CN103421675B - 精子趋向性评价及筛选的方法及其专用微流控芯片系统 - Google Patents
精子趋向性评价及筛选的方法及其专用微流控芯片系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103421675B CN103421675B CN201210149032.9A CN201210149032A CN103421675B CN 103421675 B CN103421675 B CN 103421675B CN 201210149032 A CN201210149032 A CN 201210149032A CN 103421675 B CN103421675 B CN 103421675B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- micro
- fluidic chip
- lateral
- main pipeline
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000010415 tropism Effects 0.000 title abstract 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 26
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims abstract 2
- 230000029305 taxis Effects 0.000 claims description 41
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 28
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 claims description 25
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 claims description 25
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 21
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 claims description 20
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 12
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 claims description 10
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims description 7
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 7
- 230000009182 swimming Effects 0.000 claims description 7
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- 230000009057 passive transport Effects 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 6
- 239000004020 conductor Substances 0.000 claims 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 73
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 14
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 13
- 230000028029 thermotaxis Effects 0.000 description 12
- 238000011160 research Methods 0.000 description 11
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 7
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000008010 sperm capacitation Effects 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000011652 Formyl peptide receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010076288 Formyl peptide receptors Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 3
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 3
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 3
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 3
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 3
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 2
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 210000005002 female reproductive tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003331 infrared imaging Methods 0.000 description 2
- 230000005499 meniscus Effects 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 238000009832 plasma treatment Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000034196 cell chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000001733 follicular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- -1 polydimethylsiloxane Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种精子趋向性评价及筛选的方法及其专用微流控芯片。该微流控芯片由上层结构和下层结构组成，上层结构和/或下层结构的表面包括至少一个微流体管道单元；其中，微流体管道单元包括一入口池、至少一条一端与入口池相连通的主管道、与主管道的另一端相连通的出口池、以及至少一条与主管道相连通的分支管道。使用时，主管道中形成有物理的或化学的梯度场。样品由入口池加入，在主管道的梯度场中自由运动，选择性地进入分支管道。通过对分支管道中的精子计数能够定量的评价精子的趋向性；通入与细胞培养液不相溶或者微溶的流体，在分支管道入口处形成两种流体的界面，能够限制细胞在主管道与分支管道之间的运动，从而实现具有趋向性精子的捕获与回收。
