EA011039B1

EA011039B1 - Приемлемые для лечения вич соединения

Info

Publication number: EA011039B1
Application number: EA200701406A
Authority: EA
Inventors: Сяо-Сюн Чжоу; Хун Чжан
Original assignee: Медивир Аб
Priority date: 2004-12-30
Filing date: 2005-12-28
Publication date: 2008-12-30
Also published as: EP1835916B1; ZA200705835B; CA2594229A1; HK1107518A1; AU2005321239A1; ES2325088T3; ATE427110T1; CN101132795A; EP1835916A1; WO2006070004A1; DE602005013697D1; AU2005321239B2; BRPI0519306A2; US7829548B2; US20080176817A1; CN101132795B; EA200701406A1

Abstract

Представлено применение 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина, или его пролекарства, или соли для производства лекарственного средства для лечения ВИЧ-инфекции, где обратная транскриптаза ВИЧ несет по меньшей мере одну мутацию, обеспечивающую удаление из возникающей цепи ДНК терминирующего облигатную цепь нуклеозид- или нуклеотидфосфата при помощи опосредованного АТФ или пирофосфатом удаления.

Description

Область изобретения

Данное изобретение относится к способам и фармацевтическим композициям для профилактики или лечения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), который имеет по меньшей мере один хорошо изученный класс мутаций в гене обратной транскриптазы (КТ, ОТ), который создает фенотип высвобождения (вырезания) праймера. Данные классы мутаций связаны с отдельными мутациями аналогов тимидина (ТАМ) и названы связанными с высвобождением праймера мутациями. В способах и фармацевтических композициях по изобретению используют нуклеозид 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин или пролекарства, высвобождающие данный нуклеозид ίη νίνο.

Техническая область

В отличие от других средств против ВИЧ, таких как ингибиторы протеазы или ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ΝΚΤΙ) являются фармакологически неактивными в применяемой форме и требуют фосфорилирования клеточными киназами хозяина для получения активного трифосфатного метаболита. Данная трифосфатная форма сходна с встречающимися в природе дезоксинуклеотидтрифосфатными субстратами вирусной обратной транскриптазы и конкурирует за связывание с ВИЧ-1 ОТ и включение в вирусную ДНК.

У всех одобренных для лечения ВИЧ ΝΚΤΙ и подавляющего большинства всех других представленных в патентной или академической литературе ΝΚΤΙ отсутствует З'-гидроксильная группа на рибозной части нуклеозида. Примеры включают в себя зидовудин (ΑΖΤ), ставудин (64Т). ламивудин (ЗТС), зальцитабин (ббС), абакавир (АВС), диданозин (66Ι) и тенофовир (ΤΝΕ) (последний обычно вводят в виде пролекарственной формы дизопроксилфумарата). При фосфорилировании такой нуклеозид или аналог нуклеотида ковалентно связан ферментом обратной транскриптазы с появляющейся цепью ДНК, но отсутствие 3'-гидроксильной группы в нуклеозиде или нуклеотиде предотвращает дальнейшее присоединение дополнительных нуклеотидов.

Следовательно, данные ΝΚΤΙ прекращают удлинение цепи вирусной ДНК, таким образом, приводя к ингибированию репликации ВИЧ (Мйкиуа с1 а1., 1990, 1асоЬ Мойпа с1 а1., 1993, Кеагбоп 1993).

Краеугольным камнем всех существующих антиретровирусных способов лечения (ΑΚΤ) является применение ΝΚΤΙ. Однако ΝΚΤΙ способны только замедлять распространение ВИЧ в кровотоке и на сегодняшний день не способны ликвидировать ВИЧ у пациентов. ВИЧ действует посредством вставки своей ДНК в покоящиеся клетки-хозяева, вовлеченные в иммунологическую память человека. Данный способ инфицирования предполагает, что пациенты вынуждены принимать противовирусные средства против ВИЧ пожизненно, чтобы предотвратить увеличение титра ВИЧ у пришедшего к норме после окончания терапии пациента.

Однако на практике эффективный период введения конкретного лекарственного средства против ВИЧ для данного пациента резко ограничен появлением ускользающих мутантов. Ускользающий мутант представляет собой вирус, содержащий отдельную группу мутаций, придающую резистентность к лекарственному средству и позволяющую ему пролиферировать в присутствии лекарственного средства. Ускользающие мутанты возникают у пациента в результате селективного воздействия принимаемого пациентом конкретного противовирусного(ых) средства(в). Поэтому эффективный период введения зависит от быстроты появления и пролиферации ускользающих мутантов.

Становится все более очевидно, что в странах, где постоянно назначают противовирусные средства против ВИЧ, в новых случаях ВИЧ первичная инфекция часто представляет собой не ВИЧ дикого типа, а скорее ВИЧ с цепью, которая уже частично или в большой степени резистентна к существующим противовирусным средствам. Другими словами, образующиеся у инфицированных пациентов ίη δίΐιι ускользающие мутанты также могут быть перенесены незараженным пациентам путем горизонтальной или вертикальной передачи инфекции. Это, в свою очередь, означает, что даже некоторые пациенты, которых можно было бы иначе классифицировать как не подвергавшихся лечению, уже инфицированы вирусом, резистентным к обычным способам лечения первого ряда.

Отбору ускользающих от лекарственных препаратов мутантов способствует множество факторов, включающих в себя общую величину пула ВИЧ, процессивность ОТ и ошибку в репликации вирусного генома, приспособленность вируса и многократные возможности использования клеток-мишеней. К концу 1990-х данные на основании длительного применения сочетаний на основе зидовудина (ΑΖΤ) или ставудина (оМТ) показали, что группы конкретных мутаций в ОТ были образованы последовательно. Данные группы мутаций представляют собой прототип, в настоящее время известный как мутации аналогов тимидина (ТАМ). Присутствие ТАМ увеличивало вероятность отбора дополнительных мутаций и приводило к развитию более продвинутых резистентных фенотипов ΝΚΤΙ, которые не находились четко в пределах семейства аналогов тимидина. Подобные фенотипы в настоящее время известны как мутация аналога нуклеозида (ΝΑΜ) и множественная лекарственная устойчивость (МОК) ВИЧ.

Гипотеза резистентности ΝΚΤΙ

ΑΖΤ был первым широко применяемым антиретровирусным средством, и не удивительно, что средство вызывало образование ускользающих мутантов (Ьагбег е1 а1., 1989). Однако, принимая во внимание большое количество мутаций по всему геному ВИЧ в изолятах обычного пациента, невозможно создать ίη νίΐτο резистентный фенотип с применением рекомбинантного фермента ОТ с конкретной

- 1 011039

ТАМ. В результате механизмы, посредством которых ТАМ придают резистентность, не были исчерпывающе объяснены.

Различные гипотетические модели и теоретические прогнозы механизма резистентности после ТАМ основывались на вовлечении нуклеофильной атаки донором пирофосфата (Воуег е! а1., 2002 аий Меуег е! а1., 2002). По-видимому, теория переноса ОТ представляет собой ключевой шаг в понимании связанного с ТАМ механизма резистентности. Однако она была недостаточно понятна до конца 2002, так как промежуточные соединения пре- и постпереноса ОТ являются неустойчивыми и коротко живущими, и не могут быть легко получены экспериментальным путем.

Современное понимание теории переноса ОТ предполагает, что катализируемая ОТ полимеризация ДНК проходит подробно описанным каскадным способом, как проиллюстрировано на фиг. 3, заимствованной у §агайаио8 е! а1., (2003).

Эти стадии представляют собой следующее.

1) Связывание субстрата ДНК свободным ферментом Е в положениях З'-праймерного конца на Ручастке (праймерный участок).

2) Связывание άΝΤΡ рядом с Ν-участком (участком для άΝΤΡ) образует открытый тройной комплекс.

3) При помощи конформационных изменений фермента образуется закрытый тройной комплекс.

4) Образование фосфодиэфирной связи между З'-ОН праймерного конца и альфа фосфатом άΝΤΡ сопровождается высвобождением пирофосфата (ΡΡί) с образованием претранслоцируемого комплекса ОТ на Ν-участке.

5) Перенос праймерного конца с Ν-участка к Р-участку с образованием посттранслоцируемого комплекса, необходимого для присоединения следующего άΝΤΡ и продолжения синтеза ДНК.

В случае, если используют терминаторный нуклеозидтрифосфат цепи ДНК (обычно нуклеозидный аналог, у которого отсутствует З'-гидроксильная группа на дезоксирибозной части), он имитирует свой встречающийся в природе аналог άΝΤΡ и связывается с ОТ. После соответствующего химического преобразования включенный ΝΚΤΙ образует претранслоцируемый комплекс на Ν-участке полимеризации. Это прекращает дальнейший синтез ДНК из-за отсутствия З'-гидроксила праймера на дезоксирибозной части ΝΚΤΙ.

В отличие от этого ОТ с мутациями, связанными с ТАМ, использует отличающийся от ОТ дикого типа механизм нуклеотидного включения. А именно, новый механизм приводит к высвобождению (вырезанию) включенного в праймерный конец ΝΚΤΊ, отменяя цепную терминирующую активность ΝΚΤΙ. Данный новый механизм зависит от взаимосвязи между накоплением комплексов с претранслоцируемыми структурами (на Ν-участке) и доступностью АТФ или доноров пирофосфата, которые часто отсутствуют в области инфицирования, т.е. в нормальных лимфоцитах.

В нормальных условиях АТФ или пирофосфат не участвуют в реакциях вирусной ДНКполимеризации, но структура ОТ, экспрессирующая связанный с ТАМ резистентный фенотип, способствует их проникновению к участку, расположенному рядом с только что встроенным ΝΚΤΙ. Равновесие между пре- и посттранслокационными кинетическими типами предоставляет механизм для обеспечения свободного доступа праймерного конца к Ν-участку, а также допускает одновременное связывание пирофосфатного донора АТФ на Р-участке после присоединения терминатора цепи ΝΚΤΙ и высвобождения пирофосфата. Если это происходит, АТФ (или пирофосфат) атакует фосфодиэфирную связь, связывающую присоединенный в конце ДНК ΝΚΤΙ, приводя к удалению ΝΚΤΙ посредством пирофосфоролиза. Если донором пирофосфата является АТФ, ΝΚΤΙ высвобождается в виде динуклеозидтетрафосфатного продукта. На фиг. 4 проиллюстрировано данное высвобождение праймера в ΑΖΤ-терминированной ДНК (заимствовано у СйшсСагеОрИопк™).

В настоящее время предполагают, что в фенотипическую резистентность к ΝΚΤΙ вовлечены два различных механизма (81ш5-Сгетег е! а1., 2000). Первый, известный как активность высвобождения праймера, описан выше. В нем терминирующий цепь нуклеотид удаляют из 3'-конца праймерного конца посредством зависимого от АТФ или зависимого от пирофосфата пирофосфоролиза. Однако существует еще одна группа резистентных фенотипов, обозначенная как избирательные мутанты. Данные мутанты имеют ОТ с усиленной способностью различать ΝΚΤΙ и нативные άΝΤΡ. В данном случае механизм приводит к ОТ, способной к предпочтительному выбору нужного субстрата (т.е. нативного άΝΤΡ), таким образом, избегая терминации цепи ΝΚΤΙ и обеспечивая размножение вирусного генома.

Образование мутаций у ВИЧ

Ретровирусы, такие как ВИЧ, обладают потенциалом для обеспечения быстро растущего генетического многообразия. Несмотря на то, что это энергетически невыгодный процесс, он предоставляет организму очевидные адаптивные преимущества. Используемый ВИЧ способ репликации особенно способствует появлению ошибок, образованию большого количества мутаций и обладает способностью приводить к накоплению мутаций, если организм находится под селективным воздействием.

Как правило, подавляющее большинство образованных при вирусной репликации мутаций приводит к образованию менее жизнеспособных ферментов. При этом накопление второй и особенно третьей мутации менее вероятно, так как популяционный пул для менее жизнеспособного мутанта, в пределах

- 2 011039 которого должна накапливаться вторая мутация, будет растворен быстрее размножающимся организмом дикого типа.

Более жизнеспособные вирусные мутанты могут возникать и распространяться двумя возможными путями. Первый встречается, если существует быстрый рост высокорезистентного варианта, который уже присутствует во всей вирусной популяции. Наиболее часто это отдельная точечная мутация, обеспечивающая фенотипическую резистентность к селективному воздействию. В случае ускользающих от лекарственного средства мутаций примеры включают в себя К103, быстро индуцированную ненуклеозидным ингибитором обратной транскриптазы невирапином. Второй путь встречается, когда существует продолжительная вирусная репликация при наличии селективного воздействия. Это допускает прогрессивное накопление мутаций, способных затем распространяться. В этом случае вероятность накопления мутации связана с объемом происходящей вирусной репликации. Таким образом, при более высоких вирусных нагрузках (например, >200000 копий/мл) могут происходить накопления двойных мутаций. Однако накопление тройных мутаций встречается редко и может возникать только как следствие сложной схемы лечения, обычно предусматривающей несколько различных лекарственных средств, являющихся стимулирующими для поддержания пациента. Таким образом, даже для аккуратного пациента чрезвычайно трудно гарантировать, что все активные ингредиенты присутствуют в крови в концентрациях, выше необходимых ингибиторных концентраций в течение всего 24-часового периода каждых суток (24часовой провал концентрации). При этом временное удаление любого из селективных воздействий при использовании лекарственного средства из-за ошибок во введении/24-часового провала концентрации одного или нескольких лекарственных средств допускает стихийную вирусную репликацию, таким образом, обеспечивая образование и сохранение многих новых мутантов. Когда снова применяют селективное воздействие (т.е. возобновляют сложную схему лечения), некоторые новые мутанты, которые накопили еще одну точечную мутацию, придающую лучшую резистентность к лекарственному препарату, могут распространяться в условиях, аналогичных тем, которые рассматриваются для первого пути (см. выше).

Изложенное выше обсуждение сфокусировано на накоплении точечных мутаций в отличие от, например, делеций или мутаций присоединения. Однако здесь применим сценарий, аналогичный описанному для тройной мутации. Таким образом, большинство мутаций делеции/присоединения исходно затрагивают один нуклеотид. Это имеет эффект полного изменения будущей аминокислотной последовательности кодируемого белка, если изменение происходит в пределах кодирующей области и приводит к урезанному и/или неактивному белку. Для того чтобы сохранить рамку считывания и изменить целевой белок посредством делеций или присоединения одной отдельной аминокислоты, должны быть делетированы/добавлены три нуклеотида. Так как неактивные ферменты снижают жизнеспособность организма ВИЧ, особенно если пораженным ферментом является ОТ, делеции/присоединения не будут накапливаться рег 8е, а должны произойти одновременно. Другими словами, эквивалент тройной мутации должен возникнуть в одном событии, что случается крайне редко (см. Воуег е1 а1. (2004) 1 νίτοί 78(18): 99879997, которая включена сюда в качестве ссылки в полном объеме).

Как следствие данного процесса в отношении накопления/включения тройного мутанта, только относительно недавно выявили вирус ВИЧ, демонстрирующий по меньшей мере три мутации в ОТ, создающие особенно высокую резистентность ко многим лекарственным средствам. Например, в Соединенных Штатах Америки РИА одобрила применение комбинированного лечения лекарственными средствами (ббС и ΑΖΤ) в 1992. Еще до сентября 1995 клинические испытания показали, что сочетание ΑΖΤ с ббС или бб1 было более эффективно, чем один ΑΖΤ. Только в результате применения комбинированных способов лечения, где используют множество лекарственных препаратов, но при режимах дозирования, неспособных эффективно гарантировать адекватный 24-часовой провал концентрации соответствующих лекарственных средств, получили особенно проблематичные штаммы полирезистентного вируса ВИЧ, известные в настоящее время в западном мире.

Высвобождающие праймер мутации

Высвобождающий праймер ТАМ мутант, содержащий различные перестановки в пределах группы из шести резистентных к лекарственным средствам фенотипов в аминокислотных положениях М41Ь, Ό67Ν, К70К, Б210А, Τ215Υ/Ρ и К219О/Е на ОТ, первоначально описан (Ьагбет апб Кетр, 1989, δοϊιίηηζί е1 а1., 2000). Предыдущие данные указывали на два отличающихся мутационных пути развития множества высвобождающих праймер мутантов ТАМ, оба возникают при помощи неизвестных факторов. Первый путь приводил к аминокислотной замене в 210 кодоне (210А) и был предпочтительно связан с мутациями в кодонах 41 (41Ь; более 98%) и 215 (215Υ; более 94%), а также замене в кодоне 67 (67Ν). Второй путь вызывал мутацию в кодоне 219 (219К/Е), предпочтительно связанную с мутациями в кодонах 67 (67Ν) и 70 (70К.) (Υηΐιί е1 а1., 1999). Таким образом, существовало два фенотипических профиля:

(1) Б210А, М41Ь, Τ215Υ/Ρ, +Ό67Ν. которые предоставляют высокие уровни вирусной резистентности к ΑΖΤ и 64Τ, и (2) К219К/Е, Ό67Ν, К70К, которые предоставляют средние уровни вирусной резистентности к ΑΖΤ и 64Τ.

Матеейп е1 а1. (2004) суммировали распространение связанных с ТАМ высвобождающих праймер

- 3 011039 мутаций у пациентов с вирусологическими нарушениями. При этом было исследовано 1098 последовательностей ОТ и показано два генотипических профиля, как указано на фиг. 1 и 2. Несмотря на то, что до терапии могли присутствовать различные генетические профили, последовательность и композиция антиретровирусной терапии, применяемая в виде комбинированной терапии с индивидуальными различиями в фармакологии, приводили к вирусной резистентности не только к ΑΖΤ и 64Τ, а также к другим ΝΚ.ΤΊ. В зависимости от присутствия мутационного профиля, резистентность к лекарственным средствам включала в себя резистентность к абакавиру (АВС), диданозину (66Ι), тенофовиру (ΤΝΡ), ламивудину (3ТС), эмтрицитабину (РТС) и зальцитабину (66С). Следовательно, возникновение связанного с ТАМ высвобождения праймера часто играет важную роль в дальнейшем развитии генотипических профилей ВИЧ с более выраженной резистентностью. Таким образом, один шаг в предотвращении множественной нуклеозидной резистентности относится к разработке нового ΝΚΤΙ, с тем чтобы избежать накопления связанного с ТАМ высвобождения праймера.

