CN112774743B - 一种富集细胞的微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种富集细胞的微流控芯片，该芯片包括下层芯片1、中层芯片2和上层芯片3；下层芯片1包括经通道依次连接的洗脱模块105、缓冲模块106、特异性结合模块107和富集模块108；洗脱模块105和缓冲模块106间设有阻水透气膜104；洗脱模块105设有竖向缓冲液入口101；特异性结合模块107和富集模块108间的通道上设有特异性磁性粒子溶液入口103；中层芯片包括过滤模块201和与阻水透气膜104对应设置的空腔区域202。本发明利用多通路技术，实现高通量的同时又兼容了后续芯片模块的流量限制，减少各模块连接的样本损失。

Description

一种富集细胞的微流控芯片

技术领域

本发明涉及一种微流控芯片以及医疗检测技术，尤其涉及一种微流控芯片及利用其捕获循环肿瘤细胞的方法。

背景技术

外周血中存在的循环肿瘤细胞circulating tumor cell，CTC及循环肿瘤微栓circulating tumor microemboli，CTM被认为是肿瘤转移和复发的重要原因和标志物。其存在既代表了原发灶肿瘤的侵袭能力，也预示了在远端形成转移灶的可能性。因此，对单位体积内血液中CTC及CTM数量的精确检测，可为早期筛查癌症提供重要依据；为肿瘤患者病情发展提供动态监控及预后依据；同时，也是肿瘤细胞致病机制及耐药机制研究的窗口。与外周血中存在的其他正常血细胞比，单位体积内的CTC及CTM的数量极为稀少，比例约为1：10⁹，因此对目标细胞的精确筛选、富集及释放是实现可靠检测的前提条件。换而言之，对目标细胞的捕捉率以及释放率是影响CTC及CTM的重要指标。

现有的对CTC细胞的富集方法一般分为下述两个步骤，根据CTC与全血中其他细胞的物理性差异，进行物理筛选，以初步富集样本中的CTC细胞，提高其在样本中的浓度；二是利用样本中不同细胞表面抗原的特异性表达，用正向或负向富集的方法进一步富集和捕获对CTC的。以上两种步骤不分先后，可以独立或组合实现，且技术途径多种多样。如步骤一可以利用鞘流、确定性侧向位移以及滤膜等物理手段实现，步骤二是通过免疫磁性粒子或特异性生物分子探针等生化方式实现。但上述方法也存在着技术上的瓶颈，如通量低、操作流程中易出现损失、试剂消耗量大、成本高等。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种基于微流控技术的技术方案，将物理筛选和特异性磁性粒子捕捉富集这两种手段集成于芯片，实现全芯片上的稀有细胞富集结构和方法，其中利用多通路技术，在实现高通量的同时又兼容了后续芯片模块的流量限制，减少各模块连接的样本损失。通过控制永磁铁形状以及摆放方式，在流道特定位置形成高梯度分布的特异性磁性粒子区，来提高与目标细胞的结合效率，同时有效减低了试剂消耗量。而该芯片通过结构设计，有效降低了芯片中阀门等模块的使用频率，简化芯片结构，从而降低芯片制备成本、提高芯片可靠性以及操作流程的简化，易于与自动化流程装置相兼容。

实现本发明目的的技术方案如下：

本发明提供的一种富集细胞的微流控芯片包括下层芯片1、中层芯片2和上层芯片3；其改进之处在于，

下层芯片1包含经通道依次连接的洗脱模块105、缓冲模块106、特异性结合模块107和富集模块108；洗脱模块105和缓冲模块106间设有阻水透气膜104；洗脱模块105设有竖向缓冲液入口101；特异性结合模块107和富集模块108间的通道上设有特异性磁性粒子溶液入口103；

