CN104818200A - 一种分选装置及趋性目的物分选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微型生物体分选和微流控分析领域，特别涉及一种分选装置及微型生物体分选方法。该装置包括层流分离装置和液滴生成装置，所述层流分离装置与所述液滴生成装置连接设置。层流分离装置可以对连续引入的微型生物体悬液施加具有空间梯度分布或方向性的外部刺激，使处于层流直线运动的微型生物体偏离流动方向，在层流分离装置的出口处产生分布空间变化并分流进入液滴生成装置。微型生物体趋性响应的刺激强度、空间、时间等可以通过流动的变化进行精确调节；单细胞液滴使分选后的趋性细胞可以直接进行批量化的操作、培养和分析，可以应用于特殊趋性的细菌、藻类、真菌、动物细胞、多细胞微生物等的大批量筛选、获取和分析。

Description

一种分选装置及趋性目的物分选方法

技术领域

本发明涉及微型生物体分选和微流控分析领域，特别涉及一种分选装置及微型生物体分选方法。

背景技术

趋性是一种生物(或细胞及多细胞生物)特有的重要生理行为反应，指其对一指向性刺激(由特定方向给的刺激)，而会有趋进(正趋性)或远离(负趋性)刺激源的动作。趋性和向性不同，生物的趋性有移动性且显现出趋进至远离刺激源指向运动(K.S.Charles,Animal Ecology.1961)。其中趋化性是指生物细胞感应外界化学刺激，做出定向移动的行为。趋化性广泛存在于多种生物细胞内，具有很强的特异性和选择性。趋化行为也是众多微生物适应环境变化、优化生存方式的基本生物属性，使得微生物在寻找食物或者逃避毒性环境等方面，具有生存竞争优势(J.Adler,et al.,Chemotaxis in bacteria.Science.1966,12,153.；L.D.Miller,et al.,Diversity in bacterial chemotacticresponses and niche adaptation.Adv.Appl.Microbiol.2009,66:53)。除了趋化性，很多生物在漫长的进化过程中，还发展出了对各种物理刺激的趋性，如趋光性，趋温性，趋磁性等。研究这些具有特殊趋性的微生物的趋性机制，对于阐明生物刺激相应的机理，讯号传导过程，微生物代谢途径等具有重要意义。基于微生物趋性可以带来许多重要的生物技术的突破，如污染物治理，石油微生物勘探，生物传感器等。

传统方法对于趋化性的研究方法包括游动平板法(Swarm plate assay)、滴定分析法(Drop assay)、琼脂糖塞子法(Agarose plug assay)、毛细管法(Capillary assay)、数量分析法(Quantification assay)等，其主要缺陷在于难以形成稳定的趋化效应物浓度梯度，实验的误差较大，重现性差，难以精确定量。微流控是近几年发展起来的一种利用微米尺寸的通道网络进行精确生化流体操控的技术和方法。微流控芯片的尺寸与细胞及微生物尺度匹配，流体的流动在微尺度下主要是层流，物质的扩散可以精确的进行调控，具有控制简便、耗样量小、检测灵敏的优点，在生物分析中得到了广泛应用。目前已有通过层流建立梯度浓度(N.L.Jeon,S.K.W.Dertinger,D.T.Chiu,I.S.Choi,A.D.Stroock and G.M.Whitesides,Langmuir,2000,16,22)，并对细胞的趋化性进行分析的技术出现(H.Mao,P.S.Cremer and M.D.Manson.Asensitive,versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.PNAS.2003,29,100)。然而，在芯片上对微生物趋性进行定量研究仍然面临以下困难：

(1)处于运动的细胞很难在明场下精确观察和计数，因此通常采用荧光蛋白标记的方法使细胞能在荧光显微镜下观察。然而，对许多微生物和动物细胞的荧光标记较为困难，且有可能影响细胞的活性和趋化性；且通常的荧光显微镜价格昂贵，限制了芯片方法的推广。

(2)细胞的趋性是后续实验的开端，对于具有趋性的细胞，根据研究兴趣和目标的不同，需要进行一系列实验，包括降解能力测试、细胞类型鉴定、生长条件优化、以及趋性细胞对各种物理刺激的耐受能力的测试等。对于这些测试，目前仍依赖于离线的手工方法进行，费时费力，这与连续高通量的微流控趋性分离芯片难以匹配。