Связанные с высвобождением праймера ТАМ мутации могут появляться одновременно с другими семействами ускользающих мутантов, обычно возникающими при комбинированной антиретровирусной терапии (также известной как сочетанная терапия). В настоящее время смесь комбивир (ΑΖΤ+ЗТС) представляет собой наиболее часто применяемую и рекомендованную схему терапии первого ряда для лечения наивных не подвергавшихся лечению пациентов с ВИЧ. Однако оно приводит к образованию ускользающих мутантов, резистентных к обоим лекарственным средствам. Например, МШег е! а1. (1998) сообщали о выделении ЗТС-резистентного вируса с мутацией М184У всего лишь через 4-12 недель после начала комбинированной терапии ΑΖΤ+ЗТС. С течением времени постепенно появлялись дополнительные связанные с ΑΖΤ мутации, образуя характерный генотипический профиль из М184У, М41Ь, Ό67Ν, К70Н, Ь210^, Τ215Υ/Ρ и К219О/Е, обычно обнаруживаемый в настоящее время у подвергавшихся лечению пациентов. Сообщали, что дополнительные мутации в ОТ в положениях Н208, Κ211 и Ь214 (8!игтег е! а1., 2003) и в положении 0333 (Кетр е! а1. 1998) вовлечены в двойную резистентность ΑΖΤ-ЗТС и особенно увеличивают способность к резистентности относительно ΑΖΤ. Таким образом, был расширен генотипический фон связанных с высвобождением праймера ТАМ для включения перестановок в М184У, М41Ь, Ό67Ν, К70Н, Η208Υ, Е210\\\ К211К, Ь214Р, Τ215Υ/Ρ, К219Р/Е и О333Е.

Другие типы мутаций, обычно наблюдаемые у подвергавшихся лечению пациентов, представляют собой У1181 и Ε44Ό/Α. Эти мутации прочно связаны с предшествующим воздействием 661 и 64Τ. Кроме того, они часто связаны с присутствием определенных групп ТАМ, включающих в себя М41Ь плюс Τ215Υ/Ρ или Ό67Ν плюс Ь210^. Результатом является повышенная резистентность к семейству аналогов тимидина из-за связанного с ТАМ высвобождения праймера, а также особая роль в двойной резистентности к ΑΖΤ+3ΤС (МоШек е! а1., 2002, Ойоиагб е! а1., 2003).

Распространенность ускользающих от лекарственных средств мутантов увеличивается в виде функции ряда ΝΚΤΊ, применяемых во время терапии, и формирует профиль характерных ТАМ или NΑМ, включающих в себя различные перестановки в М41Ь, Ε44ό/α, Ό67Ν, К70Н, У1181, М184У, Η208Υ, Ь210^, К.211К, Ь214Р, Τ215Υ/Ρ, К219р/Е и О333Е. Эта группа, как правило, также резистентна к ΑΖΤ- и 64ГОсодержащей комбинированной терапии и перекрестно резистентна ко всему классу ΝΚΤΊ.

Значимая резистентность к аналогам тимидина, а именно ΑΖΤ, 64Τ и ΤΝΡ, также обнаружена у ускользающих мутантов с делецией аминокислоты в положении 67 <^67) _в пальцеобразной области ОТ часто совместно с аминокислотной заменой в Τ69Ο с сопутствующей ТАМ (см. 1таш1сЫ е! а1., 2000 и 2001). Предполагают, что повышенная активность полимеризации ОТ, связанная с данным конкретным генотипом, приводит к более эффективному, зависимому от пирофосфоролиза удалению праймера (описанному выше), приводя к повышенной резистентности. Воуег с1 а1. (2004) также обнаружили, что *67 с сопутствующей ТАМ придавали повышенную способность обеспечивать зависимую от высвобождения (удаления) праймера резистентность вируса к ΑΖΤ и ΤΝΡ по сравнению только с ТАМ.

ВИЧ эволюционирует с развитием антиретровирусной терапии. Новые мутационные фенотипы появились, когда в клинической терапии ВИЧ применяли двойные и тройные коктейли из нуклеозидных аналогов, особенно для лечения не подвергавшихся терапии пациентов. Сложные схемы лечения, требующие множества лекарственных средств, принимаемых в различное время в течение суток, некоторые с пищей, а некоторые без, являются для пациентов стимулирующими. Отказ точно подчиняться данным режимам дозирования, приводящий к перерывам с 24-часовым провалом, способствовал появлению множества резистентных к ΝΚΤΙ вирусов ВИЧ, преимущественно как результат приобретенных вирусом NΑМ или МОН. Например, ряд групп (например, Мак е! а1., 2000) наблюдали появление вирусного мутанта Τ698-ΧΧ, связанного с применением ΑΖΤ. Данный мутант имеет вставку из 6 п.о. в кодирующую область его ОТ между нуклеиновыми кислотами, соответствующими 69 и 70 аминокислотам. Полученные двойные аминокислотные инсерционные комплексы (обычно инсерции 88, 80 или АО) не только приводят к вирусной резистентности к ΑΖΤ, но также почти ко всему набору ΝΚΤΙ, включающему в себя 64Т, 3ТС, 66Ι, 66С и АВС, и ΤΝΡ. Наблюдали повышенное высвобождение праймера, зависимое от пирофосфоролиза, с Т698+двойная аминокислотная вставка, особенно в присутствии ТАМ. Данный феномен, как правило, связан с ^4^^215^¹ или М41Е/Е210\У/К211Ε/Ε214Ε/Τ215Υ резистентными фе

- 4 011039 нотипами и играет важную фенотипическую роль в множественной нуклеозидной резистентности (Меуег е! а1., 2003).

Еще один класс МОК. имеет в кодоне аминокислотную замену О151М. Эта мутация наблюдается в клинике с относительно низкой частотой и часто представлена вместе со вторичными мутациями А62У, У751, Р77Ь и Ρ116Υ. Однако она придает значительную резистентность почти ко всему классу ΝΚΤΙ. Кроме того, были обнаружены связанные с ТАМ генотипы, обычно М41Ь, Ь210А и Τ215Υ/Ρ или Ό67Ν, К70К и К219К/Е. Она появляется у пациентов, подвергавшихся интенсивной терапии комбинированными схемами лечения ΑΖΤ/66Ι и ΑΖΤ/ббС.

Ь74У наиболее часто определяется при монотерапии 66Ι (Майш е! а1., 1993) и проявляет перекрестную резистентность к АВС и 3ТС. Ее действие на получение ускользающих от терапии вирусов зависит от присутствия других мутаций. В обзорах по резистентности предполагают, что частота Ь74У в значительной степени связана с ТАМ, обычно в области М41Ь, Б210А и Τ215Υ/Ρ (МагсеНи е! а1., 2004), хотя предполагали, что мутация Ь74У вызывает уменьшение вирусной репликации и обратно повышает чувствительность ΑΖΤ-резистентных вирусов, содержащих ряд ТАМ (81. С1а1г е! а1., 1991). Сочетание мутаций Ь74У и М184У в ОТ ВИЧ-1 представляет собой наиболее частый профиль, связанный с резистентностью к АВС и 66Ι (Натдаи е! а1., 2000 аиб МШег е! а1., 2000).

Хотя высокий уровень резистентности к АВС обычно требует нескольких мутаций, включающих в себя К65К, Ь74У, Υ115Ρ и М184У, отдельная мутация М184У часто возникает первой. Эта мутация, в настоящее время признанная как ключевая мутация в специфическом механизме ускользающей от лекарственных средств резистентности, дает умеренное снижение чувствительности к АВС (Г|8ба1е е! а1., 1997). Исследование СNΑ3005, в котором 562 пациента случайным образом получали ΑΖΤ и 3ТС либо с АВС или 66Ι, продемонстрировали низкое, но устойчивое увеличение части пациентов, несущих ТАМ в ΑΖΤ и 3ТС плюс АВС плече. К 48 неделе до 56% пациентов имели по меньшей мере одну ТАМ, связанную с высвобождением праймера (^ЧАМ), кроме быстро индуцируемой М184У мутации (Ме1Ьу е! а1., 2001), иллюстрируя важность предотвращения появления резистентности, связанной с высвобождением праймера. Аналогичным образом, перенос ίη νί!το ΑΖΤ-резистентного вируса, несущего генотипический профиль 67, 70, 215 и 219, при селективном воздействии 3ТС приводил к появлению мутации М184У и обеспечивал перекрестную резистентность к АВС (Икбак е! а1., 1997). Это еще раз подчеркивает концепцию, что лечение существующей ранее ТАМ, связанной с высвобождением праймера, и предотвращение накопления связанных с высвобождением праймера мутантов является основным шагом в предупреждении развития множественной нуклеозидной резистентности.

Становится все более очевидно, что мутация К65К быстро обнаруживается у очень большой части пациентов, получавших ΤΝΡ или АВС. Уа1ег е! а1. (2004) сообщали, что в клинике Мадрида уровень распространения К65К возрастал от <1% между 1997-2000 до 7% в 2003 и 12% в первые 4 месяца 2004. Действие мутанта К65К усиливалось в присутствии других мутаций, связанных со сниженной чувствительностью к АВС, 3ΤΟ, 66Ι и ббС (Рапкй е! а1., 2003). Кроме того, одновременное появление К65К связанных с высвобождением праймера генотипов ТАМ, несмотря на редкое появление, приводит к более сильному действию на высвобождение (вырезание) праймера ΤΝΡ по сравнению с ΑΖΤ (№1едег е! а1., 2001). Сообщалось, что ΤΝΡ активен против ВИЧ-1, имеющего до 3х ТАМ, если группа ТАМ не включала в себя мутацию М41Ь или Ь210А. В настоящее время неясно, почему ТАМ могут отменять некоторые из эффектов К65К в отношении чувствительности к ΤΝΡ и АВС, которые, как иначе думали, препятствуют вырезающим праймер мутантам.

Наконец, мутацию Τ69Ό исходно идентифицировали по ее роли в появлении резистентности к ббС. Также сообщали, что она связана со сниженным ответом к 66Ι, если она возникает в сочетании с мутацией Τ215Υ и другими генотипами ТАМ, связанных с высвобождением праймера.

В течение многих лет АНО и ЭНН8 (И8 Эераг1теи1 οί Неа1!й аиб Нитаи Неа1!й 8ег\зсе) рекомендовали для лечения не подвергавшихся лечению пациентов антиретровирусную терапию первого ряда, состоящую из введения 64Τ или ΑΖΤ в сочетании с 3ТС плюс невирапин или эфавиренц (Ошбейиек Гог 111е Ике οί ΑηΙίνίΓπ1 Ке1го\зга1 Адеи!к ίη ШУ-Ыикскб Аби1!к аиб Або1ексеи!8, 1и1у 14 2003 аиб Магсй 23 2004). Однако значительное количество ВИЧ-инфицированных пациентов имеют проверенный на практике неудачный результат, несмотря на исходные высокоактивные схемы антиретровирусной терапии (ΉΑΑΚΤ), показывая, что данные пациенты уже инфицированы ускользающими от лекарственных средств вирусами. Резистентные мутанты ТАМ, связанные с высвобождением праймера, продолжают играть ведущую роль в развитии резистентности к лекарственным средствам. Таким образом, разработка лекарственных средств или способов лечения, препятствующих действию резистентных мутантов ТАМ, связанных с высвобождением праймера, могли бы усиливать действие или продлевать применение существующих ΝΚΤΙ для лечения не подвергавшихся лечению пациентов, а также могли бы применяться в терапии по жизненным показаниям для лечения инфицированной ВИЧ популяции, несущей связанный с высвобождением праймера резистентный мутант.

- 5 011039

Стратегия лекарственных средств для предупреждения/ингибирования мутантов с высвобождением праймера

Высвобождение праймера и характерные мутации часто возникают вместе в том же мутантном генотипе, главным образом, из-за текущей терапевтической стратегии. Мутация М184У является характерной мутацией семейства характерных мутантов. Однако если она возникает в сочетании со связанными с высвобождением праймера мутациями, такими как М41Ь, Ό67Ν, К70К, Ь210^, Τ215Υ/Ε и К219О/Е. она играет роль в двойной резистентности к ΑΖΤ и 3ТС (МШег с1 а1., 1998).

Считается, что данные фенотипы с высвобождением праймера и характерной резистентностью связаны с различными группами мутаций в ОТ. Например, связанные с ΑΖΤ мутации, включающие в себя различные перестановки в М41Ь, Ε44Ό/Α, Ό67Ν, К70К, У1181, М184У, Η208Υ, Е210\\\ К211К, Ь214Е, Τ215Υ/Ε, Κ2Ι9Ο/Ε и ОЗЗЗЕ, МОК мутация Т698 со вставками из 6 и.о. и ' как правило, демонстрируют активность высвобождающего праймер мутанта. С другой стороны, мутации в положениях 65, 74, 89, 151, и 184 приводят к способности отличать ΝΚΤΙ и соответствующие эквиваленты 6ΝΤΡ или они могут вовлекаться в перемещение комплекса праймера и матрицы.

В недавней статье Оехщпшд аиб-АГОЗ бгидз 1агдейид 111е та)ог теейашзт οί Н1У-1 КГ ге8181аиее 1о иие1ео81бе аиа1од бгидз (НБСВ 36 (2004) 1706-1715, которая включена сюда в полном объеме в качестве ссылки), §агайаио8 с соавторами заключают, что механизм высвобождения (вырезания) праймера может осуществляться только до переноса ОТ в Ν-участок, и, кроме того, заключают, что он становится доминантным механизмом резистентности к ΝΚΤΙ. В разделе, названном 81га1еще8 Гог ίηΗίΟίΙίοη οί 111е Εχοίδΐοη Кеаебоп (см. с. 1711), они предлагают три подхода для предотвращения такого механизма резистентности.

1. Применение противовирусных средств, препятствующих эффективному связыванию АТФ (в Ручастке), возможно посредством связывания в или рядом с АТФ-связывающим сайтом, тем самым, блокируя реакцию высвобождения без воздействия на дальнейшую реакцию синтеза ДНК.

2. Применение соединений, способных блокировать синтез ДНК, но так или иначе резистентных к удалению, таких как боран- или тиозамещенных альфа фосфатных вариантов существующих ΝΚΤΙ. Аналогичным образом можно конструировать варианты существующих ΝΚΤΙ для возвращения на место увеличенной/терминированной матрицы/праймера способом без удаления, как показано при помощи низкой способности к вырезанию индуцированных 3ТС мутантов М1841/У.

3. Применение ингибиторов на основе динуклеотидтетрафосфатов для обеспечения двойного связывания в Ν- и Р-участках.

Каждый из этих трех предложенных подходов для предупреждения механизмов резистентности к ΝΚΤΙ с высвобождением праймера подвергают критике за различные теоретические недостатки. Например, в первом подходе связывания АТФ не требуется для нормальных функций ОТ. Таким образом, профилактические средства, основанные на ингибировании АТФ или связывании пирофосфата посредством конкурентного связывания или блокирования, не будут предотвращать развитие резистентности, так как форма подразумеваемого вируса не будет подвергаться опасности при помощи подобных средств. Другими словами, резистентные мутанты возникнут без эволюционных издержек. Избыточное количество АТФ, присутствующее в нормальных лимфоцитах, также ставит под сомнение разумное объяснение это го подхода.

Во втором предложенном подходе кажется вероятным, что боран- или тиозамещенные альфа фосфатные аналоги различали бы характерные резистентные мутанты, как было показано с 3ТС и ЕТС, и продуцировали резистентные мутанты ВИЧ.

Третий предложенный подход ограничен потребностью в понимании фармакокинетики в клеткемишени больших и сильно заряженных динуклеотидтетрафосфатных частиц. Это станет серьезной фармацевтической проблемой и проблемой доставки лекарственного средства.

Примечательно, что каждый из подходов §егаГашаио, включая 1 подход, который по своей сущности не является противовирусным, но предполагает совместное введение обычного ΝΚΤΙ, основан на вариантах существующего поколения ΝΚΤΙ. Таким образом, соединения, у которых отсутствует 3'гидроксильная группа и поэтому действующих, как требуют терминаторы цепи.

В противоположность обсуждавшимся выше классическим ΝΚΤΙ (т.е. соединениям, не имеющим 3'-гидроксильной группы), Ойгш е1 а1. (ί Меб Сйет (2000) 43, 4516-4525, которая включена сюда в полном объеме в качестве ссылки) описывают 4'-С-этинильные ингибиторы ВИЧ

НО—ΐ Основание

Л он

Формула I

Данные соединения сохраняют 3'-гидроксильную группу, но все-таки проявляют активность против ВИЧ-1, включая обычный характерный МОК штамм, несущий мутации А62У, У75Ь, Е77Ь, Ε116Υ и О151М. Предполагали, что механизм действия осуществляется посредством аффинности к нуклеозидной фосфорилирующей киназе. Однако также наблюдали, что данные соединения могут функционировать

- 6 011039 как терминаторы цепи ДНК, благодаря их свойству неопентилового спирта и серьезного стерического несоответствия соседнего цис-4'-заместителя, которые приводили к сильно сниженной реактивности 3'гидроксила.

Кобата е! а1. (АпИтюгоЬ Адепй СйетоШег (2001) 1539-1546, которая включена сюда в полном объеме в качестве ссылки) описывают очень похожую серию соединений, несущих 4'-С-этинильную группу рядом с сохраненной 3'-гидроксильной группой, которые были исследованы в клеточной культуре с дополнительными резистентными штаммами ВИЧ. Так как Кобата е! а1. не получали трифосфатов их соединений, они не могли объяснить механизм действия, но из различных косвенных наблюдений сделали вывод, что соединения в самом деле действуют как ΝΚΤΙ. Позднее Кобата е! а1. сообщали (аЬЧгас) 388Τ, 2003 9^4Ь СонГегепсе оп Ве1гоу1ги5С5 и ОррогШпЕОс 1нГес1юп8, который включен сюда в полном объеме в качестве ссылки), что при селективном воздействии их 4-С-этинилнуклеозида ш сйго обнаружен важный резистентный ВИЧ, несущий локализованные в каталитической области ОТ мутации Τ165Ι и М184У. Этот мутантный фенотип, очевидно, является характерным типом мутации и обладает высокой перекрестной резистентностью к 3ТС. Таким образом, связывали стерическое несоответствие, блокирующее включение 4-С-этинилнуклеозида. Это было определено 3ТС ингибиторным механизмом и поэтому почти наверняка он является характерным механизмом резистентности. В связи с этим кажется маловероятным, что соединения Кобата обеспечат доставку к целевым мутантам, облегчающим высвобождение праймера (опосредованное АТФ или пирофосфатом удаление).