中层芯片包括过滤模块201和与阻水透气膜104对应设置的空腔区域202；

上层芯片3设有样品竖向入口301，和排气口302；该排气口与阻水透气膜104和空腔区域202一道共同构成气栓去除通路。

其中，所述特异性结合模块107的磁场发生结构包括：位于所述下层芯片1中特异性结合模块107下方的下磁铁和位于所述下层芯片1中特异性结合模块107上方且与所述下磁铁对应设置的上磁铁；

所述富集模块108的磁场发生结构包括：位于所述下层芯片1中富集模块108下方的分离磁铁；

控制盒控制上磁铁、下磁铁和分离磁铁的移动和转动，实现所述特异性结合模块107和富集模块108磁场的施加和撤除。

其中，下层芯片1与中层芯片2间的下层芯片1上设有封装片11；其上设有与下层芯片1的洗脱模块105对应设置的开口111，和与中层芯片2的空腔区域202对应设置的开口112。

其中，通道为横向通道；洗脱模块105的前端设有缓冲液入口101；特异性磁性粒子溶液入口103与特异性结合模块107两通道间的夹角为钝角。

其中，制备过滤模块201的滤膜材料包含聚对二甲苯parylene、聚碳酸脂PC或聚对苯二甲酸乙二脂TETP；滤膜孔径为8μm-12μm。

其中，上层芯片、中层芯片和下层芯片之间为半可逆封装，所述半可逆封装包括，将所述下层芯片1与封装片11进行键合不可逆封装，上层芯片和中层芯片的尺寸足以覆盖封装片11开口。

其中，洗脱模块105和缓冲模块106间设有阻水透气膜104，阻水透气膜与上层芯片3的排气口302、中层芯片的空腔区域202共同构成主动和/或被动去除气栓的通路。排气口302连接恒负压源。

与最接近的现有技术比，本发明提供的技术方案具有以下优异效果：

1、本发明提供的技术方案由于竖向设置的样本通道301，与横向设置101至102通道的多通道技术，在实现高通量的同时又兼容了后续芯片模块的流量限制，减少各模块连接的样本损失。

2、本发明提供的设于所述上层芯片3的排气口302、中层芯片的空腔区域202以及所述洗脱模块105和缓冲模块106间设有阻水透气膜104一道共同构成气栓去除通路不仅可以提高气栓去除效果，而且还增加了气栓去除手段，即既可以被动去除气栓，也可以主动去除气栓。

3、本发明提供的技术方案中，所述特异性磁性粒子溶液入口103与所述特异性结合模块107的微流通道4-1出口两者间的夹角为钝角，所述特异性磁性粒子溶液入口103与富集模块108两通道间的夹角必为锐角，这样的通道结构设计一方面给特异性磁性粒子溶液的注入提供了一个较为通畅的路径，另一方面又可阻止富集模块108粒子的返回。

4、此外，在所述特异性结合模块107位置形成高梯度分布的特异性磁性粒子区，从而提高与目标细胞的结合效率，同时也能有效减低试剂消耗量。

5、本发明提供的技术方案中，所述特异性结合模块107的磁场发生模块为位于所述下层芯片(1)上下两侧的磁铁构成，而位于所述磁铁间的所述下层芯片的微流通道是阶梯状态、与传统的恒定一种横截面的微流通道比，增加了所述微流通道的处理能力。

6、本发明提供的技术方案中，该芯片的结构设计，有效降低了芯片中阀门等模块的使用频率，简化芯片结构，从而降低芯片制备成本、提高芯片可靠性以及操作流程的简化，易于与自动化流程装置相兼容。