Description
技术领域
本发明涉及一种精子趋向性评价及筛选的方法及其专用微流控芯片系统。
背景技术
人体内的受精作用是一个复杂的生理过程，众多研究证实：在正常人体内，精子需要通过女性生殖道的层层筛选，才能够到达卵子所在的受精部位发生受精作用。这样的机制既保证了单精入卵又能筛选出健康的精子最终完成受精。现今得到公认的体内筛选机制有：精子的活力筛选，只有那些运动能力较强的精子才能够游过细长的女性生殖道到达输卵管内的受精部位，并发生顶体反应，完成受精；体内的另一种重要筛选机制是精子的趋向性筛选，趋向性又主要包括两种机制：一是化学趋向性（简称趋化性），即精子沿着（或逆着）化学物质的浓度梯度的方向运动，而化学物质主要由卵子和卵丘细胞分泌，因此可以诱导具有趋化性的精子准确地找到卵子的位置。据Nature Reviews Molecular Cellular Biology 2006年的文献报道，此种作用的有效距离较短，仅在输卵管的狭部起作用。二是温度趋向性（简称趋温性）筛选，即精子沿着（或逆着）温度梯度的方向游动，据Nature Reviews Molecular Cellular Biology 2006年的文献报道，此种机制是一种长距离的作用，发生在输卵管和子宫连接处（34.7℃）与输卵管狭部即受精部位（36.3℃）之间。
精子的功能障碍被认为是导致不育发生的最重要的单一原因，然而数十年来，在临床上精液的质量仅仅通过少数几个简单的指标进行检测。世界卫生组织出版的《人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》中指出了临床精子检测的常用指标，包括：精液的体积、pH值以及精子的密度、活力、细胞形态。然而，越来越多的临床证据表明单单依靠这些指标不能完整地反映一个男性的生殖能力(Bungum et al.Asian Journal of Andrology.2011,13:69-75)。最新研究表明，精子DNA的完整性、顶体反应的能力、温度趋向性、化学趋向性等等指标，也严重影响着精子的受精能力。
哺乳动物精子的温度趋向性首先是由Bahat等人于2003年报道的（Bahat et al.Nature Medicine.2003,9:149-150）。该实验利用了一个改进的Zigmond腔室，腔室的两侧分别设有两个大腔体并控制在不同的温度下，通过显微镜观察并记录精子在中间腔室中的运动轨迹，从而分析精子在温度梯度下的运动方向。他们发现兔子和人的精子都具有正向的温度趋向性（即向高温处运动），并能够感受到很小的温差（0.5℃或更小）。此种通过显微镜观察运动轨迹的方法，仅对于精子的某一种趋向性进行评价，却不能筛选得到具有趋向性的精子用于后续的体外受精（IVF）或者研究的用途，也不利于多种趋向性指标的集成检测。
关于哺乳动物精子的化学趋向性已经有明确的文献报道（Villanueva-Diaz et al.Fertility & Sterility.1995,64:1183-1188），诱导精子趋化的物质包括卵泡液中的孕酮及一些热稳定的肽等；而且精子总体中只有一小部分获能之后的精子才具有趋化性。最近Bahat和Eisenbach的研究（Bahat & Eisenbach.Biology of Reproduction.2010,82:606-616）表明，精子同样只有获能之后才具有趋温性，而这些精子中的DNA的片段化程度更弱。这些研究也就间接证明：具有趋向性的精子有更大的概率能够成功地完成受精并最终发育成健康的下一代。因此利用趋向性这种精子本身固有的特性对精子进行评价是对临床现有男科检验手段的重要补充；对具有趋向性的精子进行筛选，用于后续的生物学研究或者体外受精，对于临床上提高体外受精的成功率并且生育健康的下一代意义重大。
微流控芯片因为其通量高、样品用量小以及自动化程度高的优点越来越多地被用于辅助生殖技术领域。主要的应用包括精子行为的研究、精子活力的评价与筛选、卵丘细胞的去除、体外受精以及囊胚的培养等。微流控芯片曾被用于各种生物如细菌、线虫等的趋化性评价。例如，专利“Microfluidic system with integrated permeablemembrane”（WO 2004/059299A1）公开了一种集成有半透膜的微流控芯片，可以通透气体、液体、细胞和小分子等物质，在管道中形成化学梯度，用于生物体的趋化性检测。再如，专利“一种甲酰肽受体激动剂筛选用微流控芯片组及筛选方法”（CN101782569A）公开了一种利用甲酰肽受体激动剂筛选用微流控芯片，包括细胞趋化检测单元、受体内吞检测单元、钙离子瞬间流动过程检测单元，用于检测细胞对于甲酰肽受体激动剂的各种响应过程。2006年，微流体管道开始被应用于精子的化学趋化性筛选（Koyama et al.Analytical Chemisty.2006,78:3354-3359）。三个进样管道及同样尺寸的三条出样管道，与芯片上的一个腔体相连。在左侧进样管道通入对精子有吸引作用的化学物质（如卵巢浸出液），右侧管道通入常规的生理溶液，中间管道通入精液样本，在中间汇合的腔体中将产生化学梯度，通过观察中间精子的游动行为可以检测精子的趋化性。但该装置的不足在于在操作过程中流体剪切力对于精子的影响难于避免，且只能对趋化性一个单一的指标进行检测。Xie等人于2010年报道了利用微流体管道对于精子的活力及趋化性进行集成的评价（Xie et al.Clinical Chemistry.2010,56:1270-1278）。该项研究优化了直管道对于精子活力筛选的尺寸，并将直管道与“Y”形的分叉管道相结合，使用体外培养的卵丘细胞形成化学梯度场，集成地评价了小鼠精子的活力及趋化性。2009年，Ko等人设计了一款芯片，在长13毫米的直线微流体管道上形成了2℃的温差，从而利用精子的趋温性达到筛选小鼠精子活力的目的(Ko et al.Proceedings of the 13th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistryand Life Sciences,2009.Jeju:540-542)。
微流控芯片在精子的评价及筛选的研究中具有很大潜力。在微流控芯片上不仅可以灵活地设计各种微管道和微结构，而且管道内的温度等物理场、化学物质等化学场可以得到准确的控制，因此适于模仿体内的生理状况对精子进行评价、筛选和操纵，使精子的评价标准更客观可靠，也使体外受精过程具有很好的可控性。另外，由于微流控芯片具有集成性优势，可以将精子的多指标检测集成在一枚芯片上完成。
发明内容
本发明的目的在于提供一种集成式微流控芯片，以解决上述现有技术难以评价并筛选出具有趋向性精子的技术问题。
