 약 5㎛ 내지 50㎛(예를 들어, 약 15㎛)인 채널을 통과하여 흐름으로써 어레이로 이동될 수 있다. 상기 채널의 폭은 다양할 수 있으나, 몇몇 구체예에서는 약 500㎛ 내지 1㎜(예를 들어, 약 800㎛)일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 채널의 폭은 1㎜ 내지 20㎜ 또는 그 이상일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 채널은 높이 조절을 더 잘 할 수 있는 지지 기둥 또는 리브(rib)를 가질 수 있다. 다른 구체예에서, 평행 채널은 단일 샘플에 대한 더 많은 어레이 위치들을 수용하거나 다수의 샘플을 수용하는데에 이용될 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 자기 어레이 없이 자성 비드 또는 입자가 사용되는 경우, 상기 자성 비드는 균일한 간격으로 단일층으로 자가 조립될 수 있다. 다른 구체예에서, 자가 조립 비드 또는 입자는 비자성일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 센서와 연계된 함몰부는 1 대 1 상호 반응을 용이하게 할 수 있으며, 비드와 센서 사이에 더 잘 배열하여 검출이 더 잘 되게 할 수 있다. 조건이 결합을 적당하게 만든 후 비드와 센서를 정렬시킬 수 있도록 하기 위해서 상기 비드의 느린 병진 또는 이동이 적당할 수 있다. 이와 같은 병진 또는 이동은 다차원적으로(예를 들어, x, y 및 세타) 일어날 수 있으며, 센서의 간격과 비드의 크기를 수용하는 거리와 시간 내에서 다양하게 움직임이 변할 수 있다. 다른 구체예에서, 환형 유체 이동은 비드 부하율을 높이는 것을 보장하는데 사용될 수 있다.
웰이 깊은 디자인에서, 비드 또는 입자는 유체 흐름에 충분히 접근하지 않을 수 있다. 몇몇 구체예에서, 비드 또는 입자는 장치의 표면 위로 돌출될 수 있으므로, 상기 비드 또는 입자는 유체 흐름에 더 용이하게 접근할 수 있다. 결과적으로, 비드는 시약 도입에 더 신속하게 반응할 수 있어서, 더 우수하고 더 신속하며 더 효율적으로 세정 및 반응이 수행될 수 있다.
도 1a는 자기 어레이(104A)에의 비드(102)의 첨가를 개략적으로 예시한다. 도 1b는 어레이(104B) 상의 체류 영역과 1 대 1로 대응하여 상기 비드가 배치된 것을 개략적으로 예시한다. 도 1c는 비드가 세정되어 떨어져 나가서 다음 샘플용으로 사용할 준비가 된 후의 센서 어레이를 나타낸다.
도 1d는 본 발명의 다양한 구체예를 예시하며, 여기서 자성, 상자성, 비 자성 입자 또는 이것들의 조합은 자성을 띄는 센서 어레이(104C), 전기적 감금현상이 있는(나타내지 않음) 센서 어레이 또는 자가 조립된 입자를 가지는 센서 어레이(104D)와 함께 사용되는, 구형 이외의 형태를 가질 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 입자들은 실질적으로 편평할 수 있다. 실질적으로 편평한 입자는 둥근형, 직사각형(106A), 별 모양 또는 육각형(106B)일 수 있거나, 아니면 다른 형태일 수 있다. 다른 구체예에서, 입자는 수지상 구조, 예를 들어 자가 조립된 3D DNA 네트워크에 의해 형성된 수지상 구조일 수 있어서, 상기 입자의 표면적이 증가할 수 있다. 상기 수지상 입자는 일반적으로 구형, 실질적으로는 편평형, 타원형 또는 기타 다른 임의의 형태일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 프라이머는 상기 수지상 입자에 부착될 수 있다. 다른 구체예에서, DNA 나노볼은 수지상 입자 또는 기타 다른 형태의 입자 또는 비드에 부착될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 입자는 다공성이거나 부분적으로 다공성일 수 있으며, 만일 상기 입자가 다공성이거나 부분적으로 다공성이면, 공극의 크기는 적당하게 프라이머 연장 서열 결정 또는 기타 다른 방법에 필요한 DNA, 중합 효소, dNTP 및 기타 다른 부의 자유로운 이동을 허용하는데 충분한 정도의 크기를 가질 수 있다. 본 발명의 비드가 사용되는 모든 장소에 있어서, 상기 비드는 본원에 기술된 바와 같은 임의의 형태를 가질 수 있다고 가정될 수 있다.
도 2a 및 2b는 본원의 다양한 구체예에 기술된 바와 같은 자성 비드로 충전된 국소화 자기 어레이의 현미경 사진으로서, 이 사진은 통상적으로 점유 수준이 높아질 수 있다는 것과 본 발명의 추가의 구체예를 예시하고 있으며, 여기서 단일 자성 또는 상자성 비드는 자기 어레이 내 단일 위치의 제 자리에 고정될 수 있다. 상기 비드는 크기별로 분류될 수 있고, 그 결과 각각의 센서 상에는 오로지 하나의 비드만이 차지하기 충분한 공간이 존재할 수 있게 되므로, 어레이 위치 및 비드 간 1 대 1 상호 반응이 제공될 수 있다. 비록 각각의 센서 상에는 오로지 하나의 비드만이 차지할 공간이 존재할 수 있긴 하지만, 비드가 센서에 근접하여 정렬될 수 있을 때에 비드 간에 부가의 간격이 존재할 수 있으므로, 센서 간 크로스토크(cross-talk)는 감소될 수 있다. 예를 들어, 센서(가로 8마이크론일 수 있음) 상에 위치하는 비드 세트는 직경이 10마이크론일 수 있으며, 상기 센서는 15마이크론 간격으로 떨어져 존재하므로, 비드 간 간격은 5마이크론일 수 있다. 만일 센서 상에 체류할 비드 2개가 차지할 공간이 불충분하면 센서의 크기는 비드보다 클 수 있다. 비드, 센서 및 간격의 크기는 다양할 수 있다. 다른 구체예에서, 비드는 크기가 10마이크론 초과, 예를 들어 15마이크론, 20마이크론, 25마이크론 또는 그보다 초과일 수 있다. 추가의 구체예에서, 비드는 10마이크론 미만, 예를 들어 5마이크론, 3마이크론, 2마이크론, 1마이크론 또는 1마이크론 미만일 수 있다. 센서는 비드가 크기에 따라서 정렬되도록 크기별 분류될 수 있으므로, 가로 8마이크론 초과 또는 미만일 수 있으며, 잠재적으로는 가로 1마이크론 미만으로부터 1마이크론, 2마이크론, 3마이크론, 5마이크론, 10마이크론, 15마이크론 또는 20마이크론 이상의 범위일 수 있다. 센서 간 간격은 또한 15마이크론 초과일 수 있거나, 또는 15마이크론 미만일 수 있으며, 센서 간격은 센서 간 1마이크론 미만으로부터 1마이크론, 2마이크론, 3마이크론, 5마이크론, 10마이크론, 15마이크론, 20마이크론, 25마이크론 이상의 범위일 수 있다. 센서는 정사각형, 직사각형, 육각형 또는 기타 다른 2차원 패턴으로 정렬될 수 있다. 주로 DNA 사용 분야, 예를 들어 증폭, 실시간 PCR, 서열 결정, 디지털 PCR 또는 DNA 혼성화 프로브 어레이에 대해 본원에 기술되어 있지만, 자기 어레이는 기타 다른 분야, 예를 들어 항체 또는 기타 다른 단백질을 이용 및/또는 검출하는 방법 또는 분야에서 사용될 수 있다.
직경 4.5um인 자성 비드에 관한 몇몇 구체예에서, 비드 부하가 국소화된 자기장에 의한 포착을 허용할 비드의 유속은 0.07㎜/초 내지 0.14㎜/초인 것이 바람직할 수 있다. 자성 비드의 탈부하를 막기 위한 시약 전달시 유속은 1.4㎜/초 내지 4.2㎜/초인 것이 바람직할 수 있다. 비드를 제거할 때의 유속은 5.6㎜/초를 초과하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 구체예에서, 공기 방울의 사용은 비드를 제거하는데 사용될 수 있다. 비록 비드 크기와 유속 간 관계는 선형일 수 없지만, 더 크고 더 작은 비드가 더 빠르고 더 느린 유속으로 사용될 수 있다.
기타 다른 재사용 방법
서열 결정 사이클 한 세트가 종료된 후, 프라이머는 분리되어 재배치될 수 있다. 완충 조건(예를 들어, 낮은 pH에서 고 농도 GuHCl)은 바이오틴 스트렙타비딘 결합을 약화시키도록 변경될 수 있으며, 대안적으로 온도는 바이오틴 스트렙타비딘 결합을 파괴하도록 70℃ 초과로 상승될 수 있다. 더 낮은 온도는 또한 이온 세기가 작은 완충액, 예를 들어 염 농도가 마이크로몰 단위인 완충액과 함께 사용될 수도 있다. 상기 조건의 조합, 예를 들어 높은 온도 및 이온 세기가 작은 완충액이 또한 사용될 수 있다. 이와 유사하게, 티올 결합들은 고온에서 파괴될 수 있다. 중합 효소 및 DNA에 대한 손상은 더 이상 중요하지 않을 수 있고, 서열 결정 반응은 이미 종료되었으므로, 공격적인 수단이 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 유기 시약은 연장된 프라이머와 표면 사이의 결합, 예를 들어 공유 결합을 파괴하는데 사용될 수 있다. 연장된 프라이머가 제거된 후, 새로운 프라이머가 센서 위 공간으로 흘러들어가서, 장치가 DNA 샘플의 또 다른 세트를 대상으로 진행될 서열 결정 사이클의 또 다른 세트에 다시 사용될 수 있게 한다. 상기 새로운 프라이머는 단일 상 액체 중에서 결합될 수 있다. 상기 새로운 프라이머는 또한 센서에 프라이머가 결합하거나 회합하는 것을 도와주는 프라이머를 함유하는 유체 중에 포함되어 있는 추가 시약들을 가질 수도 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 상기 새로운 프라이머는 증폭 반응에서 사용되어, 후속 서열 분석에 사용될 새로운 클론 군집을 생성할 수 있다. 상기 증폭은 PCR 또는 등온 증폭일 수 있다.
추가의 구체예에서, 증폭 또는 서열 결정 어레이는 비드를 제거함으로써 재사용될 수 있다. 상기 제거는, 예를 들어 영구 자석을 이동시키거나 전자석을 활성화하여, 상기 증폭 또는 서열 결정 어레이 내에 고정되어 있는 비드 또는 입자를 끌어당기거나, 움직이게 하거나 또는 탈부하하였을 때 형성되는 외부 자기장의 인가에 의해 이루어질 수 있다.
상기 비드 또는 입자가 바이오틴 스트렙타비딘 결합, 티올 결합, DNA, LNA, PNA 또는 기타 다른 핵산 유사체 혼성화 등을 통하여 제 위치에 고정되는 대안적 구체예에서, 상기 결합의 해리는 이 결합을 가역적으로 파괴하도록 상기 비드 또는 입자에 근접하는 유체 환경 및/또는 온도에 변화를 줌으로써 이루어질 수 있어, 새로운 비드 또는 입자는 추후 증폭 또는 서열 결정 어레이 내에 결합 또는 회합될 수 있다.
서열 결정
도 3 및 4는 뉴클레오티드가 성장 중인 DNA 가닥에 혼입될 때 관여하는 반응의 계략적인 예시로서, 이 도면들은 피로포스페이드의 해리 및 이에 수반되는 pH의 증가를 나타낸다. 및 열 방출을 나타낸다. 본원에 기술된 바와 같이, 통합형 서열 결정 플랫폼은 DNA를 "전기에 의해 서열 결정"하도록 pH 변화 또는 전하 농도 또는 이동도의 변화를 전자 검출하도록 구성된 전자 인식 서브시스템을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 전자 인식 서브시스템은 DNA를 "전기에 의해 서열 결정"하는 반응에 의한 온도 변화를 전자 검출하도록 구성될 수 있다.