附图说明

图1为本发明的微流控芯片的一种结构示意图；

图2为本发明的为微流控芯片的另一种结构示意图；

图3为下层芯片1的俯视图

图4为下层芯片特异性结合模块107的微流通道俯视图

图5为下层芯片特异性结合模块107的结构示意图

其中，1，下层芯片；108，下层芯片1的富集模块；104；下层芯片1的阻水透气膜；101，下层芯片1的缓冲液入口；103，下层芯片1的特异性磁性粒子溶液入口；102，下层芯片1的废液及富集液出口；105，下层芯片1的洗脱模块；107，下层芯片1的特异性结合模块；106，下层芯片1的缓冲模块，11，下层芯片1的封装片的开口111和112；11，下层芯片1的封装片；111和112为封装片11上的分别与所述下层芯片1的101和102对应的开口；2，中层芯片；201，中层芯片2的过滤模块；202，中层芯片2的空腔区域；21，中层芯片2的上表面；22，中层芯片2的下表面；3，上层芯片；301，上层芯片3的样本区域入口；302，上层芯片3的气路；4-1，结合模块的微流通道；5-1，结合模块上磁铁；5-2，结合模块下磁铁。

具体实施方式

下面结合附图1～5对本发明提供的微流控芯片作如下详细说明：

图1和图2示出了两种不同的封装模式的芯片。其中一种封装结构如图1所示：上层芯片、中层芯片和下层芯片之间为半可逆封装，所述半可逆封装包括，将所述下层芯片1与封装片11进行键合不可逆封装，上层芯片和中层芯片的尺寸足以覆盖封装片11开口。

另一种封装结构如图2所示：所述上层芯片3、中层芯片2和下层芯片1之间为可逆封装，所述中层芯片的上表面21和下表面22两分别涂覆0.05-0.5mm弹性层，并用聚对二甲苯(parylene)对所述芯片表面进行疏水处理，利用压力将下层芯片1、中层芯片2和上层芯片3结构封装。

其中，所述术语“阶梯式”的意为所述上下磁铁间的微流通道4-1的横截面为扇形，此扇形中位于所述下磁铁一侧为平面，除该侧面外的其余三面在纵向上是梯形或波浪形变化的，具有此结构的微流通道较之单一直径的微流通道无疑增加了横截面积。

本发明提供的一种富集细胞的微流控芯片，该芯片包括下层芯片1、中层芯片2和上层芯片3；下层芯片1包括经通道依次连接的洗脱模块105、缓冲模块106、特异性结合模块107和富集模块108；洗脱模块105和缓冲模块106间设有阻水透气膜104；洗脱模块105设有竖向缓冲液入口101；特异性结合模块107和富集模块108间的通道上设有特异性磁性粒子溶液入口103；中层芯片包括过滤模块201和与阻水透气膜104对应设置的空腔区域202；上层芯片3设有样品竖向入口301和排气口302；该排气口与阻水透气膜104和空腔区域202一道共同构成气栓去除通路。

下层芯片1与中层芯片2间的下层芯片1上设有封装片11；其上设有与下层芯片1的洗脱模块105对应设置的开口111，和与中层芯片2的空腔区域202对应设置的开口112。

通道为横向通道；洗脱模块105的前端设有缓冲液入口101；特异性磁性粒子溶液入口103与特异性结合模块107两通道间的夹角为钝角，在磁场作用下，在微流通4-1实现与特异性粒子间的结合；富集模块108的末端设有富集液出口102。

制备过滤模块201的滤膜材料包含聚对二甲苯parylene、聚碳酸脂PC或聚对苯二甲酸乙二脂TETP；滤膜孔径为8μm-12μm。

上、中和下三层芯片之间为可逆封装，可逆封装方法通过下述方法实现：中层芯片的上表面21和下表面22两分别涂覆0.05-0.5mm弹性层，并用聚对二甲苯parylene对芯片表面进行疏水处理。

上、中和下三层芯片之间为半可逆封装，半可逆封装包括，将下层芯片1与封装片11进行键合不可逆封装。其中不可逆封装包括热压键合，表面改性键合以及超声辅助键合等。不可逆封装后的芯片的抗液压能力高达1MPa。半可逆芯片2、3与芯片1的键合仍为可逆键合。该法可以减小芯片1与芯片2的接触面积，使可逆键合的可靠性提高，并简化封装方法；可提高芯片1中流道的抗液压强度。

