CN102015998A - 微流体成像细胞分析 - Google Patents

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迈克尔·万达姆
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Abstract

微流体系统具有包括多个移液器的移液系统、靠近所述移液系统放置的微流体芯片、靠近所述微流体芯片放置的光学成像检测系统以及与所述光学成像检测系统连接的图像处理系统。所述微流体芯片具有由微流体芯片之主体限定的多个细胞培养室，每个细胞培养室与由微流体芯片限定的输入通道和输出通道呈流体连通。所述移液系统被构建并安置成以下至少一种：当微流体系统运行时，通过多个移液器将流体注入多个输入通道中，或者通过多个移液器从多个输出通道抽取流体。

Description

微流体成像细胞分析
本申请要求2008年2月1日提交的美国临时专利申请no.61/006842的优先权，其全部内容通过引用并入本文中。
技术领域
本发明的实施方案涉及微流体系统，更特别地涉及用于大规模细胞培养和测定的微流体系统和方法。
背景技术
本说明书引用的所有参考文献均通过引用并入本文中。
脑肿瘤分类问题
星形细胞脑肿瘤包括具有独特的临床、组织病理学和遗传特征的多种赘生物。自从先前在1993年的WHO分类以来，已收集的分子遗传学数据表明，组织学定义的各类星形细胞瘤在生物学水平上更加不同1。例如，多数胶质母细胞瘤的发生不具有恶性较低的癌前病变的临床或组织学征兆，这些病变已被称为原发性胶质母细胞瘤。它们发生于短期(通常少于3个月)临床病史后的较年长患者(平均年龄55岁)中。这些原发性胶质母细胞瘤具有如下特征：EGFR扩增(约40％的病例)和/或过表达(60％)，PTEN突变(30％)，p16INK4a缺失(30％～40％)，MDM2扩增(＜10％)和/或过表达(50％)，以及在整条10号染色体上杂合性缺失(Loss of heterozygosity，LOH)(50％～80％的病例)。相反，继发性胶质母细胞瘤从弥漫性(WHO II级)或间变性星形细胞瘤(WHOIII级)恶性化的发展较慢，并且其发生于较年轻的患者(平均年龄40岁)中。继发性胶质母细胞瘤在约60％的病例中包含TP53突变，这些突变中超过90％在之前的弥漫性(WHO II级)或间变性星形细胞瘤(III级)中已经出现。导致继发性胶质母细胞瘤的途径还具有染色体19q和10q等位基因缺失的特征1。在组织病理学上，对这些亚型的明确区分仍不清楚，但它们明显地通过不同的遗传途径发展1-3。这些亚型在预后方面是否显著不同仍有待于研究，但正如它们的发生一样，它们可能对特定新疗法具有不同的响应4。因此，正在进行的临床试验需要考虑分子亚型分型，并且未来的分类体系也将无疑基于这些差异5。脑癌中的PI3K/Akt/mTOR信号途径
EGFR和EGFRvIII
在患有胶质母细胞瘤(成人中最常见的原发性恶性脑肿瘤)的患者中，少数患者亚群似乎受益于EGFR激酶抑制剂埃罗替尼(erolotinib)和吉非替尼(gefitinib)6。然而，在胶质母细胞瘤中EGFR激酶结构域的突变很少发生7-8，这表明这种EGFR突变不能解释对EGFR激酶抑制剂的响应性9。EGFR基因通常在胶质母细胞瘤中得到扩增10，但是这种异常现象也与对EGFP激酶抑制剂的响应性不相关9。胶质母细胞瘤常表达EGFRvIII，其是具有组成型活性的EGFR基因组缺失变体11-15。这种EGFR变体强烈并持续地激活磷酸肌醇3′激酶(PI3K)信号途径，这对于细胞存活、增殖和运动性非常关键16-20。认为EGFRvIII对PI3K信号传导的持续活化造成“途径依赖(pathway addiction)”21；如果此途径被酪氨酸激酶抑制剂破坏，则依赖此途径的肿瘤细胞会死亡。通过促进对PI3K信号传导的长期依赖，EGFRvIII可以使得胶质母细胞瘤细胞对EGFR激酶抑制剂敏感。PTEN
PTEN(第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物，PTEN)肿瘤抑制蛋白是PI3K信号传导途径的抑制剂，其通常在胶质母细胞瘤中丢失10，17，22。这种丢失可通过将EGFR抑制与下游的PI3K途径抑制分开而促进细胞对EGFR激酶抑制剂疗法的抗性23。我们假设，EGFRvIII会使肿瘤对EGFR激酶抑制剂敏感，而PTEN丢失会削弱对该抑制剂的响应23。
为了验证这一假说，我们分析了用EGFR激酶抑制剂治疗前的患者中胶质母细胞瘤中的EGFRvIII和PTEN的基因和蛋白质水平。我们还探查了EGFR及其异二聚化配偶体Her2/neu中的突变情况，据报道它们在胶质母细胞瘤中发生突变并且也可能影响对EGFR激酶抑制剂的响应。我们发现，胶质母细胞瘤细胞中EGFRvIII和PTEN的共表达以及对EGFR激酶抑制剂的响应性之间有强相关性。
mTOR