도 5a는 2개의 비드 세트를 도시한 것으로서, 이 비드 세트들 중 하나는 DNA의 클론 세트가 결합 또는 부착되어 있고, 다른 하나는 DNA의 클론 세트가 결합 또는 부착되어 있지 않다. 이러한 시스템은 기준 비드로서 사용되도록 클론 DNA가 결합 또는 회합되어 있지 않은 비드의 사용을 허용하고, 오프셋, 뉴클레오티드 및 기타 다른 시약의 전하, 온도, 유체 흐름 및 압력, 완충액의 농도 변화 및 기타 다른 제거될 시스템 변수를 없앨 수 있다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, 개략적 시스템(510)에서 시스템 변수들의 상기 제거는 아날로그 삭감(analog subtraction)을 이용하였을 때 적어도 하드웨어 내에서 이루어질 수 있다. 다른 구체예에서, 시스템 변수들의 제거는 소프트웨어 및/또는 외부 하드웨어에서 수행될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 국소 하드웨어 및 소프트웨어 및/또는 외부 하드웨어의 조합이 사용될 수 있다. 도 5b는 결과 데이터를 도시한 것으로서, 여기서 대부분의 추정 혼입 반응들은 반응이 일어나지 않았다는 것을 말해주는 신호 레벨을 발생시키는 한편, 일부 추정 혼입 반응들은 혼입 현상이 1회 발생하였음을 말해주는 신호 레벨을 발생시키며, 나머지 추정 혼입 반응들은 클론 DNA의 동종 중합체 영역에서 혼입 현상이 다수 회 발생하였음을 말해주는 신호 레벨을 발생시킨다.
추가의 구체예에서, 전자 인식 서브시스템은 다량의 용액 중에서의 전도도 변화, 센서 표면을 가로질러 발생하는 전도도 변화(센서에 결합된 부 또는 센서 표면의 디바이 거리 내의 부에 기인함), 비드 또는 입자의 표면을 가로질러 발생하는 전도도 변화(비드나 입자에 결합된 부 또는 비드나 입자 표면의 디바이 거리 내의 부에 기인함), 또는 이와 같은 경우들의 조합에서의 전도도 변화를 검출할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 전자 인식 서브시스템은 센서 표면 또는 이 표면의 근처, 비드나 입자 표면 또는 이 표면의 근처에서의 전하량 변화를 검출할 수 있다. 예를 들어, 전자 인식 서브시스템은 센서, 비드 또는 입자 표면의 디바이 거리, 또는 표면, 비드 또는 입자와 결합된 부의 디바이 거리 내의 전하량 변화를 검출할 수 있다.
도 6은 나노센서(604), 그리고 서열 결정 시스템과 전기적으로 소통하는 미세 유체 채널과 회합된 일련의 나노센서들(610)의 개략적인 예시를 포함한다. 나노센서들에는 클론 DNA(602)가 직접 회합 또는 결합되어 있을 수 있으며, 각각의 나노센서에는 전극 또는 자기 소자(608)가 회합되어 있을 수 있다. 다른 구체예에서, 센서는 비드 상의 클론 DNA의 전하량 변화, 상기 클론 DNA 또는 혼입으로 인해 생성된 부산물과 회합된 반대 이온의 변화를 검출할 수 있다. 나노센서(604)는 온-칩 신호 증폭에 대한 신호 증폭기(606)를 추가로 포함할 수 있다. 나노센서(604)는 공지된 절연체 재료, 예를 들어 SiO2, Al2O3, SiN 및 TaO2 중 임의의 것을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 구체예에서, 나노센서는 절연체 층에 의해 분리된 동축 및/또는 평행 전도성 층들을 포함할 수 있다. 상기 전도성 층들은 임의의 적당한 재료, 예를 들어 금, 백금, 알루미늄, 탄소 또는 폴리실리콘으로 형성될 수 있다.
(자성) 비드 및 DNA 단편은 서열 결정 시스템으로 운반될 수 있다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 서열 결정 시스템은 서열 결정 시스템 내에 한정된 미세 유체 채널과 소통하는 일련의 나노센서(708)를 포함할 수 있다. 비드 또는 입자(702)는, 몇몇 구체예에서는 국소화 자기장을 형성할 수 있으며, 다른 구체예에서는 국소화 전기장을 형성할 수 있는, 자기 소자 또는 전극 소자(710)에 의해 상기 센서(708) 상에 배치될 수 있는데, 여기서 상기 센서(708) 및 자기 소자 둘다는 기판(712)과 회합된 상태로 구성될 수 있다. 상기 비드 또는 입자(702)에는 클론 DNA(704)가 결합 또는 회합되어 있을 수 있다. 그 다음, 서열 결정 반응을 개시하기 위해서 뉴클레오티드, 프라이머, 마그네슘 및 중합 효소를 포함할 수 있는 시약(706)이 제공될 수 있다. 다른 구체예에서, 자기 소자 또는 전극 소자(710)가 자기 소자일 때, 이 소자는 영구 자기 소자 또는 전자기 소자일 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 자기 어레이를 사용하여 국소화된 자기 특징 어레이를 형성함으로써 폴리뉴클레오티드를 서열 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 자기 어레이와 다수의 자성 비드를 접촉시키는 단계를 포함하는데, 상기 자성 비드는 각각 상기 어레이에 부착되어 있으며, 클론으로서 증폭된 DNA 분절은 단일 가닥, 부분 이중 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥인지, 부분 이중 가닥인지 또는 이중 가닥인지 여부에 따라서, 주형 DNA는 변성에 의해 단일 가닥 DNA로 전환될 수 있으며, 서열 결정용 프라이머는 서열 결정용으로 준비된 단일 가닥 DNA에 혼성화될 수 있다.
염기 호출(base-calling) 이후, 어레이 상 각각의 위치에 기록된 서열은 조립될 수 있다. 예를 들어, 어레이 각 위치에서 단편의 동일성이 알려져 있지 않을 수 있거나, 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 서열(예를 들어, 야생형 서열)을 기준으로 조립될 수 있는 샷건(shot-gun) 서열 결정 방법을 사용함으로써 조립될 수 있다.
클론 DNA 서열은 각각 뉴클레오티드 혼입에 대한 주형으로서의 역할을 하는 단일 가닥 영역을 가질 수 있다. 상기 단일 가닥 영역은 길이가 10개 염기 이상일 수 있거나, 몇몇 구체예에서 상기 단일 가닥 영역은 길이가 300개 염기 이상일 수 있거나, 다른 구체예에서, 상기 단일 가닥 영역은 길이가 1kb 이상일 수 있다. 그러므로 본 발명은 길고 정확하며 비용 효율적인 판독물을 제공한다. 본원에 정의된 바와 같이, 하나 초과의 폴리뉴클레오티드 증폭 군집이 하나의 클론 군집에 존재할 수 있으며, 이 경우 폴리뉴클레오티드의 증폭된 상이한 군집은 상이한 프라이머를 가질 수 있으므로, 별도의 서열 결정 반응들은 단일 클론 군집 내에서 증폭된 군집 각각을 대상으로 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 자기 어레이는 미세 환경의 pH 변화를 측정하는 인접 나노센서를 포함하며, 상기 미세 환경은 국소화 자기장에 의해 고정되는 비드와 인접한 환경 포함한다. 이러한 양태에서, 마이크로어레이는 DNA를 전자 서열 결정하는데 유용할 수 있다. pH 변화를 검출하여 서열 결정하는 방법은 일반적으로 미국 특허 공개 제2008/0166727호에 기술되어 있으며, 이는 본원에 전체가 참고로 포함되어 있다. 폴리뉴클레오티드의 혼입을 검출하는 대안적 방법, 예를 들어 고온 서열 결정법(예를 들어, 미국 특허 공개 제2008/0166727호에 기술된 바와 같음), 전하 농도 검출법, 하전된 종과 부산물의 이동도 분석법 및 공지된 광학 검출법 등이 사용될 수 있다.
자기 어레이는 국소화된 자기 특징들이 다수 존재하여 어레이를 형성하는 기판을 포함하는데, 국소화된 자기장은 본원에 기술된 바와 같이 자성 비드를 포집하는데 충분하다. 상기 국소화된 자기 특징들은 영구 자성 재료(예를 들어, 강자성 재료)로 형성될 수 있거나, 전기장에 의해 비영구적으로 자기화(및 소자화)될 수 있다.
다른 구체예에서, 전기장은 이후 본원에 기술될 바와 같이, 하나의 위치에 비드 또는 입자를 고정 또는 체류시키는데 사용될 수 있다.
검출기
자성 또는 상자성 비드 또는 입자는 국소화 자기장 어레이를 형성하는 자기 어레이에 의해 인식 영역이나 이 영역에 인접한 곳의 제 자리에 고정될 수 있다. 체류된 자성 또는 상자성 비드는 DNA의 모노클론 군집을 가질 수 있다. 상기 비드는 크기에 따라서 분류될 수 있는데, 이로써 각각의 센서 상에는 단 하나의 비드가 들어가기 충분한 공간이 존재할 수 있으므로, 센서와 비드 간 1 대 1 상호 반응을 제공할 수 있다. 각각의 센서 상에 단 하나의 비드가 차지할 만큼의 공간이 존재할 수 있지만, 비드가 센서 상에 정렬될 수 있을 때 비드 사이에 추가 간격이 존재할 수 있으므로, 센서 간 크로스토크는 감소할 수 있다.
자기 서열 결정 어레이는 다수의 나노센서를 포함하는데, 이 경우 국소화 자기장 각각의 근처(미세 환경)에는 하나 또는 2개 이상의 나노센서가 존재한다. 상기 나노센서는 각각의 미세 환경(예를 들어, 각각의 국소화 자기장 근처)에서 pH 또는 전하 농도의 미세한 변화를 검출하기 위하여 높은 감수성을 가진다. 예를 들어, 어레이는 나노센서를 1000개 이상, 나노센서를 2000개 이상, 나노센서를 4000개 이상, 나노센서를 10,000개 이상, 나노센서를 100,000개 이상, 나노센서를 1,000,000개 이상, 나노센서를 10,000,000개 이상 또는 나노센서를 100,000,000개 이상 포함할 수 있다. 상기 나노센서는 이온(H+) 농도의 증가, 또는 중합 반응 진행시 또는 상응하는 미세 환경에서 DNA와 회합되어 있는 반대 이온의 증가를 측정하는데 충분한, 2개의 말단부를 가지는 측정 전극을 포함할 수 있다.