Сйеп е! а1. (Вюсйетщйу (1993) 32: 6000-6002, которая включена сюда в полном объеме в качестве ссылки) проводили обширные исследования механизма на структурно родственных сериях соединений, несущих на 4' азидогруппу

^он Формула II

Сйеп показывает, что ОТ эффективно включает два следующих подряд 4'азидотимидинмонофосфатных нуклеотида, которые прекращают элонгацию цепи. Кроме того, ОТ также способна к включению первого 4'-азидотимидинмонофосфата, затем нативного 6ΝΤΡ, а после этого второго 4'-азидотимидинового нуклеотида, который также приводил к обрыву цепи. Отмечают, что оба этих механизма приводили к тому, что 4'-азидотимидинмонофосфат располагался на терминированном праймерном конце ДНК, представляя собой ингибиторный механизм, очень напоминающий существующие ΝΚΤΙ. Также было очевидно, что каждая из клеточных (т.е. невирусных) полимераз α и β способна включать в появляющуюся цепь ДНК хозяина один, но не два 4'-азидонуклеотида. Затем эти клеточные полимеразы обеспечивали элонгацию цепи ДНК хозяина с дополнительными нативными 6ΝΤΡ и, таким образом, в гены ДНК хозяина навсегда вставляли нуклеотид ΝΚΤΙ. Данные соединения не были исследованы на людях, так как неправильное включение ненативных нуклеотидов при помощи клеточных ферментов имеет очевидные канцерогенезные последствия. Аналогично, фармацевтическая разработка Кобата, соответствующая 4'-С-этинильным соединениям, была остановлена, предположительно из-за высокой токсичности у высших организмов. В ЕР 341911 описывается большое семейство 3'-Сгидроксиметилнуклеозидов формулы

но^ ^к ф₀рму_Ла ||| и предлагается их применение преимущественно против герпесвирусов, таких как СМУ, а также против ретровирусов. В АО 92/06201 также раскрывается аналогичное семейство соединений и показаний.

В И8 5612319 (который включен сюда в полном объеме в качестве ссылки) показана ретровирусная активность 2'-3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина против ВИЧ-1_ШВ дикого типа и обезьяньего эквивалента 81У-1 на модели острой ВИЧ-инфекции яванских макак. В данной публикации предлагается применение соединения в качестве дополнительного средства профилактики, особенно против повреждений, вызванных уколом иглы. Дополнительная профилактика предполагает, что людям срочно вводят активный ингредиент, как, например, медицинскому персоналу, кто нечаянно уколол себя иглой от шприца, потенциально инфицированного ВИЧ. Для обеспечения быстрого введения соединения по понятным причинам потрясенному медицинскому работнику, оснащенные пружиной шприцы для самостоятельного применения, такие как применяемые для антидотов при химической и биологической войне, представляют собой предпочтительный путь введения.

Цель дополнительной профилактики состоит в том, чтобы препятствовать инфекции укореняться вместо того, чтобы лечить продолжающуюся инфекцию. По существу, предполагают, что лечение следует применять в течение короткого периода времени, как, например, 24-48 ч, используя чрезвычайно высокие дозы соединения. В данной публикации указано, что из-за дискретного интервала времени введения кратковременная токсичность приемлема, так как данным соединением пытаются предотвратить

- 7 011039 неизлечимое заболевание. Описанный в И8 5612319 способ дополнительной профилактики никогда не исследовали на людях по сведениям авторов 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин вообще никогда не вводили людям.

В 1994 г., когда была подана представленная как И8 5612319 заявка, полирезистентный ВИЧ, как это известно в настоящее время, не возникал в какой-либо убедительной форме. Существующий в настоящее время полирезистентный ВИЧ имеет высвобождающие праймер мутации, индуцированные и накапливавшиеся в течение многих лет селективного воздействия терапии ΝΚΤΙ. Другими словами, существующие во время предоставления этих патентов ВИЧ и особенно ОТ структурно и по механизмам действия сильно отличались от существующих в настоящее время вирусов.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу лечения пациента с ВИЧ, где ОТ ВИЧ несет по меньшей мере одну высвобождающую праймер мутацию, которая позволяет вырезать из возникающей цепи ДНК обрывающий существующую цепь нуклеозид- или нуклеотидфосфат при помощи опосредованного АТФ или пирофосфатом удаления. Способ включает в себя введение пациенту эффективного количества 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина или его соли.

Еще один вариант осуществления изобретения относится к способу ингибирования появления или распространения высвобождающих праймер мутаций ВИЧ, способных удалять обрывающий цепь нуклеотид ΝΚΤΙ, включенный в комплекс праймер/матрица ВИЧ, где удаление осуществляется АТФзависимым или зависимым от пирофосфата механизмом вырезания. Способ включает в себя одновременное или последовательное введение инфицированному ВИЧ индивидууму эффективного количества 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина и по меньшей мере одного терминатора цепи ΝΚΤΙ, который индуцирует высвобождающие праймер мутанты.

Согласно настоящему изобретению также предусматривается применение 2',3'-дидезокси-3'-Сгидроксиметилцитозина или его соли для производства лекарственного средства для лечения ВИЧинфекции, где обратная транскриптаза ВИЧ несет по меньшей мере одну мутацию, которая позволяет вырезать из возникающей цепи ДНК обрывающий существующую цепь нуклеозид- или нуклеотидфосфат при помощи опосредованного АТФ или пирофосфатом удаления.

Также предоставляется 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин или его соль для применения при лечении ВИЧ-инфекции, где обратная транскриптаза ВИЧ несет по меньшей мере одну мутацию, которая позволяет вырезать из возникающей цепи ДНК обрывающий существующую цепь нуклеозидили нуклеотидфосфат при помощи опосредованного АТФ или пирофосфатом удаления.

Кроме того, предусматривается применение 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина или его соли вместе по меньшей мере с одним терминатором цепи ΝΚΤΙ в качестве активных ингредиентов для производства лекарственного средства для одновременного или последовательного введения указанных активных ингредиентов для ингибирования возникновения или распространения мутантов ВИЧ у инфицированного ВИЧ индивидуума, где указанные мутанты способны удалять обрывающий цепь нуклеотид ΝΚΤΙ, включенный в комплекс праймер/матрица ВИЧ, причем удаление обеспечивается АТФ-зависимым или зависимым от пирофосфата механизмом удаления.

Также предоставляется 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин или его соль вместе по меньшей мере с одним терминатором цепи ΝΚΤΙ в качестве активных ингредиентов для применения для одновременного или последовательного введения указанных активных ингредиентов для ингибирования возникновения или распространения мутантов ВИЧ у инфицированного ВИЧ индивидуума, где указанные мутанты способны удалять обрывающий цепь нуклеотид ΝΚΤΙ, включенный в комплекс праймер/матрица ВИЧ, причем удаление обеспечивается АТФ-зависимым или зависимым от пирофосфата механизмом удаления.

Если желательно, в применениях и способах по изобретению 2',3'-дидезокси-3'-Сгидроксиметилцитозин можно использовать в форме его пролекарства, высвобождающего ίη νίνο 2',3'дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин или его 5'-монофосфат.

Не желая ограничиваться этим предложенным механизмом, авторы предполагают, что 2',3'дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин фосфорилируется в соответствующий 5'-трифосфат клеточными ферментами. Сильно мутировавшая ОТ полирезистентного ВИЧ, в частности, связанный с высвобождением праймера мутант ОТ, включает в возникающую цепь ДНК данный трифосфат в виде 5'-(2',3'дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин)монофосфата.

Обычные ΝΚΤΙ действуют как терминаторы существующей цепи, обрывая синтез ДНК в Ν-участке, и, таким образом, подтверждая описанный выше опосредованный АТФ или пирофосфатом механизм высвобождения (вырезания) праймера, присущий только полирезистентному ВИЧ. Напротив, представленные здесь данные предполагают, что 5'-(2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин)монофосфат не действует как терминатор существующей цепи, но скорее позволяет дополнительному остатку ковалентно связываться с 3'-гидроксиметильной группой 5'-(2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин)монофосфата. Затем он способствует ОТ претерпевать необходимое трансформационное изменение для ее переноса в Р-участок для следующего цикла полимеризации. Предварительный результат, основанный на представленной ниже последовательности матрицы, предполагает, что данный прикрепленный конце

- 8 011039 вой остаток представляет собой нативный нуклеотид вместо дополнительного 5'-(2',3'-дидезокси-3'-Сгидроксиметилцитозин)монофосфата.

Важно, что результат, полученный с применением способов по данному изобретению и представленный ниже, предполагает, что последний включенный нуклеотид не-2',3'-дидезокси-3'-Сгидроксиметилцитозин не доступен для дальнейшего присоединения нуклеотидов мутировавшей обратной транскриптазой. Таким образом, обрыв цепи обнаруживает возникновение одного основания после ΝΚΤΙ по изобретению, а не в ΝΚΤΙ. Кроме того, после применения соединения по изобретению оказывается, что ОТ успешно перемещается в Р-участок, чтобы связать следующий поступающий нуклеотид. Этот результат предполагает, что соединение по изобретению в сочетании с мутировавшей ОТ, связанной с высвобождением праймера, обеспечивает вид обрыва цепи, который не доступен индуцированному АТФ- или пирофосфатом высвобождению. В результате, заявленный способ обеспечивает эффективное лечение инфекций ВИЧ, не отвечающих на существующие схемы лечения.

Таким образом, обсуждавшийся выше ингибиторный механизм существенно отличается от механизма обрыва цепи 4'-замещенных нуклеозидов Сйсп с1 а1. (см. выше), который предусматривает включение нескольких нуклеотидов после включения 4-замещенного соединения. Во-первых, механизм Сйсп резко увеличивает риск прочитывания. Таким образом, ДНК-полимераза продолжает наращивать кодирующую цепь и продолжает добавлять закодированные остатки для нормального стоп-кодона, тем самым, неправильно вставляя неправильный нуклеозид в цепь ДНК. Однако противовирусная эффективность может быть потеряна, если цепь вирусной ДНК сконструирована при помощи вирусной полимеразы (т.е. ОТ), так как прочитываемая конструкция все еще может являться жизнеспособной, несмотря на неправильно включенный 4'-замещенный нуклеозид. Более того, как описывает Сйсп. если 4'замещенный нуклеозид прочитывается клеточной полимеразой (т.е. полимеразой хозяина), то полученная конструкция в дальнейшем будет представлять собой тератоген и резко повышать риск клеточного повреждения и злокачественного новообразования.

Кроме того, соединения Сйсп требуют присоединения второго 4'-замещенного нуклеотида, либо непосредственно рядом с первым, неправильно вставленным 4'-замещенным нуклеотидом (т.е. Х-Х), либо отделенного одним нативным нуклеотидом (т.е. Χ-Ν-Χ). Фактически это означает, что нуклеотид в последнем положении праймерного конца является ненативным (т. е. лекарственным) нуклеотидом. Это является аналогичной ситуацией случаю терминации цепи классических ΝΚΤΙ (т.е. ΝΚΤΙ, не имеющих 3гидроксильную группу). Таким образом, нуклеотид ΝΚΤΙ также находится в последнем положении праймерного конца, где, как обсуждалось выше, он доступен для опосредованного АТФ или пирофосфатом удаления.

Для действия 4'-замещенного нуклеотида Сйсп в качестве эффективного ингибитора ОТ необходимы множественные повторы. Следовательно, эффективность лекарственного средства зависит от последовательности считывающей цепи. Например, если соединение Сйсп представляет собой аналог тимидина, оно будет обладать наилучшей аффинностью, если считывающая цепь имеет последовательность АА или Α-Ν-Α. Таким образом, лекарственное средство было бы целесообразным и эффективным в терминации синтеза ДНК. Однако если последовательность считывающей цепи не содержит многочисленных повторов последовательности АА или Α-Ν-А, то лекарственное средство Сйсп будет в меньшей степени способным терминировать синтез ДНК при данной концентрации. Поскольку дуплет АА или триплет ΑΝ-Α встречается в геноме намного реже, чем синглет А, лекарственное средство Сйсп будет намного менее эффективным, чем другие ΝΚΤΙ, которые не имеют необходимых множественных повторов.

Подвергаемый лечению или профилактике по изобретению полирезистентный ВИЧ обычно имеет ОТ, несущую генетический профиль, включающий в себя по меньшей мере одно из:

(a) М41, +067, Ь210 и Т215;

(b) ϋ67, К70 и К219;

(c) Т693-ХХ или (ά) А67, где XX представляет собой вставку в последовательность ОТ двух любых природных аминокислот, а -^67 представляет собой аминокислотную делецию в кодоне 67.

Предполагают, что хотя указанные выше 4 генетических профиля представляют собой необходимую основу удаления ускользающего от лекарственного средства фенотипа, очевидно, что мутанты, подверженные лечению или профилактике при помощи способа по изобретению, как правило, содержат дополнительные мутации в гене ОТ и где-либо еще, часто по меньшей мере три мутации в гене ОТ.

Как правило, но не всегда, группа М41, ±067, Ь210 и Т215 часто включает в себя М41Ь, ±Ο67Ν, Ι.210Α' и Τ215Υ или Τ215Ρ.

Необязательно, перечисленные выше группы могут дополнительно включать в себя по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении Е44, К70, У118, Н208, Κ211Κ, Ь214, К219 или 0333.

Перечисленные выше группы могут дополнительно включать в себя по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении , Т69, Е203, Ь210, 0218, Н221, 0223 или Ь228.

Как правило, но не всегда, группа 067, К70 и К219 включает в себя Ό67Ν, Κ70Κ и К219О или

- 9 011039

К219Е.

Необязательно, группа Ό67, К70 и К219 может дополнительно включать в себя по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении М41, Е44, У118, Н208, Ь210, К211К, Ь214, Т215 или 6333.

Кроме того, группа Ό67, К70 и К219 необязательно дополнительно включает в себя по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении , Т69, Е203, Ь210, Ό218, Н221, Ό223 или Ь228.

Как правило, но не всегда группа Т698-ХХ может дополнительно содержать по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении М41, Е44, Ό67, К70, У118, Н208, Ь210, К211К, Ь214, Т215, К219 или 6333.

Необязательно, группа Т698-ХХ может дополнительно содержать по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении > Т69, Е203, Ь210, Ό218, Н221, Ό223 или Ь228.

Как правило, но не всегда, группа может дополнительно содержать по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении М41, Е44, Ό67, К70, У118, Н208, Ь210, К211К, Ь214, Т215, К219 или 6333.

Необязательно, группа может дополнительно содержать по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении Т69, Т698+ХХ, Е203, Ь210, Ό218, Н221, Ό223 или Ь228.

Необязательно, обратная транскриптаза может дополнительно содержать по меньшей мере одну характерную мутацию в положении К65, Ь74, М184 или 6151. особенно К65К, Ь74У, или М184У, или 6151М.

Обычно группа характерных мутаций может быть связана по меньшей мере с одной дополнительной мутацией в положении А62, У75, Е77, Υ115 или Е116.

Подвергающиеся лечению по изобретению штаммы ВИЧ являются полирезистентными штаммами ВИЧ, ОТ которых имеет мутации, способствующие АТФ- или пирофосфат-опосредованному высвобождению праймера (удалению) из цепи, терминированной нуклеотидами ΝΚΤΙ, и возникшие у пациента в результате предшествующего лечения ВИЧ при помощи по меньшей мере одного противовирусного средства, выбранного из зидовудина (ΑΖΤ, ΖΌν), ставудина (64Т), зальцитабина (ббС), диданозина (66Ι), абакавира, (АВС), ламивудина (3ТС), эмтрицитабина (ЕТС), адефовира (ΑΌν), энтакавира (ВМ8 200475), аловудина (ЕЬТ), дизопроксилфумарата тенофовира (ТОТ), амдоксавира (ΌΑΡΌ), И-64ЕС (ИРС817), -6ОТС (8ΡΌ754), 8ΡΌ-756, рацивира, Ό-ЕПОС или 687340. С другой стороны, штаммы ВИЧ представляют собой штаммы, обнаруженные у пациентов, получивших такой резистентный или полирезистентный штамм ВИЧ непосредственно или опосредованно от другого человека, у которого резистентный или полирезистентный штамм ВИЧ образовался при длительном лечении при помощи по меньшей мере одного противовирусного средства из перечисленного выше списка противовирусных средств ΝΚΓΙ. Часто полирезистентные штаммы ВИЧ содержат по меньшей мере три мутации в вирусной ОТ по сравнению со штаммом дикого типа.

Таким образом, очевидно, что способы и композицию по изобретению можно применять в качестве дополнения к существующим противовирусным способам лечения, таким как НААК.Т, или, в некоторых случаях, как неотложную терапию или терапию по жизненным показаниям. Как правило, это случай, когда полирезистентный ВИЧ индуцирован у конкретного пациента, при более ранней противовирусной терапии лекарственным средством того же пациента в прошлом. С другой стороны, способы и композиции по изобретению представляют терапию первого ряда, как правило, для пациентов, у которых наблюдалась первичная ВИЧ-инфекция с уже мутировавшим полирезистентным штаммом. Такие полирезистентные штаммы ВИЧ, имеющие высвобождающие праймер мутации ОТ, способствующие опосредованному АТФ- или пирофосфатом удалению из цепи терминирующих нуклеотидов ΝΚΉ, часто индуцируют перечисленные ниже противовирусные лекарственные средства:

зидовудин, ламивудин или комбинированные лекарственные формы комбивир или тризивир; ламивудин, абакавир или комбинированная лекарственная форма эпзиком; тенофовир, эмтрицитабин или комбинированная лекарственная форма трувада.

Так как данные лекарственные средства часто индуцируют такие полирезистентные штаммы ВИЧ, этот список лекарственных средств не является исключительным.

Следовательно, очевидно, что 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин вводят с целью предотвращения появления одного или нескольких полирезистентных штаммов ВИЧ с высвобождающими праймер мутациями ОТ, способствующими опосредованному АТФ- или пирофосфатом удалению из цепи терминирующих нуклеотидов ΝΚΉ. Эту профилактическую меру проводят, даже если одновременно вводят индуцирующие такие мутации лекарственные средства ΝΚΉ.

Третий аспект изобретения относится к фармацевтической композиции в стандартной лекарственной форме или комбинированной лекарственной форме, включающей в себя 2',3'-дидезокси-3'-Сгидроксиметилцитозин и по меньшей мере один терминатор цепи ΝΚΓΙ, где после продолжительного введения доз с ΝΚΓΙ возникают высвобождающие праймер мутации ОТ ВИЧ, способствующие зависимому от АТФ или пирофосфата вырезанию присоединенного монофосфата ΝΚΓΙ из 3'-конца комплекса праймер/матрица и дающие возможность продолжить синтез ДНК.