本发明所提供的集成式微流控芯片，由上层结构和下层结构组成，所述上层结构和/或下层结构的表面包括至少一个微流体管道单元，其改进在于：所述微流体管道单元包括一入口池、至少一条一端与所述入口池相连通的主管道、与所述主管道的另一端相连通的出口池、以及至少一条与所述主管道相连通的分支管道。
通常，入口池的直径大于主管道的直径，出口池的直径也大于主管道的直径，并以渐变过渡。
所述主管道与所述入口池可直接连通或通过连接管道相连通。通常该连接管道的直径显著小于主管道的直径，但大于待检测细胞或细菌的直径。所述连接管道的中心轴与主管道的中心轴重合。
在一些实施例中，可由出口池通入与细胞培养液不相溶或者微溶的流体，优选为空气、矿物油，在分支管道入口处形成两种流体的界面（即界面阀），限制细胞在主管道与分支管道之间的运动。为了方便对细胞的捕获和回收，使两种流体的界面在分支管道的入口处形成预订形状的界面（通常最优的形状是与主管道的管道壁相重合的平面），而不因为液体的表面张力和流动形成凹液面带走分支管道中的细胞，在微管道中设置有三种类型的微结构：1、分支管道的入口设置有至少一个与管道的上下表面相连的微结构，其间距及与管道壁之间的间距大于所加入细胞的直径。微结构可为任意形状，优选为圆柱形，优选直径为10-100微米。2、分支管道的入口附近的主管道壁设置有凸起微结构。凸起部分可为任意形状，优选为圆弧形或三角形，凸起部分距离主管道壁最远尺寸优选为10-500微米。3、所述主管道内与分支管道入口所对应的区域（优选在该区域的中央位置）设有至少一个与管道的上下表面相连的微结构，两个微结构之间的间距及其与管道壁之间的间距大于所加入细胞的直径。该微结构可为任意形状，优选为圆柱形，优选直径为10微米-1毫米。
上述三种类型的微结构的具体功效如下：
1）在分支管道入口处设置的微柱结构（如图1虚线框内），可辅助形成与主管道壁平齐的气液界面，而防止形成很大的凹液面，保证左右两侧密封的液体体积对称，而对被富集的趋温细胞（如精子）准确捕获。
2）在分支管道附近的主管道壁上增加了两个半圆形的凸起（如图1虚线框内）。这是由于界面形成时，亲水的管道壁容易贴有一层很薄的液膜，其中的高流速会导致坑中的细胞（如精子）被冲出，而增加半圆的凸起就可以截断这层薄液膜，很大程度上避免这个问题。
3）在左右分支管道前方的主管道中央位置增加了一个直径略大的微柱结构（如图1），其作用在于当气液界面在管道中前进是呈抛物面形状，并不是一个平面，界面的中间部分过于突出有可能影响到细胞（如精子）的游动，因此在中心流体运动最快的位置增加微柱减缓了当地的流体运动，能够形成更近似于平面的气液界面（如图5（c）和图8（b））。
此外，在该微流控芯片中连接入口池与主管道的很细的连接管道（见图1），可使整个管道的流阻集中于此区段。当气液界面阀工作时，此段细管道内自始至终充满液体，保持流阻基本不变，有助于稳定气液界面。另外，气液界面最终会到达连接管道，并且因细管道中界面张力大而停止前进，因此管道内的气体保持隔离，压力始终高于大气压，这保证了分支管道入口处界面的稳定可靠。
本发明所述主管道的形状可以任意改变，其横截面的大小和形状可以一致，也可以连续改变或者突变。主管道可深度为5微米至1毫米。在细胞的评价和筛选过程中，主管道中的流体可以是静止的，也可以是流动的，流动的方向是任意的。在同一个实施例中管道同一位置处的流体流动的方向一般是一致的。
上述与主管道相连通的分支管道的个数可以根据实际需要设置，如2个以上。分支管道的形状任意。其布置方式任意，包括与入口池的距离、与主管道的距离、所成角度、是否对称等。分支管道的深度优选为5微米至1毫米。分支管道优选为在主管道的左右两侧对称布置2个，优选分支管道中心与入口池圆心的距离为大于4毫米。分支管道的大小和形状任意，优选为小于倒置显微镜20×物镜的一个视野范围，即830微米×630微米。
上述与主管道相连通的分支管道可以进行级联，即上一级的分支管道作为下一级的主管道，在此主管道的基础上再有一级分支管道。每一级的分支管道的形状可以相同也可以不同。
在分支管道上可以开有与外界回收装置相连通的细胞回收池相连，分支管道与细胞回收池之间优选通过相比分支管道更细的管道进行连接。
当将上述微流控芯片用于趋温性评价的芯片时，所采用的微流控芯片系统除了所述微流控芯片外，还包括一温度梯度控制装置；所述温度梯度控制装置包括芯片放置腔体、两个恒温热源，微流控芯片置于芯片放置腔体内。使用时，两个恒温热源被控制在不同的温度值，通过芯片放置腔体中的介质（优选为空气）导热形成温度梯度，热量通过芯片表面传导进入微管道，使得微管道中也形成温度梯度场。
本发明微流控芯片的制作材料可采用聚二甲基硅氧烷、塑料、玻璃、硅等。当其用于趋温性评价的芯片时，该芯片至少应有一个表面的材料优选为导热性强的材料，如硅、玻璃，其表面厚度优选为小于2毫米。
本发明的另一目的是提供一种利用上述微流控芯片或微流控芯片系统，对可自发游动的细胞（如精子）或细菌按照趋向性进行分级的方法。
所述分级方法包括下述步骤：
a）在所述微流控芯片的微流体管道中充满待测试的细胞或细菌的培养液；
b）在所述微流控芯片的主管道中形成稳定的物理梯度场和/或化学梯度场；
形成的物理场可以是温度梯度场，其可以在上述微流控芯片系统内形成，具体方法是：将芯片置于温度梯度控制装置的芯片放置腔体内，有微管道部分的芯片均置于空气中，不与任何固体或液体接触。腔体的左右两次分别有两个不同温度的恒温热源，空气中形成温度梯度，使微流控芯片的上层结构和/或下层结构产生温度梯度，从而使管道中的流体具有相应的温度梯度。稳定温度梯度所需的时间优选为3分钟以上。
形成的化学场可以是化学物质的浓度梯度场，其具体方法是：在分支管道（或者在细胞回收池）中，化学物质经过在微管道中一定时间的扩散，形成由分支管道到主管道逐渐降低的浓度梯度。为了延缓或者加快化学物质的扩散间，可以在分支管道中或者细胞回收池中或者两者之间或者两者的上方位置，部分地或者全部地增加填充物，此种填充物优选为水凝胶、琼脂糖。所述的趋化性物质，对于精子优选为孕酮，对于其它细胞或细菌可以是生长因子、葡萄糖等。
c）在微流控芯片的入口池中加入待测试的细胞或细菌。细胞可以在静止的细胞培养液中通过自身游动进入主管道，也可以在电场力、光场力、流体力等方式的作用下被动运输进入主管道。电场力、光场力、流体力等作用也可以作为阻力，对细胞的活动力进行筛选，只有具有特定活动能力的细胞才能进入主管道。进入主管道之后的细胞在梯度场的作用下，选择在主管道中运动或者运动到某一分支管道中，从而实现对细胞或细菌的分级。加入并测试细胞过程中，所述两种流体的界面优选已经处于微流体主管道中，从而减少后续步骤中液体扰动对结果造成影响。此测试时间优选为3至30分钟。
本发明的再一个目的是提供一种对可自发游动的细胞（如精子）或细菌的趋向性、活力进行单独评价或同时评价的方法。
该评价方法包括下述步骤：
1）采用上述方法对细胞或细菌按照趋向性进行分级；
2）通过显微镜观察处于各个分支管道以及主管道中的细胞数量、运动情况、形态等。可以利用视频录像或者拍摄序列图像的方式进行记录，人工地或者自动化地统计细胞的数量、运动参数等指标，根据细胞或细菌的数量计算趋向性指数，从而评价细胞或细菌的趋向性，根据运动参数评价细胞或细菌的活力。
本发明提供的另一种对可自发游动的细胞或细菌的活力和趋向性进行同时评价的方法，包括下述步骤：
1）利用本发明提供的微流控芯片或微流控芯片系统，在所述微流控芯片的微流体管道中充满待评价的可自发游动的细胞或细菌的培养液；
