ES2325088T3

ES2325088T3 - Compuestos utiles en el tratamiento de hiv.

Info

Publication number: ES2325088T3
Application number: ES05850502T
Authority: ES
Inventors: Xiao-Xiong Zhou; Hong Medivir AB ZHANG
Original assignee: Medivir AB
Current assignee: Medivir AB
Priority date: 2004-12-30
Filing date: 2005-12-28
Publication date: 2009-08-25
Anticipated expiration: 2025-12-28
Also published as: EP1835916B1; ZA200705835B; CA2594229A1; HK1107518A1; AU2005321239A1; ATE427110T1; CN101132795A; EP1835916A1; WO2006070004A1; DE602005013697D1; EA011039B1; AU2005321239B2; BRPI0519306A2; US7829548B2; US20080176817A1; CN101132795B; EA200701406A1

Abstract

El uso de 2'',3''-didesoxi-3''-C-hidroximetilo o un profármaco del mismo que libera 2'',3''-didesoxi-3''-C-hidroximetilo o su 5''-monofosfato in vivo, o una sal del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infección con HIV, en el que la transcriptasa inversa del HIV lleva al menos una mutación que permite a un fosfato de nucleósido o nucleótido terminador de cadena obligado escindirse de la cadena de ADN naciente mediante escisión mediada por ATP o pirofosfato.

Description

Compuestos útiles en el tratamiento de HIV.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a composiciones farmacéuticas para la profilaxis o tratamiento de un virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) que lleva al menos una clase bien definida de mutaciones en el gen de transcriptasa inversa (RT) que produce un fenotipo de rescate (escisión) de cebador. Estas clases de mutaciones están asociadas con mutaciones de análogos de timidina (TAMs) particulares y se denominan mutaciones relacionadas con rescate de cebador. Las composiciones farmacéuticas de la invención emplean el nucleósido 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo o profármacos que liberan este nucleósido in vivo.

Fundamento técnico

A diferencia de otros antivíricos de HIV, tales como inhibidores de proteasa o inhibidores de transcriptasa inversa no nucleósidos, los inhibidores de transcriptasa inversa nucleósidos (NRTI) son inactivos farmacológicamente en su forma administrada y requieren fosforilación por quinasas celulares del hospedante para producir el metabolito trifosfato activo. Esta forma trifosfato se parece a los sustratos trifosfato de desoxinucleótido de origen natural de la transcriptasa inversa vírica y compite por la unión a RT de HIV-1 e incorporación a ADN vírico.

Todos los NRTI aprobados para el tratamiento de HIV, y la gran mayoría de todos los otros NRTIs propuestos en la bibliografía de patentes o académica, carecen de una función 3'-hidroxi en el resto ribosa del nucleósido. Los ejemplos incluyen zidovudina (AZT), estavudina (d4T), lamivudina (3TC), zalcitabina (ddC), abacavir (ABC), didanosina (ddI) y tenofovir (TNF) (siendo administrado típicamente este último como el profármaco fumarato de disoproxilo). Por fosforilación, tal nucleósido o análogo de nucleótido es unido covalentemente por la enzima transcriptasa inversa a la cadena de ADN naciente, pero la falta de una función 3'-hidroxilo en el nucleósido o nucleótido impide nueva incorporación de nucleótidos adicionales. Estos NRTIs terminan por tanto la prolongación de la cadena de ADN vírico, conduciendo por ello a inhibición de la replicación de HIV (Mitsuya et al. 1990, Jacob Molina et al. 1993, Reardon 1993).

La piedra angular de todas las terapias antiretrovíricas (ART) actuales es el uso de NRTIs. Los NRTIs, sin embargo, sólo son capaces de retardar la propagación de HIV en la corriente sanguínea y han sido incapaces hasta ahora de erradicar HIV de pacientes. El HIV actúa insertando su ADN en células hospedantes latentes implicadas en memoria inmunológica humana. Este modo de infección implica que los pacientes son forzados a tomar antivíricos de HIV toda la vida con el fin de impedir que el título de HIV rebote hacia atrás después de terminar la terapia.

En la práctica, sin embargo, el período de administración eficaz de un fármaco de HIV particular para un paciente dado es limitado drásticamente por la aparición de "mutantes de escape". Un mutante de escape es un virus que contiene una agrupación discreta de mutaciones que produce resistencia a fármacos y le permite proliferar en presencia del fármaco. Los mutantes de escape surgen en un paciente debido a la presión selectiva del(de los) antivírico(s) particular(es) que está tomando el paciente. Como consecuencia, un período de administración eficaz del fármaco depende de lo rápido que surjan y proliferen mutantes de escape.

En países que prescriben constantemente antivíricos de HIV se está haciendo evidente crecientemente que la infección primaria en nuevos casos de HIV no es a menudo con HIV de tipo natural, sino más bien con una cepa de HIV que ya es resistente parcial o múltiplemente a los antivíricos actuales. En otras palabras, los mutantes de escape que se generan in situ en pacientes infectados pueden extenderse también a pacientes sin tratamiento previo por transmisión lateral o vertical. Esto significa a su vez que incluso algunos pacientes que se clasificarían de otro modo como de sin tratamiento previo ya están infectados con virus resistente a terapias de primera línea convencionales.

Múltiples factores contribuyen a la selección de mutantes de escape de fármacos que incluyen el tamaño del grupo de HIV total, la capacidad de tratamiento de RT y la infidelidad en replicación genómica vírica, la adaptabilidad vírica y disponibilidades múltiples de células objetivo. A finales de los años 1990, la evidencia del uso a largo plazo de combinaciones basadas en zidovudina (AZT) o estavudina (d4T) sugirió que se generaban constantemente agrupaciones de mutaciones particulares en la RT. Estas agrupaciones de mutaciones son el prototipo conocido ahora como Mutaciones de Análogos de Timidina (TAMs). La presencia de TAMs aumentaba la probabilidad de seleccionar mutaciones adicionales y condujo al desarrollo de fenotipos de resistencia de NRTI más avanzados que no estaban claramente dentro de la familia de análogos de timidina. Tales fenotipos se conocen ahora como Mutación de Análogos de Nucleósidos (NAM) y HIV de Resistencia a Fármacos Múltiples MDR).

Hipótesis para resistencia a NRTI

AZT fue el primer antirretrovírico a ser usado ampliamente y, no sorprendentemente, fue el primero en generar mutantes de escape (Larder et al., 1989). Sin embargo, a la vista del gran número de mutaciones por todo el genoma de HIV en aislados de pacientes típicos, no es posible producir el fenotipo de resistencia in vitro usando una enzima RT recombinante que lleve la TAM particular. Como consecuencia, no ha sido sencillo aclarar los mecanismos a cuyo través las TAMs confieren resistencia.

Se han predicado diversos modelos hipotéticos y predicciones teóricas para el mecanismo detrás de la resistencia de TAM en la implicación de ataque nucleófilo por un donante de pirofosfato (Boyer et al., 2002 y Meyer et al., 2002). Presumiblemente, la teoría de translocación de RT es una etapa clave para entender el mecanismo de resistencia asociado a TAM. Esto fue, sin embargo, escasamente entendido hasta finales de 2002, porque los compuestos intermedios pre- y post-translocación de RT son transitorios y de vida corta y no accesibles fácilmente de manera experimental.

La comprensión moderna de la teoría de translocación de RT mantiene que la polimerización de ADN catalizada por RT tiene lugar de una manera en cascada detallada como se ilustra en la Fig. 3, que está adoptada de Sarafianos et al. (2003). Estas etapas son

1): La unión del sustrato de ADN por enzima libre E sitúa el extremo de cebador 3' y el lugar P (Lugar de cebador).

2): La unión de un dNTP próximo al lugar N (lugar de dNTP) forma un complejo ternario "abierto".

3): Se forma un complejo ternario "cerrado" por cambios conformacionales de la enzima.

4): La formación de unión fosfodiéster entre el término de cebador 3'-OH y el alfa fosfato del dNTP es acompañada por liberación de pirofosfato (PPi) para formar el complejo de RT pre-translocado en el lugar N.

5): Translocación del término de cebador del lugar N al lugar P formando un complejo post-translocado que es un prerrequisito para las siguientes unión de dNTP y continuación de la síntesis de ADN.

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Si se usa un nucleósido terminador de cadena de ADN (NRTI) trifosfato (típicamente un nucleósido análogo que carece de la función 3'-hidroxi en el resto de desoxirribosa), imita a su contrapartida de dNTP natural y se une a RT. Después del tratamiento químico análogo, el NRTI incorporado forma un complejo de pre-translocación en el lugar N de polimerización. Esto termina la síntesis de ADN adicional debido a la falta de un cebador de 3'-hidroxilo en el resto de desoxirribosa de NRTI.

Como contraste, las mutaciones de RT relacionadas con TAM emplean un mecanismo de incorporación de nucleótidos diferente comparado con RT de tipo natural. Específicamente, el nuevo mecanismo produce la liberación (escisión) del NRTI incorporado al término de cebador, abrogando la actividad de terminación de cadena del NRTI. Este nuevo mecanismo depende de la interacción entre la acumulación de complejos en estados pre-translocados (en el luar N) y la disponibilidad de donantes de ATP o pirofosfato, que son a menudo abundantes en el lugar de infección, es decir, linfocitos normales.

El ATP o pirofosfato no participa normalmente en reacciones de polimerización de ADN vírico, pero la estructura de una RT que expresa un fenotipo resistente relacionado con TAM facilita su entrada en un lugar adyacente a un NRTI recién incorporado. El equilibrio entre especies cinéticas pre- y post-translocacionales proporciona un mecanismo para asegurar acceso libre del término de cebador al lugar N y permite también unión simultánea del donante de pirofosfato ATP en el lugar P después de la incorporación del terminador de cadena NRTI y la liberación de pirofosfato. Cuando esto tiene lugar, ATP (o pirofosfato) ataca al enlace fosfodiéster que enlaza el NRTI incorporado al extremo del ADN, produciendo la separación del NRTI mediante pirofosfósforolisis. Cuando el donante de pirofosfato es ATP, el NRTI se libera como un producto tetrafosfato de dinucleósido. La Figura 4 ilustra el "rescate de cebador" en un ADN terminado en AZT (adoptado de ClinicCareOptions^{TM}).

Se cree ahora que dos mecanismos distintivos están implicados en la resistencia fenotípica a NRTI (Sluis-Cremer et al., 2000). El primero, conocido como actividad de "rescate de cebador", se ha descrito inmediatamente antes. Aquí, se separa el nucleótido terminador de cadena del extremo 3' del término de cebador mediante pirofósforolisis dependiente de ATP o dependiente de pirofosfato. Hay, sin embargo, otra agrupación de fenotipos de resistencia denominada "mutantes discriminativos". Estos mutantes tienen una RT con capacidad aumentada para discriminar entre NRTIs y dNTPs nativos. En este caso, el mecanismo conduce a RT que es capaz de escoger preferentemente el sustrato debido (es decir, dNTP nativo), evitando por ello terminación de cadena por un NRTI y asegurando la propagación del genoma vírico.

Generación de mutaciones en HIV

Los retrovirus tales como HIV tienen el potencial de una diversificación genética rápida. Aunque éste es un procedimiento ineficaz energéticamente, ofrece al organismo ventajas adaptativas claras. La maquinaria de replicación usada por HIV es particularmente propensa al error, genera un gran número de mutaciones y tiene el potencial de conducir a acumulación de mutaciones cuando el organismo está bajo presión selectiva.

Generalmente, la gran mayoría de mutaciones generadas por replicación vírica producen enzimas menos viables. Aquí, la acumulación de una segunda y especialmente una tercera mutación es menos probable porque el grupo de población para el mutante menos viable, dentro del cual debe acumularse la segunda mutación, se diluirá por el organismo de tipo natural que se multiplique más rápido. Todavía más mutantes víricos viables pueden surgir y expandirse por dos trayectorias posibles. La primera tiene lugar cuando hay un resultado rápido de una variante altamente resistente que ya está presente en la población vírica total. Más frecuentemente ésta es una mutación puntual simple que confiere resistencia fenotípica a una presión selectiva. En el contexto de mutaciones de escape de fármacos, los ejemplos incluyen K103 inducida rápidamente por el inhibidor de transcriptasa inversa no nucleósido nevirapina.

La segunda trayectoria tiene lugar cuando hay una replicación vírica continuada en presencia de presión selectiva. Ésta permite la acumulación progresiva de mutaciones que pueden expandirse después. En este caso, la probabilidad de acumulación de mutaciones está relacionada con la cantidad de replicación de virus que está teniendo lugar. Esto es, con mayores cargas víricas (por ejemplo, > 200.000 copias/ml), pueden tener lugar acumulaciones de mutaciones dobles. La acumulación de mutaciones triples es, sin embargo, rara y sólo puede resultar como secuencia de un régimen terapéutico complejo, que implica típicamente varios fármacos diferentes, que se están exigiendo para que el paciente se adhiera a ellos. Es por tanto extremadamente difícil para incluso un paciente diligente asegurarse que todos los ingredientes activos están presentes en la sangre en niveles por encima de las concentraciones inhibidoras necesarias sobre el período completo de 24 horas de "nivel durante 24 horas" de cada día. Aquí, la retirada temporal de una cualquiera de las presiones selectivas del tratamiento de fármacos debida a lapsos en la administración/nivel durante 24 horas de uno o más fármacos permite replicación vírica desenfrenada, permitiendo por ello la generación y establecimiento de muchos nuevos mutantes. Cuando la presión selectiva se aplica de nuevo una vez (es decir, reanudación de la terapia de fármacos compleja), los pocos nuevos mutantes que han acumulado otra mutación puntual que confiere mejor resistencia a fármacos pueden expandirse de una manera similar a la vista para la primera trayectoria (véase anteriormente).

La discusión anterior se enfoca sobre la acumulación de mutaciones puntuales en oposición a, por ejemplo, mutaciones de supresión o adición. Aquí, sin embargo, es aplicable un escenario similar al descrito para una mutación triple. Esto es, muchas mutaciones de supresión/adición implican inicialmente un nucleótido simple. Éste tiene el efecto de alterar completamente la secuencia de aminoácidos aguas abajo de la proteína codificada si el cambio tiene lugar dentro de la región de codificación y conduce a una proteína truncada y/o inactiva. Con el fin de preservar el marco de lectura y alterar la proteína final por la supresión o adición de un único aminoácido, deben suprimirse/añadirse tres nucleótidos. Puesto que las enzimas inactivas reducen la viabilidad de un organismo de HIV, particularmente si la enzima afectada es RT, las supresiones/adiciones no se acumularan per se, sino que deben tener lugar simultáneamente. En otras palabras, el equivalente de una mutación triple debe tener lugar en un acontecimiento único, lo que es altamente extraño (véase Boyer et al. (2004) J Virol 78(18):9987-9997).

Como consecuencia de este procedimiento para acumulación/introducción de mutantes triple, no fue hasta hace relativamente poco que resultó establecido virus HIV que presenta al menos tres mutaciones en RT, que crea resistencia particularmente potente a fármacos múltiples. Por ejemplo, en los Estados Unidos fue en 1992 cuando la FDA aprobó el uso de terapia de fármacos de combinación (ddC y AZT). No fue todavía hasta Septiembre de 1995 que las pruebas clínicas mostraron que la combinación de AZT con ddC o ddI era más eficaz que AZT sólo. Ha sido sólo como resultado del uso de terapias de combinación, en las que se emplean fármacos múltiples, pero en regímenes de dosificación incapaces eficazmente de garantizar un nivel durante 24 horas adecuado de los fármacos respectivos, que han generado las cepas particularmente problemáticas de virus HIV multirresistente conocidas actualmente en el mundo occidental.