Предпочтительные варианты осуществления фармацевтической композиции по изобретению и способ по изобретению включают в себя варианты осуществления и способ, где ΝΚΓΙ выбирают из зидову

- 10 011039 дина (ΑΖΤ, ΖΌν), ставудина (64Τ), зальцитабина (ббС), диданозина (66Ι), абакавира (АВС), ламивудина (3ТС), эмтрицитабина (РТС), адефовира (ΑΌν), энтакавира (ВМ8 200475), аловудина (ЕЬТ), дизопроксилфумарата тенофовира (ΤΝΡ), амдоксавира (ΌΑΡΌ), Э-64РС (ЭРС-817). -бОТС (8ΡΌ754), 8ΡΌ-756, рацивира, Ό-ЕПОС или С87340 и их сочетаний.

В частности, предпочтительные варианты осуществления включают в себя варианты осуществления, где ΝΚΤΙ выбирают из зидовудина, ставудина, диданозина, ламивудина, абакавира, тенофовира, эмтрицитабина или/и их сочетаний.

В противоположность описанным в И8 5612319 способам, 2',3'-дидезокси-3'-Сгидроксиметилцитозин по изобретению вводят пациенту в относительно низкой дозе и с расчетом на непрерывное и продолжительное противовирусное лечение. Данная указанная дозировка схемы лечения обеспечивает определенные концентрации лекарственного средства и избегает токсичности в отличие от дополнительного профилактического лечения, где кратковременная токсичность приемлема. В И8 5612319 предлагаются дозировки 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина приблизительно

10-25 мг/кг/сутки для дополнительного профилактического лечения человека, а в экспериментах на обезьянах использовали 30 мг/кг/сутки.

Однако по настоящему изобретению 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин вводят в концентрации менее 1 мг/кг/сутки, предпочтительно в диапазоне 0,05-0,5 мг/кг/сутки и наиболее предпочтительно менее 0,1 мг/кг/сутки. Соответствующая дозировка зависит от показаний и пациента и легко определяется обычным метаболизмом лекарственного средства животного и фармакокинетикой (ΌΜΡΚ) или клиническими испытаниями и ίη δίΐίοο диагностическим программным обеспечением.

Стандартная дозировка или совместная дозировка фармацевтических композиций по изобретению соответствует количествам 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина, как правило, пересчитанным на взрослого человека 60 кг или 75 кг, и необязательно разделена на один, два или три приема по ΟΌ, ВШ или ΤΙΌ схеме приема. Дозировки пересчитывают в большую сторону, если пролекарство применяют для того, чтобы учесть дополнительную массу пролекарства, и пересчитывают в меньшую сторону, принимая во внимание повышенную биодоступность. Если терапевтическая доза находится в диапазоне 0,05-0,5 мг/кг/сутки, то клиническая доза ΟΌ на человека в сутки может составлять 3-30 мг для взрослого человека 60 кг или 3,75-37,5 мг для взрослого человека 75 кг. Дозировка и ограничения введения дополнительного обычного ΝΚΤΙ в смешанной стандартной дозировке фармацевтической композиции аспекта по изобретению может требовать ΟΌ, ВШ или ΤΙΌ дозирования.

Формы совместных дозировок включают в себя отдельные упаковки, содержащие блистерные упаковки 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина или его пролекарства и дополнительный ΝΚΤΙ, как указано выше. Блистерная упаковка может содержать блистеры для обоих компонентов на одном блистерном листе (обычно с обозначением, облегчающим правильное введение соответствующего количества таблеток/капсул каждого средства, например, 2 таблетки одного лекарственного средства и 1 таблетку другого). Альтернативно, форма совместной дозировки представляет собой упаковку с некоторым количеством вложенных блистерных листов, где каждое из лекарственных средств имеет свой собственный блистерный лист.

Принятое выше во внимание положение, что 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин в контексте ОТ ВИЧ, мутировавшей таким образом, чтобы обеспечить вырезание терминатора цепи опосредованным пирофосфатом путем, работает при помощи отличного от обрывающих цепь нуклеозидов механизма действия, может быть осуществлено на практике введением исходного соединения 2',3'-дидезокси3'-С-гидроксиметилцитозина или введением пролекарств, высвобождающих 2',3'-дидезокси-3'-Сгидроксиметилцитозин ίη νίνο.

В одной группе пролекарств 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина используется модификация основания, как показано у Μαηΐάοη с1 а1. Вюгд Меб Сйеш 6 (1998) 577-585. Обычные пролекарства модифицированного основания имеют формулу

Асов—О—'* где Ροοη независимо представляет собой Н или обычный фармацевтически приемлемый сложный эфир; В⁵ представляет собой -С(=О)В⁷ или связанный с амидом Ь-аминокислотный остаток; В⁶ представляет собой Н;

или В⁵ и В⁶ вместе обозначают имин =СВ⁸В⁸;

В⁷ представляет собой С₁-С₆алкил, С₀-С₃алкилциклил;

В⁸ и В⁸' независимо представляют собой Н, С1-С6алкил, С0-С3алкилциклил; или В⁸ представляет собой Н и В⁸' представляет собой -ΝΕ⁹ν⁹';

- 11 011039

К⁹ и К⁹ независимо представляют собой Н, С|-С₆алкил. Со-Сзалкилциклил;

или К⁹ и К⁹ вместе с атомом N. к которому они присоединены. обозначают насыщенное 5- или 6членное кольцо;

η представляет собой 1. 2 или 3;

Обычные фармацевтически приемлемые сложные эфиры включают в себя сложные алкиловые эфиры. такие как ацетил. пропионил. бутирил. пивалоил. пальмитил. стеарил и т.п. и сложные ариловые эфиры. такие как бензоил. Другие обычные фармацевтически приемлемые сложные эфиры включают в себя сложные эфиры аминокислот. таких как Ь-валил. Ь-изолейцин или Ь-фенилаланин.

Примеры пролекарств модифицированного основания 2'.3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметил у Маи1боп включали в себя имины

-Ν=ΟΗΝΡ, где ΝΚ представляет собой N(№3)2. Ν(ιΡγ)2. Ν(Ργ)2. Ν^ΗΚ ЖСЩЦ ВДСНСНДО

Кроме того. пролекарства модифицированного основания Маи1боп включают в себя амиды цитозинового азота

где Ксоп представляет собой Н или обычный фармацевтически приемлемый сложный эфир.

Ка представляет собой ХН(Вос-Ь-валил). ΝΗ-Вос-Ь-Рйе. Ь-валил. Ь-Рйе;

или Ка представляет собой С(=О)СН₃. СОРИ. СОС(СН₃)₃ и т.п.

Пролекарства модифицированного основания. такие как Маи1бш. могут иметь преимущество сниженной чувствительности к клеточным и физиологическим цитозиндезаминазам. но. принимая во внимание многие реакции трансгликозилирования. происходящие в человеческих клетках. необходимо убедиться в гарантии того. что модифицированное основание не трансгликозилировано на нативном рибозиде и не включено в человеческую ДНК с канцерогенными или тератогенными проявлениями.

Предпочтительные группы пролекарств 2'.3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина. приемлемые по изобретению. представляют собой 3'- и/или 5'-сложные эфиры пролекарств формулы

где один из К и К' представляет собой часть пролекарства с частичной структурой

где К¹ представляет собой Н или С₁-С₁₈ неразветвленный или разветвленный алкил;

К² представляет собой Н или ΝΗΡ³;

К³ представляет собой Н или Ь-валиловый или Ь-изолейциловый сложный эфир; а оставшийся из К и К' представляет собой Н или идентичную часть пролекарства; или их фармацевтически приемлемую соль.

Многие из данных сложных эфиров пролекарств или 2'.3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина представляют собой новые соединения и создают дополнительный аспект изобретения.

Один вариант осуществления сложных эфиров пролекарств по изобретению включает в себя соединения формулы V. где К¹ представляет собой С1-С18 неразветвленную или разветвленную цепь алкила. а К² представляет собой Н. Характерные алкильные части включают в себя обозначающие сложные эфиры октаноил (С8. включая кетон С). деканоил (С₁₀). лаурил (С₁₂). миристоил (С₁₄). пальмитоил (С₁₆). стеароил (С₁₈) или эйкозаноил (С₂₀). Предпочтительные алкильные части включают в себя метил (т.е. ацетил). этил. н-пропил. изопропил. н-бутил. изобутил. втор-бутил. трет-бутил (т.е. пивалоил). н-пентил. 1метилбутил. 2.2-диметилбутил. 2-метилпентил. 2.2-диметилпропил. н-гексил и т.п. Пролекарство может иметь сложный эфир на К (т.е. 5'-О-сложный эфир) или К' (т.е. 3'-О-сложный эфир) или на обоих (бис3'.5'-О-сложный эфир). Для облегчения синтеза и анализа предпочтительно. но обязательно. чтобы сложные эфиры на 3' и 5' представляли собой идентичные части пролекарства.

Дополнительный вариант осуществления сложных эфиров пролекарств по изобретению включает в себя эфиры. где К¹ представляет собой низший алкил. главным образом метил. и К² представляет собой ΝΗΡό. где КЬ представляет собой остаток алифатической Ь-аминокислоты. выбранной из аланина. валина. лейцина. трет-лейцина. изолейцина и норлейцина. главным образом. где К² представляет собой ΝΗ-Ь- 12 011039 валил или ΝΗ-Ь-изолейцил. В данном варианте осуществления К¹ имеет соответствующую Ь-молочной кислоте стереохимию. Пролекарство может нести этот сложный эфир части пролекарства на К (т.е. 5'-Осложный эфир) или К' (т.е. 3'-О-сложный эфир) или на обоих (бис-3',5'-О-сложный эфир). Для облегчения синтеза и анализа предпочтительно, но обязательно, чтобы сложные эфиры на 3' и 5' представляли собой идентичные части пролекарства.

Дополнительные сложные эфиры пролекарств для применения в изобретении включают в себя эфиры, где К¹ представляет собой разветвленную цепь С3-С4 алкила и К² представляет собой ΝΗ2. Боковая цепь К¹ предпочтительно имеет стереохимию Ь-аминокислоты, такой как Ь-валин, Ь-лейцин, Ьизолейцин или Ь-трет-лейцин. Пролекарство может нести сложный эфир на К (т.е. 5'-О-сложный эфир) или К' (т.е. 3'-О сложный эфир) или на обоих (бис-3',5'-О-сложный эфир). Для облегчения синтеза и анализа предпочтительно, но необходимо, чтобы сложные эфиры на 3' и 5' представляли собой идентичные части пролекарства.

Предпочтительные пролекарства включают в себя 5'-О-Ь-валил-2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин; 5'-О-Ь-изолейцил-2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин; 5'-О-ацетил-2',3'-дидезокси-3-С-гидроксиметилцитозин; 5'-О-пропионил-2',3'-дидезокси-3-С-гидроксиметилцитозин; 5'-О-бутирил-2',3'-дидезокси-3-С-гидроксиметилцитозин; 5'-О-пивалоил-2',3'-дидезокси-3-С-гидроксиметилцитозин; 2',3'-дидезокси-3-С-(ацетилоксиметил)цитозин; 2',3'-дидезокси-3-С-(пропионилоксиметил)цитозин; 2',3'-дидезокси-3-С-(бутирилоксиметил)цитозин; 2',3'-дидезокси-3-С-(пивалоилоксиметил)цитозин; 2',3'-дидезокси-3-С-(Ь-валилоксиметил)цитозин; 2',3'-дидезокси-3-С-(Ь-изолейцилоксиметил)цитозин; 5'-О-Ь-валил-2',3'-дидезокси-3'-С-Ь-валилоксиметилцитозин; 5'-О-Ь-изолейцил-2',3'-дидезокси-3'-С-Ь-изолейцилоксиметилцитозин; 5'-О-ацетил-2',3'-дидезокси-3-С-ацетилоксиметилцитозин; 5'-О-пропионил-2',3'-дидезокси-3-С-пропионилоксиметилцитозин; 5'-О-бутирил-2',3'-дидезокси-3-С-бутирилоксиметилцитозин; 5'-О-пивалоил-2',3'-дидезокси-3-С-пивалоилоксиметилцитозин;

и их фармацевтически приемлемые соли.

Особенно предпочтительные пролекарства включают в себя 5'-О-[2-8-(Ь-валилокси)пропионил]-2',3'-дидезокси-3-С-гидроксиметилцитозин; 2',3'-дидезокси-3'-С-[2-8-(Ь-валилокси)пропионил]оксиметилцитозин; 5'-О-пентаноил-2',3'-дидезокси-3-С-гидроксиметилцитозин; 2',3'-дидезокси-3'-С-пентаноилоксиметилцитозин; или 5'-О-пентаноил-2',3'-дидезокси-3-С-пентаноилоксиметилцитозин;

или их фармацевтически приемлемые соли.

Не желая ограничиваться теорией, авторы предполагают, что подобно другим нуклеозидным аналогам 2',3'-дидезокси-3-С-гидроксиметилцитозин внутриклеточно фосфорилируется клеточными киназами до 5'-монофосфата, который, в свою очередь, дополнительно фосфорилируется до дифосфата и трифосфата. Ди- и трифосфорилирующие киназы имеют тенденцию проявлять большую активность, чем первичная монофосфорилирующая киназа, особенно в некоторых типах клеток. Другими словами, монофосфорилирование теоретически может являться скорость-лимитирующей стадией. Следовательно, в некоторых условиях может быть целесообразным введение исходного соединения в готовой монофосфорилированной форме с целью обеспечения быстро продвигающегося фосфорилирования до трифосфата. Однако не просто переправить высокополярное лекарственное средство, такое как монофосфат нуклеозида, через клеточную мембрану. Однако существуют основы лекарственных средств, которые, как полагают, обеспечивают проникновение пролекарства внутрь клетки, которое гидролизируется ίη δίΐιι до монофосфата. Один такой подход проиллюстрирован фазой ΙΙ пролекарства зидовудина-фозивудина тидоксила, в котором используют конъюгат липидного тиоэфира со сложным эфиром фосфата зидовудина. См., например, бпагб в 1ΑΙΌ8 23 227-235 и патент США 5756711, патент США 5563257 и ЕР 545966. Аналогичная конструкция, примененная в 5'-монофосфат-2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозине, представляет собой

- 13 011039

где алкил обычно представляет собой С₈-С₁₅ и η равно 0 (меркапто), 1 (тионил) или 2 (сульфонил). Предпочтительные значения включают в себя додецилмеркапто в сочетании с дециловым эфиром.

В контексте изобретения пролекарство 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина также включает в себя пролекарства 5'-монофосфата, внутриклеточно высвобождающие 2',3'-дидезокси-3-Сгидроксиметилцитозин-5'-О-фосфат.

Настоящее изобретение включает в себя фармацевтически приемлемые соли, такие как соли органических кислот, особенно карбоновых кислот, включая, но не ограничиваясь ими, ацетат, трифтораце тат, лактат, глюконат, цитрат, тартрат, малеат, малат, пантотенат, изетионат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бутират, диглюконат, циклопентанат, глюкогептанат, глицерофосфат, оксалат, гептаноат, гексаноат, фумарат, никотинат, пальмоат, пектинат, 3-фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, тартрат, лактобионат, пиволат, камфорат, ундеканоат и сукцинат. Также включены соли органических сульфокислот, такие как метансульфонат, этансульфонат, 2-гидроксиэтансульфонат, камфорсульфонат, 2нафталинсульфонат, бензолсульфонат, п-хлорбензолсульфонат и п-толуолсульфонат. Приемлемые соли также включают в себя соли неорганических кислот, такие как гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, сульфат, бисульфат, гемисульфат, тиоцианат, персульфат, фосфорной и сульфоновой кислот.

Настоящее изобретение относится к активным средствам, представляющим собой гидраты, сольваты, комплексы и другие физические формы, высвобождающие 2',3'-дидезокси-3'-Сгидроксиметилцитозин ίη νίνο.

Хотя можно вводить активное вещество отдельно, предпочтительным является его присутствие как части фармацевтической композиции. Такая композиция будет включать в себя активное вещество 2',3'дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин вместе с одним или несколькими приемлемыми носителями/эксципиентами и необязательно другие терапевтические ингредиенты. Носитель(и) должен быть при емлемым в смысле совместного существования с другими ингредиентами композиции и не вредным для реципиента.

Композиции включают в себя композиции, приемлемые для ректального, назального, местного (включая буккальное и сублингвальное), вагинального или парентерального (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное и внутрикожное) введения. Предпочтительно композиция представляет собой композицию для перорального введения. Как правило, композиции могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, например, таблетках и капсулах с замедленным высвобождением, и могут быть получены любыми способами, хорошо известными в области фармации.

Такие хорошо известные способы включают в себя стадию введения активного вещества 2',3'дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина в соединение с носителем. Как правило, композиции получают путем непрерывного и непосредственного введения активного вещества в соединение с жидкими носителями или измельченными твердыми носителями, или с теми и другими, и после этого придают форму продукту, если необходимо. Изобретение охватывает способы получения фармацевтической композиции, включающие в себя введение соединения 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина или его фармацевтически приемлемой соли в соединение или в комплекс с фармацевтически приемлемым носителем или растворителем. Если получение фармацевтической композиции включает в себя тщательное перемешивание фармацевтических эксципиентов и активного ингредиента, находящегося в солевой форме, после этого часто является предпочтительным применение не основных по природе эксципиентов, т.е. кислых или нейтральных.

Композиции для перорального применения по настоящему изобретению могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, капсулы с оболочкой или таблетки, каждая из которых содержит предварительно установленное количество активного вещества. В качестве альтернативы, они могут быть представлены в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии активного вещества в водном растворе или безводной жидкости, или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или жидкой эмульсии вода-в-масле, в виде пилюли и т. д.

В отношении композиций для перорального введения (например, таблетки и капсулы) термин приемлемый носитель включает в себя наполнители, такие как обычные эксципиенты, например, связующие средства, такие как сироп, гуммиарабик, желатин, сорбит, трагакант, поливинилпирролидон (повидон), метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, натрий-карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, сахароза и крахмал; наполнители и носители, например, кукурузный крахмал, желатин, лактоза, сахароза, микрокристаллическая целлюлоза, каолин, маннит, дикальцийфосфат, хлорид натрия и альги новая кислота; и скользящие вещества, такие как стеарат магния, стеарат натри и другие стеараты метал

- 14 011039 лов, стеарат глицерина, стеариновая кислота, кремнийорганическая жидкость, тальк, воски, масла и коллоидный диоксид кремния. Также можно использовать ароматизирующие вещества, такие как мята перечная, масло гаультерии, вишневая отдушка или т.п. Для создания легко идентифицируемой лекарственной формы может быть желательным добавление красителя. Таблетки также можно покрывать с помощью хорошо известных в данной области способов.