2）在所述微流控芯片的主管道中形成稳定的物理梯度场和/或化学梯度场；
3）在所述微流控芯片的入口池中加入待评价的可自发游动的细胞或细菌，使其自发游动，选择分支管道入口处的平面或分支管道内的某一平面作为细胞或细菌的运动终点；从加入细胞或细菌开始计时，根据相同时间内到达终点的细胞数量或者一定数量的细胞到达终点所需要的时间，评价细胞或细菌的活力；同时，分别记录相同时间内游过左右分支管道入口处的平面或左右分支管道内的某一平面的细胞数量，根据细胞或细菌的数量计算趋向性指数，从而评价细胞或细菌的趋向性。
在细胞或细菌自发游动的过程中，还可施加电场力、光场力、流体力等作用力作为阻力，对细胞的活动力进行筛选，只有具有特定活动能力的细胞才能进入主管道。
本发明的还提供一种对具有（或没有）趋向性的细胞进行捕获和回收的方法。
在某些实施例中，需要将具有（或没有）趋向性的细胞进行捕获和回收。在出口池通入与细胞培养液不相容（或微溶）的流体，使得两种流体的界面向入口池方向运动。在所述微结构的辅助下，根据两种流体之间表面张力的作用，两种流体的界面最终运动至分支管道入口处停止，将分支管道的入口完全密封。由于细胞只能够在细胞培养液中运动，而不能在与细胞培养液不相容（或微溶）的流体中运动，因此细胞在分支管道与主管道之间的运动被完全阻止，此种通过两种流体的界面阻止细胞运动的方式即为“界面阀”。
所述的在出口池通入与细胞培养液不相容（或微溶）的流体，可以是在出口池正压通入流体，也可以从细胞入口池负压吸入流体。
如果不需要样品捕获，此步骤可以省略。
回收被捕获的细胞的一种方法是通过流体压力使得在分支管道入口处的界面继续向细胞回收池的方向运动，将分支管道中的流体与其中的细胞一同输送到细胞回收池中，并通过移液枪或毛细管等从池中加以回收。所述的通过流体压力使得界面运动，可以是在出口池正压通入流体，也可以从细胞回收池负压吸入流体。
回收被捕获的细胞的另一种方法是采用吸水物质或毛细管伸入到微流控芯片的回收池中（甚至通过细胞回收池伸入到分支管道中），将其中的液体吸出，与此同时其中混有的已经被捕获的细胞或细菌也随液体一起被回收到吸水物质上或毛细管内。吸水的物质优选为滤纸。
如果不需要样品回收，此步骤可以省略。
上述微流控芯片装置及其使用方法的用途广泛，包括但不限于：人精子的检测用于男性不育的诊断；人精子的筛选用于辅助生殖领域；动物精子的检测和筛选用于育种；人或动物的精子检测和筛选，均可以用于科学机理的研究；用于除精子外其它可自发游动的细胞，用作其趋向性或活动力的筛选或科学机理的研究。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明的微流控芯片有着可控的温度梯度等物理场和化学物质梯度等化学场，能够逼真地模拟生理环境去评价细胞的趋向性。在辅助生殖的应用中，与传统的检测手段只能获得精子的活力信息不同，利用本发明的微流控芯片可以将精子活力、趋温性和趋化性检测相集成，有助于真实反映男性生殖的健康状况，有利于诊断男性不育，有助于后续辅助生殖技术的成功。2、本发明的微流控芯片对于精子趋向性评价的定量性更强，可以实现精子的活力、趋温性、趋化性在一张芯片上进行集成性的评价与筛选，且可以按照要求捕获并且回收具有趋向性的精子，从而满足辅助生殖领域和生殖生物学研究中的需求。3、本发明的微流控芯片采用“界面阀”的设计，相比于其他各种微型阀门此种阀门没有任何机械的运动部件，除了流体的驱动力外没有其它的外界动力源，因此结构简单、制造工艺简便、操作方便、成本低廉，特别适合用于各类细胞生物学的应用中。本发明所公开的温度梯度控制装置，具有形成的温度梯度大、可以控制的芯片通量高、每片芯片上的温度梯度重复性好、成本低廉等优点。综上所述，本发明的微流控芯片成本低廉，集成性高，操作方便，可广泛用于人或者动物的精子评价及筛选，甚至用于其它能够自发运动的细胞或生物的活动力筛选，在辅助生殖领域和受精机制研究中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是实施例1中微流控芯片的结构示意图。
图2是实施例2中微流控芯片的温度梯度控制装置的俯视示意图(a)、截面示意图(b)以及截面的温度场仿真图(c)。
图3是实施例2中微流控芯片的温度梯度的实际测量结果。
图4是实施例2中利用微流控芯片测量人精子趋温性的实际测量结果。
图5是实施例3微流控芯片中界面阀工作过程的序列示意图(a)-(e)
图6是实施例4中利用常规的计算机辅助精子图像分析（CASA）系统，对分支腔体中的精子轨迹和速度进行分析的结果。
图7是实施例4中微流控芯片的结构示意图。
图8是实施例4微流控芯片中气液界面阀工作过程的序列示意图(a)-(d)。
具体实施方式
下述结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明中的管道是指微流体管道内流体的通道。
实施例1、微流控芯片
该微流控芯片的结构示意图如图1所示。微流控芯片包括四个部分：一个精子入口池（3.2毫米直径）、主管道（包括100微米宽、500微米长的连接管道以及1.5毫米宽、1.4毫米长的梯度形成管道）、出口池（3.2毫米直径）、两条分支管道（与主管道分别成60度角），分支管道的大小适于显微镜20×物镜的一个视野（830微米×630微米）。图中点划线示意的是精子由入口池游入分支管道的游动平均距离，约4.5毫米。所有的微管道为矩形，高度20微米。在两个分支管道的入口处分别设置有30微米直径的圆柱形微结构两个，两个圆柱之间间距70微米，圆柱与分支管道壁之间间距85微米。临近分支管道入口处的主管道管道壁设置有半圆柱形的凸起微结构，其半径为30微米。在梯度形成管道的中心线上，临近分支管道入口的位置设置有一圆柱形微结构，直径为100微米。
本实施例的微流控芯片由上下两层组成：上层采用聚二甲基硅氧烷材料，利用软光刻工艺成形微流体管道；下层是玻璃载玻片，厚度为1毫米，两层通过氧等离子体键合的工艺键合在一起。
实施例2、微流控芯片用于精子温度趋向性的评价
首先用75%的乙醇溶液和去离子水分别清洗微流体管道，用氧等离子体处理管道，并将其充满在5%CO2，37℃条件下孵育过夜的人输卵管液（HTF），并将入口池用矿物油覆盖防止挥发。
随后实施例1的微流控芯片被插入如图2所示的温度梯度控制装置中。芯片所放置的位置是芯片放置腔体8，在出口池中正压以2毫升/小时的流量通入空气，使得气液界面进入管道中，达到图5（c）所示的位置。芯片具有微流体管道的部分全部被空气包裹，不与其它液体或者固体接触。芯片放置腔体8左右两侧分别设有水浴槽2，两个水浴槽被电阻丝3加热，并由Pt100铂电阻4测量温度反馈到温度控制器上。左右两个水浴槽2被控制在不同的温度，从而使芯片放置腔体8内形成温度梯度。因为芯片下层的玻璃7导热率高、厚度薄，所以可以将空气的热量快速传导给管道中的液体5，到达稳态后使液体5中产生与空气一致的温度梯度。图2（b）为芯片放置腔体8的横截面示意图，图2（c）为其所对应的温度场理论仿真图。图3（a）是芯片底面玻璃的红外成像结果，证明玻璃上确实存在着可控的线性的温度梯度。图3（b）是多种方式测量芯片上的温度梯度的对比，其中虚线是理论仿真得到的芯片水平中心线上的温度，实线是对应位置的红外成像测量结果，示意点为热电偶插入管道中的测量结果（方形、圆形及三角形分别表示设置左-右温度梯度为35.0-36.3℃，36.3-35.0℃以及35.0-35.0℃的测量数据）。
