DE102016222032A1 - Mikrofluidische Vorrichtung und Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuren - Google Patents

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Abstract

Mikrofluidische Vorrichtung (1) zur Analyse von Nukleinsäuren umfassend zumindest:eine Pumpeinheit (3) mit einem Pumpvolumen (4),eine Filtereinheit (5) zum Beaufschlagen mit einem Lysat, undeine Reaktionskammer (6), wobei die Pumpeinheit (3), die Filtereinheit (5) und die Reaktionskammer (6) in einer Pumprichtung der Pumpeinheit (3) in der angegebenen Reihenfolge angeordnet sind, und wobei die mikrofluidische Vorrichtung (1) dazu eingerichtet ist, ein Elutionsmedium über die Pumpeinheit (3) zur Elution in die Filtereinheit (5) und anschließend zur weiteren Prozessierung in die Reaktionskammer (6) zu pumpen.

Description

  • Die Erfindung betrifft eine mikrofluidische Vorrichtung und ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuren.
  • Mikrofluidische Vorrichtungen sind für verschiedenste Zwecke bekannt. Für die Analyse von Nukleinsäuren haben bekannte mikrofluidische Vorrichtungen allerdings Nachteile, insbesondere betreffend Effizienz und Genauigkeit der Analyse.
  • Hiervon ausgehend werden eine mikrofluidische Vorrichtung und ein Verfahren gemäß den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche beschrieben. Durch die in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen aufgeführten Merkmale sind vorteilhafte Weiterbildungen und Verbesserungen der mikrofluidischen Vorrichtung und des Verfahrens möglich.
  • Der Begriff „mikrofluidisch“ bezieht sich hier vor allem auf die Größenordnung der mikrofluidischen Vorrichtung. Die mikrofluidische Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass in den darin angeordneten fluidischen Kanälen und Kammern physikalische Phänomene relevant sind, die im Allgemeinen der Mikrotechnik zugeordnet werden. Hierzu zählen beispielsweise Kapillareffekte, Effekte (insbesondere mechanische Effekte) die im Zusammenhang mit Oberflächenspannungen des Fluids stehen. Hinzu zählen weiterhin Effekte wie Thermophorese und Elektrophorese. Diese Phänomene sind in der Mikrofluidik üblicherweise dominant gegenüber Effekten wie der Schwerkraft. Die mikrofluidische Vorrichtung kann auch dadurch gekennzeichnet sein, dass sie zumindest teilweise mit einem schichtweisen Verfahren hergestellt ist und Kanäle zwischen Schichten des Schichtaufbaus angeordnet sind. Der Begriff „mikrofluidisch“ kann auch über die Querschnitte innerhalb der Vorrichtung charakterisiert werden, welche zur Führung des Fluids dienen. Üblich sind beispielsweise Querschnitte im Bereich von 100 µm [Mikrometer] mal 100 µm bis hin zu 800 µm mal 800 µm.
  • Bei der mikrofluidischen Vorrichtung kann es sich insbesondere um ein sogenanntes „Lab on a Chip“ handeln. Ein solches „Lab on a Chip“ ist dazu bestimmt und eingerichtet, biochemische Prozesse durchzuführen. Das bedeutet, dass Funktionalitäten eines makroskopischen Labors z. B. in ein Kunststoffsubstrat integriert werden. Die mikrofluidische Vorrichtung kann z. B. Kanäle, Reaktionskammern, vorgelagerte Reagenzien, Ventile, Pumpen und/oder Aktuations-, Detektions- und Steuereinheiten aufweisen. Die mikrofluidische Vorrichtung kann ermöglichen, biochemische Prozesse vollautomatisch zu prozessieren. Damit können z. B. Tests an flüssigen Proben durchgeführt werden. Derartige Tests können z. B. in der Medizin Anwendung finden. Die mikrofluidische Vorrichtung kann auch als eine mikrofluidische Kartusche bezeichnet werden. Insbesondere durch Eingabe von Proben in die mikrofluidische Vorrichtung können in der mikrofluidischen Vorrichtung biochemische Prozesse durchgeführt werden. Dabei können den Proben auch zusätzliche Substanzen beigemischt werden, die biochemische Reaktionen auslösen, beschleunigen und/oder ermöglichen.
  • Die mikrofluidische Vorrichtung ist bevorzugt insbesondere dazu eingerichtet und bestimmt, Nukleinsäuren zu analysieren. Dies kann insbesondere eine Analyse von DNA umfassen. Die mikrofluidische Vorrichtung kann insbesondere die Durchführung mehrerer, insbesondere auch verschiedener Analyse- und/oder Detektionsmethoden erleichtern. Die mikrofluidische Vorrichtung ist bevorzugt dazu eingerichtet und bestimmt, eine Analyse von Nukleinsäuren wie im Folgenden beschrieben durchzuführen. Umfasst eine zu analysierende Probe beispielsweise Zellen mit darin befindlicher DNA, so sind zunächst die Zellen aufzubrechen. Dies geschieht bevorzugt durch eine Lyse, d. h. durch chemische, enzymatische und/oder mechanische Einwirkung (z. B. mittels Ultraschall) auf die Zellen. Ergebnis einer solchen Lyse ist ein Lysat. Die bei der Lyse aus den Zellen freigesetzten Nukleinsäuren können anschließend aufgereinigt, weiterverarbeitet und/oder analysiert werden. Beispielsweise können die Nukleinsäuren mittels einer Amplifikation weiterverarbeitet werden. Unter der Amplifikation ist insbesondere die Vermehrung von DNA durch ein Enzym (wie z. B. Polymerase) zu verstehen. Insbesondere ist eine Polymerase Chain Reaction (PCR) für die Amplifikation bevorzugt. Der Begriff Kettenreaktion („chain reaction“) bezieht sich dabei darauf, dass ein Produkt einer Amplifikationsreaktion wiederum Ausgangsstoff einer erneuten Amplifikationsreaktion sein kann.