Таблетка может быть получена прессованием или формованием, необязательно с одним или несколькими дополнительными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены прессованием в подходящем аппарате активного вещества в сыпучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанного со связующим, скользящим веществом, инертным разбавителем, консервантом, поверхностно-активным или диспергирующим веществом. Формованные таблетки могут быть получены формованием в подходящем аппарате смеси порошкообразного соединения, смоченного инертным жидким разбавителем. Таблетки необязательно могут быть с покрытием или с насечкой и могут быть составлены таким образом, чтобы обеспечить медленное или контролируемое высвобождение активного вещества.

Другие подходящие для перорального применения композиции включают в себя пастилки, содержащие активное вещество в ароматизированной основе, обычно сахарозе и гуммиарабике или трагаканте; пластинки, содержащие активное вещество в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахароза и гуммиарабик; и жидкости для полоскания рта, содержащие активное вещество в приемлемом жидком носителе.

2',3'-Дидезокси-3-С-гидроксиметилцитозин синтезируют с использованием обычной химии нуклеозидов, как описано в И8 5612319, И8 5473063, Зуапккоп Ь. е! а1. ίη 1. отд. Скет (1991) Уо1 56: 2993-2997 и В_)бг8пе М. е! а1. ίη ТеЧакебтоп, Уо1 49: 8637-8644 (1993).

Синтез пролекарств с модифицированным основанием и некоторые обычные 3' и 5' сложные эфиры описаны у Маи1б1п е! а1. Впотд Меб Скет 6 (1998) 577-585.

Синтез 3' и 5' сложных эфиров обычно осуществляют взаимодействием нуклеозида (в необходимых случаях с основанием, Ν-защищенным обычной Ν-защитной группой) с кислотой функциональной группы пролекарства:

О

П2—|—ОН К1 совместно с обычным связующим реагентом или с активированным производным данного сложного эфира, таким как галогенангидриды, такие как хлорангидриды, и активированными сложными эфирами, включая, но не ограничиваясь ими, ангидриды, полученные из муравьиной и уксусной кислоты, ангидриды, полученные из галогенангидридов алкоксикарбоновой кислоты, такие как изобутилоксикарбонилхлорид и т.п., полученные из Ν-гидроксисукцинимида сложные эфиры, полученные из Νгидроксифталимида сложные эфиры, полученные из Ν-гидроксибензотриазола сложные эфиры, полученные из №гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксамида сложные эфиры, полученные из 2,4,5трихлорфенила сложные эфиры и т.п.

Диапазон выбора 3' или 5' положений для соединений, содержащих одну функциональную группу пролекарства, обеспечивается применением больших защитных групп, например, как показано в XV О 97/30051, или применением дифференциально выбираемых пар групп, защищающих гидроксил, как показано у 8апдку1 е! а1. 8уп!ке818 1994, 1163, 8апдку1 е! а1. Те!! Ье!!, уо1. 35, р. 4697 (1994) и На1у & 8апдку1 М.1е1ео51бе5 & М.1с1еоЦбе5. Уо1 15, 1383 (1996).

Известны многие пары дифференциально выбираемых защищающих гидроксилгрупп, например Озащитные группы, описанные у Сгеепе, Рто!ес!1уе Сгоирк 1п Отдапк 8уп1ке818, (1окп νίΕ-еу & 8оп§, Νονν Уотк (1981)).

Таким образом, защитные группы для гидроксигруппы включают в себя эфиры, такие как метиловый эфир или замещенные метиловые эфиры, например метоксиметил (МОМ), бензилоксиметил, третбутоксиметил, 2-метоксиэтоксиметил (МЕМ), 2,2,2-трихлорэтоксиметил, бис-(2-хлорэтокси)метил, 2(триметилсилил)этоксиметил, тетрагидропиранил (ТНР), 3-бромтетрагидропиранил, тетрагидротиопиранил, 4-метокситетрагидропиранил, 4-метокситетрагидротиопиранил 8,8-диоксидо, тетрагидрофуранил и тетрагидротиофуранил. Этиловые эфиры включают в себя 1-этоксиэтил, 1-метил-1-метоксиэтил, 1(изопропокси)этил, 2,2,2-трихлорэтил и 2-(фенилселенил)этил. Другие эфиры включают в себя третбутил, аллил, циннамил, п-хлорфенил и бензиловые эфиры, такие как незамещенный бензил, пметоксибензил, о-нитробензил, п-нитробензил, п-галогенбензил и п-цианобензил. Другие эфиры включают в себя 3-метил-2-пиколил-И-оксидо, дифенилметил, 5-дибензосуберил, трифенилметил, альфанафтилдифенилметил, п-метоксифенилдифенилметил, п(п'-бромфенацилокси)фенилдифенилметил, 9антрил, 9-(9-фенил)ксантенил, 9-(9-фенил-10-оксо)антрил (тритилон) и бензизотиазлил-8,8-диоксидо. Силиловые эфиры включают в себя триметилсилил (ТМ8), триэтилсилил, изопропилдиметилсилил, третбутилдиметилсилил (ТВИМ8), (трифенилметил)диметилсилил, трет-бутилдифенилсилил, метилдиизопропилсилил, метилди-трет-бутилсилил, трибензилсилил, три-п-ксилилсилил, триизопропилсилил и трифенилсилил. Альтернативные защищающие гидроксилгруппы включают в себя сложные эфиры, та- 15 011039 кие как формиат, бензоилформиат, ацетат, хлорацетат, дихлорацетат, трихлорацетат, трифторацетат, метоксиацетат, трифенилметоксиацетат, феноксиацетат, п-хлорфеноксиацетат, 2,6-дихлор-4метилфеноксиацетат, 2,6-дихлор-4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)феноксиацетат, 2,4-бис-( 1,1-диметилпропил)феноксиацетат, хлордифенилацетат, п-(Р)-фенилацетат, 3-фенилпропионат, 3-бензоилпропионат, изобутират, моносукцинат, 4-оксопентаноат (левинулат), пивалоат, адамантоат, кротонат, 4метоксикротонат, (Е)-2-метил-2-бутеноат (тиглоат) и бензоаты, такие как незамещенные или о(дибромметил)-, о-(метоксикарбонил)-, п-фенил-, 2,4,6-триметил-(мезитат) или п-(Р)-бензоаты, или альфа-нафтоат. Защищающие гидроксилкарбонатные группы включают в себя метил, этил, 2,2,2трихлорэтил, изобутил, винил, аллил, циннамил, п-нитрофенил, бензилы, такие как незамещенные, пметокси-, 3,4-диметокси-, о-нитро- или п-нитробензилы, или 8-бензилтиокарбонат. Прочие защищающие гидроксилгруппы включают в себя Ν-фенилкарбамат, Ν-имидазолилкарбамат, борат, нитрат, Ν,Ν,Ν,Νтетраметилфосфородиамидат и 2,4-динитрофенилсульфенат. Сгеепе предоставляет обширные таблицы реакционной способности, чтобы облегчить выбор сопряженных пар различных защитных групп. Характерные защищающие гидроксилгруппы включают в себя группы в примерах и эфиры, такие как третбутиловый и другие низшие алкиловые эфиры, такие как изопропиловый, этиловый и особенно метиловый, бензиловый и трифенилметиловый; тетрагидропираниловые эфиры; замещенные этиловые эфиры, например 2,2,2-трихлорэтиловый; силиловые эфиры, например триметилсилиловый, третбутилдиметилсилиловый и трет-бутилдифенилсилиловый; и сложные эфиры, полученные взаимодействием гидроксильной группы с карбоновой кислотой, например ацетат, пропионат, бензоат и т.п.

В случае необходимости функциональные группы в молекуле пролекарства, такие как ΝΗ, или нуклеозидное основание защищают и снимают защиту с использованием обычных способов воздействия, как показано, например, у Сгеепе, РгсИеейуе Сгоирк ίη Отдаше ЗуШкекЕ (ίοΐιη Айеу & 8оп§, №\ν Уогк, 1981), которая включена сюда в качестве ссылки. Ν-защитные группы включают в себя ацильные группы, такие как формил, ацетил, пропионил, пивалоил, трет-бутилацетил, 2-хлорацетил, 2-бромацетил, трифторацетил, трихлорацетил, фталил, о-нитрофеноксиацетил, α-хлорбутирил, бензоил, 4-хлорбензоил, 4-бромбензоил, 4-нитробензоил и т.п.; сульфонильные группы, такие как бензолсульфонил, птолуолсульфонил и т.п., образующие карбамат группы, такие как бензилоксикарбонил, пхлорбензилоксикарбонил, п-метоксибензилоксикарбонил, п-нитробензилоксикарбонил, 2нитробензилоксикарбонил, п-бромбензилоксикарбонил, 3,4-диметоксибензилоксикарбонил, 4метоксибензилоксикарбонил, 2-нитро-4,5-диметоксибензилоксикарбонил, 3,4,5-триметоксибензилоксикарбонил, 1 -(п-бифенилил)-1-метилэтоксикарбонил, а,а-диметил-3,5-диметоксибензилоксикарбонил, бензгидрилоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил, диизопропилметоксикарбонил, изопропилоксикарбонил, этоксикарбонил, метоксикарбонил, аллилоксикарбонил, 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, феноксикарбонил, 4-нитрофеноксикарбонил, флуоренил-9-метоксикарбонил, циклопентилоксикарбонил, адамантилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил, фенилтиокарбонил, и т.п.; алкильные группы, такие как бензил, трифенилметил, бензилоксиметил и т.п.; и силильные группы, такие как триметилсилил и т.п. Предпочтительные Ν-защитные группы включают в себя формил, ацетил, бензоил, пивалоил, третбутилацетил, фенилсульфонил, бензил, трет-бутоксикарбонил (ВОС) и бензилоксикарбонил (Οόζ).

Синтез пролекарств монофосфата 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметила проводят аналогично И8 5756711, И8 5563257, ЕР 545966 и АО95/32984, с соответствующей защитой 3'-гидроксиметильной группы. Галеновые композиции для подобных соединений показаны в АО 97/26867.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1 представляет собой диаграмму, изображающую распространение ТАМ с высвобождающим праймер фенотипом Μ41Ε/Ε210Α/Τ215Υ на основе 1086 последовательностей ОТ пациентов с вирусологическими нарушениями;

фиг. 2 представляет собой диаграмму, изображающую распространение ТАМ с высвобождающим праймер фенотипом Ό67Ν/Ι<70Κ./Ε210Α на основе 1098 последовательностей пациентов с вирусологическими нарушениями;

фиг. 3 представляет собой схему катализируемой ОТ полимеризации ДНК;

фиг. 4 представляет собой схему опосредованной АТФ активности высвобождения праймера на терминированном ΑΖΤ праймерном конце;

на фиг. 5 изображено ингибирование типичных штаммов ТАМ с высвобождающим праймер фенотипом 2',3'-дидезокси-3-С-гидроксиметилцитозином по сравнению с ингибированием обычными ΝΚΤΙ;

на фиг. 6 изображено ингибирование Μ184V+ТАМ с высвобождающим праймер фенотипом 2',3'дидезокси-3-С-гидроксиметилцитозином по сравнению с ингибированием обычными ΝΚΤΙ;

на фиг. 7 изображено ингибирование Τ698+XX+ТАМ 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозином по сравнению с ингибированием обычными ΝΚΤΙ;

на фиг. 8 изображено ингибирование штаммов ТАМ 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозином по сравнению с ингибированием зидовудином и ламивудином;

фиг. 9 представляет собой диаграмму, изображающую синтез ДНК в виде функции времени, отображая включение 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин-монофосфата;

- 16 011039 фиг. 10 представляет собой диаграмму, изображающую остаточный З'-ОН праймер, указывая, что включение 2',З'-дидезокси-З'-С-гидроксиметилцитозина допускает ограниченный дополнительный синтез ДНК;

фиг. 11 представляет собой авторадиограмму геля, показывая, что индуцированный 2',З'-дидезоксиЗ'-С-гидроксиметилцитозин-монофосфатом обрыв цепи отличается от вызванного άάС монофосфатом обрыва цепи ДНК. Вызванный άάС-монофосфатом обрыв фрагмента цепи ДНК возникает в меньшей степени в геле, чем фрагмент, полученный с применением соединения по изобретению.

Подробное описание изобретения

Различные варианты осуществления и аспекты изобретения описаны только при помощи примера со ссылкой на сопутствующие примеры и рисунки.

Пример 1.

Активность 2',З'-дидезокси-З'-С-гидроксиметилцитозина против связанной с высвобождением праймера ТАМ резистентного ВИЧ в анализе ВИЧ БИепо^ен^е.

Чувствительность к 2',З'-дидезокси-З'-С-гидроксиметилцитозину изолятов ВИЧ-1 образцов плазмы от пациентов, имеющих обычные ТАМ высвобождающие праймер мутантные резистентные генотипы, определяли коммерчески доступным анализом ВИЧ БИепо^ен^е (описан Ρеΐ^οрοи1ο8, С.1. е! а1., (2000) АпйткгоЬ. Адеп18 СйетоШег. 44: 920-928 и произведен УпоЬодюк, 1пс). Анализ выполняли амплификацией протеазного сегмента (ΡΚ)-ΚΤ гена ВИЧ ро1 плазмы пациента и вставкой продуктов амплификации в модифицированный вектор ВИЧ-1, полученный из молекулярного клона ТС4-З.

Вирусный материал получали котрансфекцией клеточных культур 29З рекомбинантной вирусной векторной ДНК и экспрессионным вектором, продуцирующим амфотропные белки оболочки вируса лейкемии мышей. Псевдотипированные вирусные частицы собирали из трансфицированных клеточных культур и использовали для инфицирования свежих клеточных культур 29З. Рекомбинантная вирусная ДНК содержала люциферазную генную кассету в области гена епу ВИЧ, и продукция люциферазы в клетках-мишенях зависела от завершения одного цикла вирусной репликации. Чувствительность к лекарственному средству измеряли добавлением к клеткам последовательных концентраций соединения по изобретению и ссылочных соединений. Ингибирующие вирусную репликацию лекарственные средства снижали люциферазный сигнал в дозозависимых условиях, обеспечивая количественное измерение чувствительности к лекарственному средству.

Пример 1 а.

В табл. 1 суммирована основная группа используемых в эксперименте связанных с высвобождением праймера ТАМ-мутантов, являющихся резистентными ВИЧ и несущих характерный ТАМ-генотип, обычно возникающий в процессе противовирусной терапии с применением ΑΖΤ.

Таблица 1 Характерный генотип в связанных с высвобождением праймера ТАМ изолятах пациентов 20 и 21

Номер изолята	Характерные нутации ТАМ	связанные	с высвобождением праймера
20	М41Ь, Ο67Ν, Σ228Η	К70К,	νΐ18Ι,	Ь210Н,	К211К,	Т215Е, К2190 и
21	М41Ь, Ο67Ν, Б228Н	Κ7οε,	ν118ΐ,	Ь210Н,	К211К,	Τ215Υ, Κ219Ν и

Результаты изображены на фиг. 5. В качестве стандарта использовали вирус ВИЧ дикого типа. Таким образом, ингибирование штаммов изолятов пациентов 20 и 21 выражали в виде кратного изменения снижения чувствительности к лечению лекарственными средствами по сравнению с параллельными дорожками стандарта. Тестировали следующие противовирусные лекарственные средства: ΑΖΤ, ЗТС, ΤΝΡ, АВС, ά4Τ, РТС и соединение по изобретению. Четко видно, что соединение по изобретению 2',З'дидезокси-З'-С-гидроксиметилцитозин сохранял активность против несущих ТАМ штаммов. Результаты показали всего лишь 1,0-кратное снижение чувствительности для изолята 20 штамма и менее 1,0кратного снижения чувствительности для изолята 21 штамма. Это означает, что 2',З'-дидезокси-З'-Сгидроксиметилцитозин сохранял активность против связанной с высвобождением праймера мутантной ОТ ВИЧ пациента на уровне активности, аналогичной его активности против ОТ ВИЧ дикого типа. Напротив, другие лекарственные средства, особенно ΑΖΤ (451-кратное снижение чувствительности), а также ЗТС, ΤΡΝ, АВС, ά4Τ и РТС теряли активность против вируса данных пациентов по сравнению с вирусом дикого типа. Другими словами, вирус данных пациентов демонстрировал резистентность, выражающуюся сильным снижением чувствительности к этим лекарственным средствам, как показано на фиг. 5.

Важно отметить, что изоляты двух пациентов содержат различные аминокислотные транзиции в кодоне 215; Т на Р в изоляте 20 и Т на Υ в изоляте 21. Это является характерным признаком связанных с высвобождением праймера ТАМ резистентных мутантов.

Пример 1Ь.

В табл. 2 указан связанный с высвобождением праймера мутантный ВИЧ с генетическим фоном М184У (характерный мутант), обычно возникающий при очень часто используемой антиретровирусной

- 17 011039 терапии ΑΖΤ+3Τ0 (комбивир).

Таблица 2

Генотипические изменения в связанной с высвобождением праймера ТАМ изолята пациента 19

Номер изолята	Характерные связанные с высвобождением праймера мутации ТАМ
19	М41Ь, ϋ67Ν, К70К, νΐ18Ι, Μ184ν, Ь210И, Τ215Ε, К219Е и Б228Н

Как показано на фиг. 6, 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин еще раз сохранял активность против данного резистентного вируса, демонстрируя всего лишь 1,78-кратное отличие в чувствительности по сравнению с ВИЧ дикого типа. 3ТС и ΑΖΤ оба теряли активность и показывали сниженную активность (т.е. выраженное снижение чувствительности вируса) в отношении резистентного вируса (фиг. 6).

Пример 1с.

Продолжительное введение пациентам противовирусных лекарственных средств приводит к появлению ΜΌΚ.

Мутация Τ698 с инсерцией 6 п.о. между аминокислотами 68 и 70 в пальцеобразной области ОТ часто обнаруживается в сочетании с различными формами ТАМ и способствует повышенной активности высвобождения праймера. Была выбрана группа ΜΌΚ (с различными формами аминокислотной(ых) инсерцией(ями)) в сочетании с ТАМ, как указано в табл. 3.

Таблица 3 Генотипические изменения в связанных с высвобождением праймера изолятах пациентов 31, 32 и 35

Номер изолята	Характерные связанные с высвобождением праймера
мутации ТАМ
31	Тб 93 + двойная аминокислотная инсерция ЗС в генетический фон ТАМ Α62ν, Ц67Е и К211К
32	Т693 + двойная аминокислотная инсерция УС в генетический фон ТАМ А627, Б67С, ν75Ι и Τ215Ι
35	Т693 + двойная аминокислотная инсерция УА в генетический фон ТАМ А62У, К211К, Τ215Υ и Ь228Н

Как показано на фиг. 7, соединение по изобретению ингибирует изоляты данных пациентов, проявляя наименьшее изменение чувствительности к лекарственному средству по сравнению с шестью ссылочными противовирусными средствами, применяемыми в настоящее время при обычной противовирусной терапии.