나노센서는 충분한 간격(예를 들어, 20㎚ 내지 30㎚의 간격)을 두고 떨어져 있으며, 상응하는 미세 환경의 이온 농도 변화를 검출하도록 구성된, 포지티브 및 네거티브 말단을 가지는 측정 전극을 한쌍 이상 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 전극들 간 간격은 100㎚ 내지 500㎚ 또는 1000㎚ 내지 5000㎚일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 나노센서는, 비드 및 다른 재료 상 생물 물질의 화학 반응 또는 혼입 현상에 대한 결과로서 상응하는 미세 환경의 이온 농도 변화에 의해 유발되는 미세 환경 내 유체의 임피던스 변화를 검출할 수 있다. 대안적인 구체예에서, 상기 센서는 명칭이 "Biosensor Devices, Systems and Methods Therefore"인 미국 가출원 제61/389,590호에 기술된 바와 같은 저항성 반도체 소자일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 나노센서는, 명칭이 "Gene detection field-effect device and method of analyzing gene polymorphism therewith"인 미국 특허 제7,695,907호, 명칭이 "Methods and Apparatus for Measuring Analytes Using Large Scale FET Arrays"인 미국 특허 제7,948,015호, 명칭이 "pH Measurement for Sequencing of DNA"인 미국 특허 출원 제2011/0171655호 및 명칭이 "Nano-Sensor Array"인 미국 특허 출원 제13/118,044호에 기술된 바와 같이 켐FET 또는 ISFET일 수 있으며, 이들 문헌 각각은 본원에 전체가 참고로 포함되어 있다. 나노센서라는 용어가 본원에 사용되는 모든 경우에 있어서, 이는 상기 기술한 바와 같은 전극 세트인 것으로 간주될 수 있거나, 또는 저항성 반도체 소자일 수 있거나, 또는 ISFET 또는 켐FET 또는 전술한 센서들의 조합일 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 상이한 인식 방법의 조합, 예를 들어 나노니들 및 나노브릿지, 또는 ISFET 및 나노니들이 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상이한 센서들은 표적 부들과 연관된 상이한 특성들을 인식할 수 있다. 예를 들어, 나노니들은 표적부와 결합 또는 회합된 부들의 전도도를 검출할 수 있는 한편, 나노브릿지는 표적부와 결합 또는 회합된 전하를 검출할 수 있다.
도 8a는 나노센서 어레이의 현미경 사진과, 하나의 나노센서(802)를 확대한 현미경 사진을 나타낸다. 임피던스 측정값은 혼입된 뉴클레오티드를 검출하기 위한 나노센서에 의해 사용될 수 있다. 임피던스의 측정으로 H+ 이온 피로포스페이트의 해리 또는 중합 반응에 의한 전하의 국소 변화를 검출한다. 일반적으로 작동 주파수(frequency of operation)는, 반응 개시시 임피던스에 대한, 반응 전반에 걸친 임피던스의 최대 변화에 대해 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 기하학에 있어서 주파수는 약 0.1KHz 내지 9KHz일 수 있다. 대안적 기하학에 있어서, 주파수는 10KHz 이상일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 나노센서에는 반응의 H+ 이온 해리 여부 또는 pH 변화를 검출하기 위해, pH 감수성 재료(예를 들어, 산화 환원 감수성 재료)를 포함하거나 포함하지 않는 전극 한쌍이 장착될 수 있다. 예를 들어 임피던스 측정값은, 주기적 부 신호를 이용하여 -A 볼트에서 +A 볼트에 이르기까지, 또는 그 반대로 소인하면서 전류를 측정함으로써 구하여질 수 있다. 진폭이 A보다 작고, 주파수가 약 25Hz 이상인 펄스파가 적용될 수 있다. 전압 소인이 행해질 때 전류의 측정으로 나노센서에 근접한 용액에서의 pH 변화를 나타낼 수 있다. 도 8b는 상기 나노센서(802) 어레이의 개략적인 예시를 나타내며, 여기서 온칩 증폭기(on chip amplifier)(804)는 각각의 나노센서와 결합될 수 있다.
도 9는 서열 결정 시스템 내 나노센서(902) 어레이의 개략적인 예시이다. 상기 나노센서는 유전체(906)에 의해 분리된 2개의 전극(904)을 포함할 수 있다. 도 9에는 나노센서 어레이를 포함하는 것으로 나타내어져 있지만, 다른 구체예에서는 임피던스, 전하 또는 전류 측정을 통해 이온 구성 또는 pH 변화를 검출하기 위해 하나의 전극쌍으로 측정이 수행될 수 있다.
시스템은 다음과 같이 서열 분석을 위해 교정될 수 있다. 다양한 환경원으로부터 유발되는 일반적 노이즈와 신호(예를 들어, 온도에 의한 노이즈, 혼합 또는 유체 노이즈, 또는 뉴클레오티드 전하 또는 기타 다른 시약에 의한 영향)를 줄이기 위해서, DNA를 가지지 않는 비드 하나 또는 다수개는 DNA로 코팅된 비드와 유사한 환경에 위치할 수 있다. 2개의 센서로부터 발생하여 기록된 신호들을 시차를 두면서 측정하는 것(DNA가 코팅된 비드 및 DNA를 가지지 않는 비드 또는 비드를 가지지 않는 센서의 미세 환경을 탐지하는 것)은 노이즈를 극적으로 감소시키고, 그 결과 검출시 신호 대 노이즈 비율이 개선된다. 몇몇 구체예에서, 다수의 국소 기준 센서들은 국소 평균 기준치를 형성하기 위해 합하여질 수 있다. 다른 구체예에서, 자기 특징은 비드가 존재하지 않는 센서 위치를 형성하면서 사라질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 시차 측정은, 이웃하는 DNA 비드(사이클 내 무반응)와 동일한 사이클에 참여하는 관심 비드를 비교함으로써 행해질 수 있다. 다른 구체예에서, 시차 측정용 이웃 비드는 실질적으로 동시에 유체 흐름을 수용하는 영역, 또는 DNA를 가지지 않는 비드 또는 DNA를 가지는 비드, 그리고 사이클 내 반응이 진행되지 않는 비드로부터 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 1회 초과의 사이클에 대한 백그라운드 신호들은 평균내어 사용될 수 있다. 상기 센서와, 유체 또는 표적부와의 접촉 또는 이것과의 상호 작용으로부터 차단되는 또 다른 센서를 사용하는 시차 측정법이 수행될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 통합형 서열 결정 플랫폼은 더 우수한 신호 대 노이즈 비율을 만들 수 있으며, 서열 결정 탐지에서 양자(H+ 이온) 및 OH- 효과로부터 발생하는 노이즈의 수준을 감소시킬 수 있고/있거나 가상 웰 내 격리를, 공지의 시스템과 방법을 사용하였을 때 얻어질 수 있는 경우보다 더 우수하게 만들 수 있다. 더 구체적으로, 몇몇 구체예에서, 시스템 및 방법은 상기 진술한 바와 같이, 성능을 개선하도록 구성된 완충 매질을 사용할 수 있다. 상기 완충액은 H+(양자) 이온에 대한 확산 계수 및 이동도가 물의 상기 이온에 대한 확산 계수 및 이동도와 상이할 수 있다. 상기 완충액은 또한 H+ 및 OH-에 대한 계수에 있어서 상이한 변화를 가질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 완충 매질은 물과 매우 유사하지만, H+ 이동도는 상이한 물질, 예를 들어 산화 중수소(D2O 또는 중수) 또는 이의 기능을 가지는 임의의 일반 물질일 수 있다. 이동도의 차이는 중합 반응에서 해리된 H+ 이온의 이동을 느리게 만들 수 있다. 다른 양태에서, 완충 매질은 H+ 이온 및/또는 상이한 물질, 예를 들어 DNA, 뉴클레오티드, 프라이머 또는 기타 다른 부에 대한 이동도가 상이한 재료를 포함할 수 있으며, 겔 타입 재료일 수 있다. 겔 타입 재료는, 겔 타입 재료 내에 해리된 H+ 이온에 대한 이동도 및 확산 계수가 상이하여 검출을 더 용이하게 만들 것이고, 그 결과 신호 대 노이즈 비율을 더 우수하게 만들 것이다.
서열 결정용 시스템을 교정하고, 개별 센서로부터 발생되어 기록된 신호가 적당하고 정확할 수 있다는 것을 확인하기 위해, 뉴클레오티드의 공통 서열은 서열 결정될 모든 주형 DNA 가닥에 내포될 수 있다. 이러한 공통 서열은 증폭 프라이머를 고안함으로써 증폭 단계가 진행될 때 혼입될 수 있다. 예를 들어, AATCGA 서열은 모든 서열의 전방부 말단에 혼입될 수 있고, 시스템을 교정하는데 사용될 수 있어, 각각의 뉴클레오티드 혼입 과정에 따른 판독 결과가 확인될 수 있게 하며, 2개 이상의 염기 혼입시와는 반대로 하나의 염기 혼입의 교정을 가능하게 한다. 염기의 임의의 조합이 사용될 수 있는데, 이로써 4가지 염기 모두, 염기들 중 3가지, 염기들 중 2가지, 또는 하나의 염기가 사용될 수 있었으며, 이에 따라서 단일 염기 혼입, 2개의 염기 혼입 또는 임의의 수의 염기들, 8개 이하 및 그 이상의 염기 혼입을 포함할 수 있었다. 상이한 프라이머는 또한 상이한 샘플을 암호화하는 수단으로서 사용될 수 있다.
전기에 의한 감금 및 체류
하나의 구체예에서, 자기 어레이는 각각의 국소화 자기장 주위에 전기장을 형성하여, (예를 들어, 전기 삼투력, 전기 영동력 또는 유전 이동력에 의해) 국소화된 자기장 주위에 주형 DNA, 폴리뉴클레오티드 및 dNTP를 농축시킴으로써, 폴리뉴클레오티드 증폭 또는 중합 반응을 향상시키도록 배치된 전극들을 포함할 수 있다. 상기 전기장은 PCR 또는 서열 결정 과정 중 어레이 영역들 사이의 격리를 형성할 수 있으며, DNA 가닥 및/또는 뉴클레오티드 또는 기타 다른 하전된 분자를 클론 PCR용 비드로 전도할 수 있고/있거나 뉴클레오티드를 DNA로 코팅된 서열 결정용 비드로 전도할 수 있다. 예를 들어, 전극은 비드 포착 위치 하 및 비드 포착 영역 주위에 있는 몇몇 위치로 배치되어(예를 들어, 환형 또는 정사각형으로 정렬되어), 중합 반응을 향상시킬 수 있다. 서열 결정 분석용 자기 어레이는 기술된 바와 같이 비 자성 기판 상에 형성될 수 있다. 픽셀화된 구조에 존재할 수 있는 판독 정보 회로 및 온-칩 증폭기는 상기 기판 상에 장착될 수 있다. 이후, 개별 나노센서는 도 10에 나타낸 바와 같이, 반응의 미세 환경과 직접적 또는 간접적으로 접촉할 수 있도록 제작될 수 있다. 자기 바 어레이(1006)는 국소 자기장을 생성하여 센서(1008)에 근접하는 비드들을 회합시킨다. 임의의 결합된 증폭기(1004)는 도 10에 나타낸 바와 같이, 센서층 위 또는 아래에 통합형 장치(1002)의 일부로서 제작될 수 있다. 미세 유체 채널은 상기 구조 내에 내포될 수 있다. 상기 칩은 데이터 습득 유닛과 작동 가능하도록 연결될 수 있다. 다른 구체예에서, 비드 포착 특징 내 비드의 체류는 국소화 전기장을 이용하여 일어날 수 있다. 몇몇 구체예에서, 비드 또는 입자는 비자성일 수 있다. 또 다른 구체예에는 각각의 비드 포착 특징, 센서 또는 기타 다른 원하는 위치 주위에 전기장을 형성하도록 배치된 전극들을 포함할 수 있으므로, (예를 들어, 전기 삼투력, 전기 영동력 또는 유전 이동력에 의해) 주형 DNA, 폴리뉴클레오티드 및 dNTP를 농축시킬 수 있고, 이로써 폴리뉴클레오티드 증폭 또는 중합 반응을 향상시킬 수 있다. 상기 전기장은 PCR 또는 서열 결정 과정 중 어레이 영역들 사이의 격리를 형성할 수 있으며, DNA 가닥 및/또는 뉴클레오티드 또는 기타 다른 하전된 분자를 클론 PCR용 비드로 전도할 수 있고/있거나 뉴클레오티드를 DNA로 코팅된 서열 결정용 비드로 전도할 수 있다.