已鉴定出雷帕霉素的哺乳动物靶标(mammalian target of rapamycin，mTOR，也称为FRAP、RAFT1和RAP1)是作用于PI3K活化下游的关键激酶25。在过去5年中，特异性阻断mTOR的雷帕霉素和雷帕霉素衍生物已作为潜在抗癌药剂被开发。mTOR调节关键的信号转导途径，并参与生长刺激与细胞周期进程的偶联。响应于生长诱导信号，静息细胞提高了一系列mRNA的翻译，这些mRNA的蛋白质产物是通过细胞周期G1期继续进行所必需的。PI3K和AKT是上游途径的关键元件，所述上游途径将生长因子受体连接与mTOR的磷酸化和活化状态联系起来26，27。就PI3K/AKT/mTOR途径在癌细胞发生和增殖中的作用而言，已证实PI3K/AKT/mTOR途径中的若干元件被成红细胞白血病病毒致癌基因同源物(ERB)表面受体家族、胰岛素样生长因子受体(IGFR)和致癌的Ras所激活28-31。
用于正电子发射断层显像(positron emission tomography，PET)的放射性示踪剂
18F-2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖(18F-2-fluoro-2-deoxy-d-glucose，FDG)正电子发射断层显像(PET)的临床应用正在不断扩大，特别是在肿瘤学领域。在结直肠癌(colorectal cancer，CRC)中，对PET的不同应用包括初步诊断、分期、再分期和对治疗响应的评估32-34。另据报道，与常规的、基于解剖的形态学方法相比，PET用于检测结直肠癌的复发和疾病转移提供了多种优势，这是因为它能够提供功能图象和肿瘤行为的证据35，36。这基于这样的认识，即提高的葡萄糖摄入是恶性肿瘤代谢变化的主要特征之一。临床上，FDG是最常用的PET示踪剂。它以与葡萄糖代谢相似的方式被运送到细胞中，但一经酶促磷酸化，FDG-6-磷酸即被肿瘤细胞通过代谢而捕获。因此，肿瘤表现出提高的FDG代偿，并且可利用PET扫描图像作为示踪剂活性增加的区域进行区分37。临床上，已利用对来自同一来源之肿瘤(包括CRC)的PET扫描观察到不同的FDG摄入，可根据标准化的摄入值(standardized uptake value，SUV)所半定量地。已针对肿瘤之间的FDG摄入差异及其摄入机制进行了大量研究。新的证据表明，影响FDG摄入的因素是复杂的，因为肿瘤的特异性生物学特征决定了葡萄糖代谢程度38-40。认为影响FDG摄入的大多数因素(例如缺氧和细胞密度)与糖酵解相关蛋白质表达的变化有关41，42。认为葡萄糖转运蛋白(尤其是GLUT-1，其直接参与FDG摄入)的表达决定了癌细胞中的FDG摄入水平43-45。
PI3K/Akt/mTOR信号传导途径和PET探针摄入
如上所述，FDG是最常用的PET示踪剂，其通过葡萄糖转运蛋白(Glut)被转运至细胞中。所述被运送的FDG被己糖激酶磷酸化并被限制于细胞中。因此，FDG的摄入受Glut及己糖激酶的调控。然而，令人感兴趣的是，Glut的细胞膜定位随Akt的活化而增强。此外，己糖激酶的表达也受Akt的调控。这意味着，FDG摄入与PI3K/Akt/mTOR途径密切相关。
在使用RAD001和AP23573的少数探索性试验中，使用18F-2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖正电子发射断层显像(PET)监测施用mTOR抑制剂后肿瘤对葡萄糖的摄入。在这些初步的研究中，一些肿瘤表现出葡萄糖摄入的降低，而这与放射性方法测定的目标响应不一致46。
药物筛选以及PET探针的发现(治疗与诊断)
如上所述，PI3K/Akt/mTOR信号途径与癌细胞中的葡萄糖和FDG摄入紧密相关。这就是FDG作为评估靶向PI3K/Akt/mTOR信号传导途径之抑制剂和/或药物的疗效的重要替代标志物的原因。此外，如上所述，脑肿瘤应根据分子指纹图谱进行分类，而临床试验应遵循这一分类。用于癌症诊断的PET成像也应与这一分类结合。因此，提出分子疗法的开发应与基于疾病分子指纹图谱分类的分子诊断的开发相结合是不无道理的。然而，目前尚没有这样可用的探索平台。
发明内容
根据本发明实施方案的微流体系统具有包括多个移液器的移液系统、靠近该移液系统放置的微流体芯片、靠近该微流体芯片放置的光学成像检测系统以及与所述光学成像检测系统连接的图像处理系统。所述微流体芯片具有由微流体芯片之主体限定的多个细胞培养室，每个细胞培养室与由微流体芯片限定的输入通道和输出通道呈流体连通。所述移液系统被构建并安置成以下至少一种：当微流体系统运行时，通过多个移液器将流体注入多个输入通道中，或者通过多个移液器从多个输出通道抽取流体。对多个细胞培养物进行自动化荧光成像的方法包括：将多个细胞培养物加载到微流体芯片的多个细胞培养室中，所述多个细胞培养室包括细胞外基质材料的表面涂层用于使所述细胞培养物固定；向细胞培养物施加至少一种荧光探针；在适当的条件下孵育所述细胞培养物以促进探针与细胞中或细胞上的特异性靶标结合；照射细胞培养物以使荧光探针发射荧光；以及对从各细胞培养室中细胞发出的荧光进行成像，同时所述细胞培养物仍基本上固定于所述多个细胞培养室中以提供有关细胞中或细胞上特异性靶标的信息。