Авторы отмечают, что для изолятов пациентов 32 и 35 наблюдали выраженное (от 500- до 1000кратного) снижение чувствительности к ΑΖΤ, тогда как соединение по изобретению демонстрировало изменения в 2,79 и 4,29 раза соответственно. Это согласуется с тем, что соединение по изобретению иллюстрирует отличный механизм ингибирования по сравнению с терминаторами облигатной цепи ДНК, представленными обычными ΝΚΤΙ.

Пример 1б.

Изолят 4 представляет собой дополнительный характерный мутант, несущий генотип К65К+М184У в не являющемся необходимым фоне ТАМ, состоящем из мутаций в Κ2118 и К219Е. Данный изолят вызывает обычную перекрестную резистентность к абакавиру, 3ТС и недавно одобренному нуклеозиду РТС, но сохраняет чувствительность к аналогам тимидина, таким как ΑΖΤ и 64Τ. Данный изолят не несет характерных высвобождающих праймер мутаций, однако соединение по изобретению еще ингибирует данный вирусный фенотип, как указано значением РС 3,88. Данное значение сравнимо с аналогами тимидина ΑΖΤ (РС=1,11) и 64Τ (РС=0,71), тогда как существенная резистентность была обнаружена для 3ТС (РС>200), РТС (РС>40) и до некоторой степени для АВС (РС>9,0). Эти экспериментальные данные демонстрируют, что соединение по изобретению не только имеет уникальные свойства против высвобождающих праймер мутантов, но также способен ингибировать мутанты ВИЧ из характерного семейства. Таким образом, это отличается от ингибиторного механизма, используемого 3ТС и РТС, а также, возможно, механизма Кобата 4'-С-этинильных соединений, описанного выше, в котором М184У вместе с одной дополнительной аминокислотной заменой в кодоне Τ165Κ в каталитической области обеспечивает перекрестную резистентность к 4-С-этинилнуклеозиду (Кобата 2002).

Пример 2.

Активность 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина против связанного с высвобождением праймера резистентного ВИЧ в РВМС.

Противовирусное действие соединения по изобретению против резистентных изолятов ВИЧ с дополнительной связанной с высвобождением праймера ТАМ анализировали в культуре РВМС. Изоляты ВИЧ-1 получали и наращивали до высокого титра путем совместного культивирования РВМС инфицированного пациента о ФГА-стимулированными РВМС донора (У1го1оду Мапиа1 £ог АСТС ΗΙν БаЬогаЮпс5). Свободные от клеток супернатанты собирали, секвенировали и хранили в аликвотах при -70°С для анализа чувствительности к лекарственному средству.

Исследования чувствительности к лекарственным средствам ίη νίίΐΌ проводили с использованием

- 18 011039 модифицированного консенсусного способа АСТС/ΌΟΌ (У1го1оду Мапиа1 Гог АСТС Ηΐν 1аЬога1опс5). РВМС предварительно инфицировали вирусными штаммами в течение 4 ч при 37°С во влажной атмосфере при 5% СО₂ с последующей 4-часовой инкубацией. Инфицированные клетки дважды отмывали в среде и раскапывали в микротитровальный планшет с восемью последовательными разведениями лекарственного средства. Каждая лунка содержала 100000 предварительно инфицированных РВМС, а все разведения лекарственных средств готовили со средой клеточной культуры. Разведения лекарственных средств выбирали таким образом, чтобы покрыть 50% ингибиторную концентрацию (1С₅₀) для каждого отдельного лекарственного средства. Контрольные лунки, содержащие клетки и вирус, совместно инкубировали в каждом планшете. После 7-суточной инкубации при 37°С во влажной атмосфере при 5% СО₂определяли рост вируса, используя антигенный анализ супернатантов р24 (АЬЬоП ЬаЬогаГопек, СЫсадо, И8А). Считали процент ингибирования вирусного роста по сравнению с контрольной лункой, не содержащей лекарственного средства, и выражали в виде кратных изменений (снижение чувствительности соединений) относительно контрольной лунки. Стандартное соединение ΑΖΤ рассматривали параллельно с соединением по изобретению.

Выбирали группу характерного связанного с высвобождением праймера мутантного вируса, содержащего основной признак резистентных связанных с высвобождением праймера ТАМ мутаций ОТ. Как указано в табл. 4, применяли штаммы с мутациями в положении М41Ь, Ό67Ν, К70К, Ь210^, Τ215Υ/Ε и К219Ц/Е в различных сочетаниях с добавлением или без характерного мутанта Μ184ν.

Таблица 4

Связанный с высвобождением праймера ТАМ генотип в изолятах 9 пациентов

Номер изолята	Характерные связанные с высвобождением праймера мутаций ТАМ
1295	М41Ъ, Ο67Ν, К70К, У75М, У1181, М184У, Ц210И, К211К, Τ215Υ и К219Е
7086	ϋ67Ν, Τ69Ν, К70В, У1181, Ь210И, Т215У и К219<2
Л2840	М41Ъ, ϋ67Ν, ν118Ι, Μ184ν, Ь210И, Κ211Ν, Τ215Υ
ЛОЗОЙ	М41Б, ϋ67Ν, М184У, Ъ210И, Κ2113, Τ215Υ
7141	М41Ь, ϋ67Ν, Μ184ν, Η208Υ, Κ211Κ, Τ215Υ, Κ219Ν
Л4007	ϋ67Ν, Τ69Ν, Κ70Κ, М184У, Η208Υ, Κ211Κ, Τ215Γ, Κ2190, Б228Н
УА206	067Ν, Μ184ν, Ц210И, Κ211Κ, Τ215Υ
УА286	М41Ъ, Е44Ц, Ο67Ν, Ь74У, У1181, Μ184Ι, Ε203Κ, Η208Υ, 1210И, Κ211Κ, Τ215Υ

Большинство из этих выбранных высвобождающих праймер мутантов придавали выраженную резистентность к ΑΖΤ, в несколько сотен раз снижая значение БС. Исключением был изолят 7086 (БС=3,0), несущий аминокислотную мутацию Τ215ν. Полное описание значений БС представлено на фиг. 8. Таким образом, 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин ингибировал все 8 изолятов с самым высоким значением БС, составляющим всего 2,7.

Пример 3.

2',3'-Дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин сохраняет способность к поддержанию синтеза ДНК.

Присутствие 3'-гидроксиметильной группы в соединении по изобретению должно, в принципе, поддерживать включение и элонгацию вирусной нуклеиновой кислоты, катализируемую ОТ ВИЧ-1. Использовали скорость-ограничивающее количество праймер-матрицы (168 и 238 рибосомную РНК отжигали олигонуклеотидым ДНК-праймером с последовательностью 5'-ТААССТТ6С66СС6Т-3' (8ЕЦ Ш N0:1), как правило, синтезированным INN0VΑ6ЕN). Его предварительно инкубировали со 100 мкМ (55-кратная 1С₅₀) 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин-трифосфата, 6,0 мкМ ббС-трифосфата (54кратная 1С₅₀ ббСТР), 20 мкМ дезоксицитозин-трифосфата (20-кратная Кт 6СТР) или в качестве контроля с Н₂О. В указанные временные точки (0, 10, 30, 60 и 120 мин) процесс полимеризации ДНК останавливали инактивацией ОТ при 70°С в течение 2 мин во время первого цикла полимеризации ДНК (фиг. 9). Остаточное количество праймер-матрицы прямо отражает доступность свободного 3'-ОН праймерного конца, представленного после первого цикла реакции. Чтобы ее измерить, инициировали новую полимеризацию путем добавления новой ОТ в присутствии 150 мкМ (160-кратная Кт) 6СТР и меченного тритием 6СТР, необходимого для конкуренции за любое ингибиторное действие оставшихся от первого цикла полимеризации ДНК 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин ТР и ббСТР. Доступность свободных 3'ОН на праймерном конце в оставшемся количестве праймер-матрицы, обеспечивающей дополнительную полимеризацию ДНК, измеряли и выражали в виде функции от времени предварительной инкубации (фиг. 10).

Со ссылкой на фиг. 9 и 10, хотя предполагали обеспечить одинаковую степень ингибирования ббСТР и 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметил ТР, наблюдали резкий контраст по их относительной способности поддерживать второй цикл катализируемой ОТ ВИЧ полимеризации ДНК. Предварительная инкубация с терминатором облигатной цепи, таким как ббСТР, является причиной обрыва цепи и дает существенное снижение свободных 3'-ОН праймерного конца по сравнению с трифосфатом соединения по изобретению. Если присутствовал ббСТР, во временных точках предварительной инкубации 10 и

- 19 011039 мин менее половины количества оставшихся 3'-ОН праймерного конца продолжали поддерживать дополнительное удлинение ДНК, по сравнению с трифосфатом соединения по изобретению, несмотря на то, что в первом цикле полимеризации ДНК применяли сравнимые количества ТР соединений. Это четко указывает на то, что включение ТР соединения по изобретению в появляющуюся нуклеиновую кислоту предоставляет сохраняющуюся возможность для некоторого дополнительного синтеза ДНК. Для того чтобы произошел следующий цикл синтеза, полимеризация ДНК должна включать в себя связывание фермента с матрицей, комплекса с соответствующим 6ΝΤΡ, образование фосфодиэфира, высвобождение пирофосфата и транслокацию фермента из Ν-участка в Р-участок. Таким образом, очевидно, что соединение по изобретению способно включаться и транслоцироваться ферментом в следующее положение, после которого прекращается дальнейшая элонгация.

Пример 4.

Включение 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин-монофосфата приводит к отличному профилю терминации цепи по сравнению с ббС.

Два аналога дезоксицитозина, обычный ΝΚΤΙ ббС, лишенный функции 3'-гидроксильной группы, и соединение по изобретению подвергали анализу терминации цепи ДНК, в котором удлинение ДНК проводили с одноцепочеченой матрицей ДНК М13тр18, предварительно отжигаемой с олигонуклеотидным праймером ДНК (прямая последовательность праймера 5'-6ΤΤΤΤСССА6ΤСАС6АС6ΤΤ6ΤА-3' (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:2), получали от Атегкйат ИК). Одноцепочечную РНК М13тр18 отжигали с данным олигонуклеотидным праймером ДНК, получая конечную концентрацию 1 мг/мл в буфере, содержащем 10 мМ ΤγΕНС1, рН 7,9 и 100 мМ №С1, и хранили в аликвотах при -20°С. Полимеризацию ДНК проводили с использованием этого отожженного праймера/матрицы, ОТ ВИЧ-1 и природных 6ΝΤΡ в реакции, инкубированной при 37°С в течение 25 мин. Реакцию останавливали добавлением останавливающего раствора, содержащего 95% формамида, 20 мМ ЭДТА, 0,05% бромфенолового синего и 0,05% ксилол-цианола ЕЕ (получены от И8В, Ипйеб 81а1е5 Вюсйет1са1 У1а Атегайат ИК). После денатурации продуктов ДНК фрагмент элонгированной ДНК подвергали электрофорезу в 8,0% полиакриламидном геле и визуализировали с использованием авторадиографии.

Анализ включал в себя отрицательный контроль (природные 6ΝΤΡ), два положительных контроля ббС^ ^ΟΓΡ, 8 мкМ от 81дта Сйет1са1, 8ΐ. Ьоищ, М188., И8А и 66ΟΓΡ, полученный от И8В 5ес.|иепсе кН ШШеб 81а1е5 Вюсйетка1 У1а Атегайат ИК). Использовали различные молекулярные соотношения трифосфата соединения по изобретению и природных 6ΝΤΡ. После реакции, проведенной как описано выше, фрагменты денатурированной ДНК из каждой отдельной реакции вносили в 8,0% полиакриламидный гель в следующей далее последовательности:

- отрицательный контроль

- первый положительный контроль 8 мкМ ббСТБ (получен от 8щта)

- 20 мкМ ТР по изобретению в 200 мкМ 6ΝΤΡ

- 30 мкМ ТР по изобретению в 300 мкМ 6ΝΤΡ

- 40 мкМ ТР по изобретению в 400 мкМ 6ΝΤΡ

- 50 мкМ ТР по изобретению в 500 мкМ 6ΝΤΡ

- 20 мкМ ТР по изобретению в 80 мкМ 6ΝΤΡ

- 40 мкМ ТР по изобретению в 80 мкМ 6ΝΤΡ

- пустая дорожка (без загрузки)

- второй положительный контроль 66ΟΤΡ (от И8В 5ес.|иепсе кй)

Для того чтобы устранить любой другой фактор, способный повлиять на интерпретацию результатов анализа, как, например, связанный с полиакриламидными гелями краевой эффект, в середину геля вносили второй набор образцов. На фиг. 11 показана цифровая фотография, изображающая результаты авторадиографии, полученные в центральной части геля.

1. Отрицательный контроль (6ΝΤΡ): не обнаружена остановка полимеризации ДНК.

2. Первый положительный контроль 8 мкМ 66ΟΤΡ: приводит к терминации цепи в ожидаемых участках 2',3'-дезоксидезоксицитозина.

3. 20 мкМ ТР по изобретению в 200 мкМ 6ΝΤΡ: приводит к терминации цепи в участке после/за участком 2',3'-дезоксидезоксицитозина.

4. 30 мкМ ТР по изобретению в 300 мкМ 6ΝΤΡ: приводит к терминации цепи в участке после участка 2',3'-дезоксидезоксицитозина по сравнению с ббСТБ.

5. 40 мкМ ТР по изобретению в 4 00 мкМ 6ΝΤΡ: приводит к терминации цепи в участке после участка 2',3'-дезоксидезоксицитозина по сравнению с ббСТБ.

6. 50 мкМ ТР по изобретению в 500 мкМ 6ΝΤΡ: не обнаружена специфичная остановка (профиль терминации цепи), но, как полагают, находится в пределах экспериментальной ошибки.

7. 20 мкМ ТР по изобретению в 80 мкМ 6ΝΤΡ: приводит к более выраженному действию терминации цепи между участками в участке после участка 2',3'-дезоксидезоксицитозина по сравнению с 66ΟΤΡ и выше экспериментального образца по изобретению.

8. 40 мкМ ТР по изобретению в 80 мкМ 6ΝΤΡ: приводит к более выраженному действию термина

- 20 011039 ции цепи между участками в участке после участка 2'.3'-дезоксидезоксицитозина по сравнению с ббСТР и выше экспериментального образца по изобретению.

9. Пустая дорожка (образец не вносили).

10. Второй положительный контроль ббСТР: приводит к терминации цепи в ожидаемых участках 2'.3'-дезоксидезоксицитозина.

Соединение по изобретению вызывало терминацию цепи ДНК во всех образцах. за исключением образца № 6. содержащего 50 мкМ ТР по изобретению в 500 мкМ бЫТР. Причина этого исключения не известна. но вероятна в пределах экспериментальной сшибки. Интересно. что фрагменты ДНК. возникающие в результате включения 2'.3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин-монофосфата. мигрируют более медленно. чем полученные в результате двух положительных контрольных терминированных ббСТР фрагментов ДНК (фиг. 11). Дублированные реакции демонстрируют постоянный профиль. предполагающий. что соединение по изобретению включается в только что синтезированную цепь ДНК и обеспечивает образование дополнительной 3'.5'-фосфодиэфирной связи в следующем цикле нуклеотидного включения. Хотя был обнаружен фрагмент длиннее на одно основание. нельзя исключать. что может играть роль последовательность использованной матрицы.

Пример 3 ясно показывает. что если применяют рибосомальную РНК матрицу. то 3'-ОН праймерный конец. предварительно терминированный соединением по изобретению. в большей степени обеспечивает дополнительное нуклеотидное включение. чем 3'-ОН праймерный конец. предварительно терминированный ббСТР. Эта особенность является причиной медленного движения при электрофорезе. и подразумевается. что ОТ подвергается транслокации. чтобы начать следующий цикл полимеризации.

Не желая ограничиваться данным механизмом. авторы полагают. что соединение по изобретению. таким образом. представляет новую стратегию в ингибировании удаляющих праймер мутантов. Оно представляет собой соединение. включающееся в растущий вирусный геном. при этом одновременно сохраняя способность позволять молекуле ОТ подвергаться необходимому трансформационному изменению. чтобы подготовиться к следующему циклу синтеза ДНК. Примеры 3 и 4 ясно продемонстрировали. что соединение по изобретению обладает такими свойствами и. таким образом. способно подавлять/препятствовать механизму резистентности с высвобождением праймера. как продемонстрировано в примерах 1 и 2.

8ага1тапо е1 а1. (2002 апб 2003) предоставляют очевидные экспериментальные данные. подтверждающие заключение. что реакция высвобождения праймера может происходить только до транслокации ОТ в следующее положение. Таким образом. для эффективного действия высвобождающего праймер мутанта претранслоцируемый комплекс является необходимым условием. Представленные в примерах результаты показывают. что для соединения и способов по настоящему изобретению это не является доказательством.

Пример 5.

Получение сложноэфирных высвобождающих 2'.3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин пролекарств.

Получение соединения 1.

3'-ΜΜΤΒ/5'-ΤΜΒΌ8. избирательно защищающий соединение 1. получали в виде соответствующего уридина. как описано у 8апдНу| е1 а1.: 8уп111е818 (1994) р. 1163 & Те1гаНебгоп Ье11 ν35 (1994) р. 4697 & Νυс1езо1бе8 & ШсЬоббех ν15 (1996) 1383. Замены и на С показаны у ΚΌζ^ν е1 а1. №1с1ео81бе8 & №1с1еоббе5. ν17 (1998) 2249.

Получение соединения 2.

- 21 011039

Соединение 1 (5,0 г, 6,7 ммоль) растворяли в 80% уксусной кислоте (30 мл) и перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре. Смесь упаривали и продукт очищали флэш-хроматографией с использованием от 5 до 10% МеОН в СН₂С1₂ в качестве элюента. Выход 2,1 г (64%).

Получение соединения 3.

Соединение 1 (2,3 г, 3,06 ммоль) в ТГФ (150 мл) обрабатывали фторидом тетрабутиламмония (1М в ТГФ, 3,0 мл) в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавляли бикарбонат натрия (насыщ., 100 мл) и экстрагировали смесь дихлорметаном (3x50 мл). Органический слой сушили и упаривали. Остаток очищали флэш-хроматографией с получением 1,3 г (82%) соединения 3.

Схема 2

з 9 10

Получение соединения 4.