  • Zur Aufreinigung der aus den Zellen freigesetzten Nukleinsäuren kann das aus der Lyse entstandene Lysat beispielsweise mit einem Bindepuffer versetzt und mit einer festen Matrix in Kontakt gebracht werden. Als feste Matrix ist insbesondere ein Filter bevorzugt. Bevorzugt adsorbieren die Nukleinsäuren an dem Filter.
  • Insbesondere zur Adsorption der Nukleinsäuren umfasst die mikrofluidische Vorrichtung die Filtereinheit. Die Filtereinheit umfasst bevorzugt einen Filter, der wie beschrieben als feste Matrix dazu geeignet ist, Nukleinsäuren an sich zu binden. Dabei ist insbesondere ein Silika-Filter bevorzugt, weil ein solcher Nukleinsäuren besonders gut an sich binden kann. Daher ist ein Silika-Filter besonders gut für einen Einsatz zur Analyse von Nukleinsäuren geeignet. Bevorzugt weist die Filtereinheit einen Einlass für das Lysat auf, durch welchen das Lysat in die Filtereinheit hinein und in den Filter (insbesondere in den Silika-Filter) eingebracht werden kann. Bevorzugt kann die Filtereinheit mit dem Lysat beaufschlagt werden, indem das Lysat durch die Filtereinheit hindurchgeleitet wird. Dabei können die Nukleinsäuren an den Filter gebunden werden.
  • Die Beaufschlagung der Filtereinheit mit dem Lysat erfolgt bevorzugt mit Hilfe der Pumpeinheit, die das Lysat in den Filter fördert.
  • Nachdem die Nukleinsäuren aus dem Lysat an den Filter (insbesondere innerhalb der Filtereinheit) gebunden sind, kann optional ein weiterer Reinigungs- und/oder Waschvorgang durchgeführt werden. Anschließend können die Nukleinsäuren eluiert, d. h. aus dem Filter gelöst werden. Dazu wird der Filter bevorzugt mit einem Elutionsmedium durchspült. Bei dem Elutionsmedium handelt es sich bevorzugt um Wasser, mit Tween versetztes Wasser oder einen Elutionspuffer.
  • Das Elutionsmedium ist bevorzugt in einem Vorratsbehälter bereitgestellt. Bevorzugt ist der Vorratsbehälter in der mikrofluidischen Vorrichtung enthalten. Insbesondere ist es bevorzugt, dass die mikrofluidische Vorrichtung einen Vorratsbehälter umfasst, der genau die Menge an Elutionsmedium enthält, die für einen Analysevorgang mittels der mikrofluidischen Vorrichtung benötigt wird. Auch können mehrere derartiger Vorratsbehälter vorgesehen sein, um entsprechend mehrere Analysevorgänge mit der mikrofluidischen Vorrichtung durchführen zu können (z. B. bevor ein Nachfüllen der Vorratsbehälter nötig wird). Alternativ kann das Elutionsmedium auch durch einen Einlass von außerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung in die mikrofluidische Vorrichtung eingegeben werden.
  • Das Elutionsmedium wird bevorzugt über die Pumpeinheit in die Filtereinheit gepumpt. Dazu ist die Pumpeinheit bevorzugt mit dem Vorratsbehälter bzw. mit dem Einlass der mikrofluidischen Vorrichtung für das Elutionsmedium sowie mit der Filtereinheit über Verbindungsleitungen verbunden. Bei den Verbindungsleitungen kann es sich insbesondere um Bestandteile wie Schläuche und Kanäle eines mikrofluidischen Netzwerks handeln.
  • Die Pumpeinheit ist bevorzugt dazu bestimmt und eingerichtet, ein Fluid (insbesondere eine Flüssigkeit) durch eine Leitung zu befördern. Die Pumpeinheit kann mechanisch, elektrisch oder pneumatisch angetrieben werden. Beispielsweise kann die Pumpeinheit einen Pumpraum mit einem veränderbaren Volumen aufweisen, der durch manuelles Zusammendrücken (zum Beispiel per Hand) entleert werden kann. Durch ein derartiges Entleeren kann eine sich in der Pumpeinheit bzw. in dem Pumpraum der Pumpeinheit befindliche Flüssigkeit aus der Pumpeinheit befördert werden. Insbesondere ist es bevorzugt, dass die Pumpeinheit eine Mikromembranpumpe umfasst.