(3)对于趋性细胞的分析，目前仍然以群体细胞作为分析对象，如何做到对大批量的单细胞进行精确的定量分析和分离培养是一个难题。

因此，提供一种分选装置及微型生物体分选方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种分选装置及微型生物体分选方法。在微流控芯片中提供外部刺激容易量化，并能够层流状态下保持稳定；微型生物体趋性响应的空间、时间等可以通过流动的变化进行精确调节；包裹单个微型生物体的液滴使分选后的趋性微型生物体可以直接进行批量化的操作、培养以及统计分析，减少了人为干预和交叉污染，可以应用于特殊趋性的细菌、真菌、藻类、动物细胞等的大批量筛选、获取和分析。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种微型生物体分选装置，包括层流分离装置和微型生物体液滴生成装置，所述层流分离装置与所述微型生物体液滴生成装置连接设置。

在本发明的一些实施例中，微型生物体分选装置为微流控芯片，层流流动及液滴生成都是在微流控芯片通道内进行的。所述微流控芯片的构型为一扁平的长方形的微流控通道，趋性分离微室的优化宽度在10μm至50mm之间，优化长度在20μm至500mm之间，深度在1μm至5mm之间。

在本发明的一些实施例中，微型生物体分选装置中层流分离装置为趋性层流分离微室，所述趋性层流分离微室含有两个以上的溶液进入通道，其中至少一个通道用于引入微型生物体悬液。

在本发明的一些实施例中，微型生物体分选装置中所述层流分离装置包括待测样品进样口5。

在本发明的一些实施例中，微型生物体分选装置中所述层流分离装置还包括层流液第一进样口6。在本发明的一些具体实施方案中，层流液第一进样口6可以通入缓冲液或逆趋化物溶液。

在本发明的一些实施例中，微型生物体分选装置中所述层流分离装置还包括层流液第二进样口7。在本发明的一些具体实施方案中，层流液第二进样口7可以通入正趋化物溶液或缓冲液。

在本发明的一些实施例中，微型生物体分选装置中所述微型生物体层流分离装置具有两个以上的溶液出口通道。

在本发明的一些实施例中，微型生物体分选装置中所述微型生物体液滴生成装置中水相液流与油相液流在微通道内汇流，并形成油包水的水相液滴。在本发明的一些具体实施方案中，生成的液滴的大小为1pL至10μL。

在本发明的一些实施例中，微型生物体分选装置中所述层流分离装置与所述微型生物体液滴生成装置连接，即所述层流分离装置的至少一个液体出口通道与所述微型生物体液滴生成装置连接。在本发明的一些具体实施方案中，趋性层流分离微室的至少一个液体出口通道与一个液滴生成结构相连。

在本发明的一些实施例中，微型生物体分选装置中所述微型生物体液滴生成装置包括混合溶液进样口9；混合溶液可以是培养基，微型生物体检测指示剂，代谢底物和微型生物体裂解液等。用于引入培养基、微型生物体指示剂、微型生物体代谢转化底物、微型生物体裂解液等培养和测试试剂。

在本发明的一些实施例中，微型生物体分选装置中所述微型生物体液滴生成装置还包括载流油相进样口10。

在本发明的一些实施例中，微型生物体分选装置中所述微流控微型生物体分选装置还包括收集装置。

在本发明的一些实施例中，微型生物体分选装置中所述收集装置包括趋化微型生物体收集装置12和液滴收集装置11。

在本发明的一些实施例中，微型生物体分选装置中所述微流控微型生物体分选装置还包括液滴存储装置13。

在本发明的一些实施例中，微型生物体分选装置中所述微流控微型生物体分选装置还包括废液收集装置8。

本发明还提供了上述微型生物体分选装置在分选趋性微型生物体中的应用。

本发明还提供了一种基于上述微型生物体分选装置的分选趋性微型生物体的方法，将待测样品引入所述层流分离装置，经趋性定向迁移，所述待测样品中的趋性微型生物体在所述微型生物体液滴生成装置中被包裹在油包水液滴中，收集所述趋性微型生物体。