도 11은 원하는 공간에서 확산 상수가 더 작은 하전부를 국소화하도록 합하여지는 외력들 중 일부, 예를 들어 전기장에 의한 전압으로 일어날 수 있는 전기 영동 흐름, 마찰력, 정전기력 및 전기 이동력을 개략적으로 예시한다. 개략도(1108)는, 국소화 전기장을 생성하기 위해 전극(1106)에 가하여지는 전압을 생성하는 전압원(1118)을 나타낸다.
국소화된 전기장은 AC 및/또는 DC 성분을 포함할 수 있으며, 비정현파 파형을 차용할 수 있다. 상기 비정현파 파형은 삼각파, 정사각파 또는 임의의 형태의 파를 포함할 수 있다. 상기 비정현파의 파형은, 예를 들어 정현파 파형의 피크 중 "데드 스팟(dead spot)"을 포함할 수 있으므로, 잠재적 간섭 전기장이 존재하지 않을 때에도 혼성화 결합, 효소 결합, 기타 다른 결합 및 효소 작용이 일어나게 할 수 있다. 기타 다른 "데드 스팟"은, 예를 들어 정사각형 파에서 활용될 수 있었는데, 이때 전압은 일정 기간 동안 A 볼트 수준으로 상승될 수 있었고, 이후로는 일정 기간 동안 0 볼트로 감소될 수 있었다. 이후, 전압은 다시 A 볼트로 상승할 수 있었으며, 그 다음 진폭은 -A 볼트가 될 수 있다. "데드 스팟"은 0 볼트일 필요는 없지만, 충분히 감소되어 전기장에 의해 영향을 받는 상이한 부들 간 원하는 상호 작용이 일어날 수 있다. 하전된 분자 농축시 국소화 전기장(1109)의 결과는, 전기장에 의해 형성되고, 실질적인 격리를 제공할 수 있는 실질적 구배를 나타낸다.
DNA 용도에 대하여 본원에 주로 기술되어 있지만, 상기 기술한 바와 같은 전기에 의한 감금은 기타 다른 용도, 예를 들어 항체 또는 기타 다른 단백질 또는 화학 대사물을 이용 및/또는 검출하는 방법 또는 이와 같은 용도를 위해 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 서열 결정 또는 증폭 이외의 기타 다른 반응은 가상 웰 세트 내에서 수행될 수 있다. 이와 같은 용도로 실제 사용하기 위해서, 격리되어야 할 부들은 기타 다른 하전된 부들로 하전되거나 이 부들과 회합될 필요가 있다.
도 12는 전극(1206)에 인가되는 전기장으로부터 기인하는 시뮬레이션(1208)에 기인한, 전극 위에 생성되는 수평 가로선(1209)에서의 전기 전위를 나타낸다. DC 전압으로 인한 전기 전위 및 유선형 전기장(1202)은, 하전된 부, 예를 들어 비드 근처의 DNA 앰플리콘을 포착하고, 이 하전된 부가 다음의 비드로 이동하지 못하도록 막는데 사용될 수 있다. 이러한 시뮬레이션은 dNTP 이동에 대하여 수행되었다.
증폭
본 발명의 하나의 구체예에서, 자기 바와 전극 어레이는 자기장 및/또는 전기장에 의해 어레이의 영역들을 격리함으로써, 자성 비드 상에서 DNA 단편을 클론으로서 증폭하는 무 에멀젼 방법을 제공한다. 비드 상에서 행해지는 클론 증폭은 일반적으로 미국 특허 제7,323,305호에 기술되어 있으며, 이는 본원에 전체가 참고로 포함되어 있다. 본 발명은, 증폭이 진행되는 동안 비드, 입자 또는 센서 표면 상에 DNA 가닥들을 고정함으로써, DNA 가닥이 기타 다른 비드, 입자 또는 센서로 확산되는 것을 추가로 막아주는 가교 증폭을 이용할 수 있다.
DNA 단편을 증폭하는 예시적 방법에서, 자성 비드는 전기장을 형성하는 전극들을 가지는 자기 바 어레이 상에 주입될 수 있다. DNA 가닥 주형(이중 가닥형 또는 단일 가닥형)은 챔버에 주입되어, 비드 분포당 원하는 DNA 가닥에 대해 표적화된 농도로 비드 위를 지나감으로써, 클론 증폭을 수행할 수 있다. 임의의 구체예에서, 폴리클론 영역은 생성되지 않는다는 것을 보장하기 위해, 도입 DNA 농도는 대부분의 센서 영역이 하나의 샘플 DNA 분자를 가지거나 샘플 DNA 분자를 가지지 않도록 충분히 낮아야 한다. 이후, dNTP 및 DNA 중합 효소는 챔버에 주입되어, 상기 기술한 바와 같이 전기장에 의해 비드 주위에 농축될 수 있다. 증폭용 DNA 프라이머는 임의의 단계, 예를 들어 dNTP 및/또는 중합 효소를 첨가할 때에 제공될 수 있거나, 또는 DNA 주형과 함께 제공될 수 있다. 비드 상에 고정된 DNA 단편은 PCR 또는 등온 증폭에 의해 증폭될 수 있다. 이중 가닥 DNA가 출발 물질인 경우, 증폭 과정의 제1 단계에서는 이중 가닥 단편을 "용융(melting)"함으로써 단일 가닥 주형을 형성되고, 이후 프라이머 어닐링 및 연장 단계가 진행되는데, 만일 PCR이 이용된다면 가열 냉각 사이클이 반복 수행되고, 아니면 연속적으로 온도를 제어하는, 등온 증폭이 수행된다. 도 13은 본원에 기술된 바와 같이, 어레이 내에 고정된 이중 가닥 DNA가 있는 클론 비드의 형광 현미경 사진을 나타낸다.
증폭 과정 중 유전 이동력도 또한 앰플리콘을 체류시킴으로써 증폭이 진행되는 상이한 센서 영역들 간 교차 오염을 막는데 도움이 될 수 있다. 도 15에 예시된 구체예에서, 추가 전극들은 센서의 전압 수준에 대하여 동일한 전압을 가지는 것으로 나타내어져 있다. 도 14에 나타낸 대안적 구체예에서, 센서의 어느 한쪽 면에 존재하는 전극들은 서로에 대하여 상이한 값을 가지는 반대 신호 또는 동일 신호 전압을 가질 수 있다.
뿐만 아니라, 겔 타입 재료는 자기 어레이를 사용하는 서열 결정 또는 증폭시 상이한 영역들 내부 및/또는 사이에서 격리 재료로서의 역할을 수행할 수 있다. 이와 같은 겔 타입 완충 매질의 사용으로 DNA 가닥은 하나의 국소화 자기장으로부터 이웃(또는 인접) 국소화 자기장에 이르끼까지 최소로 확산될 수 있는데, 그 이유는 주기적 주입시 뉴클레오티드(dNTP), Mg2 + 및 기타 다른 물질이 도입될 수 있고, 이 물질들이 상기 겔 타입 또는 스폰지 매질을 통해 운반될 수 있기 때문이다. 상기 겔 타입 재료는 임의의 적당한 재료, 예를 들어 아가로스 또는 아크릴아미드 또는 기타 다른 가교 재료일 수 있는데, 여기서 가교는 물리적 또는 화학적 촉발 인자에 의해 개시될 수 있다. 이와 같은 촉발 인자의 한 가지 예로서는 온도 변화(물리적 촉발 인자), 또는 (매질을 겔 타입 상으로 만들기 위해 재료를 화학적으로 변형시키는) 물질의 첨가가 있다.
"겔 유사" 또는 "스폰지" 재료는 또한 DNA 가닥을 비드 근처 공간에 감금하는 것을 도울 수 있거나, 또는 DNA 가닥을 국소화 자기장 내부 또는 근처에 감금하는 것을 도울 수 있고/있거나 폴리뉴클레오티드의 확산을 감소시킬 수 있다. 이와 같은 구체예에서, 뉴클레오티드 및 기타 다른 물질은 더 용이하게 확산되게 할 수 있지만, DNA 가닥, 특히 샘플이나 앰플리콘 단편은 그것이 자유로이 확산되는 것이 방지될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 방법은 시스템의 증폭 영역에서 DNA 확산을 감소시킬 수 있다.
도 14는 대안적 구체예를 도시한 것으로서, 여기서 클론 군집은 센서 어레이 내 독립적인 센서(1402) 상에, 또는 특정 구역 내에 생성될 수 있다. 상기 센서는 나노니들 또는 나노브릿지 또는 기타 다른 중합 현상을 검출하는 센서일 수 있다. 하나의 구체예에서, 프라이머(1404)는 우선적으로 센서 표면에 결합될 수 있거나, 이 표면과 회합할 수 있거나, 아니면 이 표면에 부착될 수 있다. 상기 프라이머(1404)는 우선적으로 재료들 간 차이로 인해 부착될 수 있는데, 이때 상기 센서의 재료는 센서 어레이의 센서들 사이의 구역에 부착되기에 더 유리할 수 있다. 대안적 구체예에서, 마스크가 센서 어레이의 센서들 사이 구역에 적용될 수 있어, 표면 변형이 수행될 수 있다. 추후 상기 마스크는 센서 어레이의 센서들 사이 구역을 떠나 제거될 수 있는데, 이 때 표면 변형이 수행되지 않는다. 표면 변형법은 바이오틴의 부착, 금 층의 적용 및 당업계에 공지된 기타 다른 다양한 방법을 포함할 수 있다.
그 다음, 프라이머(1404)는 우선적으로 센서 어레이 내 센서(1402)의 표면 상의 구역에 적용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 프라이머는 바이오틴 스트렙타비딘 결합의 결과로서 부착될 수 있었는데, 이때 상기 바이오틴 또는 스트렙타비딘은 프라이머의 5' 말단에 부착될 수 있다. 다른 구체예에서, 티올기는 프라이머의 5' 말단에 부착된 후, 센서 위에 미리 적용한 금 층에 결합되어 Au-S 결합을 형성할 수 있다. 만일 PCR 반응이 요망되면, 프라이머는 DTPA로 변형될 수 있어, 2개의 티올 금 결합이 형성될 수 있으며, 그렇지 않으면 PCR에서 통상적으로 사용되는 60℃ 내지 95℃의 온도에서 일어날 수 있는 용해(dissolution)를 막을 수 있다. 표적 DNA(1406)는 전극(1408A 및 1408B)에 의해 생성되는 전기장(1406)에 의하여 프라이머(1404) 구역으로 농축될 수 있다. 프라이머, dNTP(1410) 및 중합 효소(1408)가 도입될 수 있으며, 임의로는 전극(1408A 및 1408B)에 의해 생성되는 전기장에 의해서 농축될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 증폭은 고체상 증폭일 수 있는데, 여기서 제1 프라이머는 비드의 표면 상에 존재할 수 있으며, 제2 프라이머는 용액 중에 존재할 수 있다. 다른 구체예에서, 증폭은 고체 상에서 진행될 수 있거나(이때, 프라이머는 전부 비드 상에 존재함), 증폭은 용액 중에서 진행될 수 있으며(이로써, 프라이머는 둘다 용액 중에 존재함], 하나의 프라이머 또는 두개의 프라이머는 또한 비드 상에 존재할 수 있다. 추가의 구체예에서, 증폭은 용액 중에서 진행될 수 있으며(이로써, 하나의 프라이머는 용액 중에 존재하게 됨), 하나의 프라이머 또는 두개의 프라이머는 또한 비드 상에도 존재한다.