芯片放入温度梯度控制装置中经过5-15分钟到达稳定后，在入口池加入1.5微升的人精子溶液（精子通过离心换液已经将精液置换成HTF溶液，并且在5%CO2，37℃条件下孵育获能1小时，精子的密度调整为5×106-40×106个/毫升）。当精子加入后15分钟，分别在显微镜下记录左右两个分支管道内的精子运动视频6秒，左右两侧的视频记录间隔很短不超过5秒。
通过MATLAB 2010a编程分析视频，计数两个分支管道中的精子数量，处于高温一侧的分支管道中的精子数量记为N1，低温一侧的分支管道中的精子数量记为N2，并按照如下公式计算趋温性指数TI：
所得到的结果如图4所示。在35.0-36.3℃，36.3-35.0℃两种温度梯度下，趋温性指数TI明显大于1，与对照组35.0-35.0℃时TI＝1有统计学差异，证明人精子在35.0-36.3℃的温度梯度下均显示出一致的正向趋温性，同时也证明本发明所述的微流控芯片可以检测人精子的趋温性，且芯片系统在测试过程中呈现良好的对称性。
实施例3、微流控芯片用于不同活力的精子的捕获
从出口池继续以2毫升/小时的流量正压通入空气，推动空气与HTF的界面向入口池方向前进，过程如图5（c）-（e）所示，最终在两个分支管道的入口处形成两个近似平面的气液界面，用以阻止主管道中的精子与分支管道中的精子之间的交换，完成游入两个分支管道的精子的捕获。最终的捕获效果如图1中虚线区域的放大图所示。由于主管道的连接管道部分很细，因此在2毫升/小时的流量下气液界面不能够通过连接管道，在连接管道与梯度形成管道的连接处也形成一个气液界面，如图5（e）所示。
实施例4、微流控芯片用于评价精子的活力及对不同活力精子的捕获
通过界面阀的封闭过程能够有效捕获已游入两个分支管道的精子。从出口池以2毫升/小时的流量继续正压通入空气，推动空气与HTF的界面向入口池方向前进，过程如图5（c）-（e）所示，最终在两个分支管道的入口处形成两个近似平面的气液界面，用以阻止主管道中的精子与分支管道中的精子之间的交换，完成已游入两个分支管道的精子的捕获。最终的捕获效果如图1中虚线区域的放大图所示。由于主管道的连接管道部分很细，因此在2毫升/小时的流量下气液界面不能够通过连接管道，在连接管道与梯度形成管道的连接处也形成一个气液界面，如图5（e）所示。
因为精子必须在微管道中游过一段路程才能达到两个分支管道中，所以速度最快的精子最先到达，而速度较慢的精子晚些到达，这就创造了一个机会将不同活力的精子在不同的时间点分开进行研究。
如图6所示是利用常规的计算机辅助精子图像分析（CASA）系统，对分支腔体中的精子轨迹和速度进行分析的结果。如图6(a)，当界面阀保持开启状态15min，分支腔体中的最快精子（VSL>25μm/s）的比例由3min的65%±17%下降到15min的38%±18%，同时中等速度的精子（5μm/s<VSL≤25μm/s）比例快速上升，由30%上升至48%。对照组实验如图6(b)，在加入精子后3min时关闭界面阀，使得后续的精子不能够进入分支腔体中。从3min阀关闭至15min这段时间内，腔体中精子的运动速度的比例变化速度很慢。综合比较上述两组实验可以发现，微流控芯片中的界面阀可以用于评价精子的活力并且对不同活力的精子完成捕获。
实施例5、另一种微流控芯片
该微流控芯片的结构示意图如图7所示，微流控芯片包括五个主要部分：一个精子入口池（3.2毫米直径）、主管道（包括100微米宽500微米长的连接管道以及1.5毫米宽、1.4毫米长的梯度形成管道）、出口池（3.2毫米直径）、两条分支管道（与主管道分别成60度角，形状为枣核形）、分别与两个分支管道的末端通过短而细的管道相连的细胞回收池。其余微结构的设置与实施例1中相同。
本实施例的微流控芯片由上下两层组成：上层采用聚二甲基硅氧烷材料，利用软光刻工艺成形微流体管道；下层是玻璃载玻片，厚度为1毫米，两层通过氧等离子体键合的工艺键合在一起。
实施例6、另一种微流控芯片用于精子化学趋向性的评价与筛选
首先用75%的乙醇溶液和去离子水分别清洗微流体管道，用氧等离子体处理管道。向精子回收池加入融化的1%的琼脂糖，由于与分支管道之间的连接很细，因此液体不会流入到分支管道中。此时，用滤纸将剩余在细胞回收池中的琼脂糖快速吸出，进入细管道的部分由于表面张力不会被吸出而遇冷固化在细管道中。随后从入口池将整个管道充满5%CO2，37℃条件下孵育过夜的人输卵管液（HTF），并将入口池用矿物油覆盖防止挥发。在出口池中正压以2毫升/小时的流量通入空气，使得气液界面进入管道中，达到图5（c）所示的位置。在两个细胞回收池中的任意一个加入含100pmol/L孕酮的HTF溶液（据文献：Teves et al.Fertility and Sterility.2006,86:745-749，人精子对1-100pmol/L的孕酮有趋化性的响应，且对10pmol/L最为敏感，因此，加入含有100pmol/L孕酮的HTF溶液），另一个池中加入不含孕酮的HTF溶液。待孕酮自由扩散在分支管道和主管道内形成稳定的浓度梯度后，在入口池加入1.5微升的人精子溶液（精子通过离心换液已经将精液置换成HTF溶液，并且在5%CO2，37℃条件下孵育获能1小时，精子的密度调整为5×106-40×106个/毫升）。通过显微镜观察并记录由主管道进入左右分支管道的精子数量，含有孕酮的一侧数量记为N1，另一侧数量记为N2，则可以通过下述公式计算精子的趋化性指数CI：
如果需要捕获具有趋化性的精子，方法是：从出口池继续以2毫升/小时的流量正压通入空气，推动空气与HTF的界面向入口池方向前进，过程如图8（b）-（c）所示，在两个分支管道的入口处形成两个近似平面的气液界面，用以阻止主管道中的精子与分支管道中的精子之间的交换，完成游入两个分支管道的精子的捕获。由于主管道的连接管道部分很细，因此在2毫升/小时的流量下气液界面不能够通过连接管道，在连接管道与梯度形成管道的连接处也形成一个气液界面，如图8（c）所示。
回收被捕获的细胞的一种方法是适当增大流体压力使得在分支管道入口处的界面继续向细胞回收池的方向运动，而保证主管道的连接管道部分的界面不动。这样就能够将分支管道中的流体与其中的精子一同输送到细胞回收池中，然后通过移液枪或毛细管等从池中加以回收。
回收被捕获的细胞的另一种方法是采用细长的滤纸条或者吸水垫通过细胞回收池伸入到分支管道中，将其中的液体吸干，与此同时将液体中混有的已经被捕获的细胞回收到滤纸条或者吸水垫上。
实施例7、另一种微流控芯片用于细菌的趋向性的评价与筛选
按照实施例6所述的方法，在如图7所示的微流体管道内形成化学物的浓度梯度，同时把芯片放入实施例2所述的温度梯度控制系统中维持管道内适当的温度梯度。当两种梯度场均达到稳定之后，在入口池加入待筛选的细菌，通过显微镜观察并记录由主管道进入左右分支管道的细菌数量一段时间，即能够计算该种细菌的趋向性指数。如果需要可以分别单独施加一种梯度场，计算该种细菌的趋温性指数、趋化性指数等等。
如实施例6所述的方法，通过“界面阀”可以有效地捕获具有（或没有）趋向性的细菌，并且加以回收。
本发明仅以上述实施例进行说明，各部件的结构、设置位置、及其连接都是可以有所变化的，在本发明技术方案的基础上，凡根据本发明原理对个别部件进行的改进和等同变换，均不应排除在本发明的保护范围之外。
Claims (30)