在本发明的一些具体实施方案中，基于上述微型生物体分选装置的分选趋性微型生物体的方法具体包括以下步骤：

a)制备包括微型生物体趋性层流分离微室和微型生物体液滴生成两部分构型的微流控芯片；

b)将微型生物体趋性实验所需的微型生物体样品和试剂通过注射泵和泵管连接到微流控芯片的溶液接口上，具体为将微型生物体趋性实验所需的微型生物体样品连接到测样品进样口5，将缓冲液或逆趋化物溶液连接到层流液第一进样口6，将正趋化物溶液或缓冲液连接到层流液第二进样口7；同时注入微流控层流分离微室，并在通道内层流流动；

c)引入层流分离微室的微型生物体垂直于流动方向上发生趋性定向迁移；

d)从微流控层流分离微室的趋化微型生物体收集装置12和废液收集装置8分别收集趋性和非趋性微型生物体；具体的，趋化微型生物体收集装置12为趋性微型生物体出口，废液收集装置8为非趋性微型生物体出口，分别收集趋性和非趋性微型生物体；

e)所收集的趋性微型生物体进入收集通道所连接的液滴生成装置，微型生物体被包裹到油包水液滴中；

f)通过收集装置对液滴收集进行进一步的培养、分析、测试等操作；

所述收集装置包括趋性微型生物体收集装置12和液滴收集装置11；

所述微流控微型生物体分选装置还包括废液收集装置8。

在本发明的一些具体实施方案中，趋性定向迁移为基于趋化效应物的趋化迁移，或者基于外加物理场的微型生物体对外界施加的光、电、磁、热等方向性或具有梯度的物理场的响应迁移，或者微型生物体与微型生物体之间相互作用诱导的迁移。进入层流分离微室的微型生物体悬液、趋化效应物溶液和缓冲液等平行层流流动，趋化效应物由于扩散作用，在垂直于通道及流动方向上产生浓度梯度，并使微型生物体产生定向迁移。

基于这种原理的定向分离，除了趋化物外，影响趋性定向迁移的因素还可以为温度，辐射，磁场，电场，细胞通讯或群感效应，趋化物的种类扩充(小分子，金属离子，溶氧溶气，DNA，蛋白，多糖，盐)的趋化作用。

在本发明的另一些具体实施方案中，还可以利用进入芯片层流溶液的温度、粘度、渗透压等物理参数，来创造非化学效应物的物理梯度和调控微型生物体的迁移。

在本发明的一些具体实施方案中，可以通过调节溶液的流速，可以改变浓度梯度的分布状况，并调节微型生物体在层流分离微室内停留的时间。

在本发明的一些具体实施方案中，可以在垂直于层流分离微室方向，对流经微室的微型生物体施加定向的电磁辐射、电场、磁场、温度梯度等刺激，使其产生定向迁移。

在本发明的一些具体实施方案中，载流油相与水不互溶，优选矿物油、十四烷、全氟烷烃油等。

在本发明中，微型生物体为细菌、藻类、真菌或动物细胞。具体为具有特殊趋性的细菌、真菌、动物细胞、多细胞微生物，本发明在此不做限定。在本发明的一些实施例中，微型生物体为细胞。

本发明提供了一种微型生物体分选装置，包括层流分离装置和微型生物体液滴生成装置，所述层流分离装置与所述微型生物体液滴生成装置连接设置。本发明中将层流趋化技术与液滴微流控技术相结合，提出了一种集成化的高通量趋性微型生物体分离、分析、培养和检测的平台。液滴微流控采用不互溶的两种流体在微通道内汇流，使其中一相以液滴的状态均匀分散于另一相中的微流控模式。液滴由于其极小的体积和相互独立的状态，能够有效的对试剂进行分割，同时避免交叉污染，在单细胞分析中具有重要的意义。目前，对液滴的二次分割、液滴融合、液滴选择性提取和液滴反应等技术已经渐趋成熟，液滴作为可程序化控制的多功能反应、检测、和分析单元，为大批量微体积筛选提供了一个理想的平台。我们将芯片微型生物体趋性分离技术与液滴微流控技术结合，弥补当前微流控芯片上微型生物体趋性实验实时分析不精确的不足，提供后续单细胞或单个微生物个体大批量操控能力，为趋性微型生物体的分离分析提供一种更加简便易行的集成化方案。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是本发明的微流控装置的简化结构示意图；其中：2为微流控芯片，5为待测样品进样口，6为层流液第一进样口，7为正趋化效应物溶液进样通道，8为废液通道，9为培养基进样通道，10为载流油相进样通道，11为液滴收集通道，12为趋性微型生物体收集通道，13为液滴收集装置，14为层流分离微室；

图2是本发明实施例1的芯片装置示意图；其中：1为待测样品，2为微流控芯片，3为目标微型生物体，4为非目标微型生物体，5为待测样品进样口，6为层流液第一进样口，7为正趋化效应物溶液进样通道，8为废液通道，9为培养基进样通道，10为载流油相进样通道，11为液滴收集通道，12为趋化微型生物体收集通道，13为液滴存储特氟龙毛细管；