  • Das Pumpvolumen gibt an, wieviel von einem Fluid zur gleichen Zeit innerhalb der Pumpeinheit zum Pumpen aufgenommen werden kann. Bei einer zyklisch betreibbaren Pumpe entspricht das Pumpvolumen der Menge des Fluids, die durch einen Pumpzyklus befördert werden kann. Unter einem Pumpzyklus einer zyklisch arbeitenden Pumpe ist zu verstehen, dass die Pumpeinheit mit dem Fluid befüllt und anschließend wieder entleert wird.
  • Bevorzugt weist die Pumpeinheit einen Einlass und einen Auslass für das Fluid auf. Die Pumpeinheit kann beispielsweise das Fluid kontinuierlich am Einlass ansaugen und am Auslass ausgeben. Bei einer zyklisch arbeitenden Pumpeinheit kann ein Pumpzyklus dadurch gegeben sein, dass das Fluid zunächst über den Einlass angesaugt wird und anschließend (nachdem die Pumpeinheit gefüllt ist) aus dem Auslass heraus befördert wird. Die Pumprichtung der Pumpeinheit ist von dem Einlass zu dem Auslass gerichtet. Der Einlass der Pumpeinheit ist bevorzugt mit dem Vorratsbehälter bzw. mit dem Einlass der mikrofluidischen Vorrichtung für das Elutionsmedium verbunden. Der Auslass der Pumpeinheit ist bevorzugt mit der Filtereinheit verbunden.
  • Der Vorratsbehälter kann in einer bevorzugten Ausführungsvariante auch austauschbar sein. Der Vorratsbehälter kann auch eine Mehrzahl (mindestens zwei) Behälterkammern aufweisen, in welchen verschiedene Medien bereitgestellt werden. Der Begriff „verschiedene Medien“ umfasst hier insbesondere Lysate, Elutionsmedien und gegebenenfalls Bindepuffer (oder auch Waschpuffer). In einem Kanal, der den Vorratsbehälter, bzw. die Behälterkammern mit der Pumpeinheit fluidisch verbindet, können bevorzugt auch Ventile oder Ähnliches angeordnet sein, um eine fluidische Verbindung zwischen dem Vorratsbehälter bzw. den Behälterkammern und der Pumpeinheit zu steuern. Ggf. können stromauf (d.h. vorratsbehälterseitig) der Pumpeinheit auch noch Anschlüsse vorgesehen sein, mit welchen Medien (insbesondere Lysate, Elutionsmedien, Bindepuffer) der Vorrichtung bereitgestellt werden können.
  • Das durch die Pumpeinheit angetriebene Elutionsmedium kann bevorzugt die Filtereinheit derart durchströmen, dass das Elutionsmedium die in der Filtereinheit (insbesondere an dem Silika-Filter) gebundenen Nukleinsäuren von dem Filter löst und aufnimmt (d. h. die Nukleinsäuren eluiert). Nach der Elution kann das Elutionsmedium, das dann auch die Nukleinsäuren enthält, als Eluat bezeichnet werden. Es ist insbesondere bevorzugt, dass das Elutionsmedium bzw. das Eluat nach Verlassen der Filtereinheit die zu analysierenden Nukleinsäuren umfasst. Die Filtereinheit weist bevorzugt einen Einlass und einen Auslass für das Elutionsmedium bzw. für das Eluat auf. Bevorzugt sind der Einlass und der Auslass der Filtereinheit für das Elutionsmedium bzw. für das Eluat von dem weiter oben beschriebenen Einlass der Filtereinheit für das Lysat verschieden. Alternativ kann auch das Lysat durch den Einlass und/oder durch den Auslass der Filtereinheit für das Elutionsmedium bzw. für das Eluat in die Filtereinheit eingegeben werden.
  • Das Elutionsmedium bzw. das Eluat (einschließlich der davon umfassten Nukleinsäuren) kann nach Austritt aus der Filtereinheit weiter prozessiert werden. Als weitere Prozesse sind insbesondere enzymatische Reaktionen wie z. B. eine Amplifikation (insbesondere eine PCR), eine Sequenzierung und ein Restriktiosnenzymverdau bevorzugt.
  • Für die Durchführung einer PCR nach einer Aufreinigung beispielsweise wird das Eluat oder eine Teilmenge des Eluats bevorzugt mit Reagenzien wie z. B. einer PCR-Reaktionsmischung vermischt und im Anschluss thermisch zyklisiert. Die PCR-Reaktionsmischung kann beispielsweise Oligonukleotide, Primer, Salze und/oder das Enzym Polymerase enthalten.
  • Zum Vermischen mit Reagenzien und/oder zum Durchführen einer insbesondere enzymatischen Reaktion dient bevorzugt die Reaktionskammer. Die Reaktionskammer ist bevorzugt über eine Verbindungsleitung mit der Filtereinheit verbunden (insbesondere mit dem Auslass der Filtereinheit für das Elutionsmedium bzw. für das Eluat). Bevorzugt sind die Reagenzien in der Reaktionskammer vorgelagert, insbesondere in gefriergetrockneter bzw. in lyophilisierter Form. Durch den Einlass des Eluats werden derart vorgelagerte Reagenzien beim Einlass des Eluats aufgelöst.