전극 배열은 매우 다양한 상이한 형태를 취할 수 있는데, 전극은 예를 들어 유동 세포의 한쪽 주요 평면 또는 양쪽 주요 평면 상의 실질적으로 편평한 전극의 형태일 수 있거나, 비드와 마주보고 있는 표면 상에 전극이 존재할 수 있으며, 각각의 센서나 비드 포착 영역과 회합된 소형 전극 세트로서 존재할 수도 있다. 도 15는 하나의 구체예를 개략적으로 예시한 것으로서, 여기서 센서(1502) 세트는 전극 구조(1504 및 1506)와 결합하여 위치할 수 있고, 전극 구조는 비드 포착 특징에 바로 근접하여 위치한 전극(1504)을 가질 수 있으며, 더 큰 전극 구조(1506)는 비드 포착 특징과 소형 전극(1504)을 감쌀 수 있다. 구체예가 서열 결정 또는 검출에 사용될 때, 상기 비드 포착 특징은 센서 활성 구역에 근접하여 존재할 수 있다. 더 큰 전극은 원으로 예시되어 있으나, 이는 정사각형, 직사각형, 타원형 또는 기타 다른 형태일 수 있고, 소형 전극(1504)을 완전히 감쌀 필요는 없다.
실질적으로 편평한 구조는 함몰부 또는 웰(정렬 또는 정전 집속 효율을 개선하기 위함) 또는 받침(유체 유동 특징을 개선하기 위함)을 포함할 수 있다.
증폭을 실시하기에 앞서, 몇몇 구체예에서 비드는 모노클로날 비드를 형성하기 위해 단일 DNA 단편과 회합될 수 있다. 통상적으로 DNA 농도가 측정될 수 있으며, DNA는 희석된 형태로 비드에 도입되므로 평균적으로 1개 미만의 단편이 각각의 비드와 결합될 수 있다. 다수의 비드는 DNA 단편을 가지지 않으며, 극소수의 비드는 하나의 단편을 가지고, 소수의 비드는 2개 이상의 단편을 가진다. 정량에 필요한 단계들은 종종 별도의 장치와 별도의 가공 절차를 필요로 한다. 정량은 종종 실시간 PCR을 이용하거나, 또는 260㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 수행될 수 있다.
만일 3개 이상의 전극들이 사용된다면, 임의의 전극 세트에 상이한 전압이 가용될 수 있다.
표적 분자들의 의도된 이동성을 제공하기 위해서, 중합체는 전압이 더 높고 지속 기간이 더 짧은 상 하나를 가지는 AC 장과 결합하여 사용될 수 있다.
하나의 구체예에서, 샘플은 높은 수준으로 희석될 수 있었고/있었거나 적은 용량의 샘플 시약이 사용되어 비드 상에 부하될 수 있다. DNA는 비드 중 일부에 결합된 다음, 가상 웰 내에서 증폭되어, DNA를 가지는 비드를 형성할 것이다. 서열 결정용 프라이머는 샘플 DNA에 결찰된 상보성 서열보다 더 짧아질 수 있었다. 서열은 공지되어 있으므로, 정확한 dNTP가 첨가되고 검출될 수 있었다. 하나의 구체예에서, 다수의 dNTP는 동시에 첨가될 수 있었다. 예를 들어 만일 dNTP 전부가 첨가되면, 중합 효소는 단편의 말단부까지 연장하여 대 신호를 발생할 것이다. 상기 대 신호는 증폭 과정의 일부로서 발생될 수 있었다. 이는 비드가 최소한으로 증폭되었을 때조차도 DNA를 가지는 비드를 검출하여 이의 수를 계수할 수 있도록 할 것이다. 얼마나 많은 수의 비드가 신호를 발생시키는지를 파악함으로써 적당한 희석율을 산정하여 모노클로날 비드를 이상적인 수만큼 생성할 수 있게 할 수 있을 것이다. 상기 신호는 전기 신호, 광학 신호 또는 당업계에 공지된 기타 다른 유형의 검출 신호일 수 있다.
몇몇 구체예에서, 앰플리콘, 중합 효소 또는 기타 다른 부를 전기에 의해 감금하는 데에는 임의의 물리적 웰 구조를 가지지 않는 장치가 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 장치는 실질적으로 편평한 표면을 가질 수 있는데, 여기서 함몰부 또는 돌출부가 존재한다. 또 다른 구체예에서, 상기 장치는 웰 구조를 가질 수 있다.
전기에 의한 농축
도 6 및 12에 예시된 바와 같이, 센서 어레이에는, 유전 농축을 수행하는데 이용될 수 있는 추가의 전극 어레이가 제공될 수 있다. 유전 농축은 처음에 샘플 DNA(1206), dNTP(1210), 프라이머 및 중합 효소(1208)를 각각의 센서 또는 증폭 영역에 끌어들이도록 수행될 수 있으며, 이때 상기 부는 각각 낮은 농도로 이용될 수 있도록 만든다. 그 다음, 증폭은 샘플 DNA 분자가 위치할 수 있는 각 센서의 영역에서 개시될 수 있다. 가상 웰에 형성되는 전기장은 앰플리콘이 하나의 가상 웰을 이탈하여 다른 가상 웰로 이동하는 것을 막아, 교차 오염이 발생하지 않도록 만들 수 있다. 유사한 방식으로, 앰플리콘을 국소화하는데 사용되는 전기장은 또한 앰플리콘, 프라이머 및 중합 효소를 센서 영역 또는 증폭 영역에 농축시킬 수도 있다.
다른 구체예에서, 샘플은 무 에멀젼 나노 웰에 존재하는 전극을 이용하여 증폭 영역 내에 농축될 수 있다. 하나의 구체예에서, 전극은 단일 평면상에 확립될 수 있다. 다른 구체예에서, 전극은 가상 웰 평면에 평행한 제2 평면에 가하여질 수 있다. 다른 구체예에서, AC 및/또는 DC 전압 인풋이 합하여질 것으로 예상된다.
다른 구체예에서, 유전 이동은 DNA를 농축하는데 사용될 수 있었다. 농축이 진행되는 동안 또는 농축이 진행된 후, DNA 농축 여부를 확인하기 위해 전류가 측정될 수 있었다. 다른 구체예에서, 농축된 DNA는 이하에 기술된 바와 같이 간섭 염료를 사용하여 정량될 수 있었다.
격리 전기장 전극도 또한 농축에 사용될 수도 있다. 몇몇 구체예에서, 동일한 전극과 전기장이 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 농축 장(concentration field)을 형성하기 위해서는 분리 장(isolating field)을 형성하는데 사용되는 전극보다 적은 수 또는 많은 수의 전극들이 이용될 수 있다.
농축은 샘플을 이용하는 것, 예를 들어 후속 증폭에 사용될 가상 웰에 DNA 샘플을 보내거나 이 웰이 상기 DNA 샘플을 끌어당기는 것을 최대화하는데 사용될 수 있다. 농축은 또한 중합 효소를 증폭용 가상 웰 또는 DNA 클론 세트(비드 또는 센서와 회합될 수 있음)에 보내거나 상기 가상 웰 또는 DNA 클론 세트가 중합 효소를 끌어당기게 하는데에 활용될 수도 있으며, 상기 중합 효소는 서열 결정 반응에서 이용될 수 있다. 유사한 방식으로, 기타 다른 부, 예를 들어 dNTP, 프라이머, 기타 다른 효소 및 기타 다른 생물 부 또는 기타 다른 하전된 부는 농축되어 반응 또는 후속 반응에 사용될 수 있다.
샘플 DNA의 유의적 증폭은 종종, 충분한 양의 DNA 샘플이 원하는 프로토콜에 충분히 높은 농도로 사용될 수 있다는 것을 보증하기 위해 수행된다. 이러한 증폭시에는 바이어스가 도입될 수 있을 뿐만 아니라, 시간과 재료비도 추가로 들 수 있다. 샘플을 증폭시킬 필요성을 감소 또는 없애는 능력이 요망될 수 있다. 하나의 구체예에서, 부하될 비드는 팩킹된 층에 내포될 수 있으며, 샘플은 이 층을 가로질러 펌핑될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 샘플은 비드와 함께 특정 구역을 다수 회 통과하면서 펌핑될 수 있으며, 그 결과, 샘플이 결합될 기회가 추가로 제공된다. 공간에 대한 큰 표면적은 최소한의 샘플이 사용될 수 있도록 허용되어야 한다. 상기 비드는 추후 유동 세포로 이동할 수 있고, 이로써 비드는 자기 어레이에 의해 제 자리에 고정될 수 있으며, 국소 콜로니들은 PCR 또는 등온 증폭에 의해 비드 상에 생성될 수 있다.
다수의 샘플
다수의 프로젝트는 칩 전체를 사용할 필요는 없으므로, 단일 칩에 다수의 샘플을 부하하는 것이 요망될 수 있다. 하나의 구체예에서, 샘플은 칩 조립체에 통합된 밸브를 사용하여 칩 상에 존재하는 벽들에 의해 격리된 독립 대역들에 보내어질 수 있다. 이와 같은 밸브는 유로에 통합된 폴리디메틸실록산 PDMS 밸브일 수 있었다. 다른 구체예에서, 샘플은 그 자체에 다수의 인풋이 존재하는 칩 조립체와 격리되어 있는 밸브를 사용하여, 칩 상에 존재하는 벽들에 의해 분리된 독립 대역들에 보내어질 수 있다. 다른 구체예에서, 별도의 인풋 및 아웃풋을 가지는 독립 대역들이 존재할 수 있다. 다른 구체예에서, 샘플은 국소 전기장을 이용하여 유동성 세포 또는 칩 상에 존재하는 독립 대역들에 보내어질 수 있다. 포지티브 전기장이 인가되면 DNA 또는 DNA 코팅된 비드는 원하는 영역에 유인될 수 있으며, 네거티브 전기장이 인가되면 DNA 또는 DNA 코팅된 비드는 원치 않는 영역들로부터 떨어져 나올 수 있다. 다른 구체예에서, 샘플은 전자석을 이용하여 독립 대역들에 보내어질 수 있으며, 그 결과 자성 비드 또는 상자성 비드가 분리될 수 있다. 다른 구체예에서, 샘플은 자가 밀봉 포트에 의해 개별 레인으로 전달될 수 있다. 자가 밀봉 포트는 고무 격벽과 바늘을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 샘플은 상이한 시점에서 주입될 수 있으며, 이때 새로운 비드는 미리 비워둔 비드 위치들로부터 발생하는 신호에 따라서 구별될 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, "바코드(barcode)"는 샘플 제조 공정의 일부로서 각각의 샘플과 회합될 수 있다. 이러한 공정에서, 길이가 짧은 올리고머가 프라이머에 가하여지고, 각각의 상이한 샘플은 프라이머 이외에도 상이한 올리고머를 이용한다. 상기 프라이머와 바코드는 라이브러리 제조 공정의 일부로서 각각의 샘플에 결찰된다. 그러므로, 각각의 콜로니를 제조하는 공정과 연합된 증폭 공정이 진행되는 동안 상기 프라이머와 길이가 짧은 올리고머도 증폭된다. 라이브러리 제조 공정의 일부로서 바코드가 회합될 때, 하나 이상의 라이브러리가 이용될 수 있으므로, 클론 군집 생성시 하나 이상의 샘플은 샘플 서열과 함께 짧은 올리고머를 서열 결정함으로써 비드와 콜로니가 어느 샘플로부터 기원되는지를 확인할 수 있게 해준다.
샘플 분리 방법은 샘플 동정 장치와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어 칩은 별도 채널 4개를 가질 수 있었으며, 또한 4개의 상이한 바코드를 사용하여 16개의 상이한 샘플들을 동시에 전개시킬 수 있었다. 이는 짧은 바코드를 사용하는 것을 허용하지만, 샘플 동정 결과는 여전히 불명확하다.