1.一种微流控芯片，由上层结构和下层结构组成，所述上层结构和/或下层结构的表面包括至少一个微流体管道单元，其特征在于：所述微流体管道单元包括一入口池、至少一条一端与所述入口池相连通的主管道、与所述主管道的另一端相连通的出口池、以及至少一条与所述主管道相连通的分支管道；
所述主管道与所述入口池直接连通；或所述主管道与所述入口池通过连接管道相连通，所述连接管道的中心轴与主管道的中心轴重合；
所述主管道内与分支管道入口所对应的区域设有至少一个微结构；和/或，所述分支管道入口处设有至少一个微结构；
所述主管道内与分支管道入口所对应的区域设置的微结构为任意形状；所述微结构与其所在管道的上下表面相连；
所述分支管道入口处设置的微结构为任意形状；所述微结构与其所在管道的上下表面相连。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述主管道和分支管道的深度为5微米至1毫米。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述分支管道为两个，其对称分布于所述主管道的左右两侧。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述分支管道的几何中心与入口池几何中心的距离大于4毫米；所述分支管道的面积为小于倒置显微镜20×物镜的一个视野范围。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述主管道内与分支管道入口所对应的区域设置的微结构为圆柱体，所述圆柱体的直径为10微米-1毫米。
6.根据权利要求1、5所述的微流控芯片，其特征在于：所述主管道内与分支管道入口所对应的区域设置的微结构与其所处管道的管壁之间的距离大于待检测细胞的直径；所述微结构至少设有两个，所述微结构两两之间的距离大于待检测细胞的直径。
7.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述分支管道入口处设置的微结构为圆柱体，所述圆柱体的直径为10-100微米。
8.根据权利要求1、7所述的微流控芯片，其特征在于：所述分支管道入口处的微结构与其所处管道的管壁之间的距离大于待检测细胞的直径；所述分支管道入口处的微结构至少设有两个，所述微结构两两之间的距离大于待检测细胞的直径。
9.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述主管道与分支管道交汇处的主管道的内壁上设置有凸起微结构。
10.根据权利要求9所述的微流控芯片，其特征在于：所述凸起微结构为任意形状；所述凸起微结构距离主管道的内壁最远尺寸为10-500微米。
11.根据权利要求10所述的微流控芯片，其特征在于：所述凸起微结构为圆弧形或三角形。
12.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流体管道单元还包括至少一个回收池；所述回收池设于所述分支管道的一端，并与所述分支管道相连通。
13.一种微流控芯片系统，包括权利要求1-12中任一项所述的微流控芯片以及温度梯度控制装置；所述温度梯度控制装置包括芯片放置腔体、两个恒温热源，所述微流控芯片置于所述芯片放置腔体内。
14.根据权利要求13所述的微流控芯片系统，其特征在于：所述微流控芯片的上层结构和下层结构中至少一个由导热性的材料制成；由导热性材料制成的芯片的厚度为小于2毫米。
15.一种利用权利要求1-12中任一项所述微流控芯片或权利要求13或14所述微流控芯片系统，对可自发游动的细胞按照趋向性进行分级的方法，包括下述步骤：
a)在所述微流控芯片的微流体管道中充满待测试的细胞的培养液；
b)在所述微流控芯片的主管道中形成稳定的物理梯度场和/或化学梯度场；
c)在所述微流控芯片的入口池中加入待测试的细胞，并使其运动或被动运输进入主管道，进入主管道的细胞在梯度场的作用下，选择在主管道中运动或者运动到某一分支管道中，从而实现对可自发游动的细胞的分级；
所述方法用于非疾病的诊断和治疗的目的。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：步骤b)中所述物理梯度场为温度梯度场；所述温度梯度场是在权利要求15或16所述微流控芯片系统中形成的，具体方法如下：将所述微流控芯片系统中的两个恒温热源设置成不同的温度，使所述微流控芯片系统的芯片放置腔体内的空气形成温度梯度，进而使微流控芯片的上层结构和/或下层结构产生温度梯度，最终导致管道中的培养液具有温度梯度；稳定温度梯度所需的时间为3分钟以上。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：步骤b)中所述化学梯度场为化学物质的浓度梯度场，形成化学物质浓度场的具体方法如下：在所述微流控芯片的分支管道或者回收池中加入趋化性物质，其经过在微管道中的扩散，形成由分支管道到主管道逐渐降低的浓度梯度；
其中，所述可自发游动的细胞为精子，所述趋化性物质为孕酮；所述细胞为除精子外的其他细胞，所述趋化性物质为生长因子或葡萄糖。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在步骤a)后、步骤b)前，在所述微流控芯片的出口池通入与所述细胞的培养液不相溶或微溶的流体的步骤。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于：所述与细胞的培养液不相溶或微溶的流体是在出口池以正压形式通入，或从入口池以负压形式吸入。
20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于：步骤c)进行前，所述细胞的培养液与通入的流体形成的界面处于微流控芯片的主管道中。
21.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤c)中实现对可自发游动的细胞的分级的时间为3至30分钟。
22.一种对可自发游动的细胞的趋向性进行评价的方法，包括下述步骤：
1)采用权利要求15-21中任一项所述的方法对可自发游动的细胞按照趋向性进行分级；
2)观察并记录处于各个分支管道中的可自发游动的细胞的数量，统计细胞的数量并计算趋向性指数，从而评价细胞的趋向性；
所述方法用于非疾病的诊断和治疗的目的。
23.一种对可自发游动的细胞的活力进行评价的方法，包括下述步骤：
1)采用权利要求15-21中任一项所述的方法对可自发游动的细胞按照趋向性进行分级；
2)观察并记录处于各个分支管道中的细胞的运动情况，统计细胞的运动参数，从而评价细胞的活力；
所述方法用于非疾病的诊断和治疗的目的。
24.一种同时评价可自发游动的细胞的趋向性和活力的方法，包括下述步骤：
1)利用权利要求1-12中任一项所述微流控芯片或权利要求13或14所述微流控芯片系统，在所述微流控芯片的微流体管道中充满待评价的可自发游动的细胞的培养液；
2)在所述微流控芯片的主管道中形成稳定的物理梯度场和/或化学梯度场；
3)在所述微流控芯片的入口池中加入待评价的可自发游动的细胞，使其自发游动，选择分支管道入口处的平面或分支管道内的某一平面作为细胞的运动终点，从加入细胞开始计时，根据相同时间内到达终点的细胞数量或者一定数量的细胞到达终点所需要的时间，评价细胞的活力；同时，分别记录相同时间内游过左右分支管道入口处的平面或左右分支管道内的某一平面的细胞数量，根据细胞的数量计算趋向性指数，从而评价细胞的趋向性；