  • Bevorzugt sind die Filtereinheit und die Reaktionskammer (und insbesondere die Volumina der Filtereinheit und der Reaktionskammer) derart aufeinander abgestimmt, dass ein aus der Filtereinheit erhaltbares Eluatvolumen vollständig in die Reaktionskammer eingefüllt werden kann, wobei die Reaktionskammer bevorzugt vollständig gefüllt wird. Das bedeutet, dass also weder ein Überschuss des Eluatvolumens übrig bleibt, noch das Eluatvolumen kleiner als das Volumen der Reaktionskammer ist. Insbesondere ist es bevorzugt, dass beim Einfüllen des Eluats in die Reaktionskammer keine Gasblasen in der Reaktionskammer gebildet werden. Weiterhin ist auch der Vorratsbehälter bzw. die Vorratsbehälterkammern (und insbesondere dessen Volumen) bevorzugt derart an die Filtereinheit und an die Reaktionskammer (und insbesondere an die Volumina der Filtereinheit und der Reaktionskammer) angepasst, dass ein aus dem Vorratsbehälter abgegebenes Volumen des Elutionsmediums dem Volumen des Eluats entspricht, das die Reaktionskammer genau ausfüllen kann. Dabei kann gegebenenfalls berücksichtigt werden, dass das Eluat vor Eintritt in die Reaktionskammer oder in der Reaktionskammer mit Reagenzien vermischt werden kann. Ein Volumen der Reagenzien wird bevorzugt derart berücksichtigt, dass das Volumen des Vorratsbehälters um das Volumen der Reagenzien kleiner ist als das Volumen der Reaktionskammer. Weiterhin ist es bevorzugt, dass die Pumpeinheit eine zyklisch arbeitende Pumpe umfasst. Damit kann das gepumpte Volumen an Elutionsmedium besonders gut kontrolliert werden. Besonders bevorzugt ist es, dass das Pumpvolumen der zyklisch arbeitenden Pumpe der benötigten Menge an Elutionsmedium genau entspricht (d.h., dass das Pumpvolumen insbesondere mit dem Volumen der Filtereinheit identisch ist), sodass ein einzelner Pumpzyklus ausreicht, um die Filtereinheit zu befüllen.
  • Sind die Filtereinheit und die Reaktionskammer (sowie gegebenenfalls auch der Vorratsbehälter) wie beschrieben aufeinander abgestimmt, kann das Eluat vollständig für weitere Prozessierungsschritte (wie z. B. eine PCR) verwendet werden. Dadurch können sämtliche eluierten Nukleinsäuren für die weitere Prozessierung verwendet werden. Daraus kann sich eine Sensitivitätssteigerung der Analyse ergeben. Auch kann bei einem derart vollständigen Umsetzen des Eluats die weitere Analyse besonders schnell durchgeführt werden. Beispielsweise kann bei einer großen Ausgangsmenge an Eluat bzw. bei einer großen Ausgangszahl an Nukleinsäuremolekülen auf eine wiederholte Amplifikation verzichtet werden und nur ein Amplifikationszyklus durchgeführt werden. Das bedeutet, dass durch die Erhöhung der Eingangsmenge (bzw. durch das vollständige Verwenden des Eluats) eine geringere Anzahl an Amplifikationszyklen die gleiche Produktmenge ergeben kann.
  • Weiterhin weist die mikrofluidische Vorrichtung bevorzugt Ventile zur Steuerung des Flusses des Elutionsmediums bzw. des Eluats auf.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der mikrofluidischen Vorrichtung ist ein Volumen der Reaktionskammer um höchstens 20 % größer als das Pumpvolumen.
  • In dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, dass die Pumpeinheit eine zyklisch arbeitende Pumpe umfasst. Die Pumpeinheit und insbesondere das Pumpvolumen sind bevorzugt auf die Filtereinheit und die Reaktionskammer (sowie gegebenenfalls auch der Vorratsbehälter) bzw. auf die jeweiligen Volumina abgestimmt. Bevorzugt kann das gesamte im Vorratsbehälter befindliche Elutionsmedium in das Pumpvolumen eingefüllt werden, wobei das Pumpvolumen vollständig gefüllt wird. Durch die zyklische Arbeitsweise der Pumpe kann das Pumpvolumen vollständig gefüllt werden. Anschließend wird das Elutionsmedium bevorzugt in die Filtereinheit gepumpt. Es ist bevorzugt, dass das gesamte Elutionsmedium aus der Pumpeinheit in die Filtereinheit gefüllt werden kann, wobei die Filtereinheit vollständig gefüllt wird. Weiterhin kann das Elutionsmedium (das dann die Nukleinsäuren enthält und als Eluat vorliegt) aus der Filtereinheit in die Reaktionskammer geleitetet werden. Dabei ist es bevorzugt, dass das Eluat vollständig in die Reaktionskammer gefüllt werden kann, wobei die Reaktionskammer vollständig gefüllt werden kann. Ist kein Vermischen mit Reagenzien vorgesehen, ist es bevorzugt, dass die Volumina des Vorratsbehälters, der Pumpe (d. h. das Pumpvolumen), der Filtereinheit und der Reaktionskammer jeweils gleich groß sind. Ist beim Eintritt in die Reaktionskammer oder zwischen Auslass aus der Filtereinheit und Einlass in die Reaktionskammer ein Vermischen des Eluats mit Reagenzien vorgesehen, so ist das Volumen der Reaktionskammer bevorzugt um das Volumen der Reagenzien kleiner als die jeweiligen Volumina des Vorratsbehälters, der Pumpe (d. h. das Pumpvolumen) und der Filtereinheit.