Mutaciones de rescate de cebador

El mutante de rescate de cebador TAM descrito originalmente comprendía diversas permutaciones dentro de un grupo de seis fenotipos resistentes a fármacos en las posiciones de aminoácidos M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F y K219Q/E en RT (Larder y Kemp, 1989, Schinazi et al., 2000). Los datos tempranos apuntaban a dos trayectorias mutacionales distintivas para el desarrollo de mutantes de rescate de cebador TAM múltiples, teniendo lugar ambas por factores desconocidos. La primera trayectoria producía una sustitución de aminoácido en el codón 210 (210W) y estaba asociada preferentemente con mutaciones en los codones 41 (41L; mayor del 98%) y 215 (215 Y, mayor del 94%) así como una sustitución en el codón 67 (67N). La segunda trayectoria generaba una mutación en el codón 219 (219K/E), que estaba asociada preferentemente con mutaciones en los codones 67 (67N) y 70 (70R) (Yahi et al., 1999). Había por tanto dos modelos fenotípicos: (1) L210W, M41L, T215Y/F, \pmD67N, que conferían altos niveles de resistencia vírica a AZT y d4T, y (2) K219K/E, D67N, K70R, que conferían niveles moderados de resistencia vírica a AZT y d4T.

Marcelin et al. (2004) resumieron el predominio de mutaciones relacionadas con rescate de cebador TAM en pacientes con fallo virológico. Aquí, se investigaron 1098 secuencias de RT y dieron dos modelos genotípicos como se indica en la Fig. 1 y la Fig. 2. Aunque puedan haber estado presentes diferentes fundamentos genéticos antes de la terapia, la secuencia y composición de la terapia antirretrovírica emprendida cuando se combinaba con diferencias individuales en farmacología produjo resistencia vírica no sólo a AZT y d4T, sino también a otros NRTIs. Dependiendo del modelo mutacional presente, la resistencia a fármacos incluía abacavir (ABC), didanosina (ddI), tenofovir (TNF), lamivudina (3TC), emtricitabina (FTC) y zalcitabina (ddC). Por ello, la aparición de TAMs relacionadas con rescate de cebador juega a menudo un papel importante en el desarrollo adicional de más modelos genotípicos de HIV resistentes pronunciadamente. Por tanto, una etapa para prevenir resistencia de nucleósidos múltiple es desarrollar un nuevo NRTI con el objetivo de evitar la acumulación de TAMs relacionadas con rescate de cebador.

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Las mutaciones TAM relacionadas con rescate de cebador pueden evolucionar concomitantemente con otras familias de mutantes de escape que surgen típicamente de terapia antirretrovírica de combinación (conocida de otro modo como terapia de cóctel). Actualmente, el cóctel "combivir" (AZT + 3TC) es el régimen de terapia de primera línea usado y recomendado más frecuentemente para el tratamiento de pacientes con HIV sin tratamiento previo. Ello conduce, sin embargo, a mutantes de escape que son resistentes a ambos fármacos. Por ejemplo, Miller et al. (1998) informaban de que se seleccionaban virus resistentes a 3TC con una mutación en M184V sólo 4-12 semanas después de iniciarse la terapia de combinación con AZT + 3TC. Al tiempo, aparecieron gradualmente mutaciones adicionales asociadas con AZT, dando un modelo genotípico característico de M184V, M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F y K219Q/E que se encuentra comúnmente en pacientes que han experimentado tratamiento actualmente. Se informa de que mutaciones adicionales en RT en las posiciones H208, R211 y L214 (Sturmer et al., 2003) y en la posición G333 (Kemp et al., 1998) están implicadas en resistencia doble a AZT-3TC y, en particular, confieren un aumento de la capacidad para resistir a AZT. Por tanto, el contexto genotípico de TAMs relacionadas con rescate de cebador se había expandido para incluir permutaciones dentro de M184V, M41L, D67N, K70R, H208Y, L210W, R211K, L214F, T215Y/F, K219Q/E y G333E.

Otros tipos de mutaciones vistas generalmente en pacientes que han experimentado tratamiento son V118I y E44D/A. Estas mutaciones están correlacionadas fuertemente con exposición previa a ddI y d4T. Además, están asociadas a menudo con la presencia de agrupaciones de TAM específicas que incluyen M41L más T215Y/F o D67N más L210W. El resultado es resistencia de TAM relacionadas con rescate de cebador aumentada a la familia de análogos de timidina así como un papel distintivo en la resistencia doble a AZT + 3TC (Montes et al., 2002, Girouard et al., 2003).

El predominio de mutantes de escape de fármacos aumenta en función del número de NRTIs usados durante el transcurso de la terapia y forma un modelo de TAMs o NAMs expandidas que comprende diversas permutaciones dentro de M41L, E44D/A, D67N, K70R, V118I, M184V, H208Y, L210W, R211K, L214F, T215Y/F, K219Q/E y G333E. Esta agrupación también es comúnmente refractaria a terapias de combinación que contienen AZT y d4T y con resistencia cruzada a la clase completa de NRTIs.

Se encuentra también resistencia significativa a análogos de timidina, notablemente AZT, d4T y TNF, en mutantes de escape que tienen supresión de aminoácidos en posición 67 (\ding{115}67) en la región de dedo de RT, a menudo en asociación con una sustitución de aminoácidos en T69G concomitante con TAM (véase Imamichi et al. 2000 y 2001). Se propone una actividad de polimerización de RT aumentada, que está asociada con este genotipo particular, para producir una escisión de cebador dependiente de pirofósforolisis (descrita antes) más eficaz, conduciendo a la resistencia aumentada. Boyer et al. (2004) han observado también que \ding{115}67 concomitante con TAM confería una capacidad aumentada para facilitar resistencia vírica de rescate de cebador (escisión) a AZT y a TNF en comparación con TAM solo.

El HIV co-evoluciona a medida que se desarrolla terapia antirretrovírica. Surgían nuevos fenotipos de mutación cuando se empleaban cócteles de análogos de dobles y triples nucleósidos en el manejo clínico de HIV, especialmente en pacientes sin tratamiento previo. Se están exigiendo para pacientes regímenes terapéuticos complejos, que requieren la toma de fármacos múltiples en diversos momentos durante el día, algunos con y algunos sin alimento. El fallo en ajustarse exactamente a estos regímenes de dosificación que conduce a fallos durante 24 horas han facilitado la aparición de virus HIV resistentes a NRTI múltiples, principalmente como resultado de NAMs o MDRs adquiridos por virus. Por ejemplo, un cierto número de grupos (por ejemplo, Mass et al. 2000) han observado la aparición del virus T69S-XX mutante asociado con el uso de AZT. El mutante tiene una inserción de 6 pb en la región de codificación de su RT entre los ácidos nucleicos que especifican los aminoácidos 69 y 70. Los complejos de inserción de aminoácidos doble resultante (típicamente inserciones de SS, SG o AG) no sólo conducen a resistencia vírica a AZT sino también a casi el grupo completo de NRTIs, incluyendo d4T, 3TC, ddI, ddC y ABC, y TNF. Se ve un rescate de cebador dependiente de pirofósforolisis aumentado con la inserción de aminoácidos doble T69S+, particularmente en presencia de TAMs. Este fenómeno está asociado típicamente con los fenotipos resistentes "M41L/T215Y" o "M41L/L210W/R211K/L214F/T215Y" y juega un papel fenotípico importante en resistencia a nucleósidos múltiple (Meyer et al. 2003).

Otra clase de MDR tiene una sustitución de aminoácidos en el codón Q151M. Esta mutación se observa con una frecuencia relativamente baja en la clínica y se presenta a menudo junto con mutaciones secundarias de A62V, V75I, F77L y F116Y. Confiere, sin embargo, una resistencia significativa a casi la clase completa de NRTIs. Además, se ha observado asociada con TAMs, típicamente los genotipos "M41L, L210W y T215Y/F" o "D67N, K70R y K219K/E". Surge en pacientes que han experimentado tratamiento fuerte con regímenes de combinación AZT/ddI y AZT/ddC.

L74V se selecciona más frecuentemente por monoterapia con ddI (Martin et al., 1993) y presenta resistencia cruzada a ABC y 3TC. Su efecto produciendo escapes víricos depende de la presencia de otras mutaciones. Los exámenes de resistencia sugieren que la frecuencia de L74V está unida significativamente con TAM, típicamente en un fondo de M41L, L210W y T215Y/F (Marcelin et al., 2004) incluso aunque se pensara que la mutación L74V causara un efecto de disminución en replicación vírica y resensibilizara virus resistentes a AZT que contienen un cierto número de TAMs (St. Clair et al., 1991). Una combinación de las mutaciones L74V y M184V en RT de HIV-1 es el modelo más frecuente asociado con resistencia a ABC y ddI (Harrigan et al., 2000 y Miller et al., 2000).

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Aunque resistencia de alto nivel a ABC requiere típicamente mutaciones múltiples que comprenden K65R, L74V, Y115F y M184V, una mutación simple, M184V, surge a menudo la primera. Esta mutación, reconocida ahora como una mutación clave en el mecanismo discriminante de resistencia de escape a fármacos, confiere un disminución moderada en la susceptibilidad a ABC (Tisdale et al., 1997). Un estudio de CNA3005 en el que un total de 562 pacientes recibió aleatoriamente AZT y 3TC con ABC o ddI, mostró un aumento lento pero uniforme de la proporción de pacientes que llevan una ATM en el arma de AZT y 3TC más ABC. A la semana 48, hasta el 56% de los pacientes tenía al menos una TAM relacionada con rescate de cebador (1xTAM) sobre y por encima de la mutación M184V inducida rápidamente (Melby et al., 2001), ilustrando la importancia de prevenir la aparición de resistencia relacionada con rescate de cebador. De modo similar, el paso in vitro de viris resistente a AZT que lleva el modelo genotípico de 67, 70, 215 y 219 bajo presión selectiva de 3TC produjo la selección de la mutación M184V y resistencia cruzada conferida a ABC (Tisdale et al., 1997). Esto subraya de nuevo el concepto de que el tratamiento de la preexistencia de TAM relacionada con rescate de cebador y la prevención de la acumulación de mutantes relacionados con rescate de cebador es una etapa esencial para evitar el desarrollo de resistencia a nucleósidos multiples.

Ha resultado claro crecientemente que la mutación K65R aparece rápidamente en una proporción muy alta de pacientes que reciben TNF o ABC. Valer et al. (2004) informaron que K65R aumentaba en predominio en su hospital de Madrid desde < 1% entre 1997 y 2000 hasta el 7% en 2003 y el 12% en los 4 primeros meses de 2004. El efecto del mutante K65R se exacerba en presencia de otras mutaciones asociadas con susceptibilidad disminuida a ABC, 3TC, ddI y ddC (Parikh et al., 2003). Todavía la aparición simultánea de K65R de genotipos TAM relacionados con rescate de cebador, aunque tiene lugar raramente, conduce a un efecto más profundo en el rescate (escisión) de TNF que de AZT (Narger et al., 2001). Se informó que TNF era activo contra HIV-1 con hasta 3 x TAMs salvo que la agrupación de TAM incluyera una mutación M41L o L210W. Actualmente no está claro por qué las TAMs podrían invertir algunos de los efectos de K65R, que se pensaba por otra parte que impediría mutantes de escisión de cebador con respecto a susceptibilidad a TNF y ABC.

Finalmente, la mutación T69D se identificó inicialmente por su papel para causar resistencia a ddC. Se ha informado también de que está asociada con una respuesta disminuida a ddI cuando tiene lugar en combinación con la mutación T215Y y otros de los genotipos de TAM relacionados con rescate de cebador.

Durante muchos años, la OMS y el DHHS (Departamento de salud y servicio sanitario humano de los EE.UU.) han recomendado terapia antirretrovírica de primera línea en el tratamiento de pacientes sin tratamiento previo consistente en administrar d4T o AZT en combinación con 3TC más nevirapina o efavirenz (Directrices para el uso de agentes retrovíricos antivíricos en adultos y adolescentes infectados con HIV-1, 14 de Julio de 2003 y 23 de Marzo de 2004). Un número sustancial de pacientes infectados con HIV-1 han experimentado, sin embargo, fallo de tratamiento cuando estaban en sus regímenes de terapia antirretrovírica altamente activa inicial (HAART), sugiriendo que estos pacientes ya estaban infectados con virus de escape de fármacos. Los mutantes de resistencia TAM relacionados con rescate de cebador continúan jugando un papel crucial en el desarrollo de resistencia a fármacos. Así, el desarrollo de fármacos o métodos terapéuticos que contrarresten el efecto de mutantes de resistencia TAM relacionados con rescate de cebador podría potenciar o prolongar el uso de NRTIs existentes para tratar pacientes sin tratamiento previo y podrían usarse también para tratar a la población infectada con HIV que lleva mutante de resistencia relacionado con rescate de cebador en una terapia de salvamento.

Estrategias de fármacos para prevenir/inhibir mutantes de rescate de cebador

Las mutaciones de rescate de cebador y discriminativas aparecen a menudo juntas en el mismo genotipo mutante, debido en gran medida a la estrategia terapéutica actual. Una mutación M184V es representativa de la familia de mutantes discriminativos. No obstante, si tiene lugar conjuntamente con mutantes relacionados con rescate de cebador tales como M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F y K219Q/E, juega un papel en la resistencia doble a AZT y 3TC (Miller et al., 1998).

Estos fenotipos de rescate de cebador y de resistencia discriminativa parecen correlacionarse con diferentes agrupaciones de mutaciones en RT. Por ejemplo, mutaciones asociadas con AZT que comprenden diversas permutaciones dentro de M41L, E44D/A, D67N, K70R, V118I, M184V, H208Y, L210W, R211K, L214F, T215Y/F, K219Q/E y G333E, una mutación T69S de MDR con inserciones de 6 pb y un \ding{115}67 presenta típicamente actividades de mutantes de rescate de cebador. Por otra parte, mutaciones en posiciones 65, 74, 89, 151 y 184 conducen a la capacidad para discriminar entre NRTIs y las respectivas contrapartidas de dNTP o pueden estar implicadas en la recolocación del complejo cebador-plantilla.

En el artículo reciente "Designing anti-AIDS drugs targeting the major mechanism of HIV-1 RT resistance to nucleoside analog drugs" (Sarafianos et al. IJBCB 36 (2004) 1706-1715), Sarafianos et al. concluyen que el mecanismo de rescate de cebador (escisión) sólo podría tener lugar antes de la translocación de RT en el lugar N y concluyen adicionalmente que se ha convertido en el mecanismo dominante de resistencia a NRTI. En el capítulo titulado "Strategies for Inhibition of the Excision Reaction" (véase página 1711), proponen tres métodos para vencer tal mecanismo de resistencia:

1.: El uso de nuevos antivíricos que interfieran con la unión productiva de ATP (en el lugar P), presumiblemente uniéndose en o cerca del lugar de unión de ATP, bloqueando por ello la reacción de escisión sin afectar a la reacción adelantada de síntesis de ADN.

2.: El uso de compuestos que pueden bloquear la síntesis de ADN pero son de algún modo resistentes a escisión, tales variantes de alfa fosfato sustituido con borano o tio de los actuales NRTIs. De manera similar, pueden diseñarse variantes de los NRTIs actuales para recolocar la plantilla/cebador extendida/terminada de un modo no escindible, como se sugiere por la mala capacidad de escisión de los mutantes M184I/V inducida por 3TC.

3.: El uso de inhibidores basados en tetrafosfatos de dinucleótidos para proporcionar unión bi-dentada en ambos lugares N y P.

Cada uno de estos tres métodos propuestos para prevenir mecanismos de rescate de cebador de resistencia a NRTI está abierto a crítica para diversos defectos teóricos. Por ejemplo, en el primer método no se requiere unión de ATP para funciones de RT normales. Así, las contramedidas basadas en inhibir la unión de ATP o pirofosfato por competición o bloqueo no impedirán desarrollo de resistencia porque la aptitud del virus subyacente no estará comprometida por tales agentes. En otras palabras, surgirán mutaciones de resistencia con coste no evolutivo. La abundante cantidad de ATP presente en linfocitos normales también demanda estudio razonado detrás de este método.

En el segundo método propuesto, parece probable que se seleccionarían análogos de alfa fosfatos sustituidos con borano o tio para los mutantes resistentes discriminativos, como se ha visto con 3TC y FTC, y producen mutantes de resistencia de HIV.

El tercer método propuesto está limitado por la necesidad de absorción farmacocinética en la célula objetivo de las especies tetrafosfato de dinucleótidos altamente cargados. Ésta será una demanda farmacéutica y de suministro de fármaco rigurosa.