附图说明
本发明的其它特征将在本发明下述各实施方案的详细描述并参考附图中提供。此外，通过结合附图并参阅详细描述，可以更好地理解本发明中上述及其它随之产生的优点，其中：
图1是根据本发明一个实施方案的用于大规模细胞培养和测定的微流体芯片的示意图；
图2是PI3K信号途径与PET探针摄入之间关系的示意图(左表显示PI3K信号途径的抑制剂，右表显示PET探针及其靶标)；
图3A-3C显示PTEN在U87细胞中的免疫荧光图像，和PTEN针对U87-PTEN细胞(图3A)、U87细胞(图3B)的流式细胞分析数据，以及基于图3A和3B之数据的与U87-PTEN细胞和U87细胞之流式细胞分析相应的定量数据(图3C)；
图4A-4C显示EGFR在U87细胞中的免疫荧光图像，和EGFR针对U87-EGFR细胞(图4A)、U87细胞(图4B)的流式细胞分析数据，以及基于图4A和4B之数据的与U87-PTEN细胞和U87细胞之流式细胞分析相应的定量数据(图4C)；
图5A-5E显示EGFRvIII在U87细胞中的免疫荧光图像，和EGFRvIII针对U87-EGFRvIII细胞(图5A)和U87细胞(图5B)的流式细胞分析数据，图5C显示单个U87细胞的EGFRvIII的平均免疫荧光强度，图5D显示基于图5A和5B之数据的与U87-PTEN细胞和U87细胞之流式细胞分析相应的直方图，图5E显示基于图5A和5B之数据的DAPI与EGFRvIII的二维图；
图6A-6E显示U87细胞对葡萄糖类似物(2-NBDG)的摄入(图6A和6B为U87细胞，图6C和6D为U87-PTEN的细胞，图6A和6C为明视场图像，图6B和6D为荧光图像，图6E为U87细胞对2-NBDG摄入的直方图)。
图7是根据本发明一个实施方案的微流体系统的示意图。
图8A-8C.图8A：用于大规模细胞培养和测定的微流体设备的实际视图；图8B：在6天期间U87细胞在微芯片中增殖的延时(time lapse)显微照片；图8C：芯片培养的U87细胞的量化增殖。
图9-10.数据收集。图9：数据收集得到二维或三维散点图。图10：数据收集得到直方图。
图11A-11C.在显微细胞分析平台中对p-S6染色的抗体浓度的优化。
图12A-12F.以自动化方式进行大规模信号传导分析的机器人移液器。
图13.对胶质母细胞瘤细胞中PI3K途径上游标志物的芯片上多参数测量：EGFR、EGFRvIII和PTEN。
图14.EGFRvIII、EGFR、PTEN基因检测——比较流式分析和芯片分析——同样的细胞悬液利用芯片和流式分析平行运行。
图15.对来自分子复杂的异质胶质母细胞瘤样品的单个细胞中的PI3K信号传导(p-EGFR、p-akt、p-S6)进行定量测量。
图16.对分子异质群的芯片上表征。
图17.芯片上检测群体中的“稀有细胞”。
图18.在实体胶质母细胞瘤的临床样品中检测PI3K信号传导。
图19.检测低水平的内源性PTEN。
图20A-20E SFK是GBM中对达沙替尼(dasatinib)敏感的分子靶标。
图21A-21E.开发在胶质母细胞瘤患者中测量mTOR抑制作用的方法以及证实抗性促进反馈回路(resistance promoting feedback loop)。
图22A-22C.微流体成像细胞分析(MIC)技术的概念性概述。
图23A-23C.用于可定量ICC的经FITC标记的pS6抗体浓度的优化。
图24A-24C.在优化的ICC条件下，用于EGFRvIII、EGFR、PTEN、pAKT和pS6单细胞分析的MIC技术的动态范围。
图25.两组同基因小鼠细胞系(包括(i)PTEN ES细胞系，即p8(+/-)且CaP8(-/-)，和(ii)MEF细胞系，即PTENloxp/loxp(+/+)且PTENΔloxp/Δloxp(-/-))中PTEN表达和pAKT磷酸化的定量。
图26.使用MIC技术进行平行信号传导分析。
图27A-27E.用不同浓度雷帕霉素处理的个体细胞中pS6表达水平的量化。
图28.使用3维散点图的两个不同视角来表明在MIC芯片中分析的脑肿瘤样品的细胞异质性。
图29A-29F.以自动化方式进行大规模信号传导分析的机器人移液系统。
图30.在MIC芯片12中分析的12例脑肿瘤样品的3维散点图，其表明各肿瘤样品中明显不同的细胞异质性。
图31.使用等级聚类方法来分析和量化给定患者样品中的细胞异质性。
图32.个体细胞的热图(heatmap)，其中绿色代表低表达，红色代表高表达，第一次传代的NS和SC显示了不同的细胞群。
图33A-33B.图33A为个体细胞的热图，其中绿色代表低表达，红色代表高表达，mTOR的阻断解除了pAkt反馈回路的抑制，且n为1。图33B为个体细胞的热图，其中绿色代表低表达，红色代表高表达，EGFR的阻断显示EGFR信号可通过pAkt传导。
发明详述
微全分析系统