  • Insbesondere deshalb ist es bevorzugt, dass das Volumen der Reaktionskammer um höchstens 20 % größer ist als das Pumpvolumen. Das bedeutet, dass das zu berücksichtigende Volumen von Reagenzien maximal den 20 % Volumenunterschied zwischen der Reaktionskammer und der Pumpeinheit (bzw. des Pumpvolumens) entspricht. Besonders bevorzugt ist, dass das Pumpvolumen 20 bis 30 µl [Mikroliter] beträgt und das Volumen der Reaktionskammer 20 bis 35 µl (sofern die genannte Bedingung eingehalten ist, dass das Volumen der Reaktionskammer um höchstens 20 % größer ist als das Pumpvolumen).
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die mikrofluidische Vorrichtung weiterhin einen ersten Seitenkanal zum Ableiten eines Inhalts der Pumpeinheit stromabwärts der Pumpeinheit.
  • Der erste Seitenkanal zweigt bevorzugt stromabwärts der Pumpeinheit, d. h. in Pumprichtung nach der Pumpeinheit, ab, insbesondere zwischen der Pumpeinheit und der Filtereinheit. Der erste Seitenkanal weist bevorzugt ein Ventil auf, um den ersten Seitenkanal nur optional zu öffnen. Insbesondere ist es bevorzugt, dass der erste Seitenkanal geöffnet wird, während die Pumpeinheit befüllt wird. Dabei kann die Pumpeinheit vollständig befüllt werden, wobei überschüssiges Elutionsmedium über den ersten Seitenkanal abfließen kann (anstatt in die Filtereinheit zu gelangen, bevor dies erwünscht ist). Nachdem die Pumpeinheit vollständig befüllt ist, wird der erste Seitenkanal bevorzugt (über das Ventil im ersten Seitenkanal) versperrt. Dann kann das Elutionsmedium aus der Pumpeinheit am ersten Seitenkanal vorbei in die Filtereinheit gepumpt werden. Der erste Seitenkanal kann in die Umgebung der mikrofluidischen Vorrichtung führen (und dort z. B. in einen Auffangbehälter). Auch kann der erste Seitenkanal in einen Auffangbehälter oder in andere Bereiche (wie z.B. in Kanäle) innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung führen. Bevorzugt ist, dass der erste Seitenkanal in den Vorratsbehälter (zurück) führt, sodass über den ersten Seitenkanal geleitetes Elutionsmedium wiederverwendet werden kann.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die mikrofluidische Vorrichtung weiterhin einen zweiten Seitenkanal zum Ableiten eines Inhalts der Filtereinheit stromabwärts der Filtereinheit.
  • Der zweite Seitenkanal zweigt bevorzugt stromabwärts der Filtereinheit, d. h. in Pumprichtung nach der Filtereinheit, ab, insbesondere zwischen der Filtereinheit und der Reaktionskammer. Der zweite Seitenkanal weist bevorzugt ein Ventil auf, um den zweiten Seitenkanal nur optional zu öffnen. Insbesondere ist es bevorzugt, dass der zweite Seitenkanal geöffnet wird, während die Filtereinheit befüllt wird. Dies kann eine Vorbefüllung der Filtereinheit (und insbesondere des Silika-Filters) mit Elutionsmedium ermöglichen, bevor die Elution durchgeführt wird. Auch kann die Vorbefüllung mit einem Waschpuffer und/oder einem Bindepuffer erfolgen. Weiterhin können Kontaminationen oder Reste eines Waschpuffers von der Filtereinheit gewaschen werden, bevor die Elution durchgeführt wird. Die Filtereinheit kann vollständig befüllt werden, wobei überschüssiges Elutionsmedium (bzw. überschüssiger Waschpuffer und/oder Bindepuffer) über den zweiten Seitenkanal abfließen kann (anstatt in die Reaktionskammer zu gelangen, bevor dies erwünscht ist). Nachdem die Filtereinheit vollständig befüllt ist, wird der zweite Seitenkanal bevorzugt (über das Ventil im zweiten Seitenkanal) versperrt. Dann kann das Elutionsmedium aus der Filtereinheit am zweiten Seitenkanal vorbei in die Reaktionskammer gepumpt werden. Der zweite Seitenkanal kann in die Umgebung der mikrofluidischen Vorrichtung führen (und dort z. B. in einen Auffangbehälter). Auch kann der zweite Seitenkanal in einen Auffangbehälter oder in andere Bereiche (wie z.B. in Kanäle) innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung führen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die mikrofluidische Vorrichtung weiterhin eine parallel zu der Filtereinheit angeordnete Rückführungsleitung.