도 16a 내지 16d에 나타낸 바와 같은 대안적 구체예에서, 샘플은 자기 어레이 및 이와 통합된 센서 어레이를 가질 수 있는 시스템 내에 도입될 수 있다. 대안적으로, 시스템은 통합된 증폭 및 검출 어레이를 가질 수 있는데, 여기서 상기 어레이의 각 소자는 가상 웰을 형성하도록 구성된 전극 세트와 센서를 가질 수 있다. 상기 어레이(1602A)의 일부만을 점유하도록 구성된 DNA 샘플 세트(1604A)는 상기 어레이(1602A)에 도입될 수 있으며, 그 결과 이용 가능한 구역의 일부에 샘플이 회합될 수 있다. 이후, 이와 같은 샘플은 각각의 가상 웰과 회합되어 도 16b에 나타낸 바와 같은 어레이(1602B)를 이루는 센서에 의해 검출될 수 있거나, 또는 증폭된 후 검출될 수 있다. 도 16b는 또한 부분적으로 충전된 자기 어레이의 현미경 사진을 나타낸다. 도 16c는 추가의 샘플 세트(1604B)를 나타내주는데, 이 세트는 이후 자기 및 센서 어레이(1602B)에 도입될 수 있고, 그 결과 도 16d에 나타낸 바와 같이 어레이(1602C)는 더 완전히 충전될 수 있다.
통합된 전기 감금 및 서열 결정
도 17은 서열 결정 반응에 사용될 수 있는 센서 어레이를 이루는 센서 위에 존재하는 증폭 영역들이 사용될 때의 양상을 예시한 것이다. DNA 샘플(1702)은 어레이 시스템(1710)에 도입될 수 있는데, 이때 상기 어레이는 예비 국소화 비드, 또는 센서 영역(1710)에 부착, 결합 또는 이 영역과 회합될 수 있는 프라이머(1708)와 함께 구성될 수 있다. 중합 효소(1704), dNTP(1706) 및 추가의 프라이머들은 상기 어레이에 동시에 도입될 수 있거나, 사전에 도입될 수 있거나 또는 추후에 도입될 수 있다. 증폭 반응(1712)이 종결된 후, 센서 어레이 위 공간은 세정될 수 있으며, 이때, 앰플리콘, 중합 효소 및 dNTP가 제거되고, 국소적으로 결합, 회합 또는 부착된 클론 세트는 어레이 위치에 회합될 수 있다. 중합 효소(1718), 프라이머(1714) 및 각각의 dNTP(1706)는 이후 센서 어레이 위 공간으로 흘러 들어갈 수 있고, 이때, 결합 및 혼입이 이루어질 뿐만 아니라, 혼입 현상이 검출될 수 있으며, 그 결과 상이한 증폭 샘플 DNA 분자 서열이 결정될 수 있다. 서열 결정 반응에 사용되는 중합 효소(1718)는 증폭 반응에 사용되는 것과 동일한 유형의 중합 효소(1704)일 수 있거나, 또는 상이한 유형의 중합 효소일 수 있다.
클론 비드의 분리
도 19의 일부는 증폭 생성물이 회합되어 있지 않고/않거나 불완전한 증폭이 일어났고/일어났거나 길이가 짧은 클론의 형태를 가지는 자성 또는 상자성 비드로부터, 클론 DNA를 가지는 자성 또는 상자성 비드를 분리할 수 있는 시스템의 개략적인 예시를 나타낸다. 이후 자성 비드(1934)는 분리될 수 있으므로, 클론으로서 증폭된 DNA 분절이 결합되어 있는 자성 또는 상자성 비드(1934)는 서열 결정 시스템으로 운반될 수 있고, 증폭된 DNA를 거의 가지지 않는 자성 또는 상자성 비드(1934)는 폐기물 챔버(waste chamber)로 운반되며/운반되거나, PCR 및 증량 시스템 내에 체류할 수 있다. 분리 또는 "증량"은 PCR 및 증량 시스템 일부를 가로질러 전기장을 인가하여 잔기 영동 흐름을 유도함으로써 이루어질 수 있다. 그러므로, 증폭된 DNA(고도로 하전됨)를 가지는 자성 또는 상자성 비드(1934)는 증폭된 DNA를 거의 가지지 않는 자성 또는 상자성 비드(1934)로부터 효율적으로 분리될 수 있다. 이와 같은 방식으로 서열 결정 시스템에 운반된 샘플은 실질적으로 서열 결정용 DNA 가닥으로서 요망되는 길이로 증폭된 DNA를 가지는 비드만을 포함할 수 있다. 이와 유사하게, 서열 결정 시스템에 전달된 샘플은 특정 %(거의 100%)의 클론 비드를 포함할 수 있다. 분리된 클론 비드는, 표면이 하전된 분자로 코팅되었거나 코팅되지 않은 비 자성 비드 또는 기타 다른 임의의 유형의 비드일 수 있다.
클론 비드가 생성될 때, 대부분의 비드는 DNA 주형을 가지지 않을 수 있다. 뿐만 아니라, 나머지 비드에서는 증폭이 거의 일어나지 않을 수 있다. 이러한 비드는 유용한 서열 결정 수단이 되지 못하므로, 효율을 개선하기 위해서 이러한 비드를 제거하는 것이 요망될 수 있다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, 전기장을 이용하여 주형을 가지지 않거나 최소량으로 가지는 비드를 분리하는 증량 모듈이 사용될 수 있다.
주형으로 충만하게 부하된 비드는 전하량이 크므로, 전기장 내에 있을 때 오로지 프라이머만을 가지거나 소수의 주형만을 가지는 비드보다 더 멀리 이동할 수 있다. 도 18a 내지 18b에 나타낸 바와 같은 하나의 구체예에서, 이러한 분리는 모듈(1800)을 통한 흐름 내에서 이루어질 수 있다. 제1 유체 인풋(1811A)은 혼합 비드를 주입할 수 있다. 제2 유입구(1812A)는 비드를 포함하지 않는 완충 용액을 주입할 수 있다. 제1 배출구(1811B)에는 제1 유입구(1811A)로부터 유래하는 하류가 흐를 수 있다. 제2 배출구(1812B)에는 제2 유입구(1812A)로부터 유래하는 하류가 흐를 수 있다. 유체는 포트(1809)를 통해 모듈로 유입되거나 이 모듈로부터 배출될 수 있다. 유체 시스템은 기판(1802)과, PDMS(1808) 유리 또는 기타 다른 재료 층에 형성된 채널(1810)을 가질 수 있다.
유체의 유속은 유체 저항 또는 펌핑 속도에 의해 설정될 수 있으므로, 더 많은 양의 액체가 제2 유입구로 흘러 들어갈 수 있다. 하나의 구체예에서, 유입구와 배출구의 폭에 변화를 주면 유체 저항이 상이하게 될 수 있으며, 유체 저항에 변화를 주는 기타 다른 방법으로서는, 예를 들어 길이와 높이를 상이하게 만드는 것이 예상된다. 이와 유사하게, 제1 배출구(1811B)와 제2 배출구의 유체 저항에 변화를 주면 더 많은 양의 액체가 제1 배출구(1811B)로부터 흘러 나오게 된다. 이와 같은 조건에서, 흐름에 대해 수직 방향으로 빠른 속도로 이동하는 비드는 제1 배출 포트(1811B)를 빠져나올 수 있다. 추가의 아웃풋 채널이 가하여지면 주형을 중간 정도의 수준으로 가지는 비드의 분리를 용이하게 할 수 있다.
전기장을 유체 흐름에 수직 방향으로 형성하여, 주형이 부하된 비드가 유로 밖으로 나와 제2 배출구(1812B)로 이동하도록 만들 수 있는 전극 한 쌍(1813)이 제공될 수 있다. 유로(1809)는 시스템 배관과 연결될 수 있다.
상기 전극들은 전기 영동에 적합한 임의의 전극 재료로 제조된 것일 수 있었다. 몇몇 구체예에서, 별도의 금속 와이어가 사용될 수 있지만, 미량 금속을 사용하는 것도 예상된다. 금속, 예를 들어 백금, 백금/이리듐, 금 및 기타 다른 귀금속 또는 합금을 사용하는 것이 예상될 뿐만 아니라, 부식 방지 재료, 예를 들어 스테인레스 강을 사용하는 것도 예상된다. 비 금속 전극, 예를 들어 탄소 전극을 사용하는 것도 예상된다.
관류 증량 모듈 챔버는 비 전도성 재료, 예를 들어 성형 플라스틱, 유리, 세라믹 또는 성형 가능한 중합체, 예를 들어 PDMS로 이루어질 수 있다. 유체 성분들은 융합 또는 결합되어 유체 챔버를 이룰 수 있다.
전극에 인가된 전압은 주기적으로 감소 또는 심지어 역전될 수도 있으며, 필요하다면 비드를 전극에 고착시켜야 할 것이다. 사용된 전압은 전기 분해에 필요한 수준 이상이어야 한다(pH 7 및 25℃에서 1.23V). 전압이 크고 갭이 좁으면 전기장 세기가 증가하여 더 강한 힘이 비드에 가하여진다. 시스템 전압은 제한된 주형을 가지지 않거나 이와 같은 주형을 가지는 비드를 흘려보낸 후 전압 또는 유속을 조정하여 상기 비드가 제2 배출구로 들어가기 충분한만큼 멀리 이동할 수 없도록 만듦으로써 교정될 수 있으며, 이때 주형을 가지는 비드는 제2 배출구로 보내어질 수 있다.
비 관류 증량 모듈도 또한 예상되지만, 이와 같은 모듈은 관류 시스템만큼 용이하게 자동화될 수는 없다. 하나의 구체예에서, 비드는 챔버 내에 도입될 수 있으며, 이때, 자기장 또는 중력은 비드를 아래로 끌어내린다. 전기장이 확립되면 주형을 가지는 비드가 끌어 올려질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 포착 막 또는 필터는 포지티브 전극 앞에 가하여질 수 있으며, 이로써 비드의 농축을 용이하게 할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 증폭된 DNA를 가지지 않는 비드나 입자(클론 비드) 및/또는 불충분하게 증폭된 DNA를 가지는 비드나 입자, 또는 지나치게 길이가 짧은 증폭 DNA 단편을 가지는 비드 및/또는 비드나 입자는 후속 증폭 반응을 위해 재순환 및 재사용될 수 있으며, 그 결과 증폭이 잘된 클론 비드 또는 입자가 생성될 수 있다. 비드 또는 입자는 또한 상기 비드 또는 입자가 서열 결정에 사용된 후에도 재순환될 수 있다. 상기 비드 또는 입자는 단일 시스템 내에서 자동으로 재순환될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 증폭된 DNA를 가지지 않는 비드나 입자는 이 비드나 입자를 추가로 가공하지 않고 직접 재사용 또는 재순환될 수 있으며, 이로써 샘플 간 오염이 발생하는 것이 방지될 수 있다. 이는, 예를 들어 하나의 샘플이 몇몇 증폭 반응에 사용될 때 유리할 수 있으며, 그 결과 어떠한 교차 오염도 일어나지 않게 될 수 있는데, 그 이유는 실제로 샘플이 동일하기 때문이다. 다른 구체예에서, 일어날 수 있는 교차 오염의 정도는 그다지 중요한 것으로 간주되지 않을 수 있는데, 그 이유는 교차 오염의 정도가 상당히 미약하기 때문이다.
다른 구체예에서, 비드는 교차 오염을 방지하는 처리가 될 수 있다. 상기 처리는, 예를 들어 상기 비드나 입자로부터 모든 프라이머를 제거 및 교체하는 것을 포함하는데, 여기서 상기 프라이머는, 예를 들어 스트렙타비딘 결합 또는 티올 결합 등을 통해 비드나 입자에 회합 또는 결합될 수 있고, 상기 결합은 파괴되고 다른 부가 결합될 수도 있다. 비드나 입자에 결합된 프라이머는 이전에 사용되었던 프라이머와 동일할 수 있거나, 예를 들어 프라이머의 일부로서 포함된 상이한 바코드를 가지는 상이한 프라이머일 수 있다.