图3是本发明优选实施例1的实验流程示意图；

图4是本发明优选实施例1的芯片实物图；为了显示清楚，芯片通道内的溶液为色素溶液；

图5为本发明优选实施例1所收集到的液滴的明场显微照片；

图6为本发明优选实施例1所收集到的液滴的红色荧光显微照片；

图7为本发明优选实施例1中，层流分离微室下游1mm处的大肠杆菌RP437的空间分布；

图8为本发明优选实施例1中，层流分离微室下游1mm处，大肠杆菌RP437在不同位置的积分数量分布；

图9是本发明对照例1中，层流分离微室下游1mm处的大肠杆菌RP437的空间分布；

图10为本发明对照例1中，层流分离微室下游1mm处，大肠杆菌RP437在不同位置的积分数量分布；

图11为本发明实施例2对大肠杆菌RP437和大肠杆菌RP1616混合均样品的趋化分离后，液滴培养的结果；

图12为本发明对照例2对大肠杆菌RP437和大肠杆菌RP1616混合均样品的趋化分离后，液滴培养的结果；

图13为本发明实施例3，用于趋光性细胞分选和培养的芯片装置及使用方法的示意图；其中：2为微流控芯片，5为待测样品进样口，6为层流液第一进样口，7为层流液第二进样口，8为废液通道，9为混合溶液进样口，10为载流油相进样通道，11为液滴收集通道，12为趋化细胞收集通道，13为液滴存储特氟龙毛细管，14为半导体发光二极管(light-emitting diode,LED)光源；

图14为本发明实施例4，用于中性粒细胞与金黄色葡萄球菌相互作用研究的芯片装置及使用方法的示意图；其中：2为微流控芯片，5为待测样品进样口，6为层流液第一进样口，7为层流液第二进样口，8为废液通道，9为混合溶液进样口，10为载流油相进样通道，11为液滴收集通道，12为趋化细胞收集通道，13为液滴存储特氟龙毛细管，14为白细胞，15为金黄色葡萄球菌，16为中性粒细胞。

具体实施方式

本发明公开了一种分选装置及微型生物体分选方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种芯片装置，能够完成微型生物体分选、单个微型生物体分离、培育和检测等功能。该芯片具有层流分离微室和液滴生成两部分微流控通道结构，这两部分通道前后相连，能够共同完成趋性微型生物体的分离分选，和趋性微型生物体液滴孵育、反应和分析的功能。

本发明提供了一种用于微型生物体趋性研究的微流控装置，主要包括微型生物体趋性层流分离微室和微型生物体液滴生成两部分构型。

作为优选，所述的层流流动及液滴生成都是在微流控芯片通道内进行的。

作为优选，层流分离微室的构型为一扁平的长方形的微流控通道，趋性分离微室的优化宽度在10μm至50mm之间，优化长度在20μm至500mm之间，深度在1μm至5mm之间。

作为优选，层流分离微室含有两个以上的溶液进入通道，其中至少一个通道用于引入微型生物体悬液。在本发明的一些实施例中，微型生物体为细胞。

作为优选，层流分离微室具有两个以上的溶液出口通道。

作为优选，液滴生成结构水相液流与油相液流在微通道内汇流，并形成油包水的水相液滴。

作为优选，液滴生成结构生成的液滴的大小为1pL至10μL。

作为优选，层流分离微室，层流分离微室的至少一个液体出口通道与一个液滴生成结构相连。

本发明还提供一种集成化的分选、培养和检测趋性微型生物体的方法。该方法利用微流控芯片中的稳定层流形成浓度梯度，利用微型生物体的趋性完成分选，同时通过微液滴技术获得微型生物体，并进行培育和检测。本发明将一系列复杂的功能集成化，解决了目前存在的微流控芯片技术中存在的问题，降低了相关实验操作的难度。