  • Die Rückführungsleitung zweigt bevorzugt stromabwärts der Filtereinheit, insbesondere zwischen der Filtereinheit und der Reaktionskammer ab. Von dort kann das Elutionsmedium entnommen werden (insbesondere aus einer Verbindungsleitung zwischen der Filtereinheit und der Reaktionskammer) und durch die Rückführungsleitung zurückgeführt werden. Insbesondere kann die Rückführung derart erfolgen, dass das entnommene Elutionsmedium an einer Stelle stromaufwärts der Filtereinheit wieder zugegeben werden kann. Dazu ist die Rückführungsleitung bevorzugt an eine Verbindungsleitung zwischen der Pumpeinheit und der Filtereinheit (oder auch an einen Auslass der Pumpeinheit oder an einen Einlass der Filtereinheit) angebunden. Die Rückführungsleitung umfasst bevorzugt eine zusätzliche Rückführungspumpe. Alternativ kann das Elutionsmedium bevorzugt aufgrund eines von der Pumpeinheit erzeugten Drucks durch die Rückführungsleitung gepumpt werden. Insbesondere ist es bevorzugt, dass die Rückführungsleitung mit dem ersten Seitenkanal und/oder mit dem zweiten Seitenkanal gemeinsam ausgebildet ist. Das kann beispielsweise bedeuten, dass die Rückführungsleitung als eine Verbindungsleitung zwischen dem ersten Seitenkanal und dem zweiten Seitenkanal ausgebildet ist. Auch kann die Rückführungsleitung beispielsweise an einer Stelle zwischen der Filtereinheit und der Reaktionskammer abzweigen, die von einer Abzweigungsstelle des zweiten Seitenkanals verschieden ist, und anschließend in den ersten Seitenkanal mündet. Auch kann die Rückführungsleitung aus dem zweiten Seitenkanal abzweigen und an einer Stelle in eine Verbindungsleitung zwischen der Pumpeinheit und der Filtereinheit münden, die von einer Abzweigungsstelle des ersten Seitenkanals verschieden ist.
  • Über die Rückführungsleitung kann das Elutionsmedium mehrfach durch die Filtereinheit geleitet werden. Dabei können in der Filtereinheit gebundene Nukleinsäuren besonders gut gelöst und von dem Elutionsmedium aufgenommen (d. h. eluiert) werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die mikrofluidische Vorrichtung weiterhin eine Mischkammer, welche mit der Filtereinheit und/oder mit der Reaktionskammer verbunden ist.
  • Bevorzugt kann das Eluat aus der Filtereinheit wahlweise in die Reaktionskammer und/oder in die Mischkammer eingeleitet werden. Insbesondere ist es bevorzugt, dass für eine Reaktion in der Reaktionskammer benötigte Reagenzien in der Mischkammer vorgelagert werden. In der Mischkammer kann ein Vermischen der Reagenzien mit dem Eluat und/oder ein Auflösen der Reagenzien (z. B. sofern diese gefriergetrocknet vorgelagert sind) erfolgen. Durch die Mischkammer ist also eine räumliche Trennung des Vermischens der Reagenzien mit dem Eluat und/oder des Auflösens der Reagenzien von der Durchführung der Reaktion möglich. Damit kann erreicht werden, dass die Reaktionskammer vollständig befüllt wird, insbesondere unter Vermeidung von Gasblasen. Ohne eine derartige räumliche Trennung könnten durch das Vermischen der Reagenzien mit dem Eluat und/oder durch das Auflösen der Reagenzien Gaseinschlüsse innerhalb der Reaktionskammer entstehen. Derartige Gasblasen könnten die durchzuführende Reaktion nachteilig beeinflussen.
  • Auch kann durch die räumliche Trennung der Mischkammer und der Reaktionskammer ein besonders schnelles und besonders wohldefiniertes Einfüllen des Eluats in die Mischkammer erfolgen. Damit kann ein besonders gutes Auflösen der Reagenzien erreicht werden. Insbesondere kann dabei die Entstehung von Gasblasen besonders gut unterdrückt werden.
  • Die Mischkammer weist bevorzugt ein Volumen auf, das dem Pumpvolumen entspricht.
  • Bevorzugt kann die Mischkammer auch als eine Pumpkammer genutzt werden, sodass das Elutionsmedium (welches dann ggf. mit aufgelösten Reagenzien versetzt ist) bevorzugt aus der Mischkammer heraus und in die Reaktionskammer hinein gepumpt werden kann. Die Mischkammer ist dabei bevorzugt als eine Pumpkammer ausgeführt. Das bedeutet, dass beispielsweise Reagenzien in einer als Pumpkammer ausgeführten Mischkammer vorgelagert sein können. Nach der Befüllung der Mischkammer insbesondere mit dem Eluat kann eine Membran der Mischkammer ausgelenkt werden und die Mischung so aus der Mischkammer in die Reaktionskammer verdrängt werden.
  • Auch kann das Eluat zunächst in der Mischkammer mit Reagenzien vermischt werden, in die Reaktionskammer gepumpt werden und anschließend zur weiteren Prozessierung wieder in die Mischkammer gepumpt werden.
  • Auch können zwei Elutionsvorgänge hintereinander durchgeführt werden, z. B. einer in dem zweiten Seitenkanal und einer in der Reaktionskammer. Die beiden Eluatfraktionen (d. h. die Anteile des Eluats, die getrennt voneinander prozessiert werden) können im Anschluss vermischt werden. Dies kann den Vorteil haben, dass ggf. in einer ersten der Eluatfraktionen enthaltene Kontaminationen verdünnt werden.
  • Als weiterer Aspekt wird ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuren gemäß Anspruch 7 vorgestellt.
  • Die weiter vorne beschriebenen besonderen Vorteile und Ausgestaltungsmerkmale der mikrofluidischen Vorrichtung sind auf das beschriebene Verfahren anwendbar und übertragbar, und umgekehrt.