除非另有说明除外，本申请说明书中的的术语“前后”是以依据流体的上游下游而言的。

1.过滤：将芯片上层3的下表面与芯片中层2上表面21贴合后，用夹持装置固定。样本通过芯片上层3的样本区域竖向入口301竖向进入芯片中层2的微孔滤膜201时，尺寸较大的目标细胞截留在如图所示的微孔滤膜201上，回收滤的废液用于其他检测。为保证过滤完全，经样本区域竖向入口301通入1-5次磷酸盐缓冲液(PBS)，并回收滤液；每次缓冲液磷酸盐PBS的用量与所通过的样本量相同。

2.完成上述步骤后，将芯片中层2翻转使下表面22朝上再与芯片上层3的下层贴合以及和与芯片下层1的上层贴合后，用夹持装置固定。

3.形成特异性磁性粒子分布区：使下层芯片1的废液及富集液出口102保持封闭状态，并使上层芯片3的样品区域的竖向入口301和下层芯片的缓冲液竖向入口101处于开放状态。从芯片下层1的特异性磁性粒子溶液入口103以50μL/mL-1mL/min的流量通入异性磁性粒子溶液，由于下层芯片1的废液及富集液出口102处于封闭状态，溶液入口103与缓冲模块108间的通道II上的流阻大于溶液入口103与特异性结合模块107通道I的流阻，所以异性磁性粒子溶液从通路I流入下层芯片的特异性结合模块107，该捕捉模块的磁场将微流通道4-1的异性磁性粒子溶液中的磁性粒子固定，异性磁性粒子溶液中剩余的溶液则通过芯片下层1的106模块经阻水透气膜104后到芯片下层的洗脱模块105。该过程既能保证异性磁性粒子溶液中的磁性粒子在特异性结合模块107中的微流通道4-1上的分布较为稳定，同时又可保持整个流程的效率。

4.洗脱过程：封闭下层芯片1的特异性磁性粒子溶液入口103和芯片1的为废液及富集液出口102，上层芯片3的样品竖向入口301处于开启状态，从芯片1的缓冲液入口101通入冲洗液，在流阻及重力的共同作用下液体充满下层芯片的洗脱模块105底面后漫过中层芯片2的过滤模块201的滤膜，持续一定时间后再封闭上层芯片的样本区域入口301并开启下层芯片的废液及富集液出口102。并从下层芯片1的缓冲液入口101通入空气，当气液界面到达芯片1的阻水透气膜104区域时，再从芯片1的缓冲液入口101通入冲洗液，其间形成的气栓通过气栓去除模块去除。

5.气栓的去除：

将上层芯片3的样本区域排气口302与恒负压装置连接，气体从下层芯片1的阻水透气膜104进入二层芯片空腔区202后从样本区域排气口302排除。

上层芯片3的样本区域排口302与恒负压装置断开，下层芯片1的缓冲液入口101通入液体时，通道中存在的气体在该液体的驱赶下经中层芯片2从排气口302排除。

6.捕捉过程：消除缓冲液的气栓后后，关闭上层芯片的样本区域竖向入口301和下层芯片的特异性磁性粒子溶液入口103，打开下层芯片的废液及富集液出口102以流出废液，源自洗脱模块105的细胞溶液先注满特异性结合模块106，进而在特异性结合模块107的微流通道4-1中与特异性磁性粒子充分接触。

本发明一个实施例中，以50μL/mL-200μL/min的流量连续向下层芯片1的缓冲液入口101通入缓冲液，使每个循环总灌注液量为107模块中特异性磁性粒子集聚区体积，所有循环的总过程灌注液量为106模块体积，以在特异性结合模块107的微流通道4-1获得与特异性磁性粒子的充分接触；

或间歇式向下层芯片1的缓冲液入口101通入缓冲液，使每个循环灌注液量为107模块中特异性磁性粒子集聚区体积，循环与循环之间间隔10s～1min，总过程灌注液量为106模块体积，获得在特异性结合模块107区的微流通道4-1中获得与特异性磁性粒子充分接触。