Es notable que cada uno de los métodos de Sarafiano, incluyendo el método 1 que no es antivírico por sí mismo, pero presupone la co-administración de un NRTI convencional, se basan en variantes de la generación actual de NRTIs. Es decir, compuestos que carecen de una función 3-hidroxilo y actúan por tanto como terminadores de cadena obligados.

En contraste con los NRTIs "clásicos" discutidos antes (es decir, los que carecen de una función 3'-hidroxi), Ohrui et al. (J. Med. Chem. (2000) 43, 4516-4525) describen inhibidores de HIV 4'-C-etinilo:

1

Estos compuestos conservan la función 3'-hidroxi pero presentan no obstante actividad contra HIV-1, incluyendo una cepa MDR discriminativa típica que lleva las mutaciones A62V, V75L, F77L, F116Y y Q151M. Se postuló que el mecanismo de acción era a través de afinidad con la quinasa fosforilante de nucleósido. Se observó también, sin embargo, que estos compuestos pueden funcionar como terminadores de cadena de ADN debido a su carácter de neopentilglicol y al impedimento estérico riguroso del sustituyente 4' cis vecinal, que producía una reactividad fuertemente disminuida del 3'-hidroxi.

Kodama et al. (Antimicrob Agents Chemother (2001) 1539-1546) describen un conjunto muy similar de compuestos que llevan un grupo 4'-C-etinilo adyacente a la función 3'-hidroxi retenida que se ensayaron en cultivo de células con cepas resistentes de HIV adicionales. Puesto que Kodama et al. no prepararon los trifosfatos de sus compuestos, fueron incapaces de aclarar el mecanismo de acción pero infirieron de diversas observaciones circunstanciales que los compuestos actúan realmente como NRTIs. Kodama et al. informaron más tarde (resumen 388-T. 2003 9^{th} Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections) de que bajo la presión selectiva de su 4-C-etinil nucleósido in vitro, se encontró HIV resistente a ruptura que lleva mutaciones T1651 y M184V situadas en el lugar catalítico de RT. Este fenotipo mutante es manifiestamente un tipo discriminativo de mutación y tiene resistencia cruzada fuertemente a 3TC. Estaba así implicado el bloqueo por conflicto estérico de la incorporación de 4-C-etinil nucleósido. Esto se ha establecido con el mecanismo inhibidor de 3TC y representa por tanto casi con certeza el mecanismo resistente discriminativo. Parece por tanto improbable que los compuestos de Kodama proporcionen guías que dirijan los mutantes que facilitan rescate de cebador (escisión mediada por ATP o pirofosfato).

Chen et al. (Biochemistry (1993) 32:6000-6002) efectuaron investigaciones de mecanismos extensas sobre una serie relacionada estructuralmente de compuestos que llevan un grupo azido en 4':

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Chen demostró que RT incorpora eficazmente dos nuleótidos monofoafato de 4'-azidotimidina consecutivos, lo que termina el alargamiento de la cadena. Además, RT también era capaz de incorporar un primer monofosfato de 4'-azidotimidina, seguido por un dNTP nativo y después un segundo nucleótido de 4'-azidotimidina, que conducía también a terminación de cadena. Nótese que ambos de estos mecanismos producían un monofosfato de 4'-azidotimidina residente en el término de cebador de ADN terminado, que es un mecanismo inhibidor que recuerda mucho a los NRTIs actuales. También fue evidente que las polimerasas celulares (es decir, no víricas) \alpha y \beta eran capaces cada una de incorporar un nucleótido 4'-azido único, pero no un segundo, en la cadena naciente del ADN del hospedante. Estas polimerasas celulares permitían después alargarse la cadena de ADN del hospedante con dNTPs nativos adicionales e incorporaban así permanentemente el nucleótido NRTI en los genes del ADN del hospedante. No se ha proseguido con estos compuestos en seres humanos porque la incorporación equivocada de nucleótidos no nativos por enzimas celulares tiene claras implicaciones en carcinogénesis. De manera similar, se detuvo el desarrollo farmacéutico de los compuestos de 4'-C-etinilo correspondientes de Kodama, debido según se afirma a toxicidad grave en organismos superiores.

El documento EP 341 911 describe una familia extensa de nucleósidos de 3'-C-hidroximetilo de fórmula

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y propone su uso principalmente contra herpesvirus tales como CMV, pero también contra retrovirus. El documento WO 92/06201 revela también un conjunto similar de compuestos e indicaciones.

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El documento US 5.612.319 (correspondiente al documento WO 95/32983) y Bottinger et al. AIDS 1997 11(2):157-162 revelan la actividad retrovírica de 2'-3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo contra HIV-1_{IIIB} de tipo natural y el equivalente de simios, SIV-1, en un modelo de mono cynomolgus agudo de infección con HIV. La publicación de patente US 5.612.319 propone el uso del compuesto como un agente profiláctico post-exposición, especialmente contra heridas por pinchazo con agujas. La profilaxis post-exposición implica que el ingrediente activo se administra inmediatamente a gente tal como personal médico, que se ha pinchado inconscientemente a sí misma con una jeringa potencialmente infectada con HIV. Con el fin de asegurar un tratamiento rápido de un profesional de cuidados sanitarios sobresaltado comprensiblemente, una vía de administración preferida es una jeringa cargada por resorte auto-administrada, tal como las usadas para antídotos en guerra química y biológica.

La intención de la profilaxis post-exposición es impedir que se establezca la propia infección en lugar de tratar una infección en marcha. Como tal, se pretendía realizar el tratamiento durante un período corto de tiempo tal como 24-48 horas, usando dosis extremadamente altas del compuesto. La publicación US 5.612.319 manifiesta que, debido al período de tiempo discreto de administración, es aceptable una toxicidad transitoria porque se está tratando de impedir una enfermedad incurable. El método profiláctico post-exposición descrito en el documento US 5.612.319 no se ha probado nunca en seres humanos, y realmente a conocimiento de los presentes inventores, 2'-3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo no se ha administrado a seres humanos en absoluto.

En 1994, cundo se presentó la solicitud concedida como US 5.612.319, no se había presentado HIV multi-resistente como se conoce hoy en ninguna forma fuerte. El HIV multi-resistente de hoy tiene mutaciones de rescate de cebador inducidas y acumuladas desde hace muchos años de presión selectiva de terapia de NRTI. En otras palabras, el HIV y especialmente la RT existentes en el momento en que se concedieron estas patentes eran estructural y de mecanísticamente muy diferentes de los virus actuales.

Descripción breve de la invención

Según la presente invención, se proporciona el uso de 2',3'-didesoxi-3'-hidroximetilo o una sal del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infección con HIV, en el que la transcriptasa inversa del HIV lleva al menos una mutación que permite escindirse una cadena obligada que termina en fosfato de nucleósido o nucleótido de la cadena de ADN naciente por escisión mediada por ATP o pirofosfato.

Se proporciona también 2',3'-didesoxi-3'-hidroximetilo o una sal del mismo para uso en el tratamiento de infección con HIV, en el que la transcriptasa inversa del HIV lleva al menos una mutación que permite escindirse una cadena obligada que termina en fosfato de nucleósido o nucleótido de la cadena de ADN naciente por escisión mediada por ATP o pirofosfato.

Además, se proporciona el uso de 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo o una sal del mismo junto con al menos un NRTI terminador de cadena como ingredientes activos en la fabricación de un medicamento para administración simultánea o secuencial de dichos ingredientes activos para la inhibición de la aparición o propagación de mutantes de HIV en un individuo infectado con HIV, en el que dichos mutantes son capaces de separar un nucleótido NRTI terminador de cadena incorporado a un complejo de cebador/plantilla de HIV, siendo facilitada la separación por un mecanismo de escisión dependiente de ATP o dependiente de pirofosfato.

Se proporciona también 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo o una sal del mismo junto con al menos un NRTI terminador de cadena como ingredientes activos para uso por administración simultánea o secuencial de dichos ingredientes activos para la inhibición de la aparición o propagación de mutantes de HIV en un individuo infectado con HIV, en el que dichos mutantes son capaces de separar un nucleótido NRTI terminador de cadena incorporado a un complejo cebador/plantilla de HIV, siendo facilitada la separación por un mecanismo de escisión dependiente de ATP o dependiente de pirofosfato.

En los usos y composiciones de la invención, el 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo puede emplearse si se desea en forma de un profármaco del mismo que libera 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo o su 5'-monofosfato in vivo.

Aunque sin desear ceñirse a este mecanismo propuesto, se cree que 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo se fosforila al correspondiente 5'-trifosfato por enzimas celulares. La RT fuertemente mutada de HIV multirresistente, en particular RT mutante relacionada con rescate de cebador, incorpora este trifosfato como el monofosfato de 5'-(2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo) en la cadena de ADN naciente.

Los NRTIs convencionales actúan como terminadores de cadena obligados, que terminan la síntesis de ADN en el lugar N, y son así susceptibles al mecanismo de rescate (escisión) de cebador mediado por ATP o pirofosfato descrito antes, único para HIV multirresistente. Como contraste, la evidencia presentada aquí sugiere que monofosfato de 5'-(2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo) no actúa como un terminador de cadena obligado, sino que permite en cambio incorporarse covalentemente un residuo adicional a la función 3'-hidroximetilo del monofosfato de 5'-(2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo). Éste promueve después que la RT experimente el cambio transformacional necesario para translocarse ella misma al lugar P para la siguiente ronda de polimerización. La evidencia preliminar basada en la secuencia de la plantilla presentada después sugiere que este residuo terminal incorporado es un nucleótido nativo en lugar de un monofosfato de 5'-(2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo) adicional.

De modo importante, la evidencia obtenida y presentada después sugiere que el último nucleótido no 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo incorporado no es susceptible a más adición de nucleótidos por la transcriptasa inversa mutada. Esto es, la terminación de cadena parece tener lugar una base más allá del NRTI de la invención en lugar de en el NRTI. Además, tras la incorporación del compuesto de la invención, la RT parece translocarse con éxito al lugar P con el fin de aceptar al siguiente nucleótido entrante. Esta evidencia sugiere que el compuesto de la invención, conjuntamente con una RT mutada relacionada con rescate de cebador, consigue una forma de terminación de cadena que no es susceptible a escisión inducida por ATP o pirofosfato. Como consecuencia, el método descrito aquí permite un tratamiento eficaz de infecciones con HIV que no es sensible a regímenes de fármacos actuales.

El mecanismo inhibidor discutido inmediatamente antes es así diferente fundamentalmente del mecanismo de terminación de cadena de los nucleósidos 4'-sustituidos de Chen et al. (véase antes), lo que permite incorporar varios nucleótidos después del compuesto 4-sustituido incorporado. En primer lugar, el mecanismo de Chen aumenta drásticamente el riesgo de "lectura completa". Esto es, la polimerasa de ADN continúa siguiendo la cadena de codificación y continúa añadiendo los residuos codificados al codón de detención normal, incorporando por ello erróneamente el nucleósido anormal dentro de la cadena de ADN. Puede perderse, sin embargo, eficacia antivírica cuando se construye una cadena de ADN vírico por la polimerasa vírica (es decir, RT), porque la construcción de lectura completa puede ser aún viable, a pesar de el nucleósido 4'-sustituido incorporado erróneamente. De manera más importante, si el nucleósido 4'-sustituido es leído completamente por una polimerasa celular (es decir, hospedante), como describe Chen, la construcción resultante representa posteriormente un teratógeno y aumenta drásticamente el riesgo de daño celular y cáncer.

Los compuestos de Chen requieren adicionalmente la adición de un segundo nucleótido 4'-sustituido, inmediatamente adyacente al primer nucleótido 4'-sustituido incorporado erróneamente (es decir, X-X) o intercalado por un nucleótido nativo (es decir, X-N-X). En la práctica esto significa que el nucleótido en la última posición del término de cebador es el nucleótido no nativo (es decir, fármaco). Ésta es una situación análoga al caso de terminación de cadena de NRTIs clásicos (es decir, los que carecen de un grupo 3-hidroxi). Aquí, el nucleótido NRTI reside también en la última posición del término de cebador, en donde, como se ha discutido antes, es susceptible a escisión mediada por ATP o pirofosfato.

Se necesitan unidades múltiples del nucleótido 4'-sustituido de Chen con el fin de que actúe como un inhibidor de RT eficaz. Como consecuencia, la eficacia del fármaco depende e la secuencia de la cadena de lectura. Por ejemplo, si el compuesto de Chen es un análogo de timidina tendrá la mejor afinidad si la cadena de lectura tiene una secuencia AA o A-N-A. Aquí, el fármaco sería eficiente y eficaz para terminar la síntesis de ADN. Pero si la secuencia de la cadena de lectura no contiene abundantes relaciones de la secuencia AA o A-N-A, el fármaco de Chen será menos capaz de terminar la síntesis de ADN, con una concentración dada. Puesto que un doblete AA o un triplete A-N-A es mucho menos común en el genoma que un singulete A, el fármaco de Chen será bastante menos eficaz que otros NRTIs que no tienen un requisito de unidades múltiples.

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El HIV multirresistente tratado o prevenido según la invención tendrá típicamente una RT que lleve un modelo genético que comprenda al menos uno entre

(a): M41, \pmD67, L210 y T215;

(b): D67, K70 y K219;

(c): T69S-XX o

(d): \ding{115}67

en los que XX representa una adición a la secuencia de RT de cualesquiera dos aminoácidos naturales y \ding{115}67 representa la supresión de aminoácido en el codón 67.

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Aunque se cree que los 4 modelos genéticos anteriores representan la base esencial del fenotipo de escape de fármaco de escisión, será vidente que los mutantes tratados o prevenidos por el uso de la invención comprenderán típicamente mutaciones adicionales en el gen de RT y en otra parte, a menudo al menos tres mutaciones en el gen de RT.

Generalmente, aunque no exclusivamente, la agrupación M41, \pmD67, L210 y T215 comprenderá a menudo M41L, \pmD67N, L210W y T215Y o T215F.

Opcionalmente, las agrupaciones inmediatamente anteriores pueden comprender además al menos una mutación adicional en posición E44, K70, V118, H208, R211K, L214, K219 o G333.

Las agrupaciones inmediatamente anteriores pueden comprender además al menos una mutación adicional en posición \ding{115}67, T69, E203, L210, D218, H221, D223 o L228.

Generalmente, aunque no exclusivamente, la agrupación D67, K70 y K219 comprende D67N, K70R y K219Q o K219E.

Opcionalmente, la agrupación D67, K70 y K219 puede comprender adicionalmente al menos una mutación adicional en posición M41, E44, V118, H208, L210, R211K, L214, T215 o G333.

Además, la agrupación D67, K70 y K219 comprende además opcionalmente al menos una mutación adicional en posición \ding{115}67, T69, E203, L210, D218, H221, D223 o L228.

Generalmente, aunque no exclusivamente, la agrupación T69S-XX puede comprender además al menos una mutación adicional en posición M41, E44, D67, K70, V118, H208, L210, R211K, L214, T215, K219 o G333.

Opcionalmente, la agrupación T69S-XX puede comprender además al menos una mutación adicional en posición \ding{115}67, T69, E203, L210, D218, H221, D223 o L228.

Generalmente, aunque no exclusivamente, la agrupación \ding{115}67 puede comprender además al menos una mutación adicional en posición M41, E44, D67, K70, V118, H208, L210, R211K, L214, T215, K219 o G333.

Opcionalmente, la agrupación \ding{115}67 puede comprender además al menos una mutación adicional en posición T69, T69S+XX, E203, L210, D218, H221, D223 o L228.

Opcionalmente, la transcriptasa inversa puede llevar además al menos una mutación discriminativa en posición K65, L74, M184 o Q151, especialmente K65R, L74V o M184V o Q151M.

Típicamente, la agrupación de mutantes discriminativos puede estar enlazada con al menos una mutación adicional en posición A62, V75, F77, Y115 o F116.