所述方法用于非疾病的诊断和治疗的目的。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述物理梯度场为温度梯度场；所述温度梯度场是在权利要求13或14所述微流控芯片系统中形成的，具体方法如下：将所述微流控芯片系统中的两个恒温热源设置成不同的温度，使所述微流控芯片系统的芯片放置腔体内的空气形成温度梯度，进而使微流控芯片的上层结构和/或下层结构产生温度梯度，最终导致管道中的培养液具有温度梯度；稳定温度梯度所需的时间为3分钟以上；
步骤2)中所述化学梯度场为化学物质的浓度梯度场，形成化学物质浓度场的具体方法如下：在所述微流控芯片的分支管道或者回收池中加入趋化性物质，其经过在微管道中的扩散，形成由分支管道到主管道逐渐降低的浓度梯度；
其中，所述可自发游动的细胞为精子，所述趋化性物质为孕酮；所述细胞为除精子外的其他细胞，所述趋化性物质为生长因子或葡萄糖。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在步骤1)后、步骤2)前，在所述微流控芯片的出口池通入与所述细胞的培养液不相溶或微溶的流体的步骤；
所述与细胞的培养液不相溶或微溶的流体是在出口池以正压形式通入，或从入口池以负压形式吸入。
27.一种对具有趋向性的可自发游动的细胞进行捕获的方法，包括下述步骤：
1)采用权利要求15-21中任一项所述的方法对可自发游动的细胞按照趋向性进行分级；
2)在微流控芯片的出口池持续通入与所述细胞的培养液不相溶或微溶的流体，使得两种流体的界面向入口池方向运动，最终运动至分支管道入口处停止，将分支管道的入口完全密封，完成游入分支管道的细胞的捕获；
所述方法用于非疾病的诊断和治疗的目的。
28.对利用权利要求27所述方法捕获的可自发游动的细胞进行回收的方法，包括下述步骤：
1)按照权利要求27所述方法捕获细胞，其中，分级步骤中所采用权利要求12中所述的微流控芯片或权利要求13或14所述的微流控芯片系统；
2)增大在微流控芯片的出口池通入与所述细胞的培养液不相溶或微溶的流体的压力，使得在分支管道入口处的两种流体界面继续向回收池的方向运动，将分支管道中的流体与其中的细胞一同输送到回收池中，并从回收池中加以回收；
或，采用吸水物质或毛细管伸入到微流控芯片的回收池中或通过回收池伸入到分支管道中，将其中的液体吸出，与此同时其中混有的已经被捕获的细胞也随液体一起被回收到吸水物质上或毛细管内。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于：步骤2)中通过移液器或毛细管从回收池中或通过回收池伸入到分支管道中对细胞加以回收；所述吸水物质为滤纸；所述毛细管后端增加负压辅助样品的回收。
30.权利要求1-12中任一所述微流控芯片或权利要求13或14所述的微流控芯片系统在下述方面的应用：
1)在检测与筛选具有运动能力的细胞中的应用；
2)在精子质量检测中的应用；
3)在检测和/或筛选精子的趋向性中的应用；
4)在检测和/或筛选细菌的趋向性中的应用；
所述应用为非疾病的诊断和治疗目的方面的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210149032.9A CN103421675B (zh) | 2012-05-14 | 2012-05-14 | 精子趋向性评价及筛选的方法及其专用微流控芯片系统 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210149032.9A CN103421675B (zh) | 2012-05-14 | 2012-05-14 | 精子趋向性评价及筛选的方法及其专用微流控芯片系统 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103421675A CN103421675A (zh) | 2013-12-04 |
| CN103421675B true CN103421675B (zh) | 2015-07-01 |
Family
ID=49647071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210149032.9A Active CN103421675B (zh) | 2012-05-14 | 2012-05-14 | 精子趋向性评价及筛选的方法及其专用微流控芯片系统 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103421675B (zh) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104818200A (zh) * | 2015-03-16 | 2015-08-05 | 中国科学院微生物研究所 | 一种分选装置及趋性目的物分选方法 |
| CN104965082B (zh) * | 2015-05-21 | 2016-08-24 | 大连理工大学 | 一种同时检测尿液中膀胱癌细胞、结石、血细胞和细菌的微流控芯片 |
| CN105154392A (zh) * | 2015-11-03 | 2015-12-16 | 上海市第一妇婴保健院 | 一种提高精子运动速度的试剂及方法 |
| EP3405560B1 (en) * | 2016-01-22 | 2023-03-29 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | A micro-fluidic device for selective sorting of highly motile and morphologically normal sperm from unprocessed semen |
| CN107099444B (zh) * | 2017-04-17 | 2024-04-09 | 隗慧林 | 精子分选芯片、精子检测设备及精子检测方法 |
| CN110551618B (zh) * | 2019-09-27 | 2021-04-23 | 中国科学技术大学 | 一种精子分选装置 |
| CN111592970A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-08-28 | 湖南孚迈生物科技有限公司 | 一种用于精子筛选的微通道协同孕酮趋化芯片及其使用方法 |
| CN111961570A (zh) * | 2020-07-06 | 2020-11-20 | 清华大学 | 全集成仿生精子筛选芯片及其制备方法 |
| CN112430542B (zh) * | 2020-11-25 | 2022-06-14 | 中南大学 | 集成微流控三维肿瘤芯片及仿生方法 |
| CN112973815B (zh) * | 2021-03-09 | 2022-06-03 | 西北大学 | 一种聚集非球形微游泳体的微流管道及一种过滤方法 |