Триэтиламин (0,4 55 г, 4,5 ммоль) и этилхлорформиат (0,26 г, 2,4 ммоль) добавляли к раствору Восвалина (0,49 г, 2,25 ммоль) в ТГФ (15 мл) при 0°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при той же температуре, а затем фильтровали в раствор соединения 2 (0,72 г, 1,5 ммоль) и ОМАР (0,55 г,

4,5 ммоль) в ТГФ (15 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. К смеси добавляли Е(ОАс и трижды промывали 2% лимонной кислотой и один раз насыщенным NаΗСОз. Органический слой сушили над №₂8О₄, фильтровали и упаривали. Остаток очищали флэшхроматографией с использованием в качестве элюента 2-5% МеОН в СН₂С1₂, получая 0,35 г (34%) соединения 4.

Получение соединения 5.

Соединение 4 (30 мг, 0,066 ммоль) растворяли в концентрированной НС1 (1 мл) при комнатной температуре и перемешивали в течение 5 мин. К раствору добавляли ацетон и упаривали. Снова добавляли ацетон и раствор упаривали и сушили в вакууме с получением 18 мг (69%) соединения 5.

Получение соединения 6.

Соединение 4 (0,35 г, 0,5 ммоль) растворяли в ТГФ (20 мл) и добавляли 1,0М фторид тетрабути

- 22 011039 ламмония в ТГФ (0,5 мл, 0,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 суток при комнатной температуре. Смесь упаривали и продукт очищали флэш-хроматографией с использованием в качестве элюента 5-10% МеОН в СН₂С1₂, получая 0,225 г (98%) соединения 6.

Получение соединения 7.

Синтез проводили в тех же условиях, что и для соединения 4, с использованием в качестве исходного вещества соединения 6.

Получение соединения 8.

Соединение 7 (75 мг, 0,114 ммоль) растворяли в 3 мл МеОН и при 0°С добавляли концентрированную НС1 (0,5 мл). Смесь перемешивали в течение 5 мин при 0°С и в течение 3 мин при комнатной температуре и после этого упаривали. К остатку добавляли ацетон и упаривали. Добавляли СН2С12 и остаток упаривали и сушили в вакууме с получением 58 мг (96%) соединения 8.

Получение соединения 9.

Этилхлорформиат (110 мг, 1,0 ммоль) добавляли к раствору Вос-валина (220 мг, 1,0 ммоль) и триэтиламина (200 мг, 2,0 ммоль) в ТГФ (30 мл) при 0°С и перемешивали смесь в течение 3 ч. Температуре давали достичь комнатной температуры и фильтровали смесь. Фильтрат добавляли к раствору соединения 3 (350 мг, 0,68 ммоль) и ΌΜΑΡ (244 мг, 2,0 ммоль) в ТГФ (20 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре, к смеси добавляли этилацетат (100 мл) и промывали лимонной кислотой (10%, 2x30 мл) и бикарбонатом натрия (насыщ., 30 мл). Растворитель удаляли и продукт разделяли на колонке с силикагелем, получая соединение 9 (220 мг, 45%).

Получение соединения 10.

Соединение 9 (200 мг, 0,28 ммоль) растворяли в 3 мл концентрированной НС1 и перемешивали в течение 3 мин при комнатной температуре. Смесь упаривали, промывали ацетоном, ацетонитрилом и диэтиловым эфиром и сушили в вакууме с получением 85 мг (77%) соединения 10.

Получение соединения 11.

Этилхлорформиат (110 мг, 1,0 ммоль) добавляли к раствору Вос-валил-молочная кислота (290 мг, 1,0 ммоль) и триэтиламина (200 мг, 2,0 ммоль) в ТГФ (30 мл) при 0°С и перемешивали смесь в течение 3 ч при 0°С. Давали температуре достичь комнатной температуры. Смесь фильтровали и добавляли фильтрат к раствору соединения 3 (300 мг, 0,58 ммоль) и ΌΜΑΡ (24 4 мг, 2,0 ммоль) в ТГФ (20 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре, к смеси добавляли этилацетат (100 мл) и промывали лимонной кислотой (10%, 2x30 мл) и бикарбонатом натрия (насыщ., 30 мл). Растворитель удаляли и продукт разделяли на колонке с силикагелем, получая соединение 11 (250 мг, 38%).

Получение соединения 12.

Соединение получали из соединения 11 в тех же условиях, что и соединение 8.

Получение соединения 13.

Соединение получали из соединения 2 в тех же условиях, что и соединение 4, с использованием в качестве исходного вещества Вос-валил-молочной кислоты вместо Вос-валина.

Получение соединения 14.

Проводили синтез из соединения 13, как для соединения 10.

Получение соединения 15.

Соединение 1 (1 г, 1,33 ммоль) растворяли в 14 мл концентрированной НС1 и перемешивали смесь в течение 8 мин при комнатной температуре и затем упаривали. Остаток промывали ацетоном и фильтровали с получением 334 мг (90%) соединения 15.

Получение соединения 16.

Триэтиламин (0,487 г, 4,82 ммоль) и этилхлорформиат (0,30 г, 2,77 ммоль) добавляли к раствору Вос-валин-молочная кислота (0,77 г, 2,65 ммоль) в ТГФ (30 мл) при 0°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при той же температуре и затем фильтровали в раствор соединения 15 (0,334 г, 1,20 ммоль) и ΌΜΑΡ (0,74 г, 6,0 ммоль) в ТГФ (30 мл) и ДМФА (30 мл). Смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. К смеси добавляли Е1ОЛе и трижды промывали 2% лимонной кислотой и один раз насыщенным NаНСОз. Органический слой сушили над №₂8О₄, фильтровали и упаривали. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией с использованием в качестве элюента 2-5% МеОН в СН2С12, получая только 65 мг (8%) соединения 16.

- 23 011039

Схема 3

Получение соединения 17.

Синтез осуществляли из соединения 16, как для соединения 8.

Получение соединения 18.

Валерилхлорид (460 мг, 3,8 ммоль) добавляли к раствору валериановой кислоты (390 мг, 3,8 ммоль) и триэтиламина (770 мг, 7,6 ммоль) в ТГФ (50 мл) при 0°С и перемешивали смесь в течение 3 ч, а затем фильтровали. Фильтрат добавляли к раствору соединения 3 (1,3 г, 2,53 ммоль) и ΌΜΑΡ (930 мг,

7,6 ммоль) в ТГФ (50 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. К смеси добавляли лимонную кислоту (10%, 50 мл) и экстрагировали этилацетатом (2x50 мл). Объединенный органический слой промывали лимонной кислотой (10%, 30 мл), а затем бикарбонатом натрия (50 мл) и насыщенным раствором соли (50 мл). После высушивания удаляли органический слой и остаток разделяли на колонке с силикагелем, получая соединение 18 (850 мг, 56%).

Получение соединения 19.

Соединение 18 (850 мг, 1,42 ммоль) растворяли в метаноле (10 мл), и при 0°С к раствору добавляли концентрированную НС1 (1,5 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 0,5 ч. К смеси добавляли

- 24 011039 карбонат натрия (50 мл) и экстрагировали дихлорметаном (3x50 мл). Растворитель удаляли и продукт разделяли на колонке с силикагелем, получая соединение 19 (230 мг, 50%).

Получение соединения 20.

Синтез осуществляли из соединения 19, как для соединения 9.

Получение соединения 21.

Синтез осуществляли из соединения 20, как для соединения 8.

Получение соединения 22.

Синтез осуществляли из соединения 19, как для соединения 18.

Схема 4

Получение соединения 23.

Соединение 2 (1,02 г, 2,1 ммоль) и ОМАР (1,05 г, 8,61 ммоль) растворяли в ТГФ (35 мл) и охлаждали до -78°С. В течение 15 мин добавляли валерилхлорид (6x42 мкл, 2,14 ммоль). Смесь перемешивали при низкой температуре в течение 2 ч, а затем 1 ч без охлаждающей бани. Реакционную смесь вливали в 5% лимонную кислоту и затем экстрагировали ЕЮАс. Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором соли, сушили над №ь8О₄ и упаривали с получением сухого вещества белого цвета, которое очищали на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента 0-6% МеОН в СН₂С1₂, с получением 0,31 г (25%) соединения 23.

- 25 011039

Получение соединения 24.

Соединение 23 (0,35 г, 0,58 ммоль) растворяли в ТГФ (20 мл), добавляли 1М ΊΈΑΓ в ТГФ (0,58 мл, 0,58 ммоль) и перемешивали смесь в течение 90 мин при комнатной температуре. Растворитель упаривали и остаток очищали флэш-хроматографией с использованием в качестве элюента 0-10% МеОН в СН₂С1₂, получая 166 мг (92%) соединения 24.

Получение соединения 25.

Синтез осуществляли из соединения 24, как для соединения 4.

Получение соединения 26.

Синтез осуществляли из соединения 25, как для соединения 8.

Пример 6.

Высвобождение 2',3'-дидезокси-3'-С-гидрометилцитозина из пролекарств.

Утверждение, что пролекарства по изобретению полностью превращаются в активное исходное соединение 2',3'-дидезокси-3'-С-гидрометилцитозин, можно оценить мониторингом появления исходного соединения в объединенной человеческой плазме, 37°С, меченной 5 мкМ пролекарства.

Соединение	К.	К’	Концентрация исходного вещества, мкМ
			0 мин	5 мин	20 мин
	Н	Е-валил	0	0,4	1,0
	Ь-валил	Н	0,2	0,4	1,2
	Ь-валил	Ь-валил1	0,1	0,2	0,3
12	Ь-вал-Ь-лактил	Н	5,6	5,4	5,4

14	Н	Ь-вал-Ь-лактил	4,6	4,5	4,6
17	Ь-вал-Ь-лактил	Ь-вал-Ь-лактил	3,6	4,2	4,3
19	пентаноил	Н	5,3	5,1	4,9
22	пентаноил	пентаноил	4,2	4,0	4,5
24	н	пентаноил	3,9	4,2	4,4

Пример 7.

Биодоступность пролекарств.

Пролекарства обычно смешивали в высокоочищенной воде Мр до концентрации 3 мг/мл и перорально вводили интубацией двум крысам. Приемлемая доза составляет 5 мг/кг. В приемлемые моменты времени, как, например, 0, 15 и 30 мин, 1, 2, 4 и 6 ч забирали образцы плазмы. Выход в плазме (в виде метаболита 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметил-в-О-эритропентофуранозилцитозина) измеряли при помощи масс-спектрометрии, определяли как натриевый аддукт с т/ζ (отношение массы к заряду) 264 (М+Иа)+.

Результаты изображены в виде концентрации плазмы в зависимости от времени и в большинстве случаев показывают Стах порядка от 3 до 5 мкМ. Абсолютную биодоступность %Р вычисляли в стандартных условиях, т.е. исходя из клиренса дозы исходного вещества ίη νίίτο, как показано в XVО 97/30051.

Так как крыс нельзя инфицировать ВИЧ, невозможно непосредственно измерить антиретровирусную активность такой пероральной композиции, но следует заметить, что для метаболита 2',3'-дидезокси3'-С-гидроксиметил-в-О-эритропентофуранозилцитозина ΕΌ₅₀ в человеческих клетках Н9 обычно составляет приблизительно 0,01 мкМ. Это, в свою очередь, означает, что порядок наблюдаемых пиковых концентраций плазмы данных пролекарств в несколько сотен раз выше ΕΌ₅₀. Другие фармацевтические параметры, такие как ΑυΓ и клиренс, обычно соответствуют достижению 24-часового провала концентрации со значительно более высокой ΕΌ₅₀ при ΡΌ или ВШ введении доз.

Каждый патент и процитированные в тексте научные ссылки перечислены ниже и, таким образом, в полном объеме включены сюда в качестве ссылки.

Ссылки

ВпдШе Μοпίек аиб МюНе1 Зе^Ыу (2002) ΡϊΌναΚηςχ οΓ (Не тиίаί^οпа1 ра((ет Ε44Ό/Α алб/οτ ν118Ι ίη (Не геуегхе (гаикспр(аке (ΡΤ) депе οΓ ΗΙν-1 ίη ге1а(юп ίο 1геа1теи1 \\ύ1ι шс^абе апа^дие ВΤ ίηΗίΗίΙοτδ. ί Меб νίτοί. 66 (3) :299-303.

Вοуе^ Ρ.Ε., ^атюЫ Τ., 8агаПагюк 8.С., Αγπο16 Ε., НидНек 8.Η. (2004) ΕίϊεΛδ οΓ (Не Эе11а67 оттр1ех οΓ ти(а(^οпк ίπ Нитап ίιηιηιπκ^Γί^ικ\· νίπΐδ (у ре 1 геуегке (гапкспр(аке οπ ηικΚοκ^ апа^д ехакюп. ί νίτο1. 78(18):9987-9997.

βολΌΓ ΡΒ., 8агаПагюк 8.С., Αγπο16 Ε., НидНек 8.Η. (2002) Иис^^е апа^д гек1к(апсе саикеб Ьу ткегίίοπκ ίπ (Не Дпдегк οΓ Нитап ^ттипοбеΓ^с^епсу νίιυκ (уре 1 геуегке (гапкспр(аке ίηνοΗΌΚ ΑΤΡ-теб^аίеб ехсГ кюп. 76(18):9143-9151.

С1гоиагб М., Οίη11ο Κ., МагсНаиб В., МсСют-иск 8. апб Ρο^ М. (2003) Ми(а(юпк Ε44Ό аиб ν118Ι ίπ (Не геуегке (гаикспр(аке οΓ НЕМ р1ау б1к(тс( тесНаткбс га1ек ίπ биа1 гек1к(аисе ίο ΑΖΤ аиб 3ТС. ί Вю1 СНет: 5;278(36):34403-34410.

Ρ.Ρ. Натдаи, С. 8йпе, Ρ. ΟπΓΓίη, Ι. Иа_)ега, 8. В^г, 8. Кетр, М. Икба^, В. Ьагбег, апб (Не СNΑ 2001 Нтх-'екНдайх'е Сгоир (2000) Век1к(аисе ргоП1е οΓ (Не Нитап ^ттипοбеΓ^с^епсу у!гнк (уре 1 ^еνе^ке (гапкспр(аке

- 26 011039 шЫЬйог аЬасас1г (1592И89) айег топоЛегару апб сотЬтабоп Легару. 1. Шес!. Όίδ. 181:912-920.

Т. ТшатсЫ, Т. БтНа, Η. ТшатсЫ, Υ.-Μ. ΖНапд, Ι.Α. Ме!са1Г, 1. Ра11ооп, апб Н.С. Ьапе. 2000. Н1дН1есе1 гех1х!апсе !о 3'^1бо-3'-беохуЛут1Лпе бие !о а бекбоп ίη (Не гесегхе бипхспр!ахе депе оГ Нитам 1ттипобеГккпсу ст.1х !уре 1. I. У1го1. 74:1023-1028.

ТбтаткЫ, МА МигрНу, Η. [таписНН апб Н.С. Ьапе. 2001. Αт^ηο ас1б бе1е(^οη а! со6оп 67 апб ΤΗγ!о-61у сНапде а! собоп 69 оГ Нитап питипобеПскпсу стих !уре 1 гесегхе !гапхсбр!ахе сопГег посе1 бгид гех1х!ап! ргоГбех. I. У1го1. 75:3988-3992.

Α. .ТасоЬо-МоНпа, 1 Όίη§, К. 6. Мити Α.Ό. С1агк, 1г., X. Ьи, С. Τаη(^11ο, К.Ь. Аббатх, 6. Катег, ΑΑ. Ретх, Ρ. С1агк, апб Е. Αγ^Η (1993) Сгух!а1 х!гис!иге оГ Нитап 1ттипобеГккпсу стих !уре 1 гесегхе 1гапхспр!ахе сотр1ехеб \сбН боиЬ1е-х!гапбеб ΌΝΑ а! 3.0 Α гехокбоп хНо\сх Ьеп! ΌΝΑ. Ргос. №111. Αсаб. 8ск υδΑ 90:6320-6324.

δ.Ό. Кетр, С. 8Ηί, δ. В1оог, Р.К. Натдап, 1. А. Ме11огх, апб Β.Α. Ьагбег. 1998. Α посе1 ро1утогрН1хт а! собоп 333 оГ Нитап 1ттипобеГккпсу стих !уре 1 гесегхе !гапхспр!ахе сап Гасббак биа1 гех1х1апсе (о ζίбоуибте апб Ь-2',3'-б1беоху-3'-Л1асуббте. к У1го1. 72:5093-509.

Β.Α. Ьагбег, Кетр δ.Ό. (1989) Ми1бр1е ти!абопх ίη НГУ-1 гесегхе !гапхспр!ахе сопГег кдН-1есе1 гех1х!апсе !о ζ^бονиб^ηе (ΑΖΤ). δ^ι^. 1;246(4934):1155-1158.

Β.Α. Ьагбег, δ. В1оог, δ.Ό. Кетр, К. Небодх, К.Ь. Ьехтек V. МШег, М. δ!и^те^, δ. δ!ахζеуχк^, ί. Кеп, Ό.Κ. δ!атте^х. Ό.Ι. δΙπηΓΐ, апб К. Раи\се1х. 1999. Α Гатбс оГ тхегбоп ти!абопх Ье!\сееп собопх 67 апб 7 0 оГ Нитап 1ттипобеГккпсу утих !уре 1 гесегхе !гапхспр!ахе сопГег ти1бпис1еох1бе апа1од гех1х!апсе. ΑηΐίιιιкгоЬ Αдеηΐх СНетоЛег. 43:1961-1967.

V. М111ег, Α. РНбШрх, С. Кобтапп, δ. δ!ахζе\схк^. К. Раиуе1х, К. Небодх, М.Р. Ье ВеЛипе, δ.Ό. Кетр, δ. В1оог, Р.К. Натдап, апб ВА. Ьагбег. 1998. Όηη1 гех1х!апсе !о ζ^бονиб^ηе (ΖΌν) апб 1атгсибте (3Τί’) ίη ра11еп1х !геа!еб \сбН ΖΌν/3Τί’ сотЫпабоп Легару: аххотабоп \сбН Легару Га11иге. I Ыеск О1х. 177:15211532.

Α. Мах, М. Рагега, С. Впопех, V. δο^^аπο, МА. Магбг^, Е. Ооттдо, апб Ь. Мепе Γ^ζ-ΑΛ^. 2000. Ко1е оГ а б1рер11бе тхегбоп Ье!\сееп собопх 69 апб 70 оГ ΗΙν-1 гесегхе !гапхспр!ахе ίη !Не тесНашхт оГ ΑΖΤ гех1х!апсе. ЕМВО I. 21:5752-5761.

Меуег Р.К., Ма!хиига δ.Ε., ^кп Α.Α., РГегГег Ι., δο Α.6., Ме11огх ЬА., δ^6 Α.Α. (2002) ЕГГес!х оГ хресШс ζ^бονиб^ηе гех1х!апсе ти!абопх апб хиЬх!га!е х!гис!иге оп пискоббе-берепбеп! рптег ипЫосктд Ьу Нитап 1ттипобеГккпсу сбпх !уре 1 гесегхе !гапхспр!ахе Αη!^т^с^οЬ Αдеηΐх СНетоЛег. 46(5):1540-1545.