近年来，生物学研究人员对于微全分析系统(micro total analysis system，μTAS)用于细胞分析产生极大的兴趣。μTAS的一个突出特征是其能够在微芯片上构建高度集成/功能性系统。因此，可以将在常规细胞分析中许多复杂的过程集成到独立的微芯片上。这种集成使得分析时间缩短以及操作简化。此外，这些集成的微流体系统具有一些优势，例如减少细胞、试剂和样品的消耗，实时分析以及实验条件恒定47。如上所述，在集成微芯片上的细胞分析可以提供多种益处。因此，利用微芯片的细胞分析已得到迅速推广，例如，应用于细胞分选48以及将基因导入细胞。
集成微流体设备
基于聚二甲基硅氧烷(poly(dimethylsiloxane)，PDMS)的集成微流体设备代表大规模的流体通道构造，其允许在同一设备上利用数字化操作控制对依序的物理、化学和生物学过程进行执行和自动化处理49，50。特别地，PDMS材料的弹性使得能够平行构建出微米级的功能模块，如阀、泵和管路51，这对于依序操作来说是必须的。此外，使用这种技术构建复杂的设备只需要相对简单的设施：使用标准的CAD软件绘制流体和控制网络，然后将其移至透明的光掩模。可使用光刻技术制备可重复使用的模具，在其上浇注PDMS树脂，并通过烘烤成型。例如，可通过在大块材料上穿孔构成进入流体通道的入口，并且此设备可容易地与玻璃或硅基底连结。大量的活动组件(如阀和泵)可通过堆叠多个单独构建的层来制造。当用空气或惰性气体加压时，跨越流动层通道的控制层发生偏斜，密封流动通道并阻止流体运动。这种阀操作方法也构成了微流体芯片的双向开关(例如，打开或关闭)。利用这种简单的构建技术，我们的联合研究小组展示了显著多样性的设备，包括具有化学反应环路的微流体设备(PCT国际申请(2006)WO 2006071470和美国专利申请(2007)No.60/876,525)、用于小鼠的集成微流体血液采样器(UCLA案例No.2005-659-1)、用于高敏感度定量放射性同位素浓度的微流体平台(美国临时专利申请，UCLA案例No.2006-388-1)以及用于细胞培养和测定的微流体平台(2006年12月22日提交的美国临时专利申请No.60/876,525)，其全部内容通过引用并入本文中。
基于显微镜的细胞分析
单细胞测量可以揭示群体平均数所掩盖的信息。例如，对大肠杆菌和酿酒酵母个体细胞52，53中基因表达变化的研究显示，由于基因表达机制运行中的随机波动，只有一小部分细胞与细胞之间的报告基因表达发生变化54-56，并已鉴定出决定和控制大部分变化的其它过程和基因54。
收集单细胞数据的一种方法是流式细胞术，对其的开发开始于20世纪30年代。现代仪器非常强大，但是(i)不能反复检测单个细胞以产生每个细胞的时间序列数据，(ii)由于细胞通过检测器的时间短(通常为几微秒)以及由于物镜的数值孔径所致，因此不能收集大量的光，所收集的光往往少于发射光的10％，(iii)通常捕获不到细胞图像，这使得难于分析细胞形状、大小和荧光的细胞内定位。最近的一些工作已试图通过长期累积荧光信号以及使用定制的电荷耦合器件(charge-coupled device，CCD)检测器捕获细胞图像来解决后两项限制57。光学显微镜可以通过提供随时间反复观察个体细胞、长时间收集发射光和高分辨率捕获细胞图像的能力来弥补流式细胞分析的一些限制。由计算机辅助的细胞追踪和图像分析的自动化操作始自20世纪60年代，其可允许生成一些这样的高通量数据57-63。但是，这种单细胞追踪的方法在实际应用中存在局限性，如低通量和/或细胞生存力不佳。
根据本发明的一个实施方案，新的基于PDMS的微流体设备(见图1)可允许进行药物筛选和PET探针的发现，其基于监测PI3K/Atk/mTOR信号传导途径和对探针摄入成像，它们分别与荧光显微镜和嵌入式检波器联用。(见2007年4月20日提交的PCT/US2007/009705)。在本发明一个实施方案的微流体设备中分析胶质母细胞瘤细胞系和经基因操作的胶质母细胞瘤细胞系包括U87、U87-PTEN、U87-EGFR和U87-EGFRvIII。这种微流体系统的内在优势可包括：节省样品和/或试剂、高通量操作、实验保真度、可扩展性、灵活性和数字化可控性。本发明某些实施方案中的微流体平台可用于高通量筛选药物和对候选探针成像。通过包括本发明某些实施方案的机器人移液系统，可使用独立设备平行筛选1000至10000个细胞培养物并且仍具有节省样品以及在单细胞水平上定量/系统读数的优势。根据本发明的某些实施方案，已发现10至1596个室是合适的。
高通量药物筛选
本发明某些实施方案的微流体平台具有显著提高使用基于显微镜之细胞测量来分析细胞的通量的潜力。该设备可使得能够在个体癌细胞中分析药物对PI3K信号途径的作用，并同时评估PET探针的摄入(图2)。更小的尺寸和更低的成本
在本发明某些实施方案的微流体设备中进行药物筛选和PET探针发现的内在优势在于，我们可以减少培养基、抗体、PET示踪剂等的用量。根据本发明的某些实施方案，已发现每个微培养室中低至约200pL的量是合适的。
监测信号途径
在本发明的一个实施方案中，使用免疫荧光方法对PI3K/Akt/mTOR信号途径的识别标志进行染色。然后，我们可以根据本发明的一个实施方案使用基于显微镜的细胞分析系统分析药物对PI3K信号途径的作用。
通过个体细胞中的分子指纹图谱对胶质母细胞瘤分类
该设备允许我们使用针对个体细胞的分子指纹图谱对患者的胶质母细胞瘤进行分类。根据这一分类，我们可以为每位胶质母细胞瘤患者选择有效的药物。
PET探针发现与个体细胞分子指纹图谱联用
同时，我们可以使用本发明一个实施方案的微流体系统为每位患者评估和选择有效的PET示踪剂。根据本发明的某些实施方案，我们可以为癌细胞中每个分子事件开发出不同的PET示踪剂。
微芯片中的高通量哺乳动物细胞培养
加州大学伯克利分校的Luke Lee博士小组展示了用于在连续灌注培养基的微培养室阵列内培养细胞的高纵横比的微流体设备。该设备的设计提供了节省成本的自动化培养细胞的有潜力的工具。该阵列中的单个单元由40μm高的圆形微流体室以及周围的2μm高的多个窄灌注通道组成。微培养室和灌注通道之间的高纵横比(～20)可提供诸多优势，如将细胞定位在微培养室内以及为细胞生长创造出均一的微环境。使用有限元法(finite element method)模拟该设备的流动模式和物质传递。于37℃在使用连续灌注培养基的设备内培养人癌细胞(HeLa)，并生长至汇合。
使用微芯片进行药物筛选
利用膜片钳技术进行离子通道活性的高通量测量作为表征治疗性分子的工具进行药物筛选引起人们极大的兴趣。结合高通量与小试剂量的微系统已导致出现了商业化的微型膜片钳设备。在这些设备中，离子通道的记录通常通过将细胞置于分隔两电极的膜中微米尺寸的小孔上来实现64，65。通过使用微流体途径将细胞引导至小孔上，可以减少将细胞置于记录点所需的劳力密集型微操作并且给予细胞持续的刺激66。获得用于高质量离子通道记录所必需的高电阻密封(～109Ω)对于大型和微型检测来说均在技术上具有挑战性，而微系统已在满足高通量挑战方面较为成功。
单细胞分析
在常规研究和微系统中，对单个细胞的分析通常使用基于图像的技术和细胞内荧光探针(如测量钙流动的荧光探针67)进行。然而，集成微流体设备能够精确地操作、处理和分析极小量，已为分析细胞内组分提供了新途径。能够分离单细胞然后使用化学裂解缓冲液裂解所述单细胞的具有集成气动阀的微流体设备已显示出能够从单个细胞中提取和回收信使RNA68。还集成了电泳分离的类似设备可以分析单个细胞裂解物中的氨基酸69。还展示了，使用电动流驱动的细胞上样、加载(docking)和裂解的通过电泳分离的单细胞分析70。
胶质母细胞瘤的分子指纹图谱
使用应用于组织微阵列的免疫组化分析，Mischel博士的小组进行等级聚类和多维尺度分析，以及单变量和多变量分析，以在体内详细研究PI3K途径17。结果提供了在体内胶质母细胞瘤中PI3K途径的首次详细研究，并提出了针对靶向激酶抑制剂治疗的患者分类的方法。此外，当可以与临床、影像和病理数据整合时，DNA微阵列分析是最有用的。需要大量的努力来开发合适的包含关键临床信息(包括患者特征，如年龄和性别)的数据库。定期进行脑成像，并将图像保存于中央数据库中。组织学显微照片记录了细胞形态，临床数据通过无线输入装置实时记入以确保信息的准确和及时。保存活检材料用于与临床数据有关的进一步分析，其用于提取RNA用于微阵列中的大规模表达分析71。
基于显微镜的细胞分析
在过去的20年中，大量的在临床和药物应用之外的以研究为导向的基于显微镜之自动细胞分析都仰赖于两个商业软件包——Metamorph(Molecular Devices Corporation)和ImagePro(Media Cybernetics，Inc.)——来操控显微镜、收集数据并进行分析。这些软件包(其常与较一般目的分析程序一起使用)例如Matlab(The Mathworks，Inc.)和Labview(National Instruments Corporation)可能构成了用于这些目的最先进的商业软件。同样，开源项目可以提供用于图像分析的有价值的工具。实例包括Open Microscopy Environment(OME)，其提供了针对microscopeimages 14、Image J、基于Java的显微镜图像分析工具包15以及CellProfiler16的文件格式和元数据(metadata)标准。
本发明一个实施方案中的微芯片
设计并构建了用于药物筛选和PET探针发现(图1)的基于以PDMS为基础之微流体系统的原型芯片。通道参数为300μm(宽)×2000μm(长)×200μm(高)。PDMS芯片牢固地粘附于经30秒氧等离子体处理的载玻片上。可将细胞外基质组分(如纤连蛋白(FN)和层粘蛋白、Matrigel和RGD肽)涂覆到所有通道的表面上用于固定细胞。
在一些实施方案中，使用如下小尺寸的微流体芯片。培养室尺寸：(100μm(长)×100μm(宽)×20μm(高)，容积为200pL。迄今常用的微流体芯片尺寸如下。培养室尺寸：(3000μm(长)×500μm(宽)×100μm(高)，容积为150nL。在另一些实例中，根据本发明的一些实施方案，使用如下大尺寸的培养室。培养室尺寸：(6000μm(长)×2000μm(宽)×200μm(高)，容积为2.4μL。
胶质母细胞瘤细胞
首先选择U87人胶质母细胞瘤细胞系和来自在加州大学洛杉矶分校接受脑肿瘤治疗之患者的原发性胶质母细胞瘤稳定生长细胞(NS 107、NS117、NS 146)用于“概念验证”试验。使用含有由CMV启动子驱动的PTEN、EGFR或EGFRvIII的逆转录病毒对U87细胞进行改造，以构建胶质母细胞瘤患者的模式细胞系(U87-PTEN、U87-EGFR和U87-EGFRvIII)。
微芯片中细胞的免疫荧光染色
将纤连蛋白(FN，细胞外基质)涂覆于所有通道的表面上用于细胞粘附。将250μg/ml浓度的8.0μl FN导入每个通道中，并在37℃孵育30分钟。将从常规细胞培养环境获得的悬浮U87细胞系的混合物导入经FN包被的通道，并在培养箱中孵育30分钟。然后，使用100μL细胞培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium+10％小牛血清+1％青霉素-链霉素+1％L-谷氨酰胺)冲洗通道。过夜后，用4％的多聚甲醛在室温下固定通道中的细胞15分钟。15分钟后，用PBS冲洗每个通道。为了防止抗体非特异性结合到每个通道表面上，将封闭溶液(含有10％正常羊血清、0.1％Triton X-100和0.1％N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷的PBS)加载到每个通道中并孵育30分钟。为了使PI3K/Akt/mTOR信号途径可视化，使用如下抗体：100μg/mL的小鼠抗人PTEN抗体(Cascade Bioscience)、15μg/mL的小鼠抗人EGFR抗体(Zymed Laboratories)、87μg/mL的抗人EGFRvIII抗体(Dako)。所有抗体均使用小鼠IgG标记试剂盒(Invitrogen)进行标记。将这些抗体加载到每个通道中，并于室温孵育30～60分钟。免疫染色后，将DAPI加载到每个通道中用于细胞核染色。完成所有染色后，使用Nikon TE-2000显微镜监测微芯片，并使用
Figure BPA00001233505000121
(MolecularDevices)成像软件对图像进行分析。
图3显示了U87-PTEN细胞(图3A)和U87细胞(图3B)中PTEN表达的免疫荧光图像，基于这些图像，如流式细胞分析一样，分析由Metamorph生成的定量数据(图3C)。使用DAPI染色作为细胞的指示物，我们可以知道哪些细胞具有免疫荧光染色阳性或阴性信号，并监测各细胞的荧光强度。在U87-PTEN的情形中，观察到两个不同强度的PTEN免疫荧光峰。通过免疫荧光染色，强度较高的细胞显示PTEN阳性细胞，强度较低的细胞显示PTEN阴性细胞。
在EGFR和EGFRvIII的情形中，我们还可以定量分析EGFR阴性/阳性细胞群和个体细胞的EGFR免疫荧光强度(图4和图5)。我们证实，我们的方法可应用于分析和分类胶质母细胞瘤。在图5的情形中，我们显示了我们基于显微镜的细胞分析对双染色进行二维分析的能力。这使我们能够从我们的免疫荧光图像获得更多的信息，例如鉴定个体细胞以及在单细胞水平上监测信号途径。
监测U87细胞中的葡萄糖摄入
为监测U87细胞中的葡萄糖摄入，使用荧光脱氧葡萄糖(2-[N-(7-硝基苯基-2-氧杂-1，3-重氮盐-4-基)氨基]-2-脱氧葡萄糖；2-NBDG)72，73监测U87和U87-PTEN细胞对2-NBDG的摄入(图6)。将细胞加载到芯片中后，使用含氯化钙的Hanks′平衡盐溶液(HBSS)清洗培养基。然后，将HBSS中的2-NBDG加载到细胞培养室中，接着在培养箱中孵育20分钟。在U87细胞的情形中，如图6B所示观察到2-NBDG信号。在U87-PTEN细胞中，未能检测到由2-NBDG摄入而产生的荧光信号(图6D)。U87细胞对2-NBDG摄入的直方图见图6E。这一结果显示，PTEN的过表达下调了Glut的细胞膜定位、己糖激酶的活性以及PI3K/Akt/mTOR信号途径。根据这一结果，同时监测PI3K信号途径和葡萄糖摄入应在筛选针对PI3K/Akt/mTOR信号途径之药物以及发现新的PET探针中起重要作用。
我们已证实，本发明一个实施方案的这种微流体设备可应用于胶质母细胞瘤和分析(包括对患者样品的分析)。本发明一些实施方案的微流体设备可提供监测个体细胞的平台。本发明一些实施方案的微流体设备可用于提供细胞分析。本发明一些实施方案的微流体系统还可用于高通量药物筛选。根据本发明的一些实施方案，细胞分析可实现降低成本。此外，本发明一些实施方案的微流体系统可用于发现PET探针。
本发明一个实施方案的微流体系统100示意于图7中。该微流体系统100具有移液系统102、靠近该移液系统102放置的微流体芯片104、靠近该微流体芯片104放置的光学成像检测系统106以及与该光学成像检测系统106连接的图像处理系统108。所述移液系统102可包括多个移液器。根据本发明的一个实施方案，所述微流体系统100还可包括照明系统100，其被构建并安排具有通向微流体芯片104的光路。当运行时，该照明系统110适于照亮所述细胞培养室中培养的细胞。在本发明的一些实施方案中，所述照明系统可以是白光或广谱照明系统、具有多光谱线的多色照明系统和/或单色照明系统(如激光)。
微流体芯片104具有由所述微流体芯片104之主体限定的多个细胞培养室。每个细胞培养室与由微流体芯片之主体限定的输入通道和输出通道呈流体连通。如上文中有关图1的描述，所述微流体芯片104可以是基于PDMS的芯片。
移液系统102被构建并安置成以下至少一种：当微流体系统100运行时，通过多个移液器将流体注入多个输入通道中，或者通过多个移液器从多个输出通道抽取液体。例如，根据本发明的一些实施方案，移液系统102可注入含有所培养之细胞的流体，可注入培养基和/或待研究的药物，以及可注入其它生物标志物等。移液系统102还可以使用同样的多个移液器或另外的多个移液器从微流体芯片104的输出通道抽取流体，例如用于细胞灌注等。
移液系统102也可以是机器人移液器(见图12A-12F)。但是，本发明的范围并不仅限于机器人移液系统。根据本发明的另一些实施方案，移液系统102也可以是手动或半自动移液系统。然而，从最初的细胞培养/培养基更换到免疫染色的自动化操作可允许用于高通量信号途径研究的大规模细胞培养/测定。
用户友好型界面可包括芯片支架(见图12A-12F)和移液器吸头阵列(见图12A-12F)。例如，可以设计机器人移液器使之处理96、396和/或1536孔板。可以利用现有的标准设备，如使用适合目前孔板平台尺寸的芯片支架。因此，可直接安装两个平板支架与机器人系统一起使用，而不需要进一步改造。目前，一个芯片支架可以容纳4个微流体芯片，而微流体芯片中有40个细胞培养/测定室。细胞培养室的每个入口和出口孔的位置可以登记为1536孔板中的特定孔位置。
本发明一些实施方案的微流体系统可包括如下手动、半自动和/或自动化的操作：
1.细胞培养样品的制备，包括细胞加载、在培养箱中培养细胞以及用于维持细胞的培养基更换。
2.免疫细胞化学：包括细胞固定、透化和免疫染色。
根据本发明的一些实施方案，微流体系统100可提供如下应用的系统：用于(i)高通量筛选的大规模细胞培养，(ii)用于精确定量单细胞生物分子的微流体细胞分析，(iii)与癌症诊断和治疗分类相关联的信号传导途径网络分析，(iv)作为Western印迹之替代的动态蛋白质定量，以及针对细胞中蛋白质组学定量分析的其它更广泛的应用。
微流体系统100的潜在应用可包括但不限于：
1.流式细胞术的替代技术，其可包括如下优势：(i)成本低，(ii)患者样品/试剂消耗少，(iii)适用于悬浮和贴附细胞，(iv)可提供实验保真度的微流体环境(具有半自动或全自动操作)，(v)通过观察荧光图像可以跟踪个体细胞的原始数据，(vi)能够捕获培养体系中微小变化的较高测量动态范围，以及(vii)单细胞精确度允许处理肿瘤异质性问题。
2.Western印迹的替代技术，可包括以下优势：(i)成本低，(ii)患者样品/试剂消耗少，(iii)可提供实验保真度的微流体环境(具有半自动或全自动操作)，(iv)单细胞精确度可允许检测肿瘤样品中的蛋白质缺失/下调，(v)平行进行大规模分析，(vi)通过观察荧光图像可以跟踪单个细胞的原始数据，(vii)超高的测量动态范围，以及(viii)捕获培养体系中微小变化的能力。
3.指出单细胞和细胞亚群中的改变。例如，提供了如下问题的答案：在患者复发期间的癌细胞中、在转移前细胞中以及在转化的最早期阶段，哪些信号传导机制处于活化状态？
4.不仅可关注“途径”，还可关注整个网络，例如用于回答下列问题：什么是药物的“靶效应”和“脱靶效应”？
5.鉴定并追踪癌症干细胞。例如：是否有表型不同的细胞亚群不被治疗所杀死并介导复发？
6.为开发药物鉴定靶标。例如：哪些信号传导机制使癌细胞对特定的化学治疗具有抗性？
7.选择最佳疗法。例如：响应于特定癌症疗法的患者是否具有类似的信号传导特征？
8.监测抗癌疗法。例如：信号传导特征是否可用作治疗性响应或副作用的生物标志物？
9.癌症的早期检测。例如：循环癌细胞或免疫系统细胞的信号传导特征是否可用于早期检测癌症？
10.了解细胞与细胞间以及癌细胞与宿主间相互作用的机制。例如：癌细胞如何与宿主微环境或免疫系统相互作用以及改变宿主微环境或免疫系统？
根据本发明一些实施方案的信号传导网络分析可提供如下作用：
1.不同于血清生物标志物的分析(诊断癌症的一种主要方法)，研究信号传导网络可有助于更好地了解疾病和针对分子损伤的治疗分类。
2.与基于组织形态学、western印迹和免疫组化(IHC)的常规病理学方法相比，定量的信号传导网络分析(利用多个信号传导节点)可以是更精确的癌症诊断技术(对于分期和诊断来说)。
3.可定期地在临床中获得活检样品。当然，应使用合适的组织处理技术。