Las cepas de HIV tratadas por la invención son cepas de HIV multirresistentes cuya RT tiene mutaciones que estimulan rescate de cebador (escisión) mediado por ATP o pirofosfato de nucleótidos NRTI terminadores de cadena y que han surgido dentro del paciente como resultado de tratamiento de HIV previo con al menos un antivírico seleccionado entre zudovudina (AZT, ZDZ), estavudina (d4T), zalcitabina (ddC), didanosina (ddI), abacavir (ABC), lamivudina (3TC), emtricitabina (FTC), adefovir (ADV), entacavir (BMS 200475), alovudina (FLT), fumarato de tenofovir disoproxilo (TNF), amdoxavir (DAPD), D-d4FC (DPC-817), -dOTC (SPD 754), SPD-756, racivir, D-FDOC o GS7340. Alternativamente, las cepas de HIV son las encontradas en pacientes que han recibido tal cepa de HIV resistente o multirresistente directa o indirectamente de otro individuo que había inducido él mismo una cepa de HIV resistente o multirresistente por tratamiento mantenido con al menos un antivírico de la lista anterior de antivíricos de NRTI. Frecuentemente, las cepas de HIV multirresistentes contienen al menos tres mutaciones en la RT vírica en comparación con el tipo natural.

Será así evidente que los compuestos y composiciones de la invención pueden usarse como un aditivo a terapias antirretrovíricas actuales, tales como HAART, o en algunos casos como una terapia de rescate o salvamento. Éste será el caso típicamente cuando se haya inducido el HIV multirresistente en el paciente actual por la historia de tratamiento con fármacos antirretrovíricos anteriores del paciente. Alternativamente, los compuestos y composiciones de la invención constituirán una terapia de primera línea, típicamente en pacientes cuya infección con HIV primaria tuvo lugar con una cepa multirresistente ya mutada. Los siguientes fármacos antivíricos inducen a menudo tales cepas de HIV multirresistentes que tienen mutaciones de rescate de cebador de RT que estimulan escisión mediada por ATP o pirofosfato de nucleótidos NRTI terminadores de cadena: zudovudina, lamivudina o las formas de dosificación combinada Combivir o Trizvir; lamivudina, abacavir o la forma de dosificación combinada Epzicom; tenofovir, emtricitabina o la forma de dosificación combinada Truvada. Aunque estos fármacos inducen frecuentemente tales cepas de HIV multirresistentes, esta lista de fármacos no es exclusiva.

Es evidente por tanto que el 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo se administra con el fin de prevenir la aparición de una o más cepas de HIV multirresistentes que tienen mutaciones de rescate de cebador de RT que estimulan escisión mediada por ATP o pirofosfato de nucleótidos NRTI terminadores de cadena. Esta prevención tiene lugar incluso cuando se administran concomitantemente fármacos de NRTI que inducen tales mutaciones.

Un tercer aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica en forma de dosificación unitaria o forma de co-dosificación que comprende 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo y al menos un NRTI terminador de cadena, en el que por dosificación mantenida con el NRTI induce mutaciones de rescate de cebador de RT de HIV que estimulan escisión dependiente de ATP o dependiente de piofosfato de monofosfato de NRTI incorporado desde el término 3' del complejo cebador/plantilla y permite la reanudación de la síntesis de ADN.

Las realizaciones preferidas de la composición farmacéutica de la invención incluyen aquellas en las que el NRTI se selecciona entre zudovudina (AZT, ZDV), estavudina (d4T), zalcitabina (ddC), didanosina (ddI), abacavir (ABC), lamivudina (3TC), emtricitabina (FTC), adefovir (ADV), entacavir (BMS 200475), alovudina (FLT), fumarato de tenofovir disoproxilo (TNF), amdoxavir (DAPD), D-d4FC (DPC-817), -dOTC (SPD 754), SPD-756, racivir, D-FDOC o GS7340 y combinaciones de ellos.

Las realizaciones particularmente preferidas incluyen aquellas en las que el NRTI se selecciona entre: zudovudina, estavudina, didanosina, lamivudina, abacavir, tenofovir, emtricitabina o combinaciones de ellos.

En contraste con los métodos descritos en el documento US 5.612.319, el 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo de la invención se administra al paciente en una dosis relativamente baja y con la expectativa de un tratamiento antirretrovírico mantenido y prolongado. Este régimen de tratamiento de dosificación definida asegura niveles de fármaco definidos y evita toxicidad, a diferencia de un tratamiento de profilaxis post-exposición en el que es aceptable una toxicidad transitoria. El documento US 5.612.319 sugiere dosis de 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo de aproximadamente 10-25 mg/kg/día para tratamiento profiláctico post-exposición humano y 30 mg/kg/día usados en los experimentos de monos.

En la corriente invención, sin embargo, el 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo se administra en menos de 1 mg/kg/
día, preferiblemente en el intervalo de 0,05-0,5 mg/kg/día y más preferiblemente en menos de 0,1 mg/kg/día. La dosificación apropiada dependerá de las indicaciones y el paciente, y se determina fácilmente por metabolismo de fármacos de animales convencional y farmacocinética (DMPK) o pruebas clínicas y software de predicción in silico.

Las composiciones farmacéuticas de dosificación unitaria o co-dosificación de la invención tienen cantidades correspondientes de 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo, escaladas típicamente para un adulto de 60 kg o 75 kg, y están divididas opcionalmente una vez, dos veces o tres veces para un régimen de dosificación de QD, BID o TID. Las dosificaciones se escalan hacia arriba si se emplea un profármaco para tener en cuenta la masa extra del profármaco y se escalan hacia abajo a la vista de la biodisponibilidad aumentada. Si la dosis terapéutica está en el intervalo de 0,05-0,5 mg/kg/día, una dosis de QD clínica por persona y día sería 3 mg-30 mg para un adulto de 60 kg o 3,75-37,5 mg para un adulto de 75 kg. La dosificación y las restricciones de régimen del NRTI convencional adicional en el aspecto de la invención de composición farmacéutica de unidad de dosificación combinada pueden necesitar dosificación de QD, BID o TID.

Las formas de co-dosificación incluyen paquetes simples que contienen envases de ampollas de 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo o su profármaco y un NRTI adicional como se ha definido antes. El envase de ampollas puede incluir ampollas para ambos componentes en la lámina de ampollas (típicamente con indicaciones que faciliten la administración correcta del número apropiado de pastillas/cápsulas de cada uno), por ejemplo, 2 pastillas de un fármaco y 1 pastilla del otro. Alternativamente, la forma de co-dosificación es un paquete con una pluralidad de láminas de ampollas contenidas, en el que cada uno de los fármacos tiene su propia lámina de ampollas.

El principio apreciado nuevamente de que 2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo en el contexto de RT de HIV, que es mutada para permitir escisión de terminador de cadena por una vía catalizada pirofosfolíticamente, está funcionando por un mecanismo diferente de acción de nucleósidos terminadores de cadena puede ponerse en efecto por administración del compuesto progenitor 2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo, o por administración de profármacos que liberen 2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo in vivo.

Un grupo de profármacos de 2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo emplea modificación de base, como se muestra en Mauldon et al. Biorg Med Chem 6 (1998) 577-585. Los profármacos modificados de base típicos tienen la fórmula:

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en la que Rcon es independientemente H o un éster aceptable farmacéuticamente convencional;

R^{5} es -C(=O)R^{7}, o un residuo de L-aminoácido unido a amida;

R^{6} es H;

o R^{5} y R^{6} juntos definen la imina =CR^{8}R^{8'};

R^{7} es alquilo C_{1}-C_{6}, alquilcicilo C_{0}-C_{3};

R^{8} y R^{8'} son independientemente H, alquilo C_{1}-C_{6}, alquilcicilo C_{0}-C_{3};

o R^{8} es H y R^{8'} es -NR^{9}R^{9'};

R^{9} y R^{9'} son independientemente H, alquilo C_{1}-C_{6}, alquilcicilo C_{0}-C_{3};

o R^{9} y R^{9'} junto con el átomo de N al que están unidos definen un anillo de 5 o 6 miembros saturado;

n es 1, 2 o 3;

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Los ésteres aceptables farmacéuticamente convencionales incluyen ésteres de alquilo tales como acetilo, propionilo, butirilo, pivaloilo, palmitilo, estearilo y similares y ésteres de arilo tales como benzoilo. Otros ésteres aceptables farmacéuticamente convencionales incluyen ésteres de aminoácidos tales como L-valilo, L-isoleucina o L-fenilalanina.

Los ejemplos de profármacos modificados de base en Mauldon incluyen las iminas:

-N=CHNR,

en la que NR es N(CH_{3})_{2}, N(iPr)_{2}, N(Pr)_{2}, N(CH_{2})_{4}, N(CH_{2})_{5}, N(CH_{2})_{6}, N(CH_{2}CH_{2})_{2}O

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Los profármacos modificados de base de Mauldon adicionales incluyen las amidas del nitrógeno de citosina

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en las que Rcon es H o un éster aceptable farmacéuticamente convencional,

Ra es NH(Boc-L-Valilo), NH-Boc L-Phe, L-valilo, L-Phe;

o Ra es C(=O)CH_{3}, COPh, COC(CH_{3})_{3} y similares.

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Los profármacos modificados de base tales como Mauldin pueden tener la ventaja de disminuir la susceptibilidad a desaminasas de citosina celulares y fisiológicas, pero, a la vista de las muchas reacciones de transglicosilación que tienen lugar en células humanas, debe tenerse cuidado de asegurar que la base modificada no es transglicosilada en una ribosida nativa e incorporada a ADN humano con consecuencias cancerógenas o tautógenas.

Un grupo preferido de profármacos de 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo útiles para la invención son profármacos ésteres 3' y/o 5' de fórmula:

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6

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en la que uno de R y R' es un resto de profármaco con la estructura parcial:

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en la que R^{1} es H o alquilo C_{1}-C_{18} recto o ramificado;

R^{2} es H o NHR^{3}

R^{3} es H o un éster de L-valilo o L-isoleucilo;

y el otro de los R y R' es H o un resto de profármaco idéntico;

o una sal del mismo aceptable farmacéuticamente.

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Muchos de estos profármacos ésteres o 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo son compuestos nuevos y forman un aspecto adicional de la invención.

Una realización de los profármacos ésteres de la invención incluye compuestos de fórmula V en los que R^{1} es un alquilo C_{1}-C_{18} de cadena recta o ramificada y R^{2} es H. Los restos alquilo representativos incluyen los que definen los ésteres octanoilo (C_{8}, incluyendo el C de la cetona), decanoilo (C_{10}), laurilo (C_{12}), miristoilo (C_{14}), palmitoilo (C_{16}), estearoilo (C_{18}) o eicosanoilo (C_{20}). Los restos alquilo preferidos incluyen metil (es decir, acetil) etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo (es decir, pivaloilo), n-pentilo, 1-metilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 2-metilpentilo, 2,2-dimetilpropilo, n-hexilo y similares. El profármaco puede llevar un éster en R (es decir, un 5'-O- éster) o R' (es ecir, un 3'-O-éster) o ambos (un bis 3',5'-O-éster). Por facilidad de síntesis y análisis es preferible, aunque obligatorio, que los ésteres en 3' y 5' sean restos de profármacos idénticos.

Una realización adicional de los profármacos ésteres de la invención incluyen aquellos en los que R^{1} es alquilo inferior, especialmente metilo, y R^{2} es NHRb, en el que Rb es el residuo de un aminoácido L-alifático seleccionado entre alanina, valina, leucina, t-leucina, isoleucina y norleucina, especialmente en los que R^{2} es NH-L-valilo o NH-L-isoleucilo. En esta realización, R^{1} tiene la estereoquímica correspondiente a L-ácido láctico. El profármaco puede llevar este resto de profármaco éster en R (es decir, un 5'-O-éster) o R' (es decir, un 3'-O-éster) o ambos (un bis 3',5'-O-éster). Por facilidad de síntesis y análisis es preferible, aunque obligatorio, que los ésteres en 3' y 5' sean restos de profármacos idénticos.

Los profármacos ésteres adicionales para uso en la invención incluyen aquellos en los que R^{1} es alquilo C_{3}-C_{4} de cadena ramificada y R^{2} es NH_{2}. La cadena secundaria de R^{1} tiene preferiblemente la estereoquímica de un L-aminoácido tal como L-valina, L-leucina, L-isoleucina o L-t-leucina. El profármaco puede llevar un éster en R (es decir, (es decir, un 5'-O-éster) o R' (es decir, un 3'-O-éster) o ambos (un bis 3',5'-O-éster). Por facilidad de síntesis y análisis es preferible, aunque obligatorio, que los ésteres en 3' y 5' sean restos de profármacos idénticos.

Los profármacos preferidos incluyen:

5'-O-L-valil-2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo;

5'-O-L-isoleucil-2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo;

5'-O-acetil-2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo;

5'-O-propionil-2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo;

5'-O-butiril-2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo;

5'-O-pivaloil-2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo;

2',3'-didesoxi-3-C-(acetil-oximetilo);

2',3'-didesoxi-3-C-(propionil-oximetilo);

2',3'-didesoxi-3-C-(butiril-oximetilo);

2',3'-didesoxi-3-C-(pivaloil-oximetilo);

2',3'-didesoxi-3-C-(L-valil-oximetilo);

2',3'-didesoxi-3-C-(L-isoleucil-oximetilo);

5'-O-L-valil-2',3'-didesoxi-3'-C-L-valiloximetilo;

5'-O-L-isoleucil-2',3'-didesoxi-3'-C-L-isoleuciloximetilo;

5'-O-acetil-2',3'-didesoxi-3-C-acetiloximetilo;

5'-O-propionil-2',3'-didesoxi-3-C-propioniloximetilo;

5'-O-butiril-2',3'-didesoxi-3-C-butiriloximetilo;

5'-O-pivaloil-2',3'-didesoxi-3-C-pivaloiloximetilo;

y sales de los mismos aceptables farmacéuticamente.

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Los profármacos particularmente preferidos incluyen:

5'-O-[2-S-(L-valiloxi)-propionil]-2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo,

2',3'-didesoxi-3'-C-[2-S-(L-valiloxi)-propionil]-oximetilo;

5'-O-pentanoil-2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo;

2',3'-dodesoxi-3'-C-pentanoil-oximetilo; o

5'-O-pentanoil-2',3'-didesoxi-3-C-pentanoil-oximetilo;

o una sal de los mismos aceptable farmacéuticamente.

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Aunque sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que 2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo, como otros análogos de nucleósidos, se fosforila intracelularmente por quinasas celulares al 5'-monofosfato, que se fosforila a su vez adicionalmente al difosfato y trifosfato. Las quinasas di y trifosforilantes tienden a ser más activas que la quinasa monofosforilante inicial, especialmente en algunos tipos de células. En otras palabras, la monofosforilación puede ser teóricamente una etapa limitante de velocidad. Por consiguiente, puede ser conveniente en algunas circunstancias administrar el compuesto progenitor en una forma ya monofosforilada, con el fin de asegurar una fosforilación hacia delante rápida al trifosfato. Sin embargo, no es sencillo conseguir un fármaco altamente polar tal como un monofosfato de nucleósido a través de la membrana celular. Hay, no obstante, manipulaciones de profármacos que se cree que permiten la penetración intracelular del profármaco, que se hidroliza in situ al monofosfato. Es ejemplo de un método así el profármaco de zidovudina de fase II fozivudina tidoxilo, que emplea un conjugado de lípido tioéter al éster fosfato de zidovudina. Véase por ejemplo Girard en JAIDS 23 227-235 y las patentes EE.UU. 5.756.711, EE.UU. 5.563. 257 y el documento EP 545 966. La construcción análoga aplicada al 5'-monofosfato de 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo es:

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en la que alquilo es típicamente C_{8}-C_{15} y n es 0 (mercapto), 1 (sulfinilo) o 2 (sulfonilo). Los valores favorecidos incluyen dodecilmercapto conjuntamente con un decil éter.

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En el contexto de la invención, un profármaco de 2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo incluye también profármacos del 5'-monofosfato que libera 5-O-fosfato de 2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo intracelularmente.