Меуег Р.К., Ьеппегх!гапб Л Ма!хиига δΕ., Ьагбег ВА., 8соб Α.Α. (2003) ЕГГес!х оГ 01рер11бе ЛхегНопх Ьебсееп Собопх 69 апб 70 оГ Нитап IттиηοбеГ^с^еηсу νίπ^ Τуρе 1 Кесегхе Τ^аηхс^^ρίахе оп Рптег ипЫосктд, Оеохуппс1еох1бе ^рНохрЫк IηН^Ь^ί^οη, апб ΌΝΑ СНат Екпдабоп. ί ^го1. 77(6):3871-3877.

V. М111ег, М. Α^!-ΚНакб, С. 81опе, Р. 6пГГт, Ό. Меход1б, Α. Си1ге11, К. Натдап, δ. δίахζеуχк^, С. Ка!1ата, 6. Реагсе, апб М. Лхбак (2000) НШ-1 гесегхе !гапхсбр!ахе (КЕ) депо!уре апб хихсербЬббс !о ΡΤ ίηкЬбогх бпппд аЬасасп топоЛегару апб сотЫпабоп Легару. ΑΙΌδ 14:912-920.

Магсебп Α.6., Ое1аидегге С., А1гбеп М., V^едах Р., δ^тοη Α., Кабата С. апб Са1νеζ V. (2004) ΤНут^б^ηе апа1одие гесегхе !гапхспр!ахе шЫЬбогх гех1х!апсе тШабопх ргойкх апб аххотабоп !о оЛег пис1еох1бе гесегхе !гапхспр!ахе ббпЬбогх гех1х!апсе тШабопх оЬхегсеб ίη Ле соп!ех! оГ с1го1одка1 Габиге. ί Меб ^го1. 72 (1) :162-165.

ЬЬ. Магбп, ЬЕ. А11хоп, К.Ь. Наупех, апб РА. Еигтап (1993) МесНатхт оГ гех1х!апсе оГ Нитап 1ттипобеГккпсу снпх !уре 1 !о 2',3'-б1беохутохте. Ргос. №111. Αсаб. δά. υδΑ 90:6135-6139.

Мбхиуа Н., Υ^^ιγ К. апб Вгобег δ. (1990) Мо1еси1аг !агде!х Гог ΑΙΌδ Легару. δ^ι^ 249: 15331544.

Ме1Ьу Τ., Το^(е11 δ., ЛюгЬогп Ό., е! а1. (2001) Лте !о арреагапсе оГ NΚΤI-аххοс^а!еб тШабопх апб гехропхе !о хпЬхес.|иеп1 Легару Гог раНеп1х оп ГаЛпд ΑΒС/СОΜ. Ιη: Ргодгат апб аЬх(гас(х оГ Ле 8Л СопГегепсе оп Ке!гостихех апб Орробптхбс [ηГес(^οηх; РеЬгиагу 4-8, 2001; СЫсадо. ΑΛ^πΑ 448.

Ν-аедег Ь.К., Магдо! Ν.Α., Шхке δ., δа^аГ^аηοх δ.6., Αγ^Λ Е., МШег М.б. (2001) Сотрапхоп оГ пис1еох1бе апб пискоббе гесегхе !гапхспр!ахе тЫЬбог гетоса1 Ьу Ле абепохте !прНохрНа!е-берепбеп! сНат!егт1па!ог гетоса1 тесНашхт. Ргехеп!еб а! Ле 5Л Iηктаύοηа1 АогкхНор оп НА Огид Кех1х!апсе & ^ηΐтеп! δί^аΐед^ех Απι^с^^ ΤНе^:6(хиρρ1 :):39. Α^ΰηΛ 48.

РапкН и. (а), КооШх Ό., Наттопб I, е! а1. (2003) К65К: а ти1бпис1еох1бе гех1х!:апсе тШабоп оГ 1о\у Ьи! тсгеахтд Ггециепсу. 12Л [п!е^па!^οпа1 НА Огид Кех1х!апсе АогкхНор: Вахт Ргттркх & С1шка1 Iтρ1^сабопх; Αп!^с^^ Ήκγ. 2003;8:δ152. ΑΛΕιΑ 136.

РапкН υ. (Ь), КоопР Ό., δ1и^х-С^ете^ Ν., е! а1. К65К: а ти1бпис1еох1бе гех1х!апсе ти!абоп оГ тсгеахтд ргесакпсе ехЫЬйх Ы-бтесбопа1 рНепо!урк ап!адошхт уйН ТАМ. Ргодгат апб аЬх!гас!х оГ Ле 11Л СопГегепсе оп Ке!гост.1хех апб ОррогШтхбс [пГес!^οпх; РеЬгиагу 8-11, 2004; δаη Ргаптхсо, СаИГогша. ΑΛΕιΑ 54.

Кеагбоп, ЬЕ. (1993) Нитап 1ттипобеГккпсу сбпх гесегхе !гапхспр!ахе. Α к1пе!1с апа1ух1х оГ ΕΝΑберепбеп! апб ΌΝΑ-берепбеп! ΌΝΑ ρο1уте^^ζа!^οη. Ь Вю1. СНет. 268:8743-8751.

δ!ηηικΓ М., δ!ахζе\уχк^ δ., Ооегг Н.А., Ьагбег В., В1оог δ., Небодх К. (2003) Согге1а!юп оГ РНепо!урк Ζ^бονиб^ηе Кех1х!апсе У!Н Мп!абопа1 Рабетх ίη Ле Кесегхе Л-апхспрЫхе оГ Нитап IттиηοбеГ^с^еηсу VI

- 27 011039 гик Туре 1: 1п1сгргс(а(1оп оГ Ек1аЬ11кЬсб МШабопк апб С11агас1спха1юп оГ Νο\ν Ро1утогрЫктк а! Собопк 208, 211, апб 214. АпйткгоЬ Адсп1к СЬстоИсг; 47(1):54-61.

8!. С1аи, М.В., ЕЬ. Майт, 6. Тибог-А1Шатк, М.С. ВасЬ, С.Ь. νανίΌ, Ό.Μ. Ктд, Р. Кс11ат, 8.Ό. Кстр, апб В.А. Ьагбсг (1991) Иск1к1апсс (о бб1 апб кспкШуку !о ΑΖΤ шбиссб Ьу а тШабоп т Ηΐν-1. 8с1спсс 253:1557-1559.

8с1ипа/1 Ε.Ρ., Ьагбсг В.А. апб Мс11огк 1.А. (2000) МШабопк ш гс1го\'ка1 дспс аккоаа1сб \\П11 бгид гс8181апсс: 2000-2001 ирба!с. Ιη!. Ап!Мг. №\\ъ 8:65-91.

81шк-Сгстсг, Ν., Ό. Апоп, апб М.А. Рагшак. (2000) Мо1сси1аг тссЬашктк оГ Ηΐν-1 гс8181апсс (о пис1сок1бс гсусгкс 1гапкспр1акс шЫЬйогк (ЯК/Пк). Сс11. Мо1. Ь1Гс 8сг 57:1408-1422.

8агайапок 8.6., С1агк А.Ь. 1г., Ьак К., Тиккс 8., Впк!сй ЕЕ, 11апкитагап Р., ЙатскЬа А.Й., 8аусг 1.М., 1сппа Э.М., Воусг Р.Ь., НидЬск 8.Н., Ато1б Е. (2002) 81гис1игск оГ Ηΐν-1 гсусгкс 1гапкспр1акс \\Ь11 ргс- апб рок1-1гапк1осабоп ΑΖΤΜΡ-ΐс^т^ηаΐсб ОЫА ЕМВО I. 2002 Осс 2;21(23) :6614-24.

8агайапок 8.6., С1агк А.Ь. 1г., Тиккс 8, 8с|икс С.Ь, Ьак К., 8Ьспд Ό., 11апкитагап Р., ЙатскЬа А.Й., Кго111 Н., 8аусг ЕМ., 1сг1па Э.М., Воусг Р.Ь., НидЬск 8.Н., Ато1б Е. (2003) Тгарршд Ηΐν-1 гсусгкс 1гапкспр1акс ЬсГоге апб айсг 1гапк1осайоп оп ОЫА. I Вю1 СЬст. 2;278(18):16280-16288. ЕриЬ 2003 1ап 28.

Т1кба1с М., А1пабаГ Т., апб Соикспк Ό. (1997) СотЬтабоп оГ тШабопк ίη Ьитап 1ттипобсйс1спсу νίгик !урс 1 гс\'сгкс 1гапкспр1акс гсс.|шгсб Гог гск1к1апсс (о Ис сагЬосусЬс пис1сок1бс 1592И89. АпбтюгоЬ Адсп!к СЬстоЛсг. 41:10941098.

Υηΐιί Ν., Тата1с( С., Тоиггск С., (1999) МШаЬоп райстк оГ 11с ютсгкс 1гапкспр1акс апб рго1сакс дспск ίη Ьитап 1ттипобсйс1спсу \'йик !урс 1-тГсс1сб райсШк ипбсгдотд сотЫпайоп Исгару: кшусу оГ 787 кссщспсск. I С1ш М1сгоЫо1. 37:4099-4106.

Vа1с^ Ь., Магйп-СагЬопсго Ь., Согга1 А., Мспбоха С.Ь., 8опапо V. (2004) Ргсб1с!огк оГ кс1ссйоп оГ К65Й: 1споГо\'й икс апб 1аск оГ ТАМк. Ап!Мг ТЬсг. 2004; 9:846.

По всему описанию и в следующей далее формуле изобретения, если смысл не подразумевает другого значения, следует понимать, что слово содержат и варианты, такие как включает в себя и включающий в себя, подразумевают включение указанного целого числа, стадии, группы целых чисел или группы стадий, но не исключение любого другого целого числа, стадии, группы целых чисел или группы стадий.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина или его пролекарства, высвобождающего ίη νί\Ό 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин или его 5'-монофосфат, или его соли для получения лекарственного средства для лечения ВИЧ-инфекции, где обратная транскриптаза ВИЧ несет по меньшей мере одну мутацию, обеспечивающую удаление терминирующего облигатную цепь нуклеозид- или нуклеотидфосфата из возникающей цепи ДНК путем опосредованного АТФ или пирофосфатом удаления.
2. Применение по п.1, где обратная транскриптаза несет по меньшей мере один из следующих генотипических профилей:

(a) М41, +ϋ67, Ь210 и Т215;

(b) Р67, К70 и К219;

(c) Т695-ХХ; или (ά) А67 (делеция в 67).
3. Применение по п.2, где генотипический профиль М41, ±Ώ67, Ь210 и Т215 включает в себя М41Ь, ±Ο67Ν, 1.210А и Ί^Υ/Ρ.
4. Применение по п.2 или 3, где генотипический профиль дополнительно включает в себя по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении Е44, К70, ν118, Н208, Й211К, Ь214, К219 или 6333.
5. Применение по п.2 или 3, где генетический профиль дополнительно включает в себя по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении Т69, Е203, Ь210, Ό218, Н221, Ό223 или Ь228.
6. Применение по п.2, где генетический профиль Ό67, К70 и К219 включает в себя Ό67Ν, К70Й и К2196/Е.
7. Применение по п.2 или 6, где генетический профиль Ό67, К70 и К219 дополнительно включает в себя по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении М41, Е44, ν118, Н208, Й211К, Ь214, Т215, К219 или 6333.
8. Применение по п.2 или 6, где генетический профиль Ό67, К70 и К219 дополнительно включает в себя по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении *67, уду Е203, Ь210, 0218. Н221, Ό223 или Ь228.
9. Применение по п.2, где генетический профиль Т698-ХХ дополнительно включает в себя по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении М41, Е44, Ό67, К70, ν118, Н208, Ь210, Й211К, Ь214, Т215, К219 или 6333.

- 28 011039
10. Применение по п.2, где генетический профиль Τ698-ΧΧ дополнительно включает в себя по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении < Т69, Е203, Ь210, 0218. Н221, 0223 или Ь228.
11. Применение по и.2, где генетический профиль ±67 дополнительно включает в себя по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении М41, Е44, Ό67, К70, У118, Н208, Ь210, К211К, Ь214, Т215, К219 или 0333.
12. Применение по п.2, где генетический профиль ±67 дополнительно включает в себя по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении Т69, Τ698+ΧΧ, Е203, Ь210, Ό218, Н221, Ό223 или Ь228.
13. Применение по любому из пп.2, 3 или 6, где обратная транскриптаза дополнительно несет по меньшей мере одну характерную мутацию в положении К65 или Ь74 или М184 или 0151.
14. Применение по п.13, где характерная мутация представляет собой К65К или Ь74У или М184У или Р151М.
15. Применение по п.13 или 14, где характерная мутация дополнительно включает в себя по меньшей мере одну дополнительную мутацию в положении А62, У75, Р77, Υ115 или Р116.
16. Применение по любому из пп.1-15, где 5'-(2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин)монофосфат включается в возникающую цепь ДНК, в результате чего один остаток, выбранный из природных нуклеотидов, монофосфатных нуклеозидных аналогов (включая 5'-(2',3'-дидезокси-3'-Сгидроксиметилцитозин)монофосфат) и фосфатных нуклеотидных аналогов ковалентно присоединяется к включенному 5'-(2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин)монофосфату, индуцируя, таким образом, терминацию цепи.
17. Применение по любому из пп.1-16, где соединение в лекарственном средстве представляет собой 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин или его фармацевтически приемлемую соль.
18. Применение по любому из пп.1-16, где включенное в лекарственное средство соединение представляет собой пролекарство формулы р'—о где один из Κ и К' представляет собой часть пролекарства с частичной структурой о

Н1 где К¹ представляет собой Н или С₁-С₁₈ неразветвленный или разветвленный алкил;

К² представляет собой Н или ИНК³;

К³ представляет собой Н или Ь-валиловый или Ь-изолейциловый сложный эфир;

а оставшийся из К и К' представляет собой Н или идентичную часть пролекарства;

или его фармацевтически приемлемую соль.
19. Применение по п.18, где

К¹ представляет собой С₁-С₁₈ неразветвленную или разветвленную алифатическую цепь и К² представляет собой Н;

К¹ представляет собой метил и К² представляет собой ПН-Ь-валил или ПН-Ь-изолейцил;

К¹ представляет собой С3-С4 разветвленную алифатическую цепь и К² представляет собой Ν42;

или его фармацевтически приемлемую соль.
20. Применение по п.19, где один или оба из К и К' представляют собой Ь-валил-Ь-лактил-, Ь-валил- или С₁-С₆ алканоил-.
21. Применение по п.20, где соединение обозначает 5'-О-[2-8-(Ь-валилокси)пропионил]-2'-3'-дидезокси-3-С-гидроксиметилцитозин; 2',3'-дидезокси-3'-С-[2-8-(Ь-валилокси)пропионил]оксиметилцитозин; 5'-О-пентаноил-2'-3'-дидезокси-3-С-гидроксиметилцитозин;

2',3'-дидезокси-3'-С-пентаноилоксиметилцитозин или 5'-О-пентаноил-2'-3'-дидезокси-3-С-пентаноилоксиметилцитозин;

или их фармацевтически приемлемые соли.
22. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство дополнительно включает в себя по меньшей мере один терминатор цепи ΝΒΤΙ, в результате чего одновременное или последовательное введение указанного 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина, или его соли, или его пролекарства и указанного терминатора цепи предназначено для ингибирования появления или распространения мутантов ВИЧ у инфицированного ВИЧ индивидуума, где указанные мутанты способны удалять указанный терминирующий цепь нуклеотид ΝΒΤΙ, включенный в комплекс праймер/матрица

- 29 011039

ВИЧ, удаление, обеспечиваемое механизмом удаления, зависимым от АТФ или пирофосфата.
23. Применение по п.22, где терминирующий цепь ΝΚΤΙ выбирают из группы, состоящей из зидовудина (ΑΖΤ, Ζϋν), ставудина (б4Т), зальцитабина (ббС), диданозина (66Ι), абакавира, (АВС), ламивудина (3ТС), эмтрицитабина (ЕТС), адефовира (Αϋν), энтакавира (ВМ8 200475), аловудина (ΕΕΤ), дизопроксилфумарата тенофовира (ΤΝΕ), амдоксавира (ΒΑΡΏ), О-64ЕС (ЭРС-817), -6ОТС (8ΡΏ754), 8ΡΏ756, рацивира, ϋ-ЕПОС и 087340.
24. Применение по п.23, где терминирующий цепь ΝΚΤΙ выбирают из группы, состоящей из зидовудина, ставудина, диданозина, ламивудина, абакавира, тенофовира, эмтрицитабина и их сочетаний.
25. Применение по п.23, где терминирующий цепь ΝΚΤΙ представляет собой зидовудин, ламивудин или комбинированные лекарственные формы комбивир или тризивир; ламивудин, абакавир или комбинированную лекарственную форму эпзиком; тенофовир, эмтрицитабин или комбинированную лекарственную форму трувада.
26. Применение по любому из предшествующих пунктов, где 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин вводят в диапазоне от 0,05 до 0,5 мг/кг/сутки.
27. Применение по п.26, где 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин вводят в дозе менее 0,1 мг/кг/сутки.
28. Способ лечения пациента с ВИЧ, где обратная транскриптаза ВИЧ несет по меньшей мере одну высвобождающую праймер мутацию, обеспечивающую удаление терминирующего облигатную цепь нуклеозид- или нуклеотидфосфата из возникающей цепи ДНК при помощи опосредованного АТФ или пирофосфатом удаления, где способ включает в себя введение пациенту эффективного количества 2',3'дидезокси-3'-гидроксиметилцитозина или его пролекарства, высвобождающего ΐη νΐνο 2',3'-дидезокси-3'С-гидроксиметилцитозин или его 5'-монофосфат, или его соли.
29. Способ ингибирования появления или распространения высвобождающих праймер мутантов ВИЧ, способных удалять терминирующий цепь нуклеотид ΝΚΤΙ, включенный в комплекс ВИЧ праймер/матрица, где удаление осуществляется зависимым от АТФ или пирофосфата механизмом удаления, где способ включает в себя одновременное или последовательное введение инфицированному ВИЧ индивидууму эффективного количества 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозина или его пролекарства, высвобождающего 2',3'-дидезокси-3'-С-гидроксиметилцитозин или его 5'-монофосфат ΐη νΐνο, или его соли и по меньшей мере одного терминатора цепи ΝΚΤΙ, индуцирующего высвобождающие праймер мутанты.