기타 구체예에서, 교차 오염은 일반적이지 않은 닉 위치를 가지는 프라이머를 사용함으로써 방지될 수 있는데, 여기서 상기 프라이머는 닉이 형성되거나, 세정되거나, 스플린트 올리고머가 제공된 프라이머, 그리고 올리고머를 결찰하여 수복된 프라이머일 수 있고, 원 서열 또는 기타 다른 올리고머에 대해 요망되는 서열은 재생산된 것이거나 처음 생산된 것이다.
통합형 시스템
도 19는 통합형 서열 결정 플랫폼의 개략적인 예시이다. 상기 통합형 서열 결정 플랫폼은 DNA 추출 시스템, 라이브러리 구성 시스템, 증폭 시스템, 증량 시스템 및 서열 결정 시스템(본원에 기술된 바와 같은 전기 검출 시스템 또는 "인식 유닛"을 포함할 수 있음)을 포함할 수 있다. 별도의 시스템으로서 개략적으로 보였으나, 상기 통합형 서열 결정 플랫폼은 이와 같은 시스템들 전부를 단일 미세 유체/마이크로 전자 장치(또는 "칩") 내부에 포함할 수 있다. 상기 시스템들은 각각 이하에 더 상세히 기술되어 있다.
DNA 추출 시스템은 분석될 생물 샘플(예를 들어, 혈액)을 수용하는 유입 챔버(1910)를 포함한다. 상기 유입 챔버는 생물 샘플 중에 함유된 세포의 분해를 촉진하는 용액을 포함할 수 있다. 이와 같은 용액은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 통상적으로는 용해 완충액이라 칭하여진다. 몇몇 구체예에서, 용해 용액은 유입 챔버로 주입되어 상기 생물 샘플과 혼합될 수 있다. DNA는 온-칩 추출 소자(1920)를 통해 생물 샘플로부터 추출될 수 있다. 추출 소자(1920)는 미세 유체 장치의 유체 채널 내부에 배치될 수 있으며, 다공성 부재로 이루어진 필터 매질을 포함한다. 추출 소자(1920)는 또한 필터 매질을 가로질러 전기장을 형성하도록 구성된 하나 이상의 전극을 포함할 수도 있다. 그러므로 필터 매질과 전기장을 조합하면 고도로 하전된 DNA(기준 캐릭터 DNA에 의해 동정)는 생물 샘플의 나머지 부분으로부터 분리된다. 뿐만 아니라, 추출 소자(1920)는 기타 핵산들(즉 RNA)로부터 DNA(1912)를 분리하도록 구성될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 전극들은 제어되어 전기장의 특징들을 조작할 수 있으며, 그 결과 추출 소자의 분리 특징들은 최적화될 수 있다. 예를 들어, 전극들은 전기장의 세기, 극성, 공간 이용도 및/또는 과도 특징(transient characteristic)을 조정하도록 제어될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 추출 소자(1920)는 2개의 전극을 포함할 수 있다: 제1 전극은 다공성 필터 매질 아래에 배치되고, 제2 전극은 상기 제1 전극 위에 대각선으로 배치된다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 라이브러리 구성 시스템은 DNA 단편화 및/또는 크기별 선별 소자(1916)를 포함할 수 있다. 상기 단편화 및/또는 크기별 선별 소자(1916)는 이하에 기술된 방법들과 소자들을 통해, 평활 말단을 가지는 이중 가닥 DNA 단편을 생산하도록 구성될 수 있다. 상기 단편화 소자(1920)는 자체의 내부에서 분리된 DNA가 단편화 비드(1924) 세트를 따라서 배치될 수 있는 미세 유체 채널(1922) 하나 이상을 포함한다. 더 구체적으로 DNA 추출 시스템에 의해 생성되어 분리된 DNA는 임의의 적당한 기구(예를 들어, 가압 주입, 전기 영동에 의한 이동, 중력에 의한 공급, 열 유도성 이동 및/또는 초음파에 의한 이동 등)에 의해 DNA 단편화 및/또는 크기별 선별 소자(1916)로 운반 또는 "주입"될 수 있다. 이와 유사하게, 단편화 비드(1924)는 임의의 적당한 기구에 의해 DNA 단편화 및/또는 크기별 선별 소자(1916)로 운반될 수 있다.
단편화 및/또는 크기별 선별 소자(1916)는 미세 유체 채널(1922) 내에서 단편화 비드(1924) 및 DNA의 용액을 이동시키는 펌프(1926)를 포함할 수 있다. 펌프(1926)는, 예를 들어 연동 펌프일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 펌프(1926)는 미세 유체 채널(1922)과 유체 소통하는 미세 유체 소자 하나 이상을 포함할 수 있고, 또한 변형시 미세 유체 채널(1922) 내부에 유체를 흘려보내는 가요성 측벽을 가진다. 그러나 다른 구체예에서, 임의의 적당한 기구는 (예를 들어, 단편화 비드(1924) 및 DNA의 용액을 선택적으로 가열 및 냉각하고, 미세 유체 채널을 공기로 가압하거나, 전기 영동으로 이동시킴으로써) 미세 유체 채널(1922) 내부에서 상기 용액을 이동시키는데 사용될 수 있다.
단편화 비드(1924)는 DNA를 분리하거나, DNA를 DNA 단편(기준 캐릭터 DNA-SEG로 동정됨)으로 절단 및/또는 분할하는데 적당한 임의의 재료로 제조될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 단편화 비드(1924)는 유리, 폴리디메틸실록산(PDMS) 또는 세라믹 등으로 제조될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 단편화 비드(1924)는 임의의 적당한 크기 및/또는 기하학적 형상을 가질 수 있으므로, 이 단편화 소자(1920)는 원하는 특징(예를 들어, 길이 또는 가닥 특징 등)을 가지는 DNA 단편을 생산한다. 또한, 미세 유체 채널(1922)의 크기 및/또는 기하학적 형상(예를 들어, 횡단면의 형태 또는 종횡비 등)은, 미세 유체 채널(1922) 내부에서 DNA가 이동할 때 단편화 비드(1924)와 접촉하게 만들어 DNA를 원하는 바대로 전단하도록 선택될 수 있다. 예를 들어 몇몇 구체예에서, 단편화 비드(1924)는 실질적으로 구형일 수 있고 직경은 50㎛ 이하일 수 있다. 다른 구체예에서, 단편화 비드(1924)의 직경은 500㎚ 이하일 수 있거나, 50㎛ 내지 500㎚ 사이의 임의의 수치일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 미세 유체 채널(1922)은 수력학적 직경이 1㎛ 내지 500㎛의 범위일 수 있다(즉 도 24에 나타낸 바와 같이, 미세 유체 채널(1922)의 횡단면은 실질적으로 직사각형일 수 있으므로, 크기는 수력학적 직경으로서 표시될 수 있다). 다른 구체예에서, 미세 유체 채널(1922)의 수력학적 직경은 10㎛ 내지 200㎛의 범위일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 미세 유체 채널(1922)의 수력학적 직경은 500㎚ 이하의 범위일 수 있다. 뿐만 아니라, 도 24에 나타낸 바에 의하면 미세 유체 채널(1922)의 횡단면은 실질적으로 직사각이지만, 다른 구체예에서 미세 유체 채널은 임의의 적당한 형태, 예를 들어 반원형, 타원형 또는 원뿔형을 가질 수 있다. 몇몇 구체예에서는, 전단된 DNA 말단이 효소로 연마될 경우 그 말단이 평활 말단이라는 것이 확인될 수 있다.
다른 구체예에서, 효소 용액은 미세 유체 채널(1922)로 운반될 수 있으며, 그 결과 DNA는 효소에 의해 적어도 부분적으로 단편화될 수 있다.
단편화 과정을 마치면, DNA 단편은 단편화 비드(1924)로부터 분리될 수 있다. DNA 단편은 임의의 적당한 기구, 예를 들어 필터, 중력(또는 구심력)에 의한 분리 또는 전기장 등에 의해 단편화 비드(1924)로부터 분리될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 예를 들어 DNA 단편은, 이하 도 20을 참고로 하여 기술된 바와 같이 하나 이상의 제어 라인 또는 제어 채널을 작동시켜 단편화 비드(1924)로부터 분리될 수 있다. 특히 제어 채널은, 미세 유체 채널(1922)로부터 격리된 유체 흐름 채널로서, 일반적으로는 상기 미세 유체 채널에 수직 방향으로 인접하는 채널일 수 있다. 상기 제어 채널은, 예를 들어 미세 유체 채널의 일부를 한정하기도 하는 측벽으로 한정될 수 있다. 이러한 방식으로, 제어 채널 내부의 유체 압력이 증가할 수 있을 때 공통 측벽은 변형될 수 있기 때문에, 미세 유체 채널(1922) 일부의 유동 면적은 변하게 된다. 단편화 비드(1924)로부터 DNA 단편을 분리하기 위해서는 제어 채널에 압력이 선택적으로 가하여질 수 있는데, 이 경우 미세 유체 채널의 유동 면적은 상기 단편화 비드가 체류하기에 충분히 작되, DNA 단편은 통과할 수 있을 정도로 충분히 클 수 있다. 몇몇 구체예에서, 대안 수단인 채널 내 밸브는 부분적으로 폐쇄되어 누수 "체 밸브(sieve valve)"가 될 수 있으며, 그 결과 단편화 비드(1924)로부터 DNA 단편이 분리될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 단편 및/또는 크기별 선별 소자는, 미세 유체 채널 내에 내포된 전극 세트를 추가로 포함할 수 있고, 또한 가교된 중합체, 완충액 및 세정 용액을 도입하는 수단도 추가로 포함할 수 있는, 전기 영동 장치를 포함할 수 있다.
도 19에 추가로 나타낸 바와 같이, DNA 단편은 이후 증폭 및 증량 시스템에 운반될 수 있다. 증폭 및 증량 시스템은, 이하에 기술된 바와 같이 서열 결정될 수 있는 단편화 DNA로부터 클론으로서 증폭된 DNA를 생산하도록 구성될 수 있다. PCR 및 증량 시스템은, 자체의 내부에서 DNA 단편이 일련의 자성 비드(1934)들과 회합될 수 있는 미세 유체 채널(1932) 어레이를 포함할 수 있다. DNA 단편 및 자성 또는 상자성 비드(1934)는 상응하는 자기 어레이를 통해 미세 유체 채널 내부에 배치될 수 있다. 이러한 방식으로, DNA 단편 및 자성 또는 상자성 비드(1934)는 원하는 위치에 잔류하게 되고, 그 결과 샘플 증폭은 정확하고 효율적으로 수행될 수 있다. 예를 들어 DNA 단편 및 자성 또는 상자성 비드(1934)는 "관류" 미세 유체 채널(1932) 내 원하는 위치에 잔류할 수 있고, 원하는 시약들은 미세 유체 채널(1932) 내부로 운반되어 DNA 단편과 접촉될 수 있으며, 그 결과 DNA 단편의 증폭이 가속화될 수 있다.
표적 DNA가 비드상에서 증폭된 후, 이 비드는 전술한 바와 같이 전기 영동 분류기(electrophoretic sorter)(1938) 내에서 분류될 수 있고, 증폭된 생성물(1940)을 적당한 양으로 가지는 비드는 서열 결정 모듈(1936)로 이동할 수 있다.
전술한 바와 같이, 통합형 서열 결정 플랫폼은, 단일 미세 유체/소형 전자 장치(또는 "칩") 내부에 본원에 기술된 시스템들을 모두 포함할 수 있거나, 또는 하나의 시스템 형태를 가지는 모듈 장치일 수 있다. 도 20 내지 도 24는 폴리뉴클레오티드를 추출, 증폭 및 서열 결정하기 위한 통합형 플랫폼의 미세 유체 일부에 관한 구체예를 나타낸다.