| CN115138402A (zh) * | 2021-03-31 | 2022-10-04 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种能够设置化学浓度梯度的微流控芯片及其制备方法和应用 |
| CN114164078A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-11 | 齐齐哈尔大学 | 一种细菌趋化物质筛选载玻片及其应用 |
| CN116121179B (zh) * | 2023-03-14 | 2023-09-29 | 苏州贝康医疗器械有限公司 | 精子优选和检测方法、装置、电子设备及存储介质 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101914435A (zh) * | 2010-05-24 | 2010-12-15 | 博奥生物有限公司 | 一种微管道装置及其使用方法 |
| DE102009045403A1 (de) * | 2009-10-06 | 2011-04-07 | INSTITUT FüR MIKROTECHNIK MAINZ GMBH | Vorrichtung zur Phasentrennung |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7211442B2 (en) * | 2001-06-20 | 2007-05-01 | Cytonome, Inc. | Microfluidic system including a virtual wall fluid interface port for interfacing fluids with the microfluidic system |
-
2012
- 2012-05-14 CN CN201210149032.9A patent/CN103421675B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102009045403A1 (de) * | 2009-10-06 | 2011-04-07 | INSTITUT FüR MIKROTECHNIK MAINZ GMBH | Vorrichtung zur Phasentrennung |
| CN101914435A (zh) * | 2010-05-24 | 2010-12-15 | 博奥生物有限公司 | 一种微管道装置及其使用方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103421675A (zh) | 2013-12-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103421675B (zh) | 精子趋向性评价及筛选的方法及其专用微流控芯片系统 | |
| Nosrati et al. | Microfluidics for sperm analysis and selection | |
| EP3460051B1 (en) | Microfluidic chips for acquiring sperms with high motility, productions and applications thereof | |
| JP7453653B2 (ja) | 粒子分離システムおよび方法 | |
| US8921122B2 (en) | System and method for quantitative assessment of biological migration behavior | |
| CN110496655B (zh) | 一种基于微流控技术的肿瘤细胞检测芯片 | |
| CN102242055B (zh) | 一种精子活力评价及筛选的方法及其专用微流控芯片装置 | |
| CN105026932B (zh) | 微流控分配设备 | |
| US9140697B2 (en) | Device for capturing circulating cells | |
| KR100746431B1 (ko) | 셀 소터 칩 | |
| CA2809877C (en) | Method and device for isolating cells from heterogeneous solution using microfluidic trapping vortices | |
| JP5859425B2 (ja) | 分析のための細胞を含む流体の薄層の調製 | |
| CN109682962B (zh) | 基于微流控芯片的免疫荧光检测系统及检测方法 | |
| CN104513787A (zh) | 用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片及系统 | |
| JP2006180810A (ja) | 細胞計測および分離チップ | |
| JP2011013208A (ja) | 生物学的操作システム及び工業的操作システム | |
| CN207703876U (zh) | 一种基于微流控的荧光免疫检测芯片 | |
| CN111796104A (zh) | 一种外泌体检测分型微流控芯片及外泌体检测分型方法 | |
| CN101625359A (zh) | 基于电极修饰技术的梅毒诊断专用多通道微流控芯片 | |
| CN102504997B (zh) | 一种细胞观测实验用芯片 | |
| CN209727963U (zh) | 基于微流控芯片的免疫荧光检测系统 | |
| CN201421455Y (zh) | 一种应用于梅毒诊断的专用微流控芯片 | |
| Suh et al. | Microfluidic applications for andrology | |
| CN108587860A (zh) | 用于筛查乳腺癌细胞的微流控芯片组合装置及其制备方法和应用 | |
| CN114410428B (zh) | 一种精子分选的微流控芯片 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 102206 Beijing City, Changping District Life Science Park Road No. 18 Applicant after: CAPITALBIO CORPORATION Applicant after: Tsinghua University Address before: 102206 Beijing City, Changping District Life Science Park Road No. 18 Applicant before: Capitalbio Corporation Applicant before: Tsinghua University |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: CAPITALBIO CORPORATION TO: CAPITALBIO CORPORATION CO., LTD. |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |