CN104797699B - 物质暴露装置 - Google Patents

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Abstract

一种装置，其包括：包含若干个孔通道的孔阵列，其中每个孔通道在所述孔通道中包含多个孔，所述孔含有使用中的物质；用于接收各自流体的一个或多个入口；和偶联至所述一个或多个入口的通道，所述通道用于将一种或多种流体选择性地供应至每个孔通道，以由此将所述物质暴露于不同的条件，从而允许测定所述物质对所述条件的应答。

Description

物质暴露装置
发明背景
本发明涉及用于将物质暴露于条件的装置和方法，并具体地涉及用于将物质例如细胞暴露于多种不同的条件从而允许测定所述物质对所述条件的应答的方法和装置。
现有技术描述
本说明书中对任何现有出版物(或来自其的信息)或对任何已知主题的参考不被且应当不被理解为认可或承认或以任何形式暗示现有出版物(或来自其的信息)或已知主题形成本说明书涉及的发明领域的公知常识的部分。
多潜能干细胞是用于产生用于细胞移植、疾病和发育模型化和用于临床前药物筛选的特化细胞类型的有前景的细胞来源。然而，人多潜能干细胞(hESC和hIPS细胞)在再生医学和药物筛选应用中的用途基于支配其未分化地扩增至足够的数量和有效地谱系特异性地分化至目标表型的能力。在整个早期发育中，干细胞至微环境刺激梯度的暴露确定了导致异质性系统化组织的图式形成的细胞命运决定。
因此，对这些刺激的准确认识和控制对于拆析复杂发育过程的多级阶递(hierarchical)性质和鉴定直接和有效地驱动确定细胞群的特化和调节的关键刺激是重要的。然而，目前几个问题阻碍了实现这些目标的努力。
已公认多个信号转导途径的活性之间的平衡在确定细胞命运结果中是重要的，并且其高度依赖于外在信号的相对水平而不仅仅是某些因子的存在或不存在。因此，需要筛选多个刺激的不同相对水平的方法，而非简单地优化各个刺激。并且，常规的静态培养系统不适合用于精确地探测支配干细胞命运的微环境刺激。
过去对含血清培养基和饲养层的使用已将未确定成分引入干细胞培养系统，但即使在无饲养层的确定培养条件下hESC也分泌已知影响自我更新和分化结果的因子，其还在分化发生后动态地变化。此外，常规的培养物经历微环境条件中大量的时空波动，如积累了分泌的因子和废物且耗尽了外源因子和营养物，而随后当补充培养基时又恢复到初始条件。
微量技术已被用于研究多种生物学现象。到目前为止，对于阵列微环境的研究已利用了高密度点样法来图式化目标分子，并且包括生物材料聚合物或细胞外基质(ECM)分子的组合阵列，任选地通过将阵列偶联至大规模孔或通过将点样的可溶性因子包含在阵列中来引入多种可溶性因子。尽管这些方法容易地呈现ECM线索，但可溶性因子呈递的控制水平是有限的。当可溶性因子被添加至大规模培养体积时，微环境控制受到存在于培养基更换之间的分批培养环境的限制。另一方面，虽然点样的可溶性因子显示信号转导活性，但输运现象例如从基质的扩散和整个培养基体积内的扩散/对流意味着被呈递至细胞的可溶性因子的精确浓度是难以确定且是随时间变化的。
先前已将“封闭的”培养系统诸如在微流体设备中实施的那些与灌注培养组合以实现具有良好时间分辨率的可溶性因子的受控供应和条件的时间变化。
例如，应用于筛选用于间质干细胞生长和分化的培养环境的96个离散的各自可寻址的微生物反应器室的多重整合描述于R.,Leyrat,A.A.,Pirone,D.M.,Chen,C.S.&Quake,S.R.Versatile,Fully Automated,Microfluidic Cell CultureSystem.Analytical Chemistry 79,8557-8563(2007)中。然而此设备需要73个芯片外连接并且不能对多个室提供连续灌注，尽管培养基的快速交换是可能的。虽然如此，微制造技术可被杠杆化成广泛多重性的并基于有限量的化合物产生广谱的条件。
用于微环境筛选的多重阵列技术的最新进展已集中于生物材料聚合物的点样组合阵列。尽管这些方法理想地适合于且容易地呈现ECM线索，但可溶性因子呈递的控制水平仍然是有限的。当可溶性因子被添加至大规模培养体积时，微环境控制受到上文详述的要点的限制。另一方面，虽然点样的可溶性因子的确显示信号转导活性，但输运现象例如从基质的扩散和整个培养基体积内的扩散/对流意味着被呈递至细胞的可溶性因子的精确浓度通常是难以确定的且还是随时间变化的。
“Microbioreactor Array for Full-Factorial Analysis of Provision ofMultiple Soluble Factors in Cellular Microenvironments”Biotechnology andBioengineering,Vol.104,No.6,December 15,2009描述了可扩展的(scalable)微生物反应器构造，其使用巢式稀释结构来产生细胞培养条件的全因子阵列。然而，该布置仅提供有限的评价事件例如旁分泌信号转导的影响的能力。
发明概述
在第一广泛形式上，本发明试图提供用于将物质暴露于条件的装置，所述装置包括：
a)包含若干个孔通道的孔阵列，其中每个孔通道在所述孔通道中包含多个孔，所述孔含有使用中的物质；
b)用于接收各自流体的一个或多个入口；和
c)偶联至所述一个或多个入口的通道，所述通道用于将一种或多种流体选择性地供应至每个孔通道，以由此将所述物质暴露于不同的条件，从而允许测定所述物质对所述条件的应答。
通常地，每个孔通道包括沿着孔通道分隔开的多个孔。
通常地，被供应至孔通道的第一末端的流体在流动方向上沿着孔通道流至所述孔通道的第二末端。
通常地，至少一个孔中的应答影响相邻孔中的条件。
通常地，在孔中产生的至少一些试剂被转移至相邻孔以从而至少部分改变所述相邻孔中的条件。
通常地，所述装置包括：
a)至少两个入口，其中每个入口用于接收各自的流体；和
b)用于将各自流体从入口供应至孔通道的若干个通道，其中每个通道具有各自的通道几何形状以从而控制流体的相对流量以使得各自比例的所述流体被供应至每个孔通道。
通常地，对于在流动方向上的流体流动，由上游孔中的物质产生的试剂被转移至下游孔。
通常地，对于无流体流动，试剂通过扩散在孔之间转移。
通常地，每个通道的孔通道几何形状被布置来使得每个孔通道接收下列的至少一种：
a)等体积的流体；
b)等流量的流体；和
c)等比例的流体。
通常地，通道几何形状包括下列的至少一种：
a)通道形状；
b)通道弯曲度；
c)通道长度；
d)通道高度；
e)通道宽度；
f)通道角度；和
g)通道内的障碍物。
通常地，至少一个通道分流以将流体供应至至少两个孔通道。
通常地，至少两个通道组合以将流体的混合物供应至至少一个孔通道。
通常地，通道包括用于混合包含在其中的流体的混合部分。
通常地，至少两个通道合并混合部分的上游。
通常地，装置包括用于接收各自的第一和第二流体的第一和第二入口，并且其中所述通道被布置来使得：
ⅰ)至少一个孔通道接收所述第一流体；
ⅱ)至少一个孔通道接收所述第二流体；和
ⅲ)至少一个孔通道接收所述第一和第二流体的混合物。
通常地，装置包括用于接收各自的第一和第二流体的第一和第二入口，所述第一流体包含因子，且所述第二流体包含缓冲液，以使得不同的孔通道接收不同浓度的因子。
通常地，装置包括若干个入口组，每个入口组包括至少两个入口，并且每个入口组用于接收各自的流体。
通常地，每个入口组接收包含各自因子的流体。
通常地，装置包括：
a)若干个(n)入口组，每个入口组包括至少两个入口，从而导致总共至少2n个入口；和
b)若干个(n)入口组，每个入口组包括至少2个入口，其中来自每个入口组的1个入口进一步连接至共同入口，从而导致总共至少n+1个入口。
通常地，装置包括：
a)用于接收第一因子和缓冲液的第一入口组；
b)用于接收第二因子和缓冲液的第二入口组；
c)用于接收第三因子和缓冲液的第三入口组，并且其中每个孔通道接收第一、第二和第三因子的每一个的各自浓度。
通常地，来自一个入口组的流体通过混合，与之后的入口组的流体合并，从而组合各自流体。
通常地，装置包括：
a)至少一个用于接收包含所述物质的接种流体的接种入口；和
b)至少一个接种出口，所述至少一个接种入口和接种出口与孔通道是流体连通的，从而允许用所述物质来接种所述孔。
通常地，装置包括若干个接种通道，所述接种通道用于将至少接种入口和至少一个接种出口的至少一个连接至所述孔通道。
通常地，所述至少一个接种入口连接至孔通道的与所述至少一个接种出口相对的末端。
通常地，接种出口与所述通道是流体连通的，并且其中在孔通道的接种之后将所述接种出口设置为被封闭，从而允许各自流体被供应至所述孔通道。
通常地，装置包括至少一个控制设备，所述控制设备用于选择性控制下述的至少一个：
a)至孔通道和孔的至少一个的流体供应；和
b)从孔通道和孔的至少一个的流体和/或物质采样。
通常地，控制设备包括用于选择性封闭通道的阀。
通常地，通道是微流体通道。
通常地，装置包括基底和覆盖层。
通常地，覆盖层包括第一和第二层，并且其中至少一些入口被提供在所述第二层中用于将各自流体供应至第一层中的通道。
通常地，通道被限定在所述覆盖层中。
通常地，所述孔被限定在基底和覆盖层的至少一个中。
通常地，覆盖层包括模制聚合物材料。
通常地，使用下列的至少一种来偶联基底和覆盖层：
a)粘附偶联；
b)热偶联；
c)机械偶联；
d)等离子体偶联；
e)共价/化学偶联；
f)静电偶联；和
g)磁性偶联。
通常地，至少所述孔是被涂层的。
通常地，所述涂层包含下列的至少一种：
a)启动子；
b)抑制剂；
c)生长因子；
d)凝血因子；
e)激素；
f)信号转导剂；
g)化学组合物；
h)药物；
i)蛋白质；
j)配体；
k)抗体；
l)有机体；
m)细胞；
n)微细胞；
o)合成的细胞；
p)脂质体；
q)胶束；
r)聚合物胶束(聚合物囊泡)；
s)脂质；
t)聚合物；
u)表面活性剂；
v)脂肪酸；
w)离子溶液；
x)酸性或碱性溶液；
y)检测试剂；
z)DNA分子；
aa)RNA分子；
bb)编码DNA或RNA序列的构建体；
cc)核苷酸；
dd)核苷；
ee)多肽；
ff)氨基酸；
gg)病毒颗粒；
hh)质粒；
ii)纳米颗粒；
jj)微粒；
kk)磁性颗粒；
ll)条件培养基；
mm)从条件培养基纯化的级分；
nn)天然提取物；
oo)培养基组分；
pp)细胞培养添加剂；
qq)碳水化合物；
rr)维生素；
ss)代谢产物；
tt)寡核苷酸；
uu)融合蛋白；
vv)蛋白聚糖；和
ww)病原体。
通常地，所述至少一种流体包含试剂。
通常地，所述试剂包括下列的至少一种：
a)启动子；
b)抑制剂；
c)生长因子；
d)凝血因子；
e)激素；
f)信号转导剂；
g)化学组合物；
h)药物；
i)蛋白质；
j)配体；
k)抗体；
l)有机体；
m)细胞；
n)微细胞；
o)合成的细胞；
p)脂质体；
q)胶束；
r)聚合物胶束(聚合物囊泡)；
s)脂质；
t)聚合物；
u)表面活性剂；
v)脂肪酸；
w)离子溶液；
x)酸性或碱性溶液；
y)检测试剂；
z)DNA分子；
aa)RNA分子；
bb)编码DNA或RNA序列的构建体；
cc)核苷酸；
dd)核苷；
ee)多肽；
ff)氨基酸；
gg)病毒颗粒；
hh)质粒；
ii)纳米颗粒；
jj)微粒；
kk)磁性颗粒；
ll)条件培养基；
mm)从条件培养基纯化的级分；
nn)天然提取物；
oo)培养基组分；
pp)细胞培养添加剂；
qq)碳水化合物；
rr)维生素；
ss)代谢产物；
tt)寡核苷酸；
uu)融合蛋白；
vv)蛋白聚糖；和
ww)病原体。
通常地，所述物质包括下列的至少一种：
a)启动子；
b)抑制剂；
c)生长因子；
d)凝血因子；
e)激素；
f)信号转导剂；
g)化学组合物；
h)药物；
i)蛋白质；
j)配体；
k)抗体；
l)有机体；
m)细胞；
n)微细胞；
o)合成的细胞；
p)脂质体；
q)胶束；
r)聚合物胶束(聚合物囊泡)；
s)脂质；
t)聚合物；
u)表面活性剂；
v)脂肪酸；
w)离子溶液；
x)酸性或碱性溶液；
y)检测试剂；
z)DNA分子；
aa)RNA分子；
bb)编码DNA或RNA序列的构建体；
cc)核苷酸；
dd)核苷；
ee)多肽；
ff)氨基酸；
gg)病毒颗粒；
hh)质粒；
ii)纳米颗粒；
jj)微粒；
kk)磁性颗粒；
ll)条件培养基；
mm)从条件培养基纯化的级分；
nn)天然提取物；
oo)培养基组分；
pp)细胞培养添加剂；
qq)碳水化合物；
rr)维生素；
ss)代谢产物；
tt)寡核苷酸；
uu)融合蛋白；
vv)蛋白聚糖；和
ww)病原体。
通常地，装置用于监测下列的至少一种：
a)对试剂的应答；
b)细胞生长；
c)细胞分化；
d)细胞活力；
e)细胞形态；
f)细胞信号转导；
g)蛋白质转运；
h)细胞抗原呈递；
i)DNA合成；
j)细胞基因组；
k)细胞转录组；
l)细胞蛋白质组；
m)细胞新陈代谢；
n)细胞电生理学功能；
o)细胞生理学功能；
p)吞噬作用；
q)内吞作用；
r)基因表达；
s)蛋白表达；
t)碳水化合物表达；
u)生物分子相互作用；
v)受体结合；
w)检测剂的细胞结合；
x)调节剂的细胞吸收；
y)细胞迁移；
z)细胞群组织(cell population organisation)；
aa)细胞粘附；
bb)细胞间相互作用；
cc)脂质表达；
dd)RNA合成；和
ee)组织形成。
附图概述
参照所附的附图现将描述本发明的实施例，其中：
图1A-1C是用于调节细胞活性的装置的实施例的示意图；
图2A是用于调节细胞活性的装置的其它实施例的示意图；
图2B是图2A的通道混合器部分的更细节的示意图；
图3A-3C是用于调节细胞活性的装置的具体实施例的示意图；
图3D是显示流动通过图3B的孔的流体流动的速率的示意图；
图3E和3F是用于与图3A-3C的装置一起使用的固定器的示意图和侧视图；
图4A是显示图3B的孔中的染料的相对浓度的实施例的图；
图4B是显示图3B的孔中的染料的测量浓度的图；
图5A是用于使用图3A-3C的装置来多潜能性筛选HES3-EOS-C(3+)-EiP hESC的筛选条件的实施例的图；
图5B是针对图5A的筛选条件的激光扫描共聚焦负像的实施例；
图5C和5D是针对图5A的筛选条件的经选择的孔的更高放大倍数激光扫描共聚焦负像的实施例；
图5E显示针对图5A的筛选条件的孔阵列中总荧光强度的示例热图。
图5F显示针对图5A的筛选条件的因子对表达指数的主效应量级的实施例的图。
图6A是用于使用图3A-3C的装置来筛选用于诱导原条标志物MIXL1和调节旁分泌效应的HES3-MIXL1-GFP细胞的筛选条件的实施例的图。
图6B是针对图6A的筛选条件的表达GFP并在实验终点用Hoechst复染色的HES3-MIXL1-GFP hESC的孔阵列的激光扫描共聚焦负像的实施例。
图6C显示针对图6A的筛选条件的阵列中的总荧光强度的示例热图。
图6D是针对图6A的筛选条件的阵列内的个体孔的更高放大倍数共聚焦成像的实施例。
图6E显示针对图6A的筛选条件的因子对表达指数的主效应量级的实施例的图。
图7A是用于使用图3A-3C的装置来筛选用于诱导原条标志物MIXL1和调节旁分泌效应的HES3-MIXL1-GFP细胞的筛选条件的第二实施例的图。
图7B是针对图7A的筛选条件的表达GFP并针对NCAM(CD56)进行原位免疫共染色以及在实验终点用Hoechst复染色的HES3-MIXL1-GFP hESC的孔阵列的激光扫描共聚焦负像的实施例。
图7C显示针对图7A的筛选条件的阵列中的总荧光强度的示例热图。
图7D-7G是针对不同条件的不同孔中的示例应答的图；
图7H是针对图7A的筛选条件的静态原条诱导培养物中Wnt信号的化学调节和效率的改善的实施例的图。
图8A是入口构造的进一步具体实施例的示意图；
图8B是出口构造的进一步具体实施例的示意图；
图8C是第一层的进一步具体实施例的示意图；
图8D是第二层的进一步具体实施例的示意图；
图8E是图8C和8D的装置中的因子A、B、C、D的每一个的理论浓度的示意图；
图8F是在图8C和8D的装置中所得的染料分布的示意图，使用四种颜色来代表各个因子A、B、C、D；
图8G是通过出口供应的单色染料所得的染料分布的示意图；和
图8H是使用中的图8C和8D的装置的图像。
优选实施方案的详述
现将参照图1A描述用于调节细胞活性的装置的实施例。
在该实施例中，装置100包括具有若干个孔通道131、132、133的孔阵列130，每个孔通道131、132、133包括多个孔131.1、131.2、131.3、132.1、132.2、132.3、133.1、133.2、133.3，所述孔被提供在孔通道131、132、133中并且通常沿着孔通道131、132、133被分隔开。在使用时，孔131.1、131.2、…133.3包含物质，所述物质对不同条件的应答待被测定。
在该实施例中，在每个孔通道上显示了三个孔，并且显示了3个孔通道，但将理解这仅用于示例性目的，并且在实践中可使用任何数量的孔和孔通道。孔可具有任何形状或大小，例如圆形、正方形、矩形、椭圆形、三角形或其它几何的或非几何的形状，并且圆形孔的使用仅用于示例性目的。
装置100还包括用于接收一种或多种流体的一个或多个入口111、112，在该实施例中显示了两个入口。
装置100还包括用于接收一种或多种流体的一个或多个入口111、112，在该实施例中显示了两个入口。入口111、112通过通道120偶联至孔通道131、132、133，从而允许将流体选择性供应至孔通道131、132、133，由此将物质暴露于不同的条件，这进而允许测定所述物质对所述条件的应答。
样品所暴露于的条件可以以多种方式进行控制。在一个实施例中，所述条件依赖于所供应的流体，其中不同的流体被供应至不同的孔通道。在该例子中，不同孔通道中的物质将因此被暴露于不同的条件，并因此可比较不同孔通道的孔内的物质的应答以测定所述物质对不同条件的应答。
可选择地，在另一个实施例中，可将不同的物质提供在不同的孔通道中，其中例如依赖于被供应至孔通道的流体，所述不同的物质被暴露于相同的或不同的条件。
在其它实施例中，孔和/或孔通道可用一种或多种涂层来涂覆。例如，涂层可包括帮助物质结合至孔表面的结合剂、用于为了检测目的标记物质的标记试剂、其它试剂或诸如此类的。示例性涂层包括蛋白质、配体、可溶性因子、固定化因子、冻干药物或蛋白、慢病毒颗粒、DNA、RNA、荧光探针、聚合物、酶或诸如此类的。涂层还可对孔内的条件产生影响，以便例如不同的涂层可被施加至不同孔通道中的孔，从而允许不同孔通道的孔中的物质被暴露于不同的条件，即使相似的流体被提供至不同的孔通道。
在上述任何实施例中，可能引发影响孔内条件的第二效应。就这一点，当将物质暴露于特定条件时，应答可包括产生或改性一种或多种试剂，所述试剂随后可被转移至相邻孔，从而改变相邻孔中的条件。因此，例如，当将细胞暴露于不同的条件时，所述细胞可被调节以使得其分泌试剂，所述试剂进而被转移至不同的孔，从而进一步调节包含在其中的细胞。因此该改变可意味着即使在共同的起始条件下，单个孔通道中的不同孔内的物质可被暴露于不同的条件。
在一个实施例中，将流体布置为在流动方向上流动通过孔通道。为实现此，在该实施例中，入口111、112与孔通道的一个末端是流体连通的，其中将流体选择性供应至孔通道131、132、133的所述末端，以使得所供应的流体在箭头150所指出的流动方向上沿着孔通道流至所述孔通道的另一末端。所述孔通道的另一末端可连接至一个或多个出口，从而允许流体流出所述孔通道。在下文将更详细地描述出口的存在和用于将流体选择性转移至孔通道的通道120的操作。在该例子中，在孔中产生或改性的任何试剂可通过流体流动转移至下游孔。
然而流体流动的使用不是必要的，并且可选择地，物质的暴露可在无流动的条件下发生，在该情况下试剂可通过其它转运机制例如扩散来转移。可选择地，可选择性控制流体流动，例如调整流体流动速率，或者使流动停止和/或反转。如将在下文更详细地描述的，还可使用控制设备例如控制阀来选择性控制不同孔和通道的流动。
还将理解，可使用其它机制例如孔的选择性加热或冷却、对辐照的选择性暴露或诸如此类的，来引发不同的条件。例如，可将加热或冷却施加至孔通道中的所有孔，或可选择地施加至不同孔通道间孔的共同组(或行)，从而进一步增加物质所暴露于的条件的范围。
因此，将理解上述装置允许将物质暴露于范围广泛的条件。在一个实施例中，主要通过将流体的不同组合供应至不同的孔通道来控制条件，尽管可通过在不同的孔通道内提供不同的涂层来实现另外的和/或备选的控制。在任何情况下，装置允许通过使用有限的输入来产生范围广泛的条件，并进一步允许引发第二效应，其中物质在一个孔中的应答改变一个或多个相邻孔中的条件，从而影响相邻孔中物质的应答。
装置可用于将多种不同物质暴露于不同的条件。然而装置理想地适合用于将化学和生物物质暴露于不同的条件，所述物质包括但不限于细胞、蛋白质、微细胞例如没有任何RNA或DNA的细菌、胶束、脂质体、核酸、化学组合物和药物。
在物质是细胞的情况下，通常所述至少一种流体包含用于诱导细胞中的应答的试剂，和特别是将改变细胞活性的调节剂例如细胞命运调节剂。可进行监测的细胞应答包括但不限于细胞生长、细胞分化、细胞活力、细胞电生理学功能、细胞生理学功能、检测剂的细胞结合、调节剂的细胞吸收、对检测剂的应答、细胞迁移、细胞群组织、细胞粘附、细胞间相互作用、脂质表达、RNA合成、组织形成或诸如此类的。
因此，例如，装置可用于优化抗体结合、转染效率或诸如此类的。装置还可用于提供细胞响应检测剂(例如抗体或荧光染料)或调节剂例如质粒或siRNA脂质体的最适浓度或组合的能力的读出。装置还可用于应答的基于细胞的筛选，包括例如针对不同疾病或病况(例如心脏疾病、癌症、神经退行性疾病)的药物筛选、药物配方设计、患者特异性医学(遗传医学)或诸如此类的。因此将理解，应答可包括对条件的任何应答，尽管装置特别适合于调节细胞的任何活性。
根据上文将理解，取决于待被引发的应答，流体可包含范围广泛的试剂。在细胞活性待被调节的情况下，试剂可以是细胞将对于其起反应的任何适当的试剂，例如信号转导剂包括激素、生长因子、凝血因子、信号转导分子、启动子、抑制剂或诸如此类的。然而，将理解可使用对细胞应答具有影响的任何试剂，包括药物或诸如此类的。此外，流体可包含任何形式的试剂，例如溶解的、悬浮的固体试剂或诸如此类的。
调节剂可以是抗体、细胞因子、趋化因子、离子例如钙和钾、DNA分子、DNA构建体、RNA分子、RNA构建体、编码DNA或RNA序列的病毒颗粒、融合蛋白、质粒、黏粒、细菌人工染色体、编码DNA或RNA序列的构建体、碳水化合物、代谢产物、纳米颗粒、微粒、脂质体、胶束、聚合物、条件培养基(取自单独的细胞培养物的培养基)、从条件培养基纯化的级分、天然提取物(例如从天然存在的生物来源分离的组合物)、细胞培养组分或培养基组分、细胞或有机体(即共培养的细胞类型或病原体)。
至少一种所述流体还可包含检测剂，以辅助监测物质的应答。这可包括例如使用检测试剂例如荧光染料或诸如此类的。
现将更详细地描述细胞调节的具体实施例。具体而言，在该实施例中，通常通过使用接种过程将细胞提供在孔阵列的孔中，如将在下文更详细地描述的。在这之后，将一种或多种流体选择性地供应至每个孔通道的第一末端，以使得所供应的流体在流动方向上沿着孔通道流至所述孔通道的第二末端，从而将所述细胞暴露于所述流体和包含在其中的任何调节剂(被称作为外源调节剂)。随着细胞暴露于流体，这通常将引起细胞内的应答，其进而可导致产生其它的调节剂(被称作为内源调节剂)，例如通过由细胞分泌调节剂来产生。在上游孔中产生的至少一些内源调节剂随后因流体流动而被转移至下游孔，从而进一步调节下游孔中的细胞活性。然而从先前的描述将理解，流体流动的存在不是必要的并且内源调节剂可使用其它机制(例如扩散或诸如此类的)在孔之间转移。
因此，在细胞暴露于一种或多种流体中的外源调节剂之后内源调节剂例如信号转导剂可在孔中被分泌。内源调节剂与外源调节剂一起被转移至相邻的或下游的孔，以使得相邻的或下游的孔中的细胞被暴露于外源和内源调节剂两者。因此，例如，如果将孔131.1中的细胞暴露于生长因子A，所述细胞可分泌其它的生长因子X，其进而被转移至下游孔131.2，从而意味着孔131.2中的细胞被暴露于生长因子A和X。因此，将理解在该实施例中，这允许在孔通道131的孔中的细胞之间引发旁分泌效应。
允许一个孔中的物质被相邻孔中物质的应答影响的能力为允许第二效应的研究提供了强有力的机制。在物质是细胞的情况下，这对于理解局部细胞微环境对细胞活性的影响是特别有用的。
一旦活性已被调节，即可进行测试以测定过程的结果。例如，可使用适当的标志物来进行化验以鉴定细胞活性的变化。另外地和/或可选择地，可提取孔的细胞和其它内含物用于进一步的分析。这可例如用于鉴定任何内源调节剂，从而允许鉴定导致某一细胞活性的精确条件。从而上述装置允许进行多种不同类型的细胞活性研究，并且特别是，允许鉴定细胞对特定调节剂的反应性。
在图1A的实施例中，还提供了若干个通道120用于将来自入口111、112的各自流体供应至孔通道131、132、133。在该实施例中，通道121从入口111延伸至孔通道131，同时通道122从入口112延伸至孔通道133。通道121、122还分流并组合以形成延伸至孔通道132的第三通道123。每个通道120都具有各自的通道几何形状以从而控制流体的相对流量以使得各自比例的流体被供应至每个孔通道131、132、133。
因此，如将从上述实施例所理解的，从入口延伸的通道120可分流，以将流体供应至至少两个孔通道，或可组合以将流体的混合物供应至至少一个孔通道。
在该实施例中，如果通过入口111、112供应第一和第二流体A、B，则孔通道131接收第一流体A，孔通道132接收第一和第二流体A和B的混合物，同时孔通道133仅接收第二流体B。在一个具体实施例中，第一流体包含因子且第二流体包含缓冲液，以使得不同的孔通道131、132、133接收不同浓度的因子。
将理解，上述布置从而允许将不同的流体供应至每个孔通道131、132、133，以使得可通过比较每个孔通道的孔中的细胞活性来研究不同流体组合的影响。因此，这允许进行多维度研究，其中不同的孔通道接收不同的流体和因此不同的外源调节剂组合，并且每个孔通道的下游孔被进一步暴露于在上游孔中产生的不同的内源调节剂。
然而，将理解这不是必要的，如上所述，可选择地，每个孔通道可接收相同的流体。在此例子中，仍可进行多维度分析，例如通过使用其它机制引发孔通道之间环境条件的差异，例如通过用不同的涂层选择性涂覆不同孔通道的孔，或诸如此类的。还可将不同的孔通道暴露于不同的外界条件，例如不同的温度、辐照水平或诸如此类的。
在任何情况下，将理解，上述装置允许产生范围广泛的不同环境和容易地比较这些对细胞活性的影响。
现将描述上述装置的其它特征。
在一个实施例中，可通过改变通道几何形状的任一个或多个方面包括通道形状、通道弯曲度、通道长度、通道高度、通道宽度和通道角度，来控制流体沿着通道的流动。另外地，可通过将障碍物(例如柱形物、交错的人字形混合器、多层通路或诸如此类的)包括在通道内来提供进一步的控制。
因此，当将对物质进行暴露时，确定被供应至孔的不同流体的相对比例，并相应地选择通道几何形状。这允许每个通道的通道几何形状被布置来使得每个孔通道接收相等的体积、流动速率或体积/时间的流体。这可帮助确保正确比例的不同流体按照通道构造被供应至正确的孔通道。
可通过使用控制设备例如控制阀来实现进一步的控制，其可被提供在通道120或孔通道131、132、133中，从而允许按需要选择性限制和/或停止至不同孔的流体流动。
流体沿着通道120和孔通道131、132、133的流动还可取决于流体的性质包括流体黏度、密度和表面张力。
通道通常是微流体通道，并且通常具有1mm或更小或者0.25mm或更小的宽度，尽管可使用任何适当的通道大小。
可使用入口、孔和通道构造的多种不同布置来将多种外源调节剂提供至孔通道。在图1B的实施例中，提供三个入口111、112、113用于各自接收流体A、B、C。在该实施例中，所述入口通过通道120连接至7个孔通道131、132…137，其中入口111与孔通道131、132、134、135是流体连通的，入口112与孔通道132、133、134、136是流体连通的，以及入口113与孔通道134、135、136、137是流体连通的。由此，孔通道131、132、133、134、135、136、137各自接收流体组合A、A+B、B、A+B+C、A+C、B+C和C。
在图1C的实施例中，提供了4个入口111、112、113、114。在该实施例中，将所述入口提供为两个入口组，其中来自入口111、112的流体A、B被混合以通过通道121、122、123提供3种流体混合物，并且来自入口113、114的流体C、D被混合并通过通道124、125、126来提供。混合物被供应至孔通道131、132、133、134、135、136、137、138、139。由此，孔通道131、132、133、134、135、136、137、138、139各自接收流体组合A+C、A+B、B+C、A+C+D、A+B+C+D、B+C+D、A+D、A+B+D、B+D。
在一个实施例中，每个入口组A、B；C、D接收包含各自因子的流体和单独的缓冲液流体，从而允许将不同因子的不同浓度供应至孔通道。例如，流体A、B对应于第一因子和缓冲液，同时流体C、D对应于第二因子和缓冲液。该布置从而允许将不同浓度的第一和第二因子A、C供应至9个孔通道131、132…139的每一个。具体地，装置可产生两种因子A、C之每一个的3个浓度的所有组合，从而提供总共具有32＝9个不同条件的全因子阵列。
应注意到，在图1B和1C的实施例中，显示单独的通道进入孔通道。然而，这仅是用于清楚的目的，且更通常地，通道将在孔通道的上游组合以使得流体在进入孔通道之前完全混合。
在图2A和2B的实施例中，修改了图1A的装置，其中经修改的装置200包括提供在通道121、122、123中的混合部分221、222、223，用于混合而包含在其中的流体。混合部分可以以任何适当的方式形成并且可包括使用湍流器、平流或对流元件或诸如此类的。然而通常地，由通道的弯曲部分形成混合部分，如图2B中所示。还如图2A中所示的，混合部分位于任何通道的组合点的下游，从而确保不同的流体在被供应至孔通道时是适当混合的。这帮助确保孔中的物质平均暴露于不同的流体，和特别是平均暴露于包含在其中的任何试剂。
现将参照图3A-3D描述装置的其它实施例。下面的描述将集中于细胞活性的调节，但将理解这仅是为了便于描述并且在实践中技术可应用于多种不同的物质和应答。
在该实施例中，装置300包括第一和第二覆盖层301、302，所述覆盖层被安装至基底303，如图3C中所示。第一和第二覆盖层301、302通常由聚合物材料例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)形成，其被模制来定义入口、通道和孔阵列。
第一和第二层的通道和端口的构造分别显示于图3A和3B中，其中相对于第一层301的第二层在图3A中以虚线显示。通过使用适当的黏结法例如附着黏结或热黏结，层301、302通常彼此黏结并黏结至基底303，所述基底通常由惰性材料例如玻璃或诸如此类的制成。然而，可使用其它的偶联技术例如磁性偶联、等离子体偶联、共价/化学偶联、静电偶联、机械偶联或诸如此类的。还可按需处理材料以使得其适合用于所述设备，因此例如，可处理PDMS以避免/减少小分子吸收。
将理解其它材料可被用于制造所述设备，尽管一般而言材料应当是生物惰性的以防止其干扰细胞调节过程。此外，在一个具体实施例中，材料优选是光学透明的以允许容易地鉴定细胞调节的结果，例如通过使用适当的化验来进行鉴定。此外，将材料例如PDMS用于覆盖层是特别有利的，因为这允许从装置容易地提取孔的内含物，例如使用针头和注射器或诸如此类的来进行提取。
在该实施例中，装置300包括三组入口311、312；313、314；315、316。入口通过通道320相互连接至孔阵列330，所述孔阵列包括27个孔通道，每个孔通道包括10个孔，从而定义了具有270个孔的孔阵列。
如该实施例中所示的，入口313、314、315、316被提供在第二层302中，而入口311、312被提供在第一层301中。在使用时，每个入口313、314通过通道323连接至3个各自的端口317.1。当如所显示的将第二层302相对于第一层301进行定位时，端口317.1与第一层301中的相应端口317.2对齐，从而从入口113、114供应流体。对于与入口315、316相关的18个端口318.1、318.2使用类似的布置。
将注意到在该实施例中，将入口313偶联至端口317.1的通道323.1、323.2、323.3都具有相同的长度。为了实现此，通道323.2包括弯曲节段以维持给定的通道长度。这是被进行来维持沿通道323.1、323.2、323.3的每一个上的相等的流动阻力，从而维持沿这些通道上的相等的流体流量。
还如所显示的，在通道320中提供了多重混合部分321，从而确保包含在其中的流体的适当混合。
在使用时，第一入口组311、312接收第一因子和缓冲液，第二入口组313、314接收第二因子和缓冲液，以及第三入口组315、316接收第三因子和缓冲液。这允许将第一、第二和第三因子的各自组合供应至27个孔通道的每一个，以使得每个孔通道接收第一、第二和第三因子的每一个的各自浓度，如将在下文中更详细地描述的。
此外，装置还包括接种入口341，其可被用于接收包含细胞的接种流体。接种入口与孔通道通过接种通道341.1流体连通，所述接种通道通常连接至孔通道的与通道320的连接点相对的末端。将理解，这允许接种入口还用作出口，从而允许按需要将已流动通过孔通道的流体排出。
还可提供接种出口342。在该实施例中，将接种出口342提供在第二层302中与接种端口342.1通过接种通道342.3流体连通。如所显示的，接种端口342.1与第一层301中相应的接种端口324.2是流体连通的，其进而与通道320是流体连通的。
在使用时，可将接种流体通过接种入口341供应至孔通道。所述接种流体在箭头351的方向上沿孔通道流过，从而将孔接种上细胞。随后接种流体流过接种端口342.2、342.1并通过接种出口342排出。通常地，使接种流体流过孔一段时间以确保足够多的具有细胞的孔群体。
此外，可在引入细胞之前对孔进行涂覆。可将孔涂覆以帮助将细胞保持在孔内、维持细胞活力或诸如此类的。可使用任何调节剂或检测试剂例如荧光染料或诸如此类的来涂覆孔。另外地或可选择地，这可被用来引入标志物例如用于化验或诸如此类的。因此将理解，涂层可包括任何适当的材料，例如蛋白质、配体、抗体、纳米颗粒或微粒、条件培养基、从条件培养基纯化的级分、天然提取物、例如从天然存在的生物来源分离的组合物、RNA分子或构建体、融合蛋白、细胞培养组分或培养基组分、碳水化合物或代谢产物、编码外源DNA或RNA序列的病毒颗粒、编码外源DNA或RNA序列的质粒/粘粒/细菌人工染色体或其它构建体、细胞或有机体(即共培养的细胞类型或病原体)或诸如此类的。
可在装置的制造或装配期间，或可选择地，通过使涂层流体流过孔阵列330来施加这样的涂层。这可在用细胞接种之前通过使用接种入口和出口341、342来实现，以使得每个孔接收相同的涂层。可选择地，可通过入口311、312、313、314、315、316引入不同的涂层，从而允许将不同的涂层组合供应至每个孔通道，由此允许评估不同涂层的影响。此外，可通过选择性加工设备的任何层来在设备的制造期间或在设备的装配之前施加涂层。该加工可包括工艺例如浸涂、旋涂、光刻、蚀刻、点样(spotting)、沉积或其它适当的工艺来引入上文指出的任何涂层或改性任何设备基底。随后可例如在该加工之后，如图3C中所示装配设备。
一旦完成了孔的接种，接种出口342可被封闭，例如使用阻塞物或诸如此类的，以使得当通过入口311、312、313、314、315、316供应流体时，所述流体流进孔通道，并且接种入口341用作通道中流体的出口。
将理解具体的接种入口和出口布置仅用于示例性的目的，并且在实践中可使用备选构造。例如，如果在图1A的实施例中提供接种出口，则可将接种出口提供为与通道121、122、123是流体连通的。
将理解上述布置仅用于示例性目的，并且在实践中许多其它变化是可能的。
例如，可按需调整入口和出口的具体构造和特别是它们的位置。这可被进行来允许装置符合标准结构，例如用于与现有的流体供应系统进行接合。这允许将装置提供为独立设备，其随后可与现有的硬件一起使用，从而减少装备用户的总体成本。还可将装置提供在标准外壳内的或具有任何其它形式的标准连接器的盒中，从而进一步帮助整合至现有的硬件中。这可包括标准的流体夹连接以由此容易地连接外部装备。还可将装置安装在滑片固定器中以使得装置呈现标准的微平板足迹，从而进一步帮助与其它装备的使用。示例性布置显示于图3E和3F中。在该实施例中，滑片固定器350包括主体351，其限定用于定义基底303的孔352。
由通道定义的不同流动路径的相对阻力可按需要进行调节，例如需要考虑所使用的流体供应系统，以及需要调节通过设备的相对流体流量。
可通过使用其它技术来实现另外的环境控制，例如使用气流罩和水化池。这可包括使用等渗浴层，其可被内置于设备中，例如在图3B所示的第二层内，其中供应是灌注的或静态的。
装置可包括内置的培养基收集排出口，从而允许按需从设备提取流体和/或物质。这可包括例如与孔阵列接合的分隔层，从而允许选择性去除孔内含物。
装置可包括另外的控制或感应设备用来确保流体通过孔阵列的一致递送，所述另外的控制或感应设备包括例如气泡捕捉器、气体交换器、气泡感应电极或传感器或诸如此类的。
在使用时，可进行启动步骤，例如用培养基冲洗装置以平衡通过孔阵列的条件。
可将控制设备内置在通道和/或孔通道中以进一步控制流体流动。这可包括使用扩散屏障来限制孔之间的试剂扩散，从而允许使流动长时间地停止而不发生试剂在孔之间的非期望的扩散。这还可通过使用增加的阻力节段长度以及增加孔通道上的孔之间的间隔来实现。此外，可使用阀来隔离各个孔以及提供用于从各个孔提取流体。还可提供等阻(分形体)出口通道节段来改善流量分布。
可使用的其它控制设备包括使用用于选择性关闭入口和/或通道的塞子和入口夹，从而允许设备在不同的模式(例如暴露模式和接种模式)之间转换。这还可被用于密封设备，例如用来在使用后容纳废产物，以及用来允许控制孔和通道内的压力。还可将这样的塞子提供为梳形布置从而允许同时封闭多个通道。
可将多种不同的检测机制用于测定物质的应答。可提供从读出/可视化区延伸的单独的流体学布置并可使用具有盖的遮蔽物。这允许暴露孔通道，同时其余的通道被不透明层覆盖，以使得它们是不可见的。这可在使用自动化传感布置来检测孔中的物质时通过阻止从通道320和接种通道341.1中的物质产生非期望信号而是有用的。
可将SBS微量滴定板用于流体培养基、细胞、裂解物、物质或诸如此类的中的任一种或多种的排出。在一个实施例中，这可包括接合至1,536孔板的塞子。
还可能提供各个纵列或孔固定物或裂解物(RLT、RIPA等)。设备还可包括从个体孔或孔的子集回收多种形式的或缓冲液中的细胞的能力，例如包括完整的活细胞、细胞的固定(例如使用多聚甲醛或适当的固定剂)样本、细胞裂解物、或RNA分离制剂。
现将对于示例性实验更详细地描述装置300的具体实施例的操作。
在这些实施例中，使用可扩展的多层次巢式稀释网络和阻流原理来设计装置，通过SU-82100光刻法和聚二甲基硅氧烷(PDMS)软光刻成型将其焊接至至250μm通道高度，并通过黏结第一和第二层301、302和基底303将其装配成图3C中所示的构造。
外源因子的全因子多重化仅由入口311、312、313、314、315、316和通道320的布置来编码，并且不依赖于整合的阀或扩展的周边连接。
将理解这允许装置300通过添加平行的或连续的复制孔(实验点的线性扩展)、另外的浓度水平(多项式扩展)或另外的因子(指数扩展)来容易地扩展，其中流体连接的数量各自具有零、零或线性的增加，并且物理层没有增加。
装置产生3种可溶性因子的每一个的3个浓度的所有组合(全因子阵列；来自仅6个流体输入的总共33＝27个不同的条件)。重要的是，该灵活的结构可容易地扩展至a个平行和/或连续的复制孔(实验点的线性扩展)、b个浓度水平(多项式扩展)和c个外源因子(指数扩展)，从而给出总共abc个实验点。
在扩散混合之后，阵列将外源因子供应至孔阵列330，该孔阵列如上所述包括270个孔，所述孔用作培养孔并被设置为与1536孔微量滴定板相似的大小和布置。网格包含27纵列的10个连续的培养孔—每纵列构成外源因子的不同组合，而内源旁分泌因子在沿孔通道的连续流体流动期间逐步积累。
在该实施例中，孔通道的宽度为250μm，其中孔331直径为1.63mm并且高度为250μm。在hESC的公称流量条件下，计算流体动力学模型显示培养孔中的细胞被暴露于慢慢缓行的层流和低的合成剪应力，而孔331之间250μm宽的相互连接用于在空间上离散化孔331，如图3D中所显示的。这些流动特征确保调节剂可在孔之间进行转移，同时确保细胞经历最小的来自流体流动的破坏。
染料载入
为了评价由阵列形成的可溶性条件谱，进行了染料载入实验，并将荧光定量用于测定每个孔中的可溶性因子水平。在该实施例中，使用红色、黄色和蓝色染料来模拟被提供至入口312、314、316的因子A、B、C。将PBS流体供应至入口311、313、315从而模拟三种因子与相应缓冲液的混合。以3的标准浓度提供储备溶液以允许随后的稀释。因子A、B、C的每一个的理论浓度显示于图4A的面板401中，并且所得的染料分布照片显示于面板402中。
进行了阵列的每个纵列中(即沿着每一个孔通道)的可溶性因子水平的荧光定量。连续地和独立地定量了因子通道A、B和C，结果显示于图4B中。在通道B和C的零-浓度条件中检测到的荧光是由残留的、吸附的染料引起的。小棒代表2个独立实验的平均值+/-S.D.。结果确认了全因子条件谱在孔阵列上的形成，以及大至40kDa的因子的充分扩散混合。所有浓度水平的准确产生还暗示通过设备的流量分布与设计流量是一致的并且在纵列之间是相等的。
使用HES3-EOS-C(3+)-EiP多潜能性报告hESC系进行了多个实验。现将总结所使用的实验程序，其中多个实验的结果描述于下文中。
HES3-EOS-C(3+)-EiP多潜能性报告hESC系
PL-SIN-EOS-C(3+)-EiP(Addgene质粒21313)慢病毒报告构建体在嵌合启动子的控制下表达eGFP-IRES-嘌呤霉素-N-乙酰转移酶，所述嵌合启动子包含小鼠早期转座子(ETn)启动子和3个来源于Oct4(也是Pou5f1)基因的远端增强子(保守区4)的Oct4/Sox2结合基序，所述Oct4基因特别地在多能细胞中是高度活化的。将慢病毒和包装载体转染至293FT细胞中用于产生病毒颗粒。用慢病毒颗粒转导适应于单细胞传代的HES3hESC并将其维持在mTeSR-1/Matrigel培养物中处于2-2.5μg/mL嘌呤霉素的选择下。
阵列筛选和静态对照
对装置300进行高压灭菌，根据“通道排气技术”进行填充，随后用单次注射的400μg/mL(总共供应10μg/cm2蛋白)纯化人纤维连接蛋白(BD Biosciences,North Ryde,Australia)(HES3-EOS-C(3+)-EiP实验)或hESC适用的基质胶(BD Biosciences)的有限稀释物(HES3-MIXL-GFP实验)进行表面涂覆(2-4小时，室温)，通过附着化验进行鉴定。
将维持在组织培养瓶中的hESC用TrypLE Express来分离，进行研制以获得单细胞悬液，随后用mTeSR-1进行洗涤并在含有10μM ROCK抑制剂(Y-27632二氢氯化物一水合物，Sigma-Aldrich,Australia)的情况下以1.6×106细胞/mL重悬于其中(HES3-EOS-C(3+)-EiP实验，4×104细胞/cm2的表面密度)或在无ROCK抑制剂的情况下以3.0×106细胞/mL重悬于其中(HES3-MIXL-GFP实验，7.5×104细胞/cm2)。
允许细胞在培养箱中(37℃，空气中5％CO2)附着至孔阵列330进行8-10小时，随后使其经历指定因子条件下总流速为60μL/h的连续流体流动。
利用3或1mL注射器(Terumo,Somerset,NJ)和聚乙烯管(PE50,0.58mm ID,BD,North Ryde,Australia)通过注射泵(NE-1800,New Era Pump Systems)提供正排量驱动的流动，其中将不锈钢、22规的钝头针尖用作至入口的连接器。将所有培养基进一步补充1％v/v青霉素/链霉素溶液。将24孔板中的静态培养对照以调整至给出每表面区域供应相等总量的蛋白的溶液浓度进行涂覆，并且还用相等表面密度的细胞进行接种，其中每天更换培养基直到实验终点(也可参见补充方法)。
为了在装置300中使用，从在RPMI B27培养基中的10ng/mL BMP-4和6ng/mL激活素A中进行分化的静态对照回收条件培养基。通过离心去除细胞并将上清培养基储存在4℃。将来自第1天和第2天的培养基混合并且在于阵列中使用之前将BMP-4和激活素A重新补充在50％的公称水平。
原位免疫荧光染色和共聚焦成像
对于原位免疫染色在流体流动开始后6.5天(HES3-EOS-C(3+)-EiP实验)或2.5天(HES3-MIXL-GFP实验)终止培养。当进行实验时，首先将入口311、312、313、314、315、316塞住关闭并使共同接种/涂覆出口342打开。通过注射泵来驱使染色和洗涤溶液的连续交换。
将孔阵列330用PBS洗涤并用2％多聚甲醛/PBS溶液进行固定(30分钟，RT)，随后用具有0.2％叠氮化钠的3％牛血清白蛋白(BSA)/PBS溶液进行封闭(30-45分钟，RT)。使用于0.3％BSA/PBS中的针对TG30(4μg/mL，Ms IgG2a同种型，Millipore)和TRA-1-60(4μg/mL，MsIgM同种型，Millipore)的第一抗体来检测标志物(1小时，RT)。
随后将孔阵列330用0.3％BSA/PBS洗涤，并随后使用于0.3％BSA/PBS中的同种型匹配的第二抗体(山羊抗-Ms IgG(H+L)-Alexa Fluor 568，山羊抗-Ms IgM-Alexa Fluor647，两者均为4μg/mL，Molecular Probes，Eugene，OR)和10μg/mL Hoechst 33342(Molecular Probes)的溶液进行处理(1小时，RT)。仅用Hoechst对HES3-MIXL-GFP阵列进行染色。
随后将孔阵列330在0.3％BSA/PBS中进行洗涤/固定以用于成像。使用Zeiss LSM710激光扫描共聚焦显微镜系统和Zen 2008采集软件(Carl Zeiss,North Ryde,Australia)来获取包含270个培养孔的整个装置300的16-比特彩色瓷砖扫描剪辑图像。为了调整因样本倾斜引起的强度变化以及为了完整捕获核和膜染色(其在z-方向上的强度发生变化)，获取光学切面并处理成最大强度投影，其被用于图像分析。
数据处理和统计方法
利用AGScan(https://mulcyber.toulouse.inra.fr/projects/agscan/)从阵列提取总荧光强度(例如TEOS-GFP)。将每个通道中的斑点强度关于个体阵列的该通道中所有斑点的平均值和标准差通过IEOS-GFP＝(TEOS-GFP-μEOS-GFP)/σEOS-GFP来进行线性转换，其中IEOS-GFP是EOS-GFP的表达指数，并且μEOS-GFP和σEOS-GFP分别是特定阵列的所有TEOS-GFP的平均值和标准差。这提供了在相对总体平均值的总体标准差方面评价每个斑点的强度的表达指数(IEOS-GFP，IMIXL1-GFP)。
利用MINITAB 15软件(Minitab Inc.)对表达指数数据进行了因子分析。将表达指数指定为应答变量且将可溶性因子指定为输入。第四输入变量‘位置’基于每个培养孔在阵列中的行坐标进行定义。随后根据在别处45描述的方法通过MINITAB产生效应量级。使用Microsoft Excel来计算皮尔逊积差相关系数(rX,Y)、线性回归的确定系数(R2)和学生氏t检验统计。对于学生氏t检验，对假定不等方差的两个样本进行双尾检验，且p<0.05的差异被认为是显著的。
原条诱导和化学调节
将在mTeSR-1/Matrigel培养物中维持的HES3-MIXL1-GFP hESC利用TrypLEExpress进行分离，以7.5×104细胞/cm2接种到涂覆了hESC适用的基质胶的有限稀释物的24孔板中，并允许附着过夜，在这之后培养物通常是～60％汇合的。随后通过在具有10ng/mlBMP-4和6ng/ml激活素A(均来自R&D Systems)并任选地添加5μM IWP-4和5μM CHIR99021(均来自Stemgent)或0.1％v/v DMSO媒介物对照的RPMI B27培养基中分化2.5天来诱导MIXL1-GFP表达。
现将描述每个实验的结果
微生物反应器阵列中的hESC多潜能性筛选
为了验证装置300在生物筛选过程中的性能，进行了HES3-EOS-C(3+)-EiP hESC在确定条件下的多潜能性筛选。对于该实验，缺少维持因子FGF-2和TGF-β1的定制mTeSR-1培养基(Cat#05892,StemCell Technologies,Vancouver,BC)的背景，和纯化的人纤维连接蛋白(BD Biosciences,North Ryde,Australia)的附着基质。在FGF-2、TGF-β1和视黄酸(RA)的全因子阵列中在恒流(总共60μL/h)下培养hESC 6.5天。筛选条件显示于图5A中，其中数字指示FGF-2(ng/mL)、TGF-β1(ng/mL)和RA(μM)的相对浓度。维持因子通过使用孔阵列330回滴定至培养基中，且视黄酸被包括来用作内部分化对照。
通过慢病毒转导的多潜能性报告系HES3-EOS-C(3+)-EiP的GFP表达被用作多潜能性状态的灵敏读出。验证了多潜能性报告系的效用，并且其响应多种维持和分化刺激的敏感性在与阵列平行进行的静态对照(24孔板)中进行了表征。多潜能性进一步通过在实验终点针对表面标志物TG30和TRA-1-60的原位免疫共染色来进行确认，并用Hoechst33342对DNA进行复染色(补充方法)。免疫检测阶段不显著影响阵列中的细胞数量或GFP荧光。
通过激光扫描共聚焦成像来捕获多通道荧光数据，所得的图像显示于图5B中。针对纵列25和纵列3的来自阵列行1的孔的更高放大倍数图像分别显示于图5C和5D中。比例尺对应于500μm。阵列中总荧光强度(任意单位)的热图显示于图5E中。将斑点强度关于个体阵列中所有斑点的平均值和标准差进行线性转换以提供表达指数(例如IEOS-GFP)。这个方法与ECM阵列所采用的测量是类似的并且具有在屏幕中清楚地突出显示“命中”的效应，其中在一个条件中可见相对于所有处理的平均值的强的正或负效应。总体标准化方法不允许在没有另外的校准器的情况下在不同的阵列或平板对照之间直接比较绝对表达水平。
结果显示HES3-EOS-C(3+)-EiP报告系中的GFP表达在第6.5天具有高动态范围和严格应答，其中用5或10μM RA的处理将EOS-GFP表达减小至低的基线水平，而无论FGF-2或TGF-β1处理。纵列1(无因子)和4(0.25ng/mL TGF-β1)还具有与RA处理的条件相似的EOS-GFP表达，显示出对于不存在的或不足够的促维持信号的敏感性。TG30和TRA-1-60显示出比EOS-GFP更低的动态范围，并具有在整个阵列上更混杂的表达分布。
如图5E和5F中所显示的，在一些RA处理的条件中在第6.5天存在残留的表达，这似乎显示出更多的与FGF-2和/或TGF-β1处理的综合效应。所有3个多潜能性标志物的最高的应答出现在第一行的纵列25上，其对应于重建的mTeSR-1条件的直接供应。因此，从验证角度上来看，阵列能够重现mTeSR-1培养基的效力，即使在施加缓慢灌注条件下也如此。
应注意到，该结果突出显示多潜能性标志物表达是位置依赖性的，并且具体地沿着孔通道的长度变化，即使共同的因子被供应至孔阵列也如此。在该实验中，多潜能性标志物最高的表达出现在阵列的第一行，随后是通过连续下游孔的降低的表达梯度。为了从阵列提取这样出现的特征，将孔通道中孔的位置坐标(行号)包括为因子分析的输入因子以表征假定的旁分泌效应，相反其在常规的培养形式中是难以明确分离的。因子分析随后揭示个体因子的主要效应，如图5F中所显示的。
在第一行中的最高EOS-GFP表达暗示外源因子能够直接作用于维持多潜能性。如果自生饲养层细胞的产生或旁分泌因子的积累是需要的，则预测EOS-GFP表达会显示下游最大值或增加的梯度。由于在筛选之前对HES3-EOS-C(3+)-EiP细胞进行了针对多能细胞的嘌呤霉素选择，因而这样的自生饲养层不可能存在于起始培养物中。结果显示GFP的减少是由在孔之间转移的可扩散因子的产生引起的。
根据阵列数据并不清楚是否存在由0.25或0.5ng/mL TGF-β1的添加引起的位置依赖性表达的显著差异，然而，缺乏TGF-β1(纵列10和19)的纵列也显示降低的梯度，表明存在不同的效应子。此外，考虑了来自代谢产物的影响。然而，在行10和在最大的细胞密度，预计葡萄糖消耗为～3mM(mTeSR-1水平的22％)，且乳酸积累为～7mM(已显示在3周19后部分减少TRA-1-60表达的水平的32％)。因此负旁分泌效应似乎是由分泌的具有净促分化效应的因子的补充引起的。这与这些因子在hESC条件培养基中的检测是一致的。
EOS-GFP数据对DNA的标准化，忽略所有含RA的条件，显示位置依赖性效应。多潜能性标志物表达指数是强烈相关的，其中基于所有270个斑点的配对总强度，相关系数(rX,Y)为rEOS-GFP,TG30＝0.77、rEOS-GFP,TRA-1-60＝0.64以及rTG30,TRA-1-60＝0.75。复制阵列实验也是高度相关的，其中基于所有270个斑点的配对总强度，IEOS-GFP、ITG30和ITRA-1-60数据分别具有0.60、0.64和0.41的rArray1,Array2，或者对于行1-5的配对平均强度，IEOS-GFP、ITG30和ITRA-1-60数据分别具有0.73、0.86和0.44的rArray1,Array2。这有利地相比于已公开的ECM蛋白阵列实验，其具有针对获自斑点子集的平均应答的0.35-0.65的相关系数。
原条分化筛选
hESC分化方案通常依赖于拟胚体(EB)来驱使目标表型的出现。然而，EB是异质性的并且包含信号转导活性的未特化的空间梯度，从而几乎无法提供旁分泌信号的控制。还已显示分化结果高度依赖于EB的大小，暗示由局部细胞密度引起的微环境参数(例如旁分泌因子积累)是关键性相关的。虽然利用报告基因标记的mESC的强制性聚集的实验已试图解析此，但这样的方法掩盖了拟胚体内微环境组成中的内部时空变化并且使得其难以将刺激的确定组合与特定分化结果联系起来。
为了进一步证实装置300提供这些功能的能力，将hESC朝向由转录因子MIXL1标志的原条样(中内胚层)表型进行分化。将生长为单层细胞的HES3-MIXL1-GFP hESC(也是HES3MIXL1GFP/w hESC；核型分析和体内畸胎瘤)在装置300中在RPMI B27培养基中的BMP-4、激活素A和GSK-3β抑制剂/经典Wnt激活剂6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)的全因子阵列中于恒流下分化2.5天。显示阵列条件的筛选面板显示于图6A中，其中数字指示BIO(μM)、BMP-4(ng/mL)和激活素A(ng/mL)的浓度。
表达GFP并在实验终点用Hoechst复染色的HES3-MIXL1-GFP hESC的共聚焦瓷砖扫描图像显示于图6B中，以及阵列中总荧光强度的热图显示于图6C中。孔阵列330内个体孔的更高放大倍数共聚焦图像显示于图6D中，其中比例尺显示500μm的长度。
终点MIXL1-GFP表达在严格划定的因子条件下被激活，其中在纵列6、15和24(各自包含10ng/mL BMP-4和6ng/ml激活素A并分别组合了0、1或2μM BIO的条件)中表达最高，如图6B和6C中所显示的。值得注意的是，高MIXL1-GFP表达孔(其包含特征为暗Hoechst DNA染色的细胞)在每种情况下均紧跟在“DNA-亮”孔(其特征在于丛生细胞层和亮DNA染色)之后。这样的表型周期性重现暗示了个体孔中(即严格划定的条件组中)由外源和旁分泌因子的独特和确定的组合引起的相对均质中间群体的离散图式形成。如图6A中的复制阵列实验针对IDNA和IMIXL1-GFP分别具有0.66和0.69的相关系数。
如图6E中所显示的，表达指数IMIXL1-GFP的因子分析显示对激活素A的线性正向依赖性，BIO和BMP-4浓度的最适点分别在1μM和10ng/mL。因子分析还突出显示了BMP-4和激活素A当在最适浓度组合时的协同作用。然而最显著的是，位置依赖性揭示了具有在行7的最适点的“旁分泌特征”，所述最适点在增加的指数趋势之后并紧跟在表达水平降低的指数趋势之前。在整个阵列上，仅在孔的第4行之下检测到可观的MIXL1-GFP表达，暗示仅BMP、激活素和经典Wnt刺激的组合不足以直接激活MIXL1表达。运行3.5天的阵列具有类似的GFP表达分布，暗示前几行中的缺陷不是纯粹由不充分的诱导时间引起的。相反，MIXL1活化需要旁分泌可溶性因子通过一系列培养孔的逐步积累。
为了强力地支持这样的可转移旁分泌因子的存在，当在随后的实验中提供诱导条件培养基(重新补充了50％的公称因子水平)作为因子时，观察到MIXL1-GFP表达以剂量依赖性方式朝向阵列的上排迁移。
为了显示鉴定负责此的因子的能力，将装置300进一步用于筛选作为候选旁分泌信号的FGF信号转导。
图7A显示了所使用的筛选条件，其中数字指示CHIR99021(CHIR,μM)、诱导条件和因子补充的培养基(CM，终％v/v)和IWP-4(μM)的浓度。表达GFP并在实验终点用Hoechst复染色的HES3-MIXL1-GFP hESC的共聚焦瓷砖扫描图像显示于图7B中，以及阵列中总荧光强度的热图显示于图7C中。
图7D是显示针对CM的组合和IMIXL1-GFP上的位置的平均效应量级的相互作用效应图。这突出显示条件培养基增加表达水平并将表达朝向阵列的上部迁移。图7E显示纵列19-21的DNA标准化的总荧光强度(TMIXL1-GFP/TDNA)，其显示CHIR添加的位置依赖性效应。CHIR增加表达水平并扩大了可观表达所延伸的行数。图7F和7G显示了来自分别在总强度和DNA标准化强度方面确认CHIR添加的效应的单独阵列运行的数据。
图7H显示Wnt积累也是需要的，因为IWP-4完全封闭了静态对照中的MIXL1表达，然而其不太可能是“限制性”积累因子，因为CHIR99021仅最低限度地向上迁移表达。
在MIXL1-GFP活化之后，下游培养孔中的表达强度迅速减弱，表明要么MIXL1诱导受到狭窄浓度范围的旁分泌因子的调节，要么MIXL1-GFP+群体自身产生对其诱导进行负反馈的因子。
还注意到在一个条件即纵列15(10ng/mL BMP-4、6ng/ml激活素A、1μM BIO)中，亮MIXL1-GFP表达在4-5行上延伸，而非如在图5B和5C中所示的在纵列6(在相同的条件下但无BIO)的行7上所见的单个峰值的荧光。这暗示可通过强制性的经典Wnt信号转导来部分克服负反馈效应。为了测试此假设，将细胞在包含10ng/mL BMP-4和6ng/ml激活素A的RPMI B27培养基的背景中的CHIR99021(CHIR，与BIO相反，其是不干扰CDK4活性的GSK-3β抑制剂)、重新补充了BMP-4和激活素A的50％的公称水平的诱导条件培养基(CM)和IWP-4(Wnt产生抑制剂)的全因子阵列中进行分化(补充方法)。CHIR99021同样地产生MIXL1-GFP表达的延伸条纹，如图7B、7C、7E中所显示的，这基于其作用模式—经典Wnt信号转导在GSK-3β/β-连环蛋白水平上的细胞内执行—暗示分泌的Wnt-拮抗信号例如DKK和sFRP是该反馈环的一类潜在中介物。该效应在图7F、7G中所示的单独阵列实验是也是明显的。
尽管这样的调节中内胚层特化的旁分泌因子依赖性和负反馈信号在瞬态体内结构例如原条中是明确必需的发育驱动器，但它们不可避免地减小体外分化效率。因此测试了在阵列中调节正向和负向旁分泌调节器的结果是否可被转化来在常规静态培养物中优化定向分化方案。的确，发现相对于RPMI B27+10ng/mL BMP-4+6ng/ml激活素A的标准条件，5μM CHIR99021的添加将MIXL1-GFP诱导从细胞的51％增加至86％，如图7H中所显示的。
现将参照图8A-8D描述装置的其它具体实施例，其显示了图3A-3C的装置的改良形式。
在该实施例中，装置仍然包含安装至基底803的第一和第二覆盖层801、802，如图8A和8B中所显示的。同样地，所述层可从PDMS或其它类似的材料形成并使用适当的黏结法来进行黏结。通常将基底适应于与滑片固定器相配以提供标准的微平板足迹，如在上述图3A-3C的实施例中所描述的。
在该实施例中，装置800包括入口810，其通过通道820相互连接至孔阵列830。所述入口810被提供在第一层801中并通过各自端口连接至第二层802中的孔阵列。将理解该布置与上述图3A-3C的具体实施例的布置是类似的并因此将不进行任何进一步的详细描述。
在该实施例中，装置包括4对入口811.1、811.2、812.1、812.2、813.1、813.2、814.1、814.2，其中每对入口用于接收各自因子和缓冲液。孔阵列830定义了在81个孔通道上的包含通过所述4对入口供应的4种因子的3个浓度水平的全因子阵列。通道在孔阵列中重复两次。每个孔通道包括50个孔，从而定义了具有8100个孔的孔阵列。
如图8C中所示的，通过适当的通道路线改变，将4对入口811.1、811.2、812.1、812.2、813.1、813.2、814.1、814.2对齐地提供在第二层上。将入口提供为对齐的构造帮助将入口偶联至流体供应物，例如按照需要通过允许单夹连接器被用来将因子和缓冲液供应物偶联至入口。在一个实施例中，这可被用于适应Dolomite Microflux连接器(8-针)布置。
为了确保因子和缓冲液至孔通道的一致递送，相应地重新设计了通道320的阻力，例如通过使用适当的弯曲。
装置800还包括接种入口841，其可被用于接收包含细胞的接种流体。接种入口通过接种通道842与孔通道流体连通，所述接种通道通常连接至孔通道的与通道820的连接点相对的末端。将理解这允许接种入口还用作出口，从而允许按需要将已流动通过孔通道的流体排出。
在该实施例中，以等阻(分形体)布置提供接种通道842以改善流量分布。此外，提供了具有增加宽度的低阻力通道842.1。用作出口节段的等阻接种通道的包含确保操作期间的均匀流量分布，以及确保提供低阻力细胞接种结构用于接种期间的均等细胞分布。
因此，在出口节段中提供较长的通道提供了在细胞接种结构与孔通道阵列之间的扩散屏障以防止使用中的孔通道的交叉污染。
在81个孔通道的每一个上的因子组合的实施例显示于图8E和8F中，其中绿色、红色、黄色和蓝色染料被用来模拟提供至入口811.1、812.1、813.1、814.1的因子A、B、C、D，其中相应的缓冲液被提供至入口811.2、812.2、813.2、814.2。在该实施例中，理论浓度显示于图8E中，以及来自染料载入实验的实际所得的浓度显示于图8F中。相应地，通过接种入口841的染料载入的结果显示于图8G中，其突出显示了在整个孔通道上的染料均等分布。
因此，上述实施例提供了用于在多种条件下调节细胞活性的装置。在一个实施例中，装置利用确定培养基和附着基质来不折不扣地筛选可溶性因子，提供培养基的连续灌注来分离和可视化旁分泌效应并呈现更加时间稳定的微环境，以及产生培养条件的全因子补足物以解卷积多重刺激之间的相互作用效应。
实验数据证实所述装置可被用于将刺激的确定组合映射至多潜能干细胞中横跨范围广泛的过程的表型结果。此外，阵列通过提供沿着孔通道定位的多个孔而能够在空间上分离和可视化旁分泌效应，其在常规静态培养物和特别是EB中是隐蔽的。通过揭示由给定的外源因子刺激方式引起的旁分泌特征，装置还提供了用于解码直接作用性可溶性因子的多级阶递系统(hierarchy)的测定：例如，假定的旁分泌因子至阵列的直接添加，以及因子从培养基的耗尽或其信号转导途径的抑制，是用来揭示参与驱动分化结果的旁分泌因子的性质的有效策略。
装置还允许检查调节分化结果的旁分泌效应，从而允许鉴定作用的多级阶递系统和模式或负责的具体因子。
将理解上述装置可与具有自动化和外围支持的微流体芯片的标准化平台结构一起使用，以允许将微生物反应器阵列技术广泛用于发现和优化控制多潜能干细胞自我更新和分化过程的微环境信号，从而最终开启多潜能干细胞的未来潜能。所述平台还可具有对于其它细胞类型的广泛效用，作为用于多种生物分子和药理学试剂的通用微环境筛选平台。
预期了多种物质，包括但不限于启动子、抑制剂、生长因子、凝血因子、激素、信号转导剂、化学组合物、药物、蛋白质、配体、抗体、有机体、细胞、微细胞、合成的细胞、脂质体、胶束、聚合物胶束(聚合物囊泡)、脂质、聚合物、表面活性剂、脂肪酸、离子溶液、酸性或碱性溶液、检测试剂、DNA分子、RNA分子、编码DNA或RNA序列的构建体、核苷酸、核苷、多肽、氨基酸、病毒颗粒、质粒、纳米颗粒、微粒、磁性颗粒、条件培养基、从条件培养基纯化的级分、天然提取物、培养基组分、细胞培养添加剂、碳水化合物、维生素、代谢产物、寡核苷酸、融合蛋白、蛋白聚糖和病原体。
在可使用的细胞方面，非限制性实施例包括：干细胞，包括但不限于造血干细胞、神经干细胞、骨干细胞、肌肉干细胞、间质干细胞、上皮干细胞、内胚层干细胞、多能胚胎干细胞、诱导多潜能干细胞、多能胚胎生殖细胞、全能细胞；成肌细胞；嗜中性粒细胞；淋巴细胞；肥大细胞；成红血细胞；成骨细胞；破骨细胞；软骨细胞；嗜碱粒细胞；嗜酸细胞；脂肪细胞；神经元；肾上腺髓质细胞；黑素细胞；上皮细胞；内皮细胞；肝细胞；肺细胞；肾细胞；以及其各自前体；肿瘤细胞，其示例性实施例包括：黑色素瘤、髓样白血病、肺、乳腺、卵巢、结肠、肾、前列腺、胰腺、脑和睾丸的癌；来源于干细胞或其它细胞的前体或分化细胞的中间群体；以及，包含上述任何细胞的细胞混合物。其它适宜的细胞包括已知的研究细胞和细胞系，包括但不限于Jurkat T细胞、NIH3T3细胞、CHO、COS等，以及非哺乳动物细胞类型包括细菌、藻类、酵母、真菌等。在一些实施方案中，细胞形成基本上均质的细胞群。在其它实施方案中，细胞形成异质培养物并包括已知通过旁分泌信号转导机制相互作用的细胞类型。
预期了多种涂层，包括但不限于启动子、抑制剂、生长因子、凝血因子、激素、信号转导剂、化学组合物、药物、蛋白质、配体、抗体、有机体、细胞、微细胞、合成的细胞、脂质体、胶束、聚合物胶束(聚合物囊泡)、脂质、聚合物、表面活性剂、脂肪酸、离子溶液、酸性或碱性溶液、检测试剂、DNA分子、RNA分子、编码DNA或RNA序列的构建体、核苷酸、核苷、多肽、氨基酸、病毒颗粒、质粒、纳米颗粒、微粒、磁性颗粒、条件培养基、从条件培养基纯化的级分、天然提取物、培养基组分、细胞培养添加剂、碳水化合物、维生素、代谢产物、寡核苷酸、融合蛋白、蛋白聚糖和病原体。
流体还可包含试剂，包括但不限于启动子、抑制剂、生长因子、凝血因子、激素、信号转导剂、化学组合物、药物、蛋白质、配体、抗体、有机体、细胞、微细胞、合成的细胞、脂质体、胶束、聚合物胶束(聚合物囊泡)、脂质、聚合物、表面活性剂、脂肪酸、离子溶液、酸性或碱性溶液、检测试剂、DNA分子、RNA分子、编码DNA或RNA序列的构建体、核苷酸、核苷、多肽、氨基酸、病毒颗粒、质粒、纳米颗粒、微粒、磁性颗粒、条件培养基、从条件培养基纯化的级分、天然提取物、培养基组分、细胞培养添加剂、碳水化合物、维生素、代谢产物、寡核苷酸、融合蛋白、蛋白聚糖和病原体。试剂可以是任何适当的形式的，例如溶解在流体内或作为固体悬浮在流体内。
因此，上述实施例提供了可扩展的连续流动微生物反应器阵列，其呈现外源调节剂的全因子组，并另外地允许内源调节剂在不同维度上的积累。通过使用人胚胎干细胞中的多潜能性维持和原条分化的实施例，上述实验证明了该平台分离、可视化、鉴定和调节在常规培养平台中不可容易理解的旁分泌效应的独特能力。所述阵列平台解码了因子相互作用和旁分泌信号转导事件和直接作用性可溶性因子的多级阶递系统，并因此允许解释微环境控制，例如对干细胞命运的因子效应。
在一个具体实施例中，阵列通过仅使用6个流体输入来产生3种可溶性因子的每一个的3个浓度的所有组合(全因子阵列；总共33＝27个不同的条件)，并且允许鉴定最适处理、因子之间相互作用效应，以及分离旁分泌因子积累和随后可视化对细胞表型的差别效应。所述阵列可用多种附着基质进行涂覆并用培养基连续缓慢灌注至少7天来维持hESC。报告基因表达和/或原位免疫染色允许细胞表型的读出。
将理解上述装置可用于其中期望能够评价物质对不同条件的应答和特别是评价细胞对不同环境条件(例如通过暴露于细胞调节剂)的应答的任何情况。因此装置可适用于多种应用和调节剂。例如，装置可被用于对细胞进行培养、温育、起反应、测定和分化，以及用于进行对调节剂的测试，例如以测试药物对改变细胞活性的有效性。其它的监测可包括细胞活力、细胞形态、细胞信号转导、蛋白质转运、细胞抗原呈递、DNA合成、细胞基因组、细胞转录组、细胞蛋白质组、细胞新陈代谢、细胞电生理学功能、细胞生理学功能、吞噬作用、内吞作用、基因表达、蛋白表达、碳水化合物表达、生物分子相互作用、受体结合、检测剂的细胞结合和调节剂的细胞吸收；
上述实施例从而是非限制性的。
本领域技术人员将理解许多变化和改性将变得明显。所有这样的对于本领域技术人员变得明显的变化和改性应当被认为落入本发明在所描述的内容之前明显显示的精神和范围之内。

Claims (33)

1.用于将物质暴露于条件的装置，所述装置包括：
a)包含若干个孔通道的孔阵列，其中每个孔通道包含沿着所述孔通道分隔开的多个孔，所述孔含有使用中的物质；
b)多个入口组，每个入口组包括用于接收各自的第一和第二流体的第一和第二入口，每个入口组接收各自第一流体，并且来自一个入口组的流体通过混合，与之后的入口组的流体合并，从而合并各流体；
c)偶联至所述多个入口组的入口的通道，所述通道用于将一种或多种流体选择性地供应至每个孔通道，以由此将所述物质暴露于不同的条件，从而允许测定所述物质对所述条件的应答，其中每个通道分流将流体供应至至少两个孔通道且其中至少两个通道组合以将流体的混合物供应至至少一个孔通道；和
d)基底和覆盖层，其中所述覆盖层包括第一和第二层，并且其中至少一个入口组被提供在所述第二层中用于将各自流体通过在第二层中的通道供应至所述第一层中的通道，在第二层中所述至少一个入口组的每个入口通过第二层中的通道与第二层中的多个端口相连，在第二层中的所述端口与在第一层中的相应端口对齐，从而从第二层中所述至少一个入口组的入口供应流体，并且其中所述孔被限定在所述基底和所述覆盖层的至少一个中。
2.权利要求1的装置，其中被供应至所述孔通道的第一末端的流体在流动方向上沿着所述孔通道流至所述孔通道的第二末端。
3.权利要求1的装置，其中至少一个孔中的应答影响相邻孔中的条件。
4.权利要求1的装置，其中在孔中产生的至少一些试剂被转移至相邻孔以从而至少部分改变所述相邻孔中的条件。
5.权利要求1的装置，其中对于在流动方向上的流体流动，由上游孔中的物质产生的试剂被转移至下游孔。
6.权利要求1的装置，其中对于无流体流动，试剂通过扩散在孔之间转移。
7.权利要求1的装置，其中所述每个通道的孔通道几何形状被布置来使得每个孔通道接收下列的至少一种：
a)等体积的流体；
b)等流量的流体；和
c)等比例的流体。
8.权利要求1的装置，其中所述通道几何形状包括下列的至少一种：
a)通道形状；
b)通道弯曲度；
c)通道长度；
d)通道高度；
e)通道宽度；
f)通道角度；和
g)通道内的障碍物。
9.权利要求1的装置，其中所述通道包括用于混合包含在其中的流体的混合部分。
10.权利要求9的装置，其中至少两个所述通道合并混合部分的上游。
11.权利要求1的装置，其中所述装置包括：
a)用于接收第一因子和缓冲液的第一入口组；
b)用于接收第二因子和缓冲液的第二入口组；
c)用于接收第三因子和缓冲液的第三入口组，并且其中每个孔通道接收第一、第二和第三因子的每一个的各自浓度。
12.权利要求11的装置，其中来自一个入口组的流体通过混合，与之后的入口组的流体合并，从而组合各自流体。
13.权利要求1的装置，其中所述装置包括：
a)至少一个用于接收包含所述物质的接种流体的接种入口；和
b)至少一个接种出口，所述至少一个接种入口和接种出口与所述孔通道是流体连通的，从而允许用所述物质来接种所述孔。
14.权利要求13的装置，其中所述装置包括若干个接种通道，所述接种通道用于将至少接种入口和至少一个接种出口的至少一个连接至所述孔通道。
15.权利要求13的装置，其中所述至少一个接种入口连接至孔通道的与所述至少一个接种出口相对的末端。
16.权利要求13的装置，其中接种出口与所述通道是流体连通的，并且其中在所述孔通道的接种之后将所述接种出口设置为被封闭，从而允许各自流体被供应至所述孔通道。
17.权利要求1的装置，其中所述装置包括至少一个控制设备，所述控制设备用于选择性控制下述的至少一个：
a)至孔通道和孔的至少一个的流体供应；和
b)从孔通道和孔的至少一个的流体和/或物质采样。
18.权利要求17的装置，其中所述控制设备包括用于选择性封闭通道的阀。
19.权利要求1的装置，其中所述通道是微流体通道。
20.权利要求1的装置，其中所述覆盖层包括模制聚合物材料。
21.权利要求1的装置，其中使用下列的至少一种来偶联所述基底和覆盖层：
a)粘附偶联；
b)热偶联；
c)机械偶联；
d)等离子体偶联；
e)共价/化学偶联；
f)静电偶联；和
g)磁性偶联。
22.权利要求1的装置，其中至少所述孔是被涂层的。
23.权利要求22的装置，其中所述涂层包含下列的至少一种：
a)抑制剂；
b)生长因子；
c)凝血因子；
d)激素；
e)信号转导剂；
f)化学组合物；
g)药物；
h)蛋白质；
i)配体；
j)抗体；
k)有机体；
l)脂质体；
m)胶束；
n)脂质；
o)聚合物；
p)表面活性剂；
q)检测试剂；
r)编码DNA或RNA序列的构建体；
s)核苷酸；
t)核苷；
u)多肽；
v)氨基酸；
w)质粒；
x)纳米颗粒；
y)微粒；
z)磁性颗粒；
aa)天然提取物；
bb)培养基组分；
cc)细胞培养添加剂；
dd)碳水化合物；
ee)维生素；
ff)代谢产物；
gg)寡核苷酸；和
hh)蛋白聚糖。
24.权利要求22的装置，其中所述涂层包含细胞。
25.权利要求22的装置，其中所述涂层包含病毒颗粒。
26.权利要求1的装置，其中至少一种所述流体包含试剂。
27.权利要求26的装置，其中所述试剂包括下列的至少一种：
a)抑制剂；
b)生长因子；
c)凝血因子；
d)激素；
e)信号转导剂；
f)化学组合物；
g)药物；
h)蛋白质；
i)配体；
j)抗体；
k)有机体；
l)脂质体；
m)胶束；
n)脂质；
o)聚合物；
p)表面活性剂；
q)检测试剂；
r)编码DNA或RNA序列的构建体；
s)核苷酸；
t)核苷；
u)多肽；
v)氨基酸；
w)质粒；
x)纳米颗粒；
y)微粒；
z)磁性颗粒；
aa)天然提取物；
bb)培养基组分；
cc)细胞培养添加剂；
dd)碳水化合物；
ee)维生素；
ff)代谢产物；
gg)寡核苷酸；和
hh)蛋白聚糖。
28.权利要求26的装置，其中所述试剂包含细胞。
29.权利要求26的装置，其中所述试剂包含病毒颗粒。
30.权利要求1的装置，其中所述物质包括下列的至少一种：
a)抑制剂；
b)生长因子；
c)凝血因子；
d)激素；
e)信号转导剂；
f)化学组合物；
g)药物；
h)蛋白质；
i)配体；
j)抗体；
k)有机体；
l)脂质体；
m)胶束；
n)脂质；
o)聚合物；
p)表面活性剂；
q)检测试剂；
r)编码DNA或RNA序列的构建体；
s)核苷酸；
t)核苷；
u)多肽；
v)氨基酸；
w)质粒；
x)纳米颗粒；
y)微粒；
z)磁性颗粒；
aa)天然提取物；
bb)培养基组分；
cc)细胞培养添加剂；
dd)碳水化合物；
ee)维生素；
ff)代谢产物；
gg)寡核苷酸；和
hh)蛋白聚糖。
31.权利要求1的装置，其中所述物质包含细胞。
32.权利要求1的装置，其中所述物质包含病毒颗粒。
33.权利要求1的装置，其中所述装置用于监测下列的至少一种：
a)对试剂的应答；
b)细胞生长；
c)细胞分化；
d)细胞活力；
e)细胞形态；
f)细胞信号转导；
g)蛋白质转运；
h)细胞抗原呈递；
i)DNA合成；
j)细胞基因组；
k)细胞转录组；
l)细胞蛋白质组；
m)细胞新陈代谢；
n)细胞电生理学功能；
o)细胞生理学功能；
p)吞噬作用；
q)内吞作用；
r)基因表达；
s)蛋白表达；
t)碳水化合物表达；
u)生物分子相互作用；
v)受体结合；
w)检测剂的细胞结合；
x)调节剂的细胞吸收；
y)细胞迁移；
z)细胞群组织；
aa)细胞粘附；
bb)细胞间相互作用；
cc)脂质表达；
dd)RNA合成；和
ee)组织形成。
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