도 20에 나타낸 바와 같이, 미세 유체 장치(2000)는 인풋 또는 아웃풋 포트(2006) 하나 이상을 가질 수 있다. 유체는 상기 포트(2006)를 통하여 유체 채널(2004)로 도입될 수 있다. 제어 라인(2002)은 밸브(2008)를 작동시킴으로써 유체 흐름을 제어할 수 있다. 제어 라인(2002)에 압력을 가하면 제어 라인(2002)과 유체 채널(2004) 사이의 벽이 변형되고, 유체 채널은 핀치 오프되며 밸브(2008)는 폐쇄된다. 도 21은 유사한 제어 라인(2102), 유체 채널(2104) 및 밸브(2108)와 추가의 크로스오버(crossover)(2110)를 가지는 유체 시스템에 관한 추가의 구체예를 나타내며, 여기서 상기 제어 라인은 지나치게 협소하여 유체 채널(2102)이 밀폐되는 지점을 완전히 변형시킬 수 없어서, 상기 크로스오버(2110)가 밸브(2108)로서 작동하지 못하도록 만든다. 도 22는 유체 채널(2204)을 확대하여 나타낸, 장치(2200A 및 2200B)의 일부를 촬영한 현미경 사진으로서, 이 사진을 통해서는 제어 라인(2202)의 작동이 눈으로 확인될 수 있다. 장치(2200A)를 참고하면, 제어 라인이 작동하지 않을 때, 밸브(2208)는 개방되는 것이 확인될 수 있다. 제어 라인(2202)이 작동하게 되면, 장치(2200B) 내부에서는 밸브(2208B)가 변형되어 유체 채널(2204)을 밀폐하는 것이 확인될 수 있다. 도 23은 채널 내에서 흐름이 진행될 때 상자성 비드(2304)의 모습에 관한 현미경 사진을 비롯하여, PDMS 밸브 장치(2302)를 몇 가지 관점에서 나타내며, 여기서 밸브가 작동되면 흐름은 진행되지 않는다. 미세 유체 장치는, 본원에 개시된 미세 유체 채널들과 교차하고/교차하거나 이 미세 유체 채널들을 막는 일련의 제어 라인들에 의해, 본원에 개시된 비드, 시약 및/또는 샘플의 흐름 또는 "주입"을 제어할 수 있다. 도 24에 나타낸 바와 같이, 그리고 전술된 바와 같이, 제어 라인이 확장되면 장치의 소정 부분 내부에 용액 및/또는 비드가 체류될 수 있다.
피코리터만큼의 양의 증폭 또는 서열 결정 시약을 유체 시스템에 주입하기 위해서(예를 들어, dNTP를 비드에 고정된 DNA 프라이머에 혼입하기 위해서), 자기 어레이는 미세 유체 시스템을 이용할 수 있다. 예를 들어 미세 유체 플랫폼은 국소화 자기장에 반응물을 주입/전달하기 위한 라인들을 포함할 수 있다. 서열 결정에 관한 구체예에서, 미세 유체 시스템은 뉴클레오티드 트리포스페이트를 기질이나 국소화 자기장에 연속적으로 주입하는 것을 제어한다. 미세 유체 채널은 직경이 1㎛ 내지 100㎛의 범위일 수 있거나, 임의의 구체예에서, 미세 유체 채널은 직경이 10㎛ 내지 20㎛의 범위일 수 있다. 미세 유체 시스템을 제작하는 방법 및 이에 사용되는 재료는 공지되어 있다. 예를 들어 미세 유체 시스템은 폴리디메틸실록산(PDMS), 성형 또는 가공 플라스틱 또는 유리로 제작될 수 있다.
그러므로 임의의 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 자기 어레이로서, 자성 비드 또는 입자가 자기력에 의해 다수의 국소화 자기 특징들에 포집되어 있는 어레이를 제공하는데, 여기서 각각의 자성 비드 또는 입자에는 클론으로서 증폭된 서열 분석용 DNA 분절이 결합되어 있다. DNA 분절은 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어 임의로는 전기장이 형성되어 있는 자기 어레이를 사용하여 클론으로서 증폭될 수 있다.
증폭 및 서열 결정 어레이는 통합형 플랫폼 내에서 순서대로 연속 배치될 수 있다. 비드는, 예를 들어 자기 어레이 상에서 증폭된 후 DNA 전기 영동력을 바탕으로 증량될 수 있다. 구체적으로, 적당한 길이로 증폭된 DNA를 가지는 비드는 DNA 서열 결정기가 통합된 배출구로 최소량의 전하가 끌어당겨지게 만들 수 있다. 아무것도 결합되어 있지 않은 비드(null bead)와 불완전 증폭이 일어났거나 매우 짧은 DNA를 가지는 비드는 다른 배출구를 통해 분리될 수 있다.
다수의 프로젝트들은 칩의 전체 용량을 필요로 하지 않으므로, 단일 칩에서 다수의 샘플들을 가공하는 것이 요망될 수 있다. 기타 프로젝트들은 칩의 용량을 초과할 단일 샘플을 가질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 샘플은 개별 튜브, 튜브 스트립, 96-웰 평판, 384-웰 평판 등에 내장된 장치에 도입될 수 있었다. 몇몇 구체예에서, 샘플 웰은 상기 장치가 오래 사용될 수 있도록 밀봉될 수 있었다. 다른 구체예에서, 평판은 냉각되었을 때 샘플의 수명이 증가할 수 있다. 다른 구체예에서, 샘플은 로봇 피펫에 의해 소프트웨어 선별 방식으로 접근될 수 있었다. 만일 샘플이 지나치게 많으면, 시스템은 다수의 유체 채널 또는 칩 상에 샘플을 나누어 분배할 수 있었으며, 또한 만일 (예를 들어, 서열 바코드 샘플을 사용하였을 때) 샘플들이 합하여질 수 있으면, 시스템은 샘플들을 합할 수 있었다. 몇몇 구체예에서, 샘플은 상이한 시간에 동일한 서열 결정 장치의 상이한 채널 내에 부하될 수 있는데, 이로써 샘플들은 이것들이 이용 가능하게 되었을 때 전개될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 장치에 제공된 샘플은 서열 결정 준비가 된 것이다. 다른 구체예에서, 샘플들은 서열 결정 준비가 된 샘플을 생산하는 장치에 의해 가공될 수 있었다.
하나의 구체예에서, 혼성화를 바탕으로 하는 회수 방법에 의해 목표 농도에 도달할 수 있다. 고체 지지체, 예를 들어 회수용 비드(pull-out bead)는 일정 수의 결합 위치들로 작용화될 수 있었다. 몇몇 구체예에서, 상기 결합 위치는 DNA 프라이머 증여체(DNA primer compliment)일 수 있었다. 증폭되지 않은 샘플은 각각의 말단에 결찰된 공지의 프라이머를 가질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 프라이머는 회수용 비드 상에 존재하는 DNA에 혼성화될 것이다. 상기 위치들이 소진된 후, 잔류 DNA는 세정되어 제거될 것이며, 비드에 결합된 DNA는 추후 변성되어 공지된 양만큼의 DNA를 해리하게 될 것이다.
다른 구체예에서, 각각의 DNA 단편에 결찰된 프라이머는 프라이머 증여체에 결합될 수 있었으며, 이후, 상기 프라이머는 삽입된 염료를 형광 검출함으로써 검출될 수 있었다. 프라이머의 길이는 공지되어 있을 수 있으므로, 신호 수준은 단편의 수에 비례할 수 있다. 다른 구체예에서, 중합체 및 회합된 dNTP가 도입되면 전장 이중 가닥 DNA가 생성될 수 있었다. 프라이머 신호로부터 얻은 정보를 종합하여 보았을 때, 전장 삽입 염료 신호 수준을 통하여 평균 단편 길이가 측정될 수 있을 것이다.
비록 다양한 구체예들은 그 자체에 구체적인 특징들 및/또는 구성 요소들의 조합이 포함되는 것으로 기술되어 있지만, 기타 구체예들도 그 자체에 전술한 구체예들 중 임의의 것으로부터 기인하는 임의의 특징들 및/또는 구성 요소들의 조합이 포함될 수 있다.
다양한 구체예들이 전술되어 있지만, 이와 같은 구체예들은 오로지 예로서 제시되는 것이지, 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아님이 이해되어야 한다. 상기 기술한 방법 및/또는 개략도가 임의의 순서로 진행되는 임의의 현상들 및/또는 흐름 패턴을 나타내는 경우, 임의의 현상 및/또는 흐름 패턴의 순서는 변경될 수 있다. 본 발명의 구체예들이 구체적으로 보이고 기술되었지만, 이 구체예들의 형태와 내용에 다양한 변화가 가하여질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 구체예들은 핵산 검출 또는 DNA 서열 결정에 대해 구체적으로 나타내고 기술되어 있지만, 시스템은 기타 다른 다양한 생화학 반응과 이 반응의 검출을 위해 구성 또는 사용될 수 있다는 것이 이해될 수 있을 것이다.

Claims (52)

  1. (a) 다수의 입자들을 제공하고, 여기서 상기 다수의 입자들 중의 입자가 핵산 샘플로부터 생성된 하나의 핵산 분자에 결합되며;
    (b) 상기 입자에 결합된 상기 핵산 분자 상에서 핵산 증폭 반응을 수행함으로써, 상기 입자에 결합된 핵산 분자의 클론 군집을 생성하고;
    (c) 핵산 분자의 상기 클론 군집에 혼성화되는 프라이머를 사용하여 핵산 연장 반응을 수행하고;
    (d) 센서 어레이의 센서를 사용하여 상기 입자 또는 상기 입자에 결합된 핵산 분자의 클론 군집과 연관된 국소 임피던스 변화를 검출하여 상기 핵산 분자의 서열을 결정하는 것을 포함하되,
    상기 국소 임피던스 변화는 상기 입자가 상기 센서에 인접하게 위치되어 있는 동안 검출되고, 상기 센서는 상기 입자 또는 상기 입자에 결합된 핵산 분자의 상기 클론 군집의 디바이 거리 내에 있는 적어도 2개의 전극을 포함하는 것인,
    핵산 샘플을 서열 결정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 증폭 반응이 에멀젼이 없는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, (b) 이후에, 클론-증폭된 핵산 분자를 운반하는 입자를 클론-증폭된 핵산 분자를 운반하지 않는 입자로부터 분리시켜, 상기 입자에 결합된 핵산 분자의 상기 클론 군집을 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, (b)가 센서 어레이에 인접한 입자로 수행되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, (c) 및 (d)가 동시에 수행되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, (c) 및 (d)가 상이한 완충액 중에서 수행되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 다수의 입자가 비드인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 다수의 입자가 자성인 방법.
  9. 제1항에 있어서, (c)에서, 다수의 입자가 자성으로 고정되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, (d)에서, 상기 핵산 분자의 상기 서열 결정이 상기 센서에 인접한 상기 입자로부터의 상기 국소 임피던스 변화와 상기 센서 어레이의 적어도 다른 센서로부터의 국소 임피던스 변화 사이에 시차를 두는 측정법을 사용하는 것을 포함하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 핵산 연장 반응이 서열 결정을 위해 프라이밍된 핵산 가닥에의 뉴클레오티드의 혼입을 포함하며, 상기 핵산 가닥은 상기 입자와 회합되어 있는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 적어도 2개의 전극이 상기 입자 및 상기 입자에 결합된 핵산 분자의 상기 클론 군집을 포함하는 용액과 접촉하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 입자에 전기장을 인가하는 동안 상기 핵산 증폭 반응을 수행하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 전기장이 DC 및 AC 성분을 가지는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 전기장이 입자 주위에 주형 DNA 단편, 프라이머, 중합 효소 및 dNTP 중 하나 이상을 격리하거나 농축하도록 조정되는 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 전기장이 핵산 증폭 반응의 생성물을 격리하거나 농축하도록 적용되는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 센서 어레이가 실질적으로 편평한 것인 방법.
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