7.由于下层芯片的富集模块108强磁场的存在，所以在此区截留细胞-磁性粒子复合结构。

8.富集液收集：去除下层芯片的特异性结合模块107及富集模块108区域的磁场后，并使上层芯片3的样本区域入口301和芯片下层1的特异性磁性粒子溶液入口103保持闭合状态，从下层芯片1的缓冲液入口101通入冲洗液或空气，在下层芯片的102收集富集液。

该富集液可以再次通过滤膜去除富余磁性粒子，也可选择其他手段对其数量、基因型等信息进行进一步分析检测。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本实用新型进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本实用新型精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种富集细胞的微流控芯片，该芯片包括下层芯片(1)、中层芯片(2)和上层芯片(3)；其特征在于，

所述下层芯片(1)包括经通道依次连接的洗脱模块(105)、缓冲模块(106)、特异性结合模块(107)和富集模块108；所述洗脱模块(105)和缓冲模块(106)间设有阻水透气膜(104)；所述洗脱模块(105)设有竖向缓冲液入口(101)；所述特异性结合模块(107)和富集模块(108)间的通道上设有特异性磁性粒子溶液入口(103)；

所述中层芯片包括过滤模块(201)和与所述阻水透气膜(104)对应设置的空腔区域(202)。

2.如权利要求1所述的富集细胞的微流控芯片，其特征在于，所述特异性结合模块(107)的磁场发生结构包括：位于所述下层芯片(1)中特异性结合模块(107)下方的下磁铁和位于所述下层芯片(1)中特异性结合模块(107)上方且与所述下磁铁对应设置的上磁铁；

所述富集模块(108)的磁场发生结构包括：位于所述下层芯片(1)中富集模块(108)下方的分离磁铁；

控制盒控制上磁铁、下磁铁和分离磁铁的移动和转动，实现所述特异性结合模块(107)和富集模块(108)磁场的施加和撤除。

3.如权利要求2所述的富集细胞的微流控芯片，其特征在于，位于所述上下磁铁间的所述下层芯片(1)的微型通道的横截面为阶梯状态。

4.如权利要求1所述的富集细胞的微流控芯片，其特征在于，所述下层芯片(1)与中层芯片(2)间的下层芯片(1)上设有封装片(11)；所述封装片(11)上设有与下层芯片(1)的所述洗脱模块(105)对应设置的开口(111)，和与所述中层芯片(2)的所述空腔区域(202)对应设置的开口(112)。

5.如权利要求1所述的富集细胞的微流控芯片，其特征在于，所述通道为横向通道；所述洗脱模块(105)的前端设有缓冲液入口(101)；所述特异性磁性粒子溶液入口(103)与所述特异性结合模块(107)两通道间的夹角为钝角；所述富集模块(108)的末端设有富集液出口(102)。

6.如权利要求1所述的富集细胞的微流控芯片，其特征在于，制备所述过滤模块(201)的滤膜材料包含聚对二甲苯(parylene)、聚碳酸脂(PC)或聚对苯二甲酸乙二脂；所述滤膜孔径为8μm-12μm。

7.如权利要求1所述的富集细胞的微流控芯片，其特征在于，所述上层芯片、中层芯片和下层芯片之间为半可逆封装，所述半可逆封装包括，将所述下层芯片(1)与封装片(11)进行键合不可逆封装，上层芯片和中层芯片的尺寸足以覆盖封装片(11)开口。

8.如权利要求1所述的富集细胞的微流控芯片，其特征在于，所述洗脱模块(105)和缓冲模块(106)间设有阻水透气膜(104)，所述阻水透气膜与上层芯片(3)的排气口(302)、中层芯片的空腔区域(202)共同构成气栓去除通路，用于主动和/或被动去除气栓。

9.如权利要求8所述的富集细胞的微流控芯片，其特征在于，所述排气口(302)与恒负压源连接。

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