  • Die angegebenen Verfahrensschritte werden bevorzugt, aber nicht notwendig, in der angegebenen Reihenfolge durchlaufen.
  • In Schritt b) wird das in Schritt a) bereitgestellte Lysat der Probe bevorzugt in die Filtereinheit eingegeben. Innerhalb der Filtereinheit befindet sich bevorzugt das Filtermaterial. Das Filtermaterial kann insbesondere in Form eines Silika-Filters vorliegen. In Schritt c) erfolgt das Pumpen des Elutionsmediums bevorzugt über die Pumpeinheit. Durch die oben beschriebenen bevorzugt aufeinander abgestimmten Volumina der Bestandteile der mikrofluidischen Vorrichtung kann Schritt d) unter Ausnutzung des gesamten in Schritt c) verwendeten Elutionsmediums (bzw. Eluats) durchgeführt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin den Verfahrensschritt:
    • e) Auflösen von vorgelagerten Reagenzien durch das Elutionsmedium.
  • Die in Schritt e) aufgelösten Reagenzien können beispielsweise PCR-Reagenzien sein. Die Reagenzien sind bevorzugt in der Reaktionskammer und/oder in der Mischkammer vorgelagert, insbesondere in gefriergetrockneter Form.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die mikrofluidische Vorrichtung zumindest zeitweise derart orientiert, dass die Reaktionskammer oberhalb der Filtereinheit angeordnet ist.
  • Bevorzugt ist die mikrofluidische Vorrichtung für die gesamte Dauer des Verfahrens wie beschrieben orientiert. Dass die Reaktionskammer oberhalb der Filtereinheit angeordnet ist, ist in Bezug auf die Erdgravitation zu verstehen. Das bedeutet, dass bei einer Orientierung der mikrofluidischen Vorrichtung, bei der die Reaktionskammer oberhalb der Filtereinheit angeordnet ist, die Erdgravitation beispielsweise auf das Elutionsmedium in einer Richtung von der Reaktionskammer auf die Filtereinheit wirkt. Dadurch kann das Ausbilden von Gasblasen innerhalb der Reaktionskammer besonders gut unterdrückt werden.
  • Auch bei perfekter Befüllung einer Kammer können beim Auflösen lyophilisierter Reagenzien Gasblasen gebildet werden. Diese sammeln sich in diesem Verfahren an einer Oberseite der Kammer, in der die Reagenzien aufgelöst werden. Bevorzugt wird für diese Ausführungsform des Verfahrens eine mikrofluidische Vorrichtung mit einer Mischkammer und einer Reaktionskammer verwendet. Dabei ist bevorzugt, dass eine Verbindungsleitung zwischen der Mischkammer und der Reaktionskammer ein Leitungsvolumen aufweist, das einem (zu erwartenden) Volumen der entstehenden Gasblasen entspricht. Damit kann durch Umfüllen des Eluats aus der Mischkammer in die Reaktionskammer das entstehende Gas in der Verbindungsleitung gesammelt werden, während das Eluat ohne Gaseinschlüsse in die Reaktionskammer gepumpt werden kann.
  • Die Erfindung und das technische Umfeld werden nachfolgend anhand der Figuren näher erläutert. Die Figuren zeigen besonders bevorzugte Ausführungsbeispiele, auf die die Erfindung jedoch nicht begrenzt ist. Insbesondere ist darauf hinzuweisen, dass die Figuren und insbesondere die dargestellten Größenverhältnisse nur schematisch sind. Es zeigen schematisch:
    • 1: eine mikrofluidische Vorrichtung zur Analyse von Nukleinsäuren in einer ersten Ausführungsform,
    • 2: eine mikrofluidische Vorrichtung zur Analyse von Nukleinsäuren in einer zweiten Ausführungsform,
    • 3: eine mikrofluidische Vorrichtung zur Analyse von Nukleinsäuren in einer dritten Ausführungsform,
  • 1 zeigt eine erste Ausführungsform einer mikrofluidischen Vorrichtung 1 zur Analyse von Nukleinsäuren. Die mikrofluidische Vorrichtung 1 umfasst einen Vorratsbehälter 2, eine Pumpeinheit 3 mit einer Pumprichtung 20, eine Filtereinheit 5 zum Beaufschlagen mit einem Lysat und eine Reaktionskammer 6, die in der angegebenen Reihenfolge in einer Pumprichtung der Pumpeinheit 3 angeordnet sind. Die Pumprichtung weist in der Darstellung der 1 von links nach rechts, was durch einen Pfeil in der Pumpeinheit 3 angegeben ist. Die Filtereinheit 5 umfasst ein Filtermaterial 19. Die Pumpeinheit 3 weist ein Pumpvolumen 4 auf. Die mikrofluidische Vorrichtung 1 ist dazu eingerichtet, ein Elutionsmedium aus dem Vorratsbehälter 2 über die Pumpeinheit 3 zur Elution in die Filtereinheit 5 und anschließend zur weiteren Prozessierung in die Reaktionskammer 6 zu pumpen. Weiterhin eingezeichnet sind ein erstes Ventil 11 und ein zweites Ventil 12.
  • 2 zeigt eine zweite Ausführungsform einer mikrofluidischen Vorrichtung 1, die eine Ergänzung der ersten Ausführungsform darstellt. Die im Folgenden nicht beschriebenen Elemente sind mit denen aus der ersten Ausführungsform identisch. Die zweite Ausführungsform weist zusätzlich zu der ersten Ausführungsform einen ersten Seitenkanal 7 auf, der zwischen der Pumpeinheit 3 und dem ersten Ventil 11 von einer Verbindungsleitung zwischen der Pumpeinheit 3 und der Filtereinheit 5 abzweigt. Der erste Seitenkanal 7 weist ein drittes Ventil 13 auf. Der erste Seitenkanal 7 führt aus der mikrofluidischen Vorrichtung 1 heraus, was durch einen Pfeil angedeutet ist. Die zweite Ausführungsform weist weiterhin zusätzlich zu der ersten Ausführungsform einen zweiten Seitenkanal 8 auf, der zwischen der Filtereinheit 5 und einem fünften Ventil 15 von einer Verbindungsleitung zwischen der Filtereinheit 5 und der Reaktionskammer 6 abzweigt. Der zweite Seitenkanal 8 weist ein viertes Ventil 14 auf. Der zweite Seitenkanal 8 führt aus der mikrofluidischen Vorrichtung 1 heraus, was durch einen Pfeil angedeutet ist.
  • 3 zeigt eine dritte Ausführungsform einer mikrofluidischen Vorrichtung 1, die eine Ergänzung der ersten Ausführungsform darstellt. Die im Folgenden nicht beschriebenen Elemente sind mit denen aus der ersten Ausführungsform identisch. Die mikrofluidische Vorrichtung 1 weist neben der Reaktionskammer 6 eine Mischkammer 10 auf. Die Mischkammer 10 kann dazu genutzt werden, von der Reaktionskammer 6 räumlich getrennt ein Elutionsmedium mit Reagenzien zu vermischen. Während die Reaktionskammer 6 über das fünfte Ventil 15 mit der Filtereinheit 5 verbunden ist, ist die Mischkammer 10 über ein sechstes Ventil 16 und ein siebtes Ventil 17 mit der Filtereinheit 5 verbunden. An einer Stelle zwischen dem sechsten Ventil 16 und dem siebten Ventil 17 zweigt eine Rückführungsleitung 9 ab, die an einer Stelle zwischen der Pumpeinheit 3 und dem zweiten Ventil 12 in eine Verbindungsleitung zwischen der Pumpeinheit 3 und der Filtereinheit 5 mündet. Die Rückführungsleitung 9 ist parallel zu der Filtereinheit 5 angeordnet und ermöglicht es, ein Elutionsmedium mehrfach durch die Filtereinheit zu leiten. Die Rückführungsleitung weist ein achtes Ventil 18 auf.

Claims (9)

  1. Mikrofluidische Vorrichtung (1) zur Analyse von Nukleinsäuren umfassend zumindest: - eine Pumpeinheit (3) mit einem Pumpvolumen (4), - eine Filtereinheit (5) zur Beaufschlagung mit einem Lysat, und - eine Reaktionskammer (6), wobei die Pumpeinheit (3), die Filtereinheit (5) und die Reaktionskammer (6) in einer Pumprichtung (20) der Pumpeinheit (3) in der angegebenen Reihenfolge angeordnet sind, und wobei die mikrofluidische Vorrichtung (1) dazu eingerichtet ist, ein Elutionsmedium über die Pumpeinheit (3) zur Elution in die Filtereinheit (5) und anschließend zur weiteren Prozessierung in die Reaktionskammer (6) zu pumpen.
  2. Mikrofluidische Vorrichtung (1) nach Anspruch 1, wobei ein Volumen der Reaktionskammer (6) um höchstens 20 % größer ist als das Pumpvolumen (4).
  3. Mikrofluidische Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche weiterhin umfassend einen ersten Seitenkanal (7) zum Ableiten eines Inhalts der Pumpeinheit (3) stromabwärts der Pumpeinheit (3).
  4. Mikrofluidische Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche weiterhin umfassend einen zweiten Seitenkanal (8) zum Ableiten eines Inhalts der Filtereinheit (5) stromabwärts der Filtereinheit (5).
  5. Mikrofluidische Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend eine parallel zu der Filtereinheit angeordnete Rückführungsleitung (9).
  6. Mikrofluidische Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend eine Mischkammer (10), welche mit der Filtereinheit (5) und/oder mit der Reaktionskammer (6) verbunden ist.
  7. Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuren mittels einer mikrofluidischen Vorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfassend zumindest die folgenden Verfahrensschritte: a) Bereitstellen eines Lysats einer Probe, b) Binden des Lysats an ein Filtermaterial (19), c) Eluieren des Lysats durch Pumpen eines Elutionsmediums durch das Filtermaterial (19), und d) Prozessieren von in dem Elutionsmedium gelösten Nukleinsäuren unter Verwendung des Elutionsmediums aus Schritt c).
  8. Verfahren nach Anspruch 7 weiterhin umfassend den Verfahrensschritt: e) Auflösen von vorgelagerten Reagenzien durch das Elutionsmedium.
  9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die mikrofluidische Vorrichtung (1) zumindest zeitweise derart orientiert wird, dass die Reaktionskammer (6) oberhalb der Filtereinheit (5) angeordnet ist.
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