本发明提供了使用该微流控芯片装置进行微型生物体分选、分离和检测的方法，包括以下步骤：

a)层流分离微室部分的含两个以上入口，通过微量注射泵持续注入待分离样品、缓冲液或趋化效应物溶液。待分离样品中的目标微型生物体在层流微室中层流流动，感受趋性刺激并偏离层流的初始运动轨迹，在层流通道的出口，趋性微型生物体会进入趋性微型生物体收集通道，而在没有相应的物理刺激或浓度梯度的对照实验中，趋性微型生物体会进入废液收集通道。

b)液滴生成通道部分的水相入口通入培养基、细胞反应液、或其他用于测试的试剂，并与趋性通道收集的趋性微型生物体溶液汇合，油相入口通入载流油相形成液滴。液滴可以连续不间断的生成。

c)收集生成的液滴，进行必要的存储、孵育，获得液滴中微型生物体的生长、显色、液滴组分变化等信息，并对其进行统计学分析。

步骤a)所述的趋性，指微型生物体感受外界化学物质，温度，辐射，磁场，电场等，并作出有利于微型生物体自身生存的方向性迁移。对于趋化性分析，我们利用趋化效应物在层流中的自由扩散浓度梯度实现微型生物体的趋化迁移。对于趋光、趋磁或趋电等细胞的分析，我们通过在缓冲液层流保护限制微型生物体的引入区域，并通过外加具有方向性的光源、磁场或电场，对层流中的微型生物体施加趋性刺激。

步骤a)所述的趋性刺激，可以对目标微型生物体起正趋性作用，也可以对目标微型生物体起负趋性作用。

步骤a)所述的趋化效应物的浓度梯度，其梯度受到流速和趋化效应物溶液的初始浓度的影响，应该按照实际需求进行选择。

步骤b)所述的载流油相可以是任何与水不相溶的流体，优选液体为全氟烷烃油或矿物油。

作为优选，基于以上微流控装置的用于趋性微型生物体分析分选的方法，具体包括以下步骤：

a)制备包括微型生物体趋性层流分离微室和微型生物体液滴生成两部分构型微流控芯片；

b)将微型生物体趋性实验所需的细胞样品和试剂通过注射泵和泵管连接到微流控芯片的溶液接口上，同时注入微流控层流分离微室，并在通道内层流流动；

c)引入层流分离微室的微型生物体垂直于流动方向上发生趋性定向迁移；

d)从微流控层流分离微室的趋性微型生物体出口和非趋性微型生物体出口，分别收集趋性和非趋性微型生物体。

e)所收集的趋性微型生物体进入收集通道所连接的液滴生成通道结构，微型生物体被包裹到油包水液滴中。

f)对液滴进行进一步的培养、分析、测试等操作。

作为优选，趋性迁移可以使基于趋化效应物的趋化迁移，或者基于外加物理场的微型生物体对外界施加的光、电、磁、热等方向性或具有梯度的物理场的响应迁移，或者细胞与细胞之间相互作用诱导的迁移。

作为优选，趋性迁移为进入层流分离微室的微型生物体悬液、趋化效应物溶液和缓冲液等平行层流流动，趋化效应物由于扩散作用，在垂直于通道及流动方向上产生浓度梯度，并使细胞产生定向迁移。

作为优选，趋性迁移可以利用进入芯片层流溶液的温度，粘度、渗透压等物理参数，来创造非化学效应物的物理梯度和调控微型生物体的迁移。

作为优选，通过调节溶液的流速，可以改变浓度梯度的分布状况，并调节微型生物体在层流分离微室内停留的时间。

作为优选，可以在垂直于层流分离微室方向，对流经微室的微型生物体施加定向的电磁辐射、电场、磁场、温度梯度等刺激，使其产生定向迁移。

作为优选，使用的载流油相与水不互溶，优选矿物油、十四烷、全氟烷烃油等。

本发明提供的微流控微型生物体分选装置集成了层流分离微室和液滴生成与调控机构两部分。层流分离微室可以对连续引入的微型生物体悬液施加具有空间梯度分布的外部刺激，使处于层流直线运动的微型生物体偏离流动方向，在层流分离微室的出口处产生微型生物体的分布空间变化。液滴生成装置能够收集具有特定趋性迁移能力的微型生物体，并将微型生物体与相应的培养基、指示剂、检测试剂等混合，在与不互溶油相汇流的过程中，生成包裹单个或多个微型生物体的油包水微液滴，实现在线的趋性微型生物体分析、鉴定、培养以及裂解等操作。所述的趋性层流分离微室中，微型生物体受到的外部刺激可以是化学物质、光、电、磁、温度等，个体微型生物体将根据自身的趋性发生偏离流动方向的迁移，进而进入不同的收集通道，并形成油包水的微液滴，进行高通量的基于微液滴的定量分析和培养等操作。该发明的优势在于在微流控芯片中提供外部刺激容易量化，并能够层流状态下保持稳定；微型生物体趋性响应的空间、时间等可以通过流动的变化进行精确调节；微型生物体液滴使分选后的趋性微型生物体可以直接进行批量化的操作、培养以及统计分析，减少了人为干预和交叉污染，可以应用于特殊趋性的细菌、真菌、动物细胞等的大批量筛选、获取和分析。

本发明的优点在于利用层流流动限制引入微型生物体的初始流动轨迹，并利用浓度梯度和外加物理场等，对微型生物体施加可精确定量的化学和物理刺激，能够持续稳定的对微型生物体样品进行趋性分选。本发明的优点还在于可以通过调整各液相的流速控制目标微型生物体进入液滴生成通道的比例，获得具有不同趋性能力的微型生物体。

本发明提供的微流控分选装置及微型生物体分选方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

图1、图2是本发明优选实施例1的用于微生物趋化性分析和分离微流控芯片的结构示意图，芯片为PDMS(聚二甲基硅氧烷)材质，按照功能分为水相层流细胞趋化和油包水单细胞包裹液滴生成两个部分：

第一部分：层流趋化部分含有细胞悬液入口即待测样品进样口5、趋化效应物溶液入口即层流液第二进样口7、缓冲液入口即层流液第一进样口6。三个入口引入的溶液在趋化微室内形成层流流动。层流趋化微室的宽度为2.1mm，长5mm，深度为100μm。细胞引入口在层流趋化微室的中间，入口的宽度为0.1mm，两侧的通道的宽度分别为1mm，用于引入趋化效应物和缓冲液。趋化效应物在层流微室内由于扩散作用，形成浓度梯度。细胞感受到浓度梯度，选择性的发生趋化的迁移。趋化微室有两个不对称的出口，其中与趋化效应物入口对应的是上侧通道12(宽度为500μm)、与缓冲液入口对应的是下侧通道8(1600μm)。不对称出口的设计可以使趋化的细胞和不趋化的细胞发生分离。进入下侧通道8的细胞为废弃的趋性较弱的细胞。进入上侧通道的为具有较强趋性细胞。

第二部分：液滴生成部分与层流趋化部分的上侧通道12相连。包含了混合溶液进样口9，油相载流通道10，以及液滴形成通道11。所有通道的深度均为200μm。其中，油相载流通道与液滴生成通道在一条直线上，试剂通道和趋化上侧通道在其下侧混合后，和油相液流汇合，形成液滴。液滴形成通道的宽度为100μm。液滴形成通道的出口接入一根内径200μm，外径250μm的特氟龙(Teflon)毛细管13，长度为30cm。毛细管与芯片通道的间隙用熔融的石蜡填充缝隙，防止泄漏。特氟龙毛细管可以稳定的储存液滴，形成一维液滴阵列，避免液滴的蒸发，并方便对液滴进行孵育和细菌生长的观察。

芯片的溶液接口直径为0.6mm左右，能够直接与连接外径0.8mm的特氟龙泵管的注射器通过泵管连接。

实验简要步骤如图3所示，主要包括：

(1)样品和试剂制备：在此优选实施例中，我们选取了红色荧光蛋白标记的大肠杆菌RP437作为趋化菌株。RP437对天冬氨酸的强趋化性，红色荧光蛋白标记的便于对菌的游动和位置进行实时观察和定位。将RP437在LB(Lysogeny broth)培养基中培养到OD＝0.3左右，离心去除培养基，用磷酸盐缓冲溶液(1×PBS)清洗细胞两次，并根据OD值调整至1×10⁷CFU/mL作为待测样品。同时，选取pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(1×PBS)作为缓冲液，10mM的天冬氨酸溶液作为趋化效应物溶液。选取LB培养基，FC-40作为载流油相。

(2)趋化和液滴收集：将样品、趋化效应物、缓冲液、培养液、载流油相等装载到50μL的注射器中，并将注射器固定到可编程控制的注射泵上。开始时，用微量注射泵将缓冲液、待测混合菌样、趋化效应物溶液分别按250nL/min、25nL/min、250nL/min的流速，从6、5、7入口注入微流控芯片的趋化分离微室，芯片的废液出口以230nL/min的流速向外抽液体。在倒置荧光显微镜下观察层流通道的上下游的荧光细菌的分布情况，并拍照记录。

(3)待趋化通道中稳定层流建立5min后，用微量注射泵将培养基和载流油相分别按200nL/min和2000nL/min的流速，从入口9和入口10注入微流控装置。实验达到稳定后，在芯片液滴生成通道出口的特氟龙毛细管内能够连续收集到包裹细菌的液滴。最初产生的部分液滴会随着流动从特氟龙毛细管的出口流出并舍弃。

(4)待毛细管内收集到足够多的液滴后，将特氟龙毛细管从芯片连接口拔下，并停止注射泵。将毛细管的两端用熔融的石蜡封闭，避免液滴的流失和蒸发，并放置在30℃的培养箱中培养24小时。图5是毛细管内的一个液滴培养24小时后的明场照片，可以看到液滴内有微小的运动的细胞。图6是同一个液滴的在535nm激发，570nm发射的荧光照片。可以看到红色荧光的大肠杆菌充满了整个液滴。

为了进一步说明以上芯片的操作，图4展示了本发明优选实施例1的芯片的实物图。芯片的细胞悬液入口、缓冲液入口、趋化效应物入口分别连接纯水、黄色素溶液，蓝色素溶液，培养基入口连接红色素溶液，载流油相入口连接FC-40油相。按照以上流速设定，我们可以在层流分离微室中观察到黄色和蓝色色素的扩散浓度梯度，并再废液出口收集到绿色的溶液，在毛细管内收集大小均一的蓝灰色液滴。

图7为实施例1所获得的在层流分离微室下游1mm处的大肠杆菌RP437分布位置图。可以看到大肠杆菌向右侧(天冬氨酸)趋化的趋势。

图8为实施例1所获得的在层流分离微室下游1mm处大肠杆菌在通道横截面上的数量分布图。可以看到RP437偏离了其进样的中心线(垂直虚线)，向右侧趋化。分离微室的分选位置为垂直的实线。根据细胞数目的积分，约35％的大肠杆菌由于其对天冬氨酸的趋化性，偏向通道右侧。在本实施例中，最终消耗RP437菌液1.2μL，获得含有红色荧光标记大肠杆菌RP437的液滴127个。

实施例2

在此优选实施例中，我们选取了两种大肠杆菌的混合菌悬液测试芯片对趋化微生物细胞的分离作用。这一分离能力在对于未知环境样品中趋化菌的富集分离方面具有应用价值。红色荧光蛋白标记的大肠杆菌RP437具有对天冬氨酸的强趋化性，绿色荧光蛋白标记的大肠杆菌RP1616为鞭毛缺失菌株，不能够对天冬氨酸作出趋化响应。将上述两种大肠杆菌在LB培养基中培养到OD＝0.3左右，离心去除培养基，用磷酸盐缓冲溶液(1×PBS)清洗细胞两次，并根据OD值调整至1×10⁷CFU/mL，然后将两种菌的PBS悬液1:1混合，作为待测样品。同时，选取pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(1×PBS)作为缓冲液，10mM的天冬氨酸溶液作为趋化效应物溶液。选取LB培养基，FC-40作为载流油相。

按照实施例1的实验条件，我们对该样品进行了趋化和液滴生成实验。并对毛细管收集得到的液滴进行了24小时培养。对培养后的液滴，我们采用明场、绿色荧光和红色荧光分别拍照，并计算空白液滴、红色荧光液滴(含RP437)、绿色荧光液滴(含RP1616)、绿色和红色荧光兼有的液滴(含RP437和RP1616)的数量。其最终的统计结果如图11所示。可以看到，得到的RP437的液滴的数量为46％，明显高于含RP1616的液滴的数量(4％)。显示了芯片高效分离趋化性细菌的能力。

实施例3

图12是本发明的实施例3的实现趋光性细胞分选培养的示意图。该实施例旨在说明本发明除了利用层流的扩散浓度梯度实现趋化性细胞的趋化性分析和分离外，还能够利用外加的方向性物理场对趋性细菌进行分离。微流控装置的结构和尺寸与实施例1相同。在层流分离微室的上侧5mm处放置一个LED灯：500nm波长，电压4.5V,电流10mA。从中间入口通道5引入细胞浓度为1×10⁶CFU/mL的趋光性的衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的培养基溶液，在通道7和6分别通入纯培养基(培养基采用纯水配制，含0.03％酵母提取物，0.03％牛肉膏，0.06％胰蛋白胨，0.3％葡萄糖，pH＝7.2)。在LED打开时，启动注射泵，开始层流趋光实验和液滴收集。在液滴收集通道收集趋光微生物并进行液滴培养。

实施例4

图14是本发明的实施例4的装置示意图，该装置被应用于中性粒细胞与金黄色葡萄球菌的吞噬作用的研究。装置的通道结构与实施例1相同。在通道7通入金黄色葡萄球菌15的1×PBS悬液，其浓度为1×10⁷CFU/mL。在下侧通道6通入1×PBS。中间通道5通入分离健康人体血液的中性粒细胞16的1×PBS悬液，其浓度为1×10⁶CFU/mL。

由于中性粒细胞对金黄色葡萄球菌的趋向性和吞噬能力，白细胞14在流动过程中，能够向金黄色葡萄球菌定向迁移。部分活性较高的中性粒细胞随金黄色葡萄球菌进入上侧收集通道，与细胞培养液混合后，在5nL的液滴内与金黄色葡萄球菌进行相互作用。生成液滴体积为5nL时，液滴内的金黄色葡萄球菌的个数约为10个，白细胞的数量为1个或0个。在液滴内进行白细胞与金黄色葡萄球菌的相互作用研究，可以观察白细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬作用，及金黄色葡萄球菌分泌物对白细胞的拮抗作用。本方法的优势在于，通过层流分离微室的定向迁移，对中性粒细胞中具有高活度的细胞进行选择性富集，避免了因为细胞活度差异影响细胞-细菌相互作用研究的结果。

对照例1

芯片及细菌样品和试剂配制和实验条件同实施例1。将注入通道7的趋化效应物溶液替换为pH＝7.0的1×PBS缓冲液。在此条件下，从中间通道通入的大肠杆菌RP437不受到趋化效应物浓度梯度的影响。图9是对照例1所获得的在层流分离微室下游1mm处大肠杆菌RP437的分布位置图。可以看到大部分大肠杆菌集中在中间，没有发生明显的向两侧的迁移。图10为对照例1所获得的在层流分离微室下游1mm处大肠杆菌在通道横截面上的数量分布图。可以看到大肠杆菌大部分集中在分选实线的左侧，发生趋化的大肠杆菌的数量非常少。

对照例2

芯片及细菌样品和试剂配制和实验条件同实施例2。将注入通道7的趋化效应物溶液替换为pH＝7.0的1×PBS缓冲液。并对毛细管收集得到的液滴进行了24小时培养。对培养后的液滴，我们采用明场、绿色荧光和红色荧光分别拍照，并计算空白液滴、红色荧光液滴(含RP437)、绿色荧光液滴(含RP1616)、绿色和红色荧光兼有的液滴(含RP437和RP1616)的数量。其最终的统计结果如图12所示。可以看到，得到的RP437的液滴的数量为4％，含RP1616的液滴的数量为6％。在此条件下，大肠杆菌没有明显的趋化现象，因此实施例2所得到的结果是可靠的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种微型生物体分选装置，其特征在于，包括层流分离装置和微型生物体液滴生成装置，所述层流分离装置与所述液滴生成装置连接设置。

2.根据权利要求1所述的微型生物体分选装置，其特征在于，所述层流分离装置包括待测微型生物体样品进样口5。

3.根据权利要求1或2所述的微型生物体分选装置，其特征在于，所述层流分离装置还包括层流液第一进样口6和层流液第二进样口7。

4.根据权利要求1至3任一项所述的微型生物体分选装置，其特征在于，所述液滴生成装置包括混合溶液进样口9。

5.根据权利要求1至4任一项所述的微型生物体分选装置，其特征在于，所述液滴生成装置还包括载流油相进样口10。

6.根据权利要求1至5任一项所述的微型生物体分选装置，其特征在于，所述微型生物体分选装置还包括液滴收集装置。

7.根据权利要求6所述的微型生物体分选装置，其特征在于，所述收集装置包括趋化微型生物体收集装置12和/或液滴收集装置11。

8.根据权利要求1至7任一项所述的微型生物体分选装置，其特征在于，所述微型生物体分选装置还包括液滴存储装置13和/或废液收集装置8。

9.根据权利要求1至8任一项所述的微型生物体分选装置在分选趋性微型生物体中的应用。

10.一种基于权利要求1至9任一项所述的微型生物体分选装置的分选趋性微型生物体的方法，其特征在于，将待测样品引入所述层流分离装置，经趋性定向迁移，所述待测样品中的趋性微型生物体在所述液滴生成装置中被包裹在油包水液滴中，收集所述趋性微型生物体。