La corriente invención incluye sales aceptables farmacéuticamente tales como sales de ácidos orgánicos, especialmente ácidos carboxílicos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, acetato, trifluoroacetato, lactato, gluconato, citrato, tartrato, maleato, malato, pantotenato, isetionato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, butirato, digluconato, ciclopentanato, glucoheptanato, glicerofosfato, oxalato, heptanoato, hexanoato, fumarato, nicotinato, palmoato, pectinato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, proprionato, tartrato, lactobionato, pivolato, canforato, undecanoato y succinato. También están incluidas las sales de ácidos orgánicos sulfónicos tales como metanosulfonato, etanosulfonato, 2-hidroxietano sulfonato, canforsulfonato, 2-naftalenosulfonato, bencenosulfonato, p-cloro-bencenosulfonato y p-toluenosulfonato. Las sales aceptables incluyen también las de ácidos inorgánicos tales como hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, sulfato, bisulfato, hemisulfato, tiocianato, persulfato, ácidos fosfórico y sulfónico.

La corriente invención se extiende a agentes activos que son hidratos, solvatos, complejos y otras formas físicas que liberan 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo in vivo.

Aunque es posible administrar el agente activo solo, es preferible presentarlo como parte de una formulación farmacéutica. Tal formulación comprenderá el agente activo 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo junto con uno o más vehículos/excipientes aceptables y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. El(los) vehículo(s) debe(n) ser acepta-
bles(s) en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor.

Las formulaciones incluyen las adecuadas para administración rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Preferiblemente la formulación es una formulación administrada oralmente. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, pastillas y cápsulas de liberación sostenida, y pueden prepararse por cualesquiera métodos bien conocidos en la técnica de farmacia.

Tales métodos bien conocidos incluyen la etapa de poner en asociación el agente activo 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo con el vehículo. En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociación uniforme e íntimamente el agente activo con excipientes líquidos o excipientes sólidos finamente divididos o ambos, y conformando después el producto, si es necesario. La invención se extiende a métodos para preparar una composición farmacéutica que comprenden poner en conjunción o asociación un compuesto de 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo o su sal aceptable farmacéuticamente con un excipiente o vehículo aceptable farmacéuticamente. Si la fabricación de formulaciones farmacéuticas implica mezclar íntimamente excipientes farmacéuticos y el ingrediente activo en forma de sal, se prefiere entonces a menudo usar excipientes que sean de naturaleza no básica, es decir, ácidos o neutros.

Las formulaciones para administración oral de la presente invención pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, sellos o pastillas, cada una conteniendo una cantidad predeterminada del agente activo. Alternativamente, pueden presentarse como un polvo o gránulos; como una solución o una suspensión del agente activo en un líquido acuoso o un líquido no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite, como un bolus, etc.

Con respecto a composiciones para administración oral (por ejemplo, pastillas y cápsulas), la expresión "excipiente adecuado" incluye vehículos tales como excipientes comunes, por ejemplo, agentes de unión tales como jarabe, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto, polivinilpirrolidona (Povidone), metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, hidroxipropilmedtil-celulosa, sacarosa y almidón; cargas y vehículos, por ejemplo, almidón de maíz, gelatina, lactosa, sacarosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, fosfato bicálcico, cloruro sódico y ácido algínico; y lubricantes tales como estearato magnésico, estearato sódico y otros estearatos metálicos, estearato de glicerol ácido esteárico, fluido de silicona, ceras de talco, aceites y sílice coloidal. Pueden usarse también agentes saporíferos tales como menta piperita, aceite de gualteria, sabor de cereza o similares. Puede ser deseable añadir un agente colorante para hacer a la forma de dosificación fácilmente identificable. Las pastillas pueden revestirse por métodos muy conocidos en la técnica.

Puede fabricarse una pastilla por compresión o moldeo,.opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Pueden prepararse pastillas comprimidas comprimiendo en una máquina adecuada el agente activo en una forma fluida tal como polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglomerante, lubricante, diluyente inerte, agente de conservación, agente tensioactivo o dispersante. Pueden fabricarse pastillas moldeadas moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo mojado con un diluyente líquido inerte. Las pastillas pueden revestirse o rayarse opcionalmente y pueden formularse para proporcionar liberación lenta o controlada del agente activo.

Otras formulaciones adecuadas para administración oral incluyen grageas que comprenden el agente activo en una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el agente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y lavados bucales que comprenden el agente activo en un vehículo líquido adecuado.

Se sintetiza 2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo por químicas de nucleósidos convencionales, tales como las reveladas en los documentos US 5.612.319, US 5.473.063, Svansson L. et al. en J. Org. Chem. (1991) Vol. 56: 2993-2997 y Björsne M. et al. en Tetrahedron, Vol. 49: 8637-8644 (1993).

La síntesis de profármacos modificados de base, y ciertos ésteres 3' y 5' convencionales se revela en Mauldin et al. Biiorg. Med. Chem. 6 (1998) 577-585.

La síntesis de ésteres 3' y 5' se realiza típicamente por reacción del nucleósido (con la base N-protegida con un grupo protector de N convencional, según sea necesario) con el ácido del resto del profármaco:

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conjuntamente con un reactivo de acoplamiento convencional o con un derivado activado de este éster tal como a haluros de ácido tales como cloruros de ácido, y ésteres activados que incluyen, aunque sin limitarse a ellos, anhídridos derivados de ácido fórmico y acético, anhídridos derivados de haluros de alcoxicarbonilo tales como cloruro de isobutiloxicarbonilo y similares, ésteres derivados de N-hidroxisuccinimida, ésteres derivados de N-hidroxiftalimida, ésteres derivados de N-hidroxibenzotriazol, ésteres dertivados de N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxamida, ésteres derivados de 2,4,5-triclorofenilo y similares.

La regioselección de la posición 3' o 5', para los compuestos que comprenden un resto de profármaco único, se consiguen con el uso de grupos protectores voluminosos, por ejemplo como se muestra en el documento WO 97/30051, o usando pares seleccionables diferencialmente de grupos protectores de hidroxilo, como se muestra en Sanghvi et al. Synthesis 1994, 1163, Sanghvi et al. Tett Lett vol. 35 pág. 4697 (1994) y Haly & Sanghvi Nucleosides & Nucleotides Vol. 15 1383 (1996).

Se conocen muchos pares de grupos protectores de hidroxilo seleccionables diferencialmente, por ejemplo los grupos O-protectores revelados en Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis" (John Wiley & Sons, Nueva York (1981)).

Los grupos protectores de hidroxi comprenden así éteres tales como metil éter o metil éteres sustituidos, por ejemplo, metoximetilo (MOM), benciloximeilo, 1-butoximetilo, 2-metoxietoximetilo (MEM), 2,2,2-tricloroetoximetilo, bis(2-cloroetoxi)metilo, 2-(trimetilsilil)etoximetilo, tetrahidropiranilo (THP), 3-bromotetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, 4-metoxitetrahidropiranilo, 4-metoxitetrahidrotiopiranilo S,S dixido, tetrahidrofuranilo y tetrahidrotiofuranilo. Los etil éteres incluyen 1-etoxietilo, 1-metil-1-metoxietilo, 1-(isopropoxi)etilo, 2,2,2-tricloroetilo y 2-(fenilselenil)etilo. Otros éteres incluyen t-butil, alil, cinamil, p-clorofenil y bencil éteres tales como bencilo no sustituido, p-metoxibencilo, o-nitrobencilo, p-nitrobencilo, p-halobencilo y p-cianobencilo. Otros éteres incluyen 3-metil-2-picolil N-óxido, difenilmetilo, 5-dibenzosuberilo, trifenilmetilo, alfa naftildifenilmetilo, p-metoxi-fenildifenilmetilo, p(p'-bromofenaciloxi)fenildifenilmetilo, 9-antrilo, 9-(9-fenil)xantenilo, 9-(9-fenil-10-oxo)antrilo (tritilona) y bencisotiazolil S,S-dioxodo. Los silil éteres incluyen trimetilsililo (TMS), tretilsililo, isopropildimetilsililo, t-butildimetilsililo (TBDMS), (trifenilmetil)dimetilsilo, t-butildifenilsililo, metildiisopropilsililo, metildi-t-butilsililo, tribencilsililo, tri-p-xililsililo, triisopropilsililo y trifenilsililo, Los grupos protectores de hidroxilo alternativos incluyen ésteres, tales como los formiato, benzoilformiato, acetato, cloroacetato, dicloroacetato, tricloroacetato, trifluoroacetato, metoxiacetato, trifenilmetoxiacetato, fenoxiacetato, p-clorofenoxiacetato, 2,6-dicloro-4-metilfenoxiacetato, 2,6-dicloro-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenoxiacetato, 2,4-bis(1,1-dimetilpropil)fenoxiacetato, clorodifenilacetato, p-(P)-fenilacetato, 3-fenilpropionato, 3-benzoilpropionato, isobutirato, monosuccinato, 4-oxopentanoato (levinulato), pivaloato, adamantoato, crotonato, 4-metoxicrotonato, (E)-2-metil-2-butenoato (tigloato) y benzoatos tales como los no sustituidos, u o-(dibromometil)-, o-(metoxicarbonil)-, p-fenil-, 2,4,6-trimetil- (mesitato) o p-(P)-benzoatos, o alfa-naftoato. Los grupos protectores de hidroxilo carbonatos incluyen los metil, etil, 2,2,2-tricloroetil, isobutil, vinil, alil, cinamil, p-nitrofenil, bencilos tales como los no sustituidos, p-metoxi-, 3,4-dimetoxi-, o-nitro o p-nitrobencilos, o tiocarbonato de S-bencilo. Los grupos protectores de hidroxilo diversos incluyen N-fenilcarbamato, N-imidazolilcarbamato, borato, nitrato, N,N,N,N-tetrametilfósforodiamidato y 2,4-dinitrofenilsulfenato. Greene proporciona tablas de reactividad extensas para facilitar la selección de pares complementarios de grupos protectores diferenciales.

Los grupos protectores de hidroxilo representativos incluyen los de los ejemplos, y éteres tales como t-butil y otros alquilo inferior éteres, tales como isopropil, etil y especialmente metil, bencil y trifenilmetil, tetrahidropiranil éteres, etil éteres sustituidos, por ejemplo, 2,2,2-tricloroetil; silil éteres, por ejemplo, trimetilsilil, t-butildimetilsilil y t-butildifenilsilil; y ésteres preparados haciendo reaccionar el grupo hidroxilo con un ácido carboxílico, por ejemplo, acetato, propionato, benzoato y similares.

Cuando se protegen y desprotegen grupos funcionales necesarios en el resto de profármaco tal como NH, o la base de nucleósido, usando estrategias de manipulación convencionales, como se muestra por ejemplo en Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1981), los grupos protectores de N incluyen grupos acilo tales como formilo, acetilo, propionilo, pivaloilo, t-butilacetilo, 2-cloroacetilo, 2-bromoacetilo, trifluoroacetilo, tricloroacetilo, ftalilo, o-nitrofenoxiacetilo, \alpha-clorobutirilo, benzoilo, 4-clorobenzoilo, 4-bromobenzoilo, 4-nitrobenzoilo y similares; grupos sulfonilo tales como bencenosulfonilo, p-toluenosulfonilo y similares, grupos formadores de carbamato tales como benciloxicarbonilo, p-clorobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, 2-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, 3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 4-metoxibenciloxicarbonilo, 2-nitro-4,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,4,5-trimetoxibenciloxicarbonilo, 1-(p-bifenilil)-1-metiletoxicarbonilo, \alpha,\alpha-dimetil-3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, benzhidriloxicarbonilo, t-butoxicarbonilo, diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, metoxicaronilo, aliloxicarbonilo, 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo, fenoxicarbonilo, 4-nitrofenoxicarbonilo, fluorenil-9-metoxicarbonilo, ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, cilohexiloxicarbonilo, feniltiocarbonilo y similares; grupos alquilo tales como bencilo, trifenilmetilo, benciloximetilo y similares; y grupos sililo tales como trimetilsililo y similares. Los grupos protectores de N preferidos incluyen formilo, acetilo, benzoilo, pivaloilo, t-butilacetilo, fenilsulfonilo, bencilo, t-butoxicarbonilo (BOC) y benciloxicarbonilo (Cbc).

La síntesis de profármacos del monofosfato transcurre análogamente a los documentos US 5.756.711,
US 5.563.257, EP 545.966 y WO 95/32984, con protección apropiada de la función 3' hidroximetilo. Se muestran formulaciones galénicas para tales compuestos en el documento WO 97/26867.

Descripción breve de los dibujos

La Fig. 1 es un gráfico que representa el predominio de TAMs que tienen un fenotipo de rescate de cebador en el fondo M41L/L210W/T215Y de 1086 secuencias de RT de pacientes con fallo virológico;

La Fig. 2 es un gráfico que representa el predominio de TAMs que tienen un fenotipo de rescate de cebador en el fondo D67N/K70R/L210W de 1098 secuencias de pacientes con fallo virológico;

La Fig. 3 es una vista esquemática de polimerización de ADN catalizada por RT;

La Fig. 4 es una vista esquemática de actividad de rescate de cebador mediada por ATP en un término de cebador terminado en AZT;

La Fig. 5 representa la inhibición de cepas de TAM típicas que tienen un fenotipo de rescate de cebador por 2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo, con relación a la inhibición de NRTIs convencionales;

La Fig. 6 representa la inhibición de M184V + TAMs que tienen un fenotipo de rescate de cebador por 2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo, con relación a NRTIs convencionales;

La Fig. 7 representa la inhibición de T69S+XX + TAMs por 2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo, con relación a la inhibición de NRTIs convencionales;

La Fig. 8 representa la inhibición de cepas de TAM por 2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo, con relación a la inhibición de zidovudina y lamivudina;

La Fig. 9 es un gráfico que representa la síntesis de ADN en función del tiempo, que refleja la incorporación de monofosfato de 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo;

La Fig. 10 es un gráfico que representa cebador de 3'-OH residual, indicando que la incorporación de 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo permite síntesis de ADN adicional limitada;

La Fig. 11 es una autorradiografía de un gel que muestra que la terminación de cadena inducida por monofosfato de 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo difiere de ADN terminado de cadena inducida por monofosfato de ddC. El fragmento de ADN terminadode cadena inducida por monofosfato de ddC aparece más abajo en el gel que el fragmento producido usando el compuesto de la invención.

Descripción detallada de la invención

Se describirán ahora diversas realizaciones y aspectos de la invención sólo a modo de ejemplo, con referencia a los ejemplos y dibujos que se acompañan.

Ejemplo 1 Actividad de 2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo contra HIV resistente relacionado con rescate de cebador de TAM en el ensayo de HIV PhenoSense

La susceptibilidad de 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo en aislados de HIV de muestras de plasma de pacientes que llevan genotipos resistentes de mutantes de rescate de cebador TAM típicos por el ensayo de HIV PhenoSense disponible comercialmente (descrito en Petropoulos CJ et al., (2000) Antimicrob. Agents Chemother. 44:920-928 y efectuado por ViroLogics, Inc.). El ensayo se realiza multiplicando el segmento de (PR)-RT de proteasa del gen pol de HIV de plasma de pacientes e insertando los productos de multiplicación en un vector de HIV-1 modificado derivado de un clon molecular NL4-3.

Se preparan materiales víricos co-transfectando cultivos de células 293 con vector de ADN vírico recombinante y un vector de expresión que produce las proteínas de envoltura de virus de leucemia de ratón anfotrópico. Se cosechan partículas de virus pseudotipificado de los cultivos de células transfectadas y se usan para infectar cultivos de células 293 nuevos. El ADN vírico recombinante contiene una cassette de gen de luciferasa dentro de la región del gen env de HIV y la producción de luciferasa en células objetivo depende de que se complete una ronda de replicación vírica. La susceptibilidad del fármaco se mide añadiendo a las células concentraciones en serie del compuesto de la invención y los compuestos de referencia. Los fármacos que inhiben la replicación del virus reducen la señal de luciferasa de una manera dependiente de la dosis, proporcionando una medida cuantitativa de la susceptibilidad del fármaco.

Ejemplo 1a

La Tabla 1 resume una agrupación principal e mutantes TAM relacionados con rescate de cebador usados en el experimento que son resistentes a HIV y llevan el genotipo de TAM característico que surge típicamente durante terapia retrovírica que implica AZT.

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TABLA 1 Genotipo característico en aislados 20 y 21 de pacientes de TAM relacionado con rescate de cebador

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Los resultados se representan en la Fig. 5. Se usó como referencia virus HIV de tipo natural. Aquí, la inhibición de cepas de aislados del paciente 20 y 21 se expresa como el cambio en veces de la reducción de susceptibilidad al fármaco de tratamiento en comparación con pruebas paralelas de la referencia. Se ensayaron los siguientes fármacos antivíricos: AZT, 3TC, TNF, ABC, d4T, FTC y el compuesto de la invención. Es evidente claramente que el 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo de la invención conservó actividad contra las cepas que llevan TAM. Los resultados muestran sólo una reducción de 1,0 veces de la susceptibilidad para la cepa del aislado 20 y menos de una reducción de 1,0 veces de la susceptibilidad para la cepa de aislado 21. Esto significa que 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo conservó actividad contra la RT de HIV mutante relacionado con rescate de cebador del paciente en un nivel de eficacia similar a su eficacia contra RT de HIV de tipo natural. Como contraste, otros fármacos, notablemente AZT (reducción de susceptibilidad de 451 veces), pero también 3TC, TFN, ABC, d4T y FTC, perdieron eficacia contra el virus de estos pacientes en comparación con el tipo natural. En otras palabras, el virus de estos pacientes presentaba resistencia, es decir, reducciones de susceptibilidad grandes a estos fármacos, como se muestra en la Fig. 5.

Es importante señalar que los dos aislados de pacientes albergan transiciones de aminoácidos diferentes en el codón 215; T a F en el aislado 20 y T a Y en el aislado 21. Ésta es una marca de contraste representativa de mutantes de resistencia TAM relacionados con rescate de cebador.

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Ejemplo 1b

La Tabla 2 expone a grandes rasgos un HIV mutante relacionado con rescate de cebador con el fondo genético M184V (un mutante discriminativo), que se selecciona típicamente por la terapia antirretrovírica empleada muy comúnmente AZT+3TC (Combivir).

TABLA 2 Cambios genotípicos en aislado 19 de pacientes relacionado con rescate de cebador de TAM

11

Como se muestra em la Fig. 6, 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo conservó una vez más actividad contra este virus resistente, mostrando sólo una diferencia de susceptibilidad de 1,78 veces en comparación con el HIV de tipo natural. 3TC y AZT perdieron actividad y mostraron eficacia reducida (es decir, una reducción pronunciada de la susceptibilidad vírica) para el virus resistente (Fig. 6).

Ejemplo 1c

La demanda continua de pacientes con agentes retrovíricos produce la aparición de MDR. Se ve a menudo una mutación T69S con una inserción de 6 pb entre los aminoácidos 68 y 70 en la región de dedo de RT, en combinación con diversas formas de TAMs, y contribuye a una actividad de rescate de cebador aumentada. Se escogió una agrupación de MDR (con diferentes formas de inserción(es) de aminoácido(s)) en combinación con TAM, como se expone a grandes rasgos en la Tabla 3.

TABLA 3 Cambios genotípicos en aislados 31, 32 y 35 de pacientes relacionados con rescate de cebador

12

Como se muestra en la Fig. 7, el compuesto de la invención inhibió estos aislados de pacientes, dando el cambio más pequeño de susceptibilidad del fármaco en comparación con seis antivíricos de referencia usados actualmente en terapia antirretrovírica convencional.

Nótese que se observó una reducción de susceptibilidad pronunciada (de 500 a 1000 veces) a AZT para los aislados de pacientes 32 y 35, mientras que el compuesto de la invención mostró cambios de 2,79 y 4,29 veces respectivamente. Esto es consecuente con que el compuesto de la invención presenta un mecanismo diferente de inhibición en comparación con los terminadores de cadena de ADN obligatorios representados por NRTIs convencionales.

Ejemplo 1d

El aislado 4 representa un mutante discriminativo adicional que lleva el genotipo K65R+M184V en un fondo de TAM no esencial consistente en mutaciones en R211S y K219E. Este aislado causa una resistencia cruzada típica a abacavir, 3TC y el recién aprobado nucleósido FTC, pero conserva su susceptibilidad a análogos de tinidina, tales como AZT y d4T. Este aislado no lleva mutaciones de rescate de cebador típicas, aunque el compuesto de la invención inhibe todavía este fenotipo vírico como se indica por un valor de FC de 3,88. Este valor es comparable con los análogos de timidina AZT (FC = 1,11) y d4T (FC = 0,71), mientras que se encontró resistencia significativa para 3TC (FC > 200), FTC (FC > 40) y en alguna extensión para ABC (FC > 9,0). Estos datos experimentales demuestran que el compuesto de la invención no sólo lleva propiedades únicas contra mutantes de "rescate de cebador", sino que también es capaz de inhibir mutantes de HIV de la familia discriminativa. Esto contrasta, por tanto, con el mecanismo inhibidor empleado por 3TC y FTC así como el mecanismo probable de los compuestos de 4'-C-etinilo de Kodama descritos antes en los que M184V junto con un cambio de aminoácido adicional en el codón T165R en la región catalítica contribuye a resistencia cruzada a nucleósido de 4-C-etinilo (Kodama 2002).

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Ejemplo 2 Actividad de 2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo contra HIV resistente relacionado con rescate de cebador en PBMC

Se ensayó en un cultivo de PBMC el funcionamiento antivírico del compuesto de la invención contra aislados de HIV resistente relacionado con rescate de cebador de TAM adicionales. Se generaron aislados de HIV-1 y se expandieron hasta título alto por co-cultivo de PBMC de paciente infectado con PBMC de donante estimulado con PHA (Virology Manual for ACTG HIV Laboratories). Se cosecharon los sobrenadantes libres de células, se determinaron sus secuencias y se guardaron en partes alícuotas a -70ºC para ensayos de susceptibilidad del fármaco.

Se efectuaron ensayos de susceptibilidad del fármaco in vitro usando un método de consenso ACTG/DOD modificado (Virology Manual for ACTG HIV Laboratories). Se preinfectaron PBMCs con materiales víricos durante 4 h a 37ºC en una atmósfera humidificada del 5% de CO_{2} tras 4 h de incubación. Las células infectadas se lavaron dos veces en medios y se pipetearon a una placa de microtitulación con ocho diluciones de fármaco en serie. Cada pocillo contenía 100.000 PBMC preinfectadas y todas las diluciones de fármaco se hicieron con medio de cultivo de células. Las diluciones de fármaco se escogieron para extender la concentración inhibidora del 50% (IC_{50}) para cada fármaco simple. Los pocillos testigo que contenían células y virus se co-incubaron en cada placa. Después de 7 días de incubación a 37ºC en una atmósfera humidificada del 5% de CO_{2}, se determinó el crecimiento vírico usando un ensayo de antígeno p24 en sobrenadantes (Abbott Laboratories, Chicago, EE.UU.). Se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento vírico en comparación con el pocillo testigo, que no contenía fármaco, y se expresó como cambios en veces (reducciones de la susceptibilidad de los compuestos) en comparación con el pocillo testigo. El compuesto de referencia AZT se probó en paralelo con el compuesto de la invención.

Se seleccionó una agrupación de representantes de virus mutantes relacionados con rescate de cebador que alberga la característica esencial de mutaciones de RT resistentes TAM relacionadas con rescate de cebador. Se usaron como se indica en la Tabla 4 cepas con mutaciones en las posiciones M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F y K219Q/E en diversas combinaciones con o sin M184V mutante discriminativo.

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TABLA 4 Genotipo relacionado con rescate de cebador de TAM en 9 aislados de pacientes

13

Muchos de estos mutantes de rescate de cebador seleccionados conferían uma resistencia pronunciada a susceptibilidad de AZT, cayendo um par de cientos de veces en el valor de FC. La excepción fue el aislado 7086 (FC = 3,0), que lleva la mutación de aminoácidos T215V. Se presenta un informe completo de calores de FC en la Fig. 8. Aquí, el 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo inhibía los 8 aislados, siendo sólo el valor de FC más alto 2,7.

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Ejemplo 3 2',3'-Didesoxi-3'-C-hidroximetilo conserva la capacidad para apoyar síntesis de ADN

La presencia de un grupo 3'-hidroximetilo en el compuesto de la invención debe, en principio, apoyar la incorporación y alargamiento en el ácido nucleico vírico catalizados por RT de HIV-1. Se usó una cantidad limitadora de velocidad de cebador-plantilla (ARN ribosómico 16S y 23S reasociado con un cebador de oligo-ADN con la secuencia de 5'-TAACCTTGCGGCCGT-3' (SEQ ID NO: 1), sintetizado de encargo por INNOVAGEN). Éste se pre-incubó con trifosfato de 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo 100 \muM (55 veces la IC_{50}), trifosfato de ddC 6,0 \muM (54 veces la ddCTP IC_{50}), trifosfato de desoxicitosina 20 \muM (20 veces la dCTP km) o el testigo (H_{2}O). En los puntos de tiempo indicados (0, 10, 30, 60 y 120 min), se detuvo el procedimiento de polimerización de ADN por inactivación de la RT a 70ºC durante 2 min durante la primera ronda de polimerización de ADN (Fig. 9).

La cantidad residual de cebador-plantilla refleja directamente la disponibilidad de término de cebador 3'-OH libre presente después de la primera ronda de reacción. Con el fin de medir ésta, se inició una nueva polimerización por adición de RT nueva en presencia de dCTP 150 \muM (160 veces la km) y dCTP marcado con tritio que es suficiente para eliminar por competencia cualquier efecto inhibidor de los 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetiloTP y ddCTP dejados de la primera ronda de polimerización de ADN. Se midió la disponibilidad de 3'-OH libre en el término de cebador en la cantidad residual de cebador-plantilla que apoyaba polimerización de ADN adicional y se expresó en función del tiempo de pre-incubación (Fig. 10).

Con referencia a las Figuras 9 & 10, aunque se fijaron ddCTP y 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetiloTP para proporcionar un nivel inhibidor igual, hubo un fuerte contraste en su capacidad respectiva para apoyar la segunda ronda de polimerización de ADN catalizada por RT de HIV. La pre-inubación con un terminador de cadena obligatorio tal como ddCTP causa terminación de cadena y da una reducción significativa de término de cebador 3-OH libre en comparación con el trifosfato del compuesto de la invención. En puntos de tiempo de pre-incubación de 10 y 30 minutos, se dejó menos de la mitad de la cantidad de término de cebador 3-OH residual para apoyar prolongación de ADN adicional cundo está presente ddCTP en comparación con el trifosfato del compuesto de la invención, a pesar de que se usaron cantidades comparables de los compuestos de TP en la primera ronda de polimerización de ADN. Esto indica claramente que la incorporación del TP del compuesto de la invención al ácido nucleico naciente proporciona una oportunidad continuada de alguna síntesis de ADN adicional. La polimerización de ADN debe incluir unión de la enzima a la plantilla, acomplejamiento con dNTP apropiado, formación de fosfo-diéster, liberación de pirofosfato y translocación de la enzima del lugar N al lugar P para que tenga lugar la siguiente ronda de síntesis. Es evidente por tanto que el compuesto de la invención es capaz de incorporarse y translocarse por la enzima a la siguiente posición, tras lo que cesa el alargamiento adicional.

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Ejemplo 4

La incorporación de monofosfato de 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo conduce a un modelo de terminación de cadena diferente en comparación con ddC.

Dos análogos de citosina, el NRTI ddC convencional que carece de una función de grupo 3'-hidroxilo, y el compuesto de la invención, se sometieron a un ensayo de terminación de cadena de ADN, en el que la prolongación de ADN se efectuó con plantilla de ADN de cadena sencilla de M13mp18 pre-reasociada a un cebador de oligo-ADN (la secuencia de cebador delantera de 5'-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA-3' (SEQ ID NO: 2) se compró a Amersham UK). Se reasoció ARN de cadena sencilla de M13mp18 a este cebador de oligo-ADN dando una concentración final de 1 mg/ml en un tampón que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 7,9 y NaCl 100 mM, y se guardó en partes alícuotas a -20ºC. La polimerización de ADN se efectuó usando esta plantilla/cebador reasociados, RT de HIV-1 y dNTPs naturales en una reacción incubada a 37ºC durante 25 min. La reacción se detuvo por adición de solución Stop que contenía 95% de formamida, EDTA 20 mM, 0,05% de azul de bromofenol y 0,05% de xileno cianol FF (comprado a USB, United States Biochemical, a través de Amersham UK). Después de desnaturalizar los productos de ADN, el fragmento de ADN alargado se sometió a electroforesis en un gel de poliacrilamida del 8,0% y se visualizó usando autorradiografía.

El ensayo incluyó un testigo negativo (el dNTP nativo), testigos de ddCTP positivos dobles (ddCTP, 8 \muM de Sigma Chemical, St. Louis, Miss, EE.UU., y ddCTP obtenido de un juego de secuencias USB, United States Biochemical, a través de Amersham UK). Se usaron diversas relaciones de moléculas del trifosfato del compuesto de la invención y el dNTP natural. Después de efectuarse la reacción como se ha descrito antes, los fragmentos de ADN desnaturalizados de cada reacción individual se cargaron en un gel de poliacrilamida del 8,0% en el siguiente orden:

1-: Testigo negativo

2-: 1^{er} Testigo positivo ddCTP 8 \muM (comprado a Sigma)

3-: TP de la invención 20 \muM en dNTP 200 \muM

4-: TP de la invención 30 \muM en dNTP 300 \muM

5-: TP de la invención 40 \muM en dNTP 400 \muM

6-: TP de la invención 50 \muM en dNTP 500 \muM

7-: TP de la invención 20 \muM en dNTP 80 \muM

8-: TP de la invención 40 \muM en dNTP 80 \muM

9-: Espacio vacío (sin carga)

10-: 2º Testigo positivo ddCTP (de juego de secuencias USB)

Con el fin de evitar cualquier otro factor que pueda influir en la interpretación del resultado del ensayo, tal como el efecto de borde asociado con geles de poliacrilamida, se cargó un juego duplicado de muestras en medio del gel. La Fig. 11 muestra una foto digital de la representación de los resultados de autorradiología obtenidos de la parte central del gel:

1.: Testigo negativo (dNTP): no se encontró pausa en polimerización de ADN.

2.: 1er Testigo positivo ddC-TP 8 \muM: condujo a terminación de cadena en los lugares de 2'3'-desoxidesoxicitosina anticipados.

3.: TP de la invención 20 \muM/dNTP 200 \muM: condujo a terminación de cadena en el lugar después del/detrás del lugar de 2'3'-desoxidesoxicitosina.

4.: TP de la invención 30 \muM/dNTP 300 \muM: condujo a terminación de cadena en el lugar después del lugar de 2'3'-desoxidesoxicitosina comparado con ddC-TP.

5.: TP de la invención 40 \muM/dNTP 400 \muM: condujo a terminación de cadena en el lugar después del lugar de 2'3'-desoxidesoxicitosina comparado con ddC-TP.

6.: TP de la invención 50 \muM/dNTP 500 \muM: No se encontró pausa específica (modelo de terminación de cadena), pero se considera que está dentro del error experimental.

7.: TP de la invención 20 \muM/dNTP 80 \muM: condujo a un efecto de terminación de cadena más pronunciado en el lugar después del lugar de 2'3'-desoxidesoxicitosina comparado con ddC-TP y la muestra experimental de la invención inmediatamente anterior.

8.: TP de la invención 40 \muM/dNTP 80 \muM: condujo a un efecto de terminación de cadena más pronunciado en el lugar después del lugar de 2'3'-desoxidesoxicitosina comparado con ddC-TP y la muestra experimental de la invención inmediatamente anterior.

9.: Espacio vacío (sin muestra cargada)

10.: 2º Testigo positivo ddC-TP: condujo a terminación de cadena en los lugares de 2'3'-desoxidesoxicitosina anticipados.

El compuesto de la invención ha inducido terminación de cadena de ADN en todas las muestras, con la excepción de la muestra nº 6 que contiene TP de la invención 50 \muM en dNTP 500 \muM. La razón para esta excepción es desconocida, pero está probablemente dentro del error experimental. De manera interesante, fragmentos de ADN resultantes de la incorporación de monofosfato de 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo migran más lentamente que los resultantes de los dos fragmentos de ADN terminados en ddCTP testigos positivos (Fig. 11). Las reacciones duplicadas muestran un modelo consecuente que implica que el compuesto de la invención se incorpora a la cadena de ADN recién sintetizada y permite la formación de un enlace 3',5'-fosfodiéster adicional en la siguiente ronda de incorporación de nucleótidos. Aunque se observó un fragmento más largo en una base, no puede excluirse que la secuencia de la plantilla empleada pueda jugar un papel.

El Ejemplo 3 muestra claramente que el término de cebador 3'-OH que se pre-terminó por el compuesto de la invención apoya la incorporación de nucleótidos adicional más que un término de cebador 3'-OH pre-terminado por ddCTP, cuando se usa una plantilla de ARN ribosómico. Esta característica hace la movilidad de electroforesis lenta e implica que la RT ha experimentado translocación para comenzar la siguiente ronda de polimerización.

Aunque sin desear ceñirse a este mecanismo, se cree que el compuesto de la invención representa por tanto una nueva estrategia para inhibir mutantes de escisión de cebador. Esto es, el compuesto se incorpora al genoma vírico en crecimiento mientras conserva simultáneamente la capacidad para permitir que la molécula de RT experimente el cambio transformacional necesario con el fin de prepararse para la siguiente ronda de síntesis de ADN. Los Ejemplos 3 y 4 han demostrado claramente que el compuesto de la invención lleva tales propiedades y es así capaz de vencer/contrarrestar al mecanismo resistente de rescate de cebador como se demuestra en los Ejemplos 1 y 2.

Sarafinano et al. (2002 y 2003) proporcionan datos experimentales convincentes que apoyan la conclusión de que la reacción de rescate de cebador sólo puede tener lugar antes de que la RT se transloque a la siguiente posición. Esto es, el complejo de pre-translocación es una condición necesaria para que sea eficaz un mutante de rescate de cebador. La evidencia presentada en los Ejemplos sugiere que éste no es el caso para el compuesto de la corriente invención.

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Ejemplo 5 Preparación de profármacos ésteres que liberan 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo

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Esquema 1

14

Preparación de Compuesto 1

El Compuesto 1 protegido diferencialmente con 3'-MMTR/5'-TMBDS se prepara como la uridina correspondiente según se describe por Sanghvi et al. Synthesis (1994) pág. 1163 & Tetrahedron Lett v 35 (1994) pág. 4697 & Nucleosides & Nuvleotides v. 15 (1996) 1383. Las conversiones U a C mostradas en Kozlov et al. Nucleosides & Nucleotides, v. 17 (1998) 2249.

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Preparación de Compuesto 2

El Compuesto 1 (5,0 g, 6,7 mmoles) se disolvió en ácido acético del 80% (30 ml) y se agitó durante 24 h a temperatura ambiente. La mezcla se evaporó y el producto se purificó por cromatografía rápida con 10% de MeOH en CH_{2}CL_{2} como eluyente. La producción fue 2,1 g (64%).

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Preparación de Compuesto 3

El Compuesto 1 (2,3 g, 3,06 mmoles) en THF (150 ml) se trató con fluoruro de tetrabutilamonio (1M en THF, 3,0 ml) durante 1 h a temperatura ambiente. Se añadió bicarbonato sódico (sat., 100 ml) y se extrajo la mezcla con diclorometano (3 x 50 ml). La capa orgánica se secó y evaporó. El residuo se purificó por cromatografía rápida para dar 1,3 g (82%) de compuesto 3.

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Esquema 2

15

Preparación de Compuesto 4

Se añadieron trietilamina (0,455 g, 4,5 mmoles) y cloroformiato de etilo (0,26 g, 2,4 mmoles) a la solución de Boc-valina (0,49 g, 2,25 mmoles) en THF (15 ml) a 0ºC. La mezcla de reacción se agitó durante 3 h a la misma temperatura y se filtró después a la solución de Compuesto 2 (0,72 g, 1,5 mmoles) y DMAP (0,55 g, 4,5 mmoles) en THF (15 ml). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se añadió EtOAc a la mezcla y se lavó tres veces con ácido cítrico del 2% y una vez con NaHCO_{3} sat. La capa orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía rápida con 2 a 5% de MeOH en CH_{2}Cl_{2} como eluyente para dar 0,35 g (34%) de Compuesto 4.

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Preparación de Compuesto 5

El Compuesto 4 (30 mg, 0,066 mmoles) se disolvió en HCl conc. (1 ml) a temperatura ambiente y se agitó durante 5 min. Se añadió a la solución acetona y se evaporó. Se añadió de nuevo acetona y la solución se evaporó y secó bajo vacío para dar 18 mg (69%) de Compuesto 5.

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Preparación de Compuesto 6

El Compuesto 4 (0,35 g, 0,5 moles) se disolvió en THF (20 ml) y se añadió fluoruro de tetrabutilamonio 1,0 M en THF (0,5 ml, 0,5 mmoles). La mezcla de reacción se agitó durante 2 días a temperatura ambiente. Se evaporó la mezcla y el producto se purificó por cromatografía rápida con 5 a 10% de MeOH en CH_{2}Cl_{2} como eluyente para dar 0,225 g (98%) de compuesto 6.

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Preparación de Compuesto 7

La síntesis se hizo de la misma manera que para el Compuesto 4 usando Compuesto 6 como material de partida.

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Preparación de Compuesto 8

El Compuesto 7 (75 mg, 0,114 mmoles) se disolvió en 3 ml de MeOH y se añadió HCl conc. (0,5 ml) a 0ºC. La mezcla se agitó durante 5 min a 0ºC y durante 3 min a temperatura ambiente y se evaporó después. Se añadió acetona al residuo y se evaporó. Se añadió CH_{2}Cl_{2} y el residuo se evaporó y secó bajo vacío para dar 58 mg (96%) del Compuesto 8.

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Preparación de Compuesto 9

Se añadió cloroformiato de etilo (110 mg, 1,0 mmoles) a la solución de Boc-valina (220 mg, 1,0 mmoles) y trietilamina (200 mg, 2,0 mmoles) en THF (30 ml) a 0ºC, y se agitó la mezcla durante 3 h. Se permitió a la temperatura alcanzar temperatura ambiente y se filtró la mezcla. Se añadió el filtrado a la solución de compuesto 3 (350 mg, 0,68 mmoles) y DMAP (244 mg, 2,0 mmoles) en THF (20 ml). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente, se añadió a la mezcla acetato de etilo (100 ml) y se lavó con ácido cítrico (10%, 2 x 30 ml) y bicarbonato sódico (sat., 30 ml). Se retiró disolvente y el producto se separó en una columna de gel de sílice para dar el Compuesto 9 (220 mg, 45%).

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Preparación de Compuesto 10

El Compuesto 9 (200 mg, 0,28 mmoles) se disolvió en 3 ml de HCl conc. y se agitó durante 3 min a temperatura ambiente. La mezcla se evaporó, se lavó con acetona, acetonitrilo y dietiléter y se secó bajo vacío para dar 85 mg (77%) del Compuesto 10.

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Preparación de Compuesto 11

Se añadió cloroformiato de etilo (110 mg, 1,0 mmoles) a la solución de Boc-valilo-ácido láctico (290 mg, 1,0 mmoles) y trietilamina (200 mg, 2,0 mmoles) en THF (30 ml) a 0ºC, y la mezcla se agitó durante 3 h a 0ºC. Se permitió a la temperatura alcanzar la temperatura ambiente. Se filtró la mezcla y se añadió el filtrado a la solución de Compuesto 3 (300 mg, 0,58 mmoles) y DMAP (244 mg, 2,0 mmoles) en THF (20 ml). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente, se añadió a la mezcla acetato de etilo (100 ml) y se lavó con ácido cítrico (10%, 2 x 30 ml) y bicarbonato sódico (sat., 30 ml). Se retiró el disolvente y el producto se separó en una columna de gel de sílice para dar el Compuesto 11 (250 mg, 38%).

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Preparación de Compuesto 12

El compuesto se preparó a partir del Compuesto 11 de la misma manera que el Compuesto 8.

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Preparación de Compuesto 13

El compuesto se preparó de igual manera que el Compuesto 4 a partir del Compuesto 2 usando Boc-valilo-çácido láctico como material de partida en lugar de Boc-valina.

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Preparación de Compuesto 14

La síntesis se hizo a partir de Compuesto 13 como para el Compuesto 10.

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Preparación de Compuesto 15

El Compuesto 1 (1 g, 1,33 mmoles) se disolvió en 14 ml de HCl conc. y la mezcla se agitó durante 8 min a tem-
peratura ambiente y evaporó después. El residuo se lavó con acetona y filtró para dar 334 mg (90%) de Compuesto 15.

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Preparación de Compuesto 16

Se añadieron trietilamina (0,487 g, 4,82 mmoles) y cloroformiato de etilo (0,30 g, 2,77 mmoles) a la solución de Boc-valina-ácido láctico (0,77 g, 2,65 mmoles) en THF (30 ml) a 0ºC. La mezcla de reacción se agitó durante 3 h a la misma temperatura y s filtró después a la solución de Compuesto 15 (0,334 g, 1,20 mmoles) y DMAP (0,74 g, 6,0 mmoles) en THF (30 ml) y DMF (30 ml). La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se añadió a la mezcla EtOAc y se lavó tres veces con ácido cítrico del 2% y una vez con NaHCO_{3} sat. La capa orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se evaporó. El producto crudo se purificó por cromatografía rápida con 2 a 5% de MeOH en CH_{2}Cl_{2} como eluyente para dar sólo 65 mg (8%) de Compuesto 16.

Esquema 3

16

Preparación de Compuesto 17

La síntesis se hizo a partir de Compuesto 16 como para el Compuesto 8.

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Preparación de Compuesto 18

Se añadió cloruro de valerilo (460 mg, 3,8 mmoles) a la solución de ácido valérico (390 mg, 3,8 mmoles) y trietilamina (770 mg, 7,6 mmoles) en THF (50 ml) a 0ºC, y la mezcla se agitó durante 3 h y se filtró después. El filtrado se añadió a la solución de Compuesto 3 (1,3 g, 2,53 mmoles) y DMAP (930 mg, 7,6 mmoles) en THF (50 ml). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se añadió a la mezcla ácido cítrico (10%, 50 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2 x 50 ml). La capa orgánica combinada se lavó con ácido cítrico (10%, 30 ml) y después con carbonato sódico (50 ml) y salmuera (50 ml). Después de secar, se retiró el disolvente orgánico y el residuo se separó en una columna de gel de sílice para dar el Compuesto 18 (850 mg, 56%).

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Preparación de Compuesto 19

El Compuesto 18 (850 mg, 1,42 mmoles) se disolvió en metanol (10 ml) y se añadió a la solución a 0ºC HCl conc. (1,5 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 0,5 h. Se añadió a la mezcla carbonato sódico (50 ml) y se extrajo con diclorometano (3 x 50 ml). Se retiró el disolvente y el producto se separó en una columna de gel de sílice para dar el Compuesto 19 (230 mg, 50%).

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Preparación de Compuesto 20

La síntesis se hizo a partir de Compuesto 19 como para el Compuesto 9.

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Preparación de Compuesto 21

La síntesis se hizo a partir de Compuesto 20 como para el Compuesto 8.

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Preparación de Compuesto 22

La síntesis se hizo a partir de Compuesto 19 como para el Compuesto 18.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Esquema 4

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Preparación de Compuesto 23

El Compuesto 2 (1,02 g, 2,1 mmoles) y DMAP (1,05 g, 8,61 mmoles) se disolvieron en THF (35 ml) y se enfriaron a -78ºC. Se añadió durante 15 min cloruro de valerilo (6 x 42 \mul, 2,14 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura fría durante 2 h y después 1 h sin baño de enfriamiento. La mezcla de reacción se vertió en ácido cítrico del 5% y se extrajo después con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporaron para dar un sólido blanco que se purificó en una columna de gel de sílice con 0 a 6% de MeOH en CH_{2}Cl_{2} como eluyente para dar 0,31 g (25%) de Compuesto 23.

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Preparación de Compuesto 24

El Compuesto 23 (0,35 g, 0,58 mmoles) se disolvió en THF (20 ml), se añadió TBAF 1 M en THF (0,58 ml, 0,58 mmoles) y la mezcla se agitó durante 90 min a temperatura ambiente. Se evaporó el disolvente y el residuo se purificó por cromatografía rápida con 0 a 10% de MeOH en CH_{2}Cl_{2} como eluyente para dar 166 mg (92%) de Compuesto 24.

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Preparación de Compuesto 25

La síntesis se hizo a partir de Compuesto 24 como para el Compuesto 4.

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Preparación de Compuesto 26

La síntesis se hizo a partir de Compuesto 25 como para el Compuesto 8.

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Ejemplo 6 Liberación de 2'3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo de profármacos

La confirmación de que los profármacos de la invención se convierten completamente a compuesto progenitor 2'3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo, puede valorarse comprobando la aparición del compuesto progenitor en plasma humano agrupado, a 37ºC, sembrado con profármaco 5 \muM.

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Ejemplo 7 Biodisponibilidad de profármacos

Los profármacos se mezclan típicamente en agua de calidad MQ, a razón de 3 mg/ml, y se administran oralmente por intubación a ratas por duplicado. Una dosis adecuada es 5 mg/kg. Se toman muestras de plasma en puntos de tiempo adecuados, tales como t 0, 15 & 30 minutos, 1, 2, 4 y 6 horas. La recuperación (como el metabolito 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetil-\beta-D-eritropentofuranosilcitosina) en el plasma se mide con espectrometría de masas, detectado como el aducto de sodio m/z 264 (M+Na)^{+}.

Los resultados se representan como concentración en plasma frente al tiempo y muestran generalmente una Cmáx del orden de 3 a 5 \muM. La biodisponibilidad absoluta %F se calcula de manera convencional, es decir, por referencia a la eliminación de una dosis in vitro del progenitor, como se muestra en el documento WO 97/30051.

Como no pueden infectarse ratas con HIV, la actividad antirretrovírica de tales formulaciones orales no puede medirse directamente, pero se nota que la ED_{50} para el metabolito 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetil-\beta-D-eritropento-furanosilcitosina es típicamente alrededor de 0,01 \muM en células H9 humanas. Esto significa a su vez que las concentraciones en plasma de pico del orden de magnitud visto con estos profármacos están varios cientos de veces sobre la ED_{50}. Otros parámetros farmacéuticos tales como AUC y eliminación son típicamente consecuentes con conseguir un nivel durante 24 h muy por encima de la ED_{50} con dosificación de QD o BID.

Referencia

Brigitte Montes and Michel Segondy (2002) Prevalence of the mutational pattern E44D/A and/or V118I in the reverse transcriptase (RT) gene of HIV-1 in relation to treatment with nucleoside analogue RT inhibitors. J Med Virol. 66(3):299-303.

Boyer PL, Imamichi T, Sarafianos SG, Arnold E, Hughes SH (2004) Effects of the Delta67 complex of mutations in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase on nucleoside analog excision. J Virol. 78(18):9987-9997.

Boyer PL, Sarafianos SG, Arnold E, Hughes SH (2002) Nucleoside analog resistance caused by insertions in the fingers of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase involves ATP-mediated excision. 76(18):9143-9151

Girouard M, Diallo K, Marchand B, McCormick S and Gotte M (2003) Mutations E44D and V118I in the reverse transcriptase of HIV-1 play distinct mechanistic roles in dual resistance to AZT and 3TC. J Biol Chem: 5;278(36):34403-34410.

Harrigan, P. R., C. Stone, P. Griffin, I. Nájera, S. Bloor, S. Kemp, M. Tisdale, B. Larder, and the CNA 2001 Investigative Group (2000) Resistance profile of the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase inhibitor abacavir (1592U89) after monotherapy and combination therapy. J. Infect. Dis. 181:912-920

Imamichi, T., T. Sinha, H. Imamichi, Y.-M. Zhang, J. A. Metcalf, J. Falloon, and H. C. Lane. 2000. High-level resistance to 3'-azido-3'-deoxythymidine due to a deletion in the reverse transcriptase gene of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 74:1023-1028.

Imamichi, T., M. A. Murphy, H. Imamichi, and H. C. Lane. 2001. Amino acid deletion at codon 67 and Thr-to-Gly change at codon 69 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase confer novel drug resistant profiles. J. Virol. 75:3988-3992.

Jacobo-Molina, A., J. Ding, R. G. Nanni, A. D. Clark, Jr., X. Lu, C. Tantillo, R. L. Williams, G. Kamer, A. L. Ferris, P. Clark, and E. Arnold (1993) Crystal structure of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase complexed with double-stranded DNA at 3.0 \ring{A} resolution shows bent DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6320-6324

Kemp, S. D., C. Shi, S. Bloor, P. R. Harrigan, J. W. Mellors, and B. A. Larder. 1998. A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine. J. Virol. 72:5093-5098

Larder BA, Kemp SD (1989) Multiple mutations in HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT). Science. 1; 246(4934):1155-1158

Larder, B. A., S. Bloor, S. D. Kemp, K. Hertogs, R. L. Desmet, V. Miller, M. Stürmer, S. Staszewski, J. Ren, D. K. Stammers, D. I. Stuart, and R. Pauwels. 1999. A family of insertion mutations between codons 67 and 70 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase confer multinucleoside analog resistance. Antimicrob Agents Chemother. 43:1961-1967

Miller, V., A. Phillips, C. Rottmann, S. Staszewski, R. Pauwels, K. Hertogs, M. P. De Béthune, S. D. Kemp, S. Bloor, P. R. Harrigan, and B. A. Larder. 1998. Dual resistance to zidovudine (ZDV) and lamivudine (3TC) in patients treated with ZDV/3TC combination therapy: association with therapy failure. J. Infect. Dis. 177:1521-1532.

Mas A., M. Parera, C. Briones, V. Soriano, M. A. Martínez, E. Domingo, and L. Menéndez-Arias. 2000. Role of a dipeptide insertion between codons 69 and 70 of HIV-1 reverse transcriptase in the mechanism of AZT resistance. EMBO J. 21:5752-5761

Meyer PR, Matsuura SE, Tolun AA, Pfeifer I, So AG, Mellors JW, Scott WA (2002) Effects of specific zidovudine resistance mutations and substrate structure on nucleotide-dependent primer unblocking by human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase Antimicrob Agents Chemother. 46(5):1540-1545.

Meyer PR, Lennerstrand J, Matsuura SE, Larder BA, Scott WA (2003) Effects of Dipeptide Insertions between Codons 69 and 70 of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Reverse Transcriptase on Primer Unblocking, Deoxynucleoside Triphosphate Inhibition, and DNA Chain Elongation. J Virol. 77(6):3871-3877

Miller, V., M. Ait-Khaled, C. Stone, P. Griffin, D. Mesogiti, A. Cutrell, R. Harrigan, S. Staszewski, C. Katlama, G. Pearce, and M. Tisdale (2000) HIV-1 reverse transcriptase (RT) genotype and susceptibility to RT inhibitors during abacavir monotherapy and combination therapy. AIDS 14:912-920

Marcelin AG, Delaugerre C, Wirden M, Viegas P, Simon A, Katlama C and Calvez V (2004) Thymidine analogue reverse transcriptase inhibitors resistance mutations profiles and association to other nucleoside reverse transcriptase inhibitors resistance mutations observed in the context of virological failure. J Med Virol. 72(1):162-165

Martin, J. L., J. E. Wilson, R. L. Haynes, and P. A. Furman (1993) Mechanism of resistance of human immunodeficiency virus type 1 to 2',3' dideoxyinosine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6135-6139

Mitsuya H., Yarchoan R. and Broder S. (1990) Molecular targets for AIDS therapy. Science 249: 1533-1544.

Melby T, Tortell S, Thorborn D, et al (2001) Time to appearance of NRTI-associated mutations and response to subsequent therapy for patients on failing ABC/COM. In: Program and abstracts of the 8th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections; February 4-8, 2001; Chicago. Abstract 448

Naeger LK, Margot NA, Tuske S, Sarafianos SG, Arnold E, Miller MD (2001) Comparison of nucleoside and nucleotide reverse transcriptase inhibitor removal by the adenosine triphosphate-dependent chain-terminator removal mechanism. Presented at the 5th International Workshop on HIV Drug Resistance & Treatment Strategies Antivir Ther: 6 (suppl 1):39. Abstract 48.

Parikh U (a), Koontz D, Hammond J, et al. (2003) K65R: a multi-nucleoside resistance mutation of low but increasing frequency. 12th International HIV Drug Resistance Workshop: Basic Principles & Clinical Implications; Antivir Ther. 2003; 8:S152. Abstract 136.

Parikh U (b), Koontz D, Sluis-Cremer N, et al. K65R: a multinucleoside resistance mutation of increasing prevalence exhibits bi-directional phenotypic antagonism with TAM. Program and abstracts of the 11th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections; February 8-11, 2004; San Francisco, California. Abstract 54

Reardon, J. E. (1993) Human immunodeficiency virus reverse transcriptase. A kinetic analysis of RNA-dependent and DNA-dependent DNA polymerization. J. Biol. Chem. 268:8743-8751

Sturmer M, Staszewski S, Doerr HW, Larder B, Bloor S, Hertogs K (2003) Correlation of Phenotypic Zidovudine Resistance with Mutational Patterns in the Reverse Transcriptase of Human Immunodeficiency Virus Type 1: Interpretation of Established Mutations and Characterization of New Polymorphisms at Codons 208, 211, and 214. Antimicrob Agents Chemother; 47(1):54-61

St. Clair, M. B., J. L. Martin, G. Tudor-Williams, M. C. Bach, C. L. Vavro, D. M. King, P. Kellam, S. D. Kemp, and B. A. Larder (1991) Resistance to ddI and sensitivity to AZT induced by a mutation in HIV-1. Science 253:1557-1559

Schinazi RF., Larder BA. And Mellors JW (2000) Mutations in retroviral gene associated with drug resistance: 2000-2001 update. Int. Antivir. News 8:65-91

Sluis-Cremer, N., D. Arion, and M. A. Parniak. (2000) Molecular mechanisms of HIV-1 resistance to nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs). Cell. Mol. Life Sci. 57:1408-1422

Sarafianos SG, Clark AD Jr, Das K, Tuske S, Birktoft JJ, Ilankumaran P, Ramesha AR, Sayer JM, Jerina DM, Boyer PL, Hughes SH, Arnold E (2002) Structures of HIV-1 reverse transcriptase with pre- and post-translocation AZTMP-terminated DNA EMBO J. 2002 Dec 2;21(23):6614-24

Sarafianos SG, Clark AD Jr, Tuske S, Squire CJ, Das K, Sheng D, Ilankumaran P, Ramesha AR, Kroth H, Sayer JM, Jerina DM, Boyer PL, Hughes SH, Arnold E (2003) Trapping HIV-1 reverse transcriptase before and after translocation on DNA. J Biol Chem. 2; 278(18):16280-16288. Epub 2003 Jan 28.

Tisdale M, Alnadaf T, and Cousens D (1997) Combination of mutations in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase required for resistance to the carbocyclic nucleoside 1592U89. Antimicrob Agents Chemother. 41:10941098

Yahi N, Tamalet C, Tourres C, (1999) Mutation patterns of the reverse transcriptase and protease genes in human immunodeficiency virus type 1-infected patients undergoing combination therapy: survey of 787 sequences. J Clin Microbiol. 37:4099-4106

Valer L, Martin-Carbonero L, Corral A, Mendoza CD, Soriano V (2004) Predictors of selection of K65R: tenofovir use and lack of TAMs. Antivir Ther. 2004; 9:S46.

Por toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, salvo que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprenden" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende" se entenderán que implican la inclusión de un número entero declarado, etapa, grupo de números enteros o grupo de etapas, pero no la exclusión de cualquier otro número entero, etapa, grupo de números enteros o grupo de etapas.

Claims

1. El uso de 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo o un profármaco del mismo que libera 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo o su 5'-monofosfato in vivo, o una sal del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infección con HIV, en el que la transcriptasa inversa del HIV lleva al menos una mutación que permite a un fosfato de nucleósido o nucleótido terminador de cadena obligado escindirse de la cadena de ADN naciente mediante escisión mediada por ATP o pirofosfato.

2. El uso según la reivindicación 1ª, en el que la transcriptasa inversa lleva al menos uno de los siguientes modelos genotípicos:

(a): M41, \pmD67, L210 y T215;

(b): D67, K70 y K219;

(c): T69S-XX o

(d): \ding{115}67 (supresión en 67).

3. El uso según la reivindicación 2ª, en el que el modelo genotípico M41, \pmD67, L210 y T215 comprende M41L, \pmD67N, L210W y T215Y/F.

4. El uso según la reivindicación 2ª o la reivindicación 3ª, en el que el modelo genotípico comprende además al menos una mutación adicional en posición E44, K70, V118, H208, R211K, L214, K219 o G333.

5. El uso según la reivindicación 2ª o la reivindicación 3ª, en el que el modelo genotípico comprende además al menos una mutación adicional en posición \ding{115}67, T69, E203, L210, D218, H221, D223 o L228.

6. El uso según la reivindicación 2ª, en el que el modelo genético D67, K70 y K219 comprende D67N, K70R y K219Q/E.

7. El uso según la reivindicación 2ª o la reivindicación 6ª, en el que el modelo genético D67, K70 y K219 comprende además al menos una mutación adicional en posición M41, E44, V118, H208, R211K, L214, T215, K219 o G333.

8. El uso según la reivindicación 2ª o la reivindicación 6ª, en el que el modelo genético D67, K70 y K219 comprende además al menos una mutación adicional en posición \ding{115}67, T69, E203, L210, D218, H221, D223 o L228.

9. El uso según la reivindicación 2ª, en el que el modelo genético T69S-XX comprende además al menos una mutación adicional en posición M41, E44, D67, K70, V118, H208, L210, R211K, L214, T215, K219 o G333.

10. El uso según la reivindicación 2ª, en el que el modelo genético T69S-XX comprende además al menos una mutación adicional en posición \ding{115}67, T69, E203, L210, D218, H221, D223 o L228.

11. El uso según la reivindicación 2ª, en el que el modelo genético \ding{115}67 comprende además al menos una mutación adicional en posición M41, E44, D67, K70, V118, H208, L210, R211K, L214, T215, K219 o G333.

12. El uso según la reivindicación 2ª, en el que el modelo genético \ding{115}67 comprende además al menos una mutación adicional en posición T69, T69S+XX, E203, L210, D218, H221, D223 o L228.

13. El uso según una cualquiera de la reivindicación 2ª, la reivindicación 3 o la reivindicación 6ª, en el que la transcriptasa inversa lleva además una mutación discriminativa en posición K65 o L74 o M184 o Q151.

14. El uso según la reivindicación 13ª, en el que la mutación discriminativa es K65R o L74V o M184V o Q151M.

15. El uso según la reivindicación 13ª o la reivindicación 14ª, en el que la mutación discriminativa comprende además al menos una mutación adicional en posición A62, V75, F77, Y115 o F116.

16. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 15ª, en el que el monofosfato de 5'-(2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo) se incorpora a la cadena de ADN naciente por el que un residuo seleccionado entre monofosfatos de nucleótidos naturales, análogos de nucleósidos (incluyendo monofosfato de 5'-(2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo)) y fosfatos de análogos de nucleótidos se une covalentemente al monofosfato de 5'-(2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo) incorporado, induciendo por ello terminación de cadena.

17. El uso según alguna de las reivindicaciones 1ª-16ª, en el que el compuesto en el medicamento es 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo, o una sal del mismo aceptable farmacéuticamente.

18. El uso según alguna de las reivindicaciones 1ª-16ª, en el que el compuesto formulado en el medicamento es un profármaco de fórmula:

20

en la que uno de los R y R' es un resto de profármaco con la estructura parcial

21

en la que R^{1} es H o alquilo C_{1}-C_{18} recto o ramificado;

R^{2} es H o NHR^{3}

R^{3} es H o un éster de L-valilo o L-isoleucilo;

y el otro de los R y R' es H o un resto de profármaco idéntico;

o una sal del mismo aceptable farmacéuticamente.

\vskip1.000000\baselineskip

19. El uso según la reivindicación 18ª, en el que

R^{1} es un alquilo C_{1}-C_{18} de cadena recta o ramificada y R^{2} es H;

R^{1} es metilo y R^{2} es NH-L-valilo o NH-L-isoleucilo;

R^{1} es alquilo C_{3}-C_{4} de cadena ramificada y R^{2} es NH_{2};

o una sal del mismo aceptable farmacéuticamente.

\vskip1.000000\baselineskip

20. El uso según la reivindicación 19ª, en el que uno o ambos de los R y R' son L-valilo-L-lactilo, L-valilo- o alcanoilo C_{1}-C_{6}-.

21. El uso según la reivindicación 20ª, en el que el compuesto indica:

5'-O-[2-S-(L-valiloxi)-propionil]-2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo,

2',3'-didesoxi-3'-C-[2-S-(L-valiloxi)-propionil]-oximetilo;

5'-O-pentanoil-2',3'-didesoxi-3-C-hidroximetilo;

2',3'-dodesoxi-3'-C-pentanoil-oximetilo; o

5'-O-pentanoil-2',3'-didesoxi-3-C-pentanoil-oximetilo;

o uma sal de los mismos aceptable farmacéuticamente.

\vskip1.000000\baselineskip

22. El uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el medicamento comprende además al menos un NRTI terminador de cadena, por lo que la administración simultánea o secuencial de dicho 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo o sal o profármaco del mismo y dicho terminador de cadena se pretende para inhibir la aparición o propagación de mutantes de HIV en un individuo infectado con HIV, en el que dichos mutantes son capaces de separar dicho nucleótido NRTI terminador de cadena incorporado a un complejo de cebador/plantilla de HIV, facilitándose la separación por un mecanismo de escisión dependiente de ATP o dependiente de pirofosafato.

23. El uso según la reivindicación 22ª, en el que el NRTI terminador de cadena se selecciona del grupo constituido por zudovudina (AZT, ZDV), estavudina (d4T), zalcitabina (ddC), didanosina (ddI), abacavir (ABC), lamivudina (3TC), emtricitabina (FTC), adefovir (ADV), entacavir (BMS 200475), alovudina (FLT), fumarato de tenofovir disoproxilo (TNF), amdoxavir (DAPD), D-d4FC (DPC-817), -dOTC (SPD 754), SPD-756, racivir, D-FDOC y GS7340.

24. El uso según la reivindicación 23ª, en el que el NRTI terminador de cadena se selecciona del grupo constituido por zudovudina, estavudina, didanosina, lamivudina, abacavir, tenofovir, emtricitabina y combinaciones de ellos.

25. El uso según la reivindicación 23ª, en el que el NRTI terminador de cadena es zudovudina, lamivudina o las formas de dosificación combinada Combivir o Trizivir; lamivudina, abacavir o la forma de dosificación combinada Epzicom; tenofovir, emtricitabina o la forma de dosificación combinada Truvada.

26. El uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo se administra en el intervalo de 0,05-0,5 mg/kg/día.

27. El uso según la reivindicación 26ª, en el que el 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo se administra en menos de 0,1 mg/kg/día.

28. 2',3'-didesoxi-3'-hidroximetilo o un profármaco del mismo que libera 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo o su 5'-monofosfato in vivo; o una sal del mismo para uso en el tratamiento de infección con HIV, en el que la transcriptasa inversa del HIV lleva al menos una mutación que permite escindirse de la cadena de ADN naciente un fosfato de nucleósido o nucleótido terminador de cadena obligado por escisión mediada por ATP o pirofosfato.

29. 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo o un profármaco del mismo que libera 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilo o su 5'-monofosfato in vivo; o una sal del mismo, según la reivindicación 28ª, junto con al menos un NRTI terminador de cadena como ingredientes activos para uso para administración simultánea o secuencial de dichos ingredientes activos para inhibir la aparición o propagación de mutantes de HIV en un individuo infectado con HIV, en el que dichos mutantes son capaces de separar un nucleótido NRTI terminador de cadena incorporado a un complejo de cebador/plantilla de HIV, facilitándose la separación por un mecanismo de escisión dependiente de ATP o dependiente de pirofosfato.