4.定量的信号传导网络分析允许多维度的系统生物学研究(一段时间内的小变动/测量值)，提供了所述系统如何处理信息的更加动态的认识。
5.定量的信号传导网络分析可用于新药疗效的评估，这可以加快临床试验(二期和三期)。
6.基于芯片的研究可潜在地提供用于进行体外治疗的平台(在该设备中处理患者的肿瘤组织样品，以及在芯片中监测它们的治疗响应)，其可以在患者接受治疗前预测治疗效果。通过使用这种方法，可以在很短的时间内(如48小时)测试和评估多种药物或鸡尾酒治疗方法，且没有风险。
实施例A：测定实施例
1)样品制备，包括细胞加载、在培养箱中培养细胞以及用于维持细胞的培养基更换。
2)免疫细胞化学：包括细胞固定、透化和免疫染色。
·可以测量胶质母细胞瘤系统中参与PI3K-Akt-mTOR信号网络的多种信号传导节点(包括EGFR、EGFvIII、PTEN、pAkt、pmTOR、pS6)和增殖标志物Ki67。
·可以测量乳腺癌系统中参与PI3K-Akt-mTOR信号网络的多种信号传导节点(包括EGFR、ErbB2、PTEN、pAkt、pmTOR、pS6)和增殖标志物Ki67。
活细胞的生长曲线可如下监测：
图8所示的细胞培养/测定芯片由负责(i)平行操作72份细胞培养物和测定以及(ii)润湿相邻的细胞培养室(防止培养基蒸发)的两类微通道组成。同时，我们努力地研究微通道的表面修饰，以确保细胞在7天内的生存力。使用具有12个移液吸头的半自动移液器加载细胞，更换培养基，加入固定试剂、透化试剂和免疫染色试剂。持续的培养基更换允许芯片上的细胞培养物维持6天或更长的时间。已成功地在此设备中培养了多种经基因操作的胶质母细胞瘤细胞系(即，U87、U87-PTEN、U87-EGFR、U87-EGFRvIII和U87-EGFRvIII/PTEN)，其再生增长率与在大型设备中所获得的相当。
图8A是用于大规模细胞培养和测定的微流体设备的实际视图，其中两类流体通道已被加载了食用染料以助于使微流体芯片的不同功能可视化：(红色)润湿通道，(绿色)细胞培养通道。图8B是在6天期间微芯片中U87细胞增殖的延时显微照片。图8C是通过在一段时间中监测细胞培养室中U87细胞的数目来定量经芯片培养的U87细胞的增殖。
实施例B：数据收集
本发明一些实施方案的方法获得的数据可采用如下形式，例如二维或三维点图(X轴——一个信号传导节点的强度(在此情形中为EGFRvIII)，Y轴——另一信号传导节点的强度(在此情形中为DAPI)，对于三维点图来说，Z轴——第三信号传导节点的强度))(图9)。在另一实施方案中(图10)，数据可采用直方图的形式(X轴——一个信号传导节点的强度(在此情形中为EGFRvIII)和Y轴——细胞数目)。
芯片中胶质母细胞瘤细胞培养的操作步骤
材料：
24通道聚-L-赖氨酸包被的细胞培养芯片
细胞培养基：500mL Dulbecco′s Modified Eagle培养基
50mL胎牛血清
5mL青霉素-链霉素/L-谷氨酰胺
细胞系和同源(isogenetic)细胞：
U87
U87-PTEN
U87-EGFR
U87-EGFRvIII
U87-EGFRvIII/PTEN
自动移液器：
多通道移液器(来自Matrix Technologies Corporation，两种推荐的移液器产品号为2239和2139)
单通道移液器(来自Matrix Technologies Corporation，移液器产品号为1029)
仪器：
Nikon-TE2000显微镜
操作步骤：
细胞加载：
1.将芯片在生物安全柜中用紫外光照射消毒15分钟。
2.使用细胞培养基(每次2μL)清洗每个通道两次；移液器的加载速度为6μL/s。使用移液器吸头(与真空连接)移除废液。
3.向每个通道中加载含30％FBS的2μL细胞培养基。
4.将芯片置于培养皿中，并向培养皿中滴加0.5mL无菌水。
5.将培养皿置于培养箱中孵育24小时。
6.从培养箱中取出培养皿。使用2μL细胞培养基清洗每个通道两次；移液器的加载速度为6μL/s。使用移液器吸头(与真空连接)排除废液。
7.使用移液器以0.55μL/s的加载速度向每个通道加载每毫升8×105个细胞的2μL细胞悬液。
8.将芯片置于培养箱中(37℃，5％CO2)
9.使芯片在培养箱中过夜，以确保细胞良好贴附。
10.通过以0.55μL/s的加载速度，每12小时加载每个通道2μL新鲜培养基来为细胞更换培养基。
11.使用Nikon-TE2000显微镜，针对每个通道每天拍摄10张照片以监测细胞。
12.将细胞在芯片中培养6天。
提示：芯片中有时可能会产生气泡。在入口处滴一滴培养基将有助于减少芯片中产生气泡的机会。
PDMS微流体芯片构建的操作步骤
材料：Sylgard 184PDMS(Dow Corning Corp.货号4019862)
具有所限定光刻设计的硅晶片(Silicon Quest)
培养皿(VWR LABshop，货号为25384-302)
聚-L-赖氨酸显微镜载玻片(Polysciences，Inc.，货号No.22247)
显微镜载玻片(预清洗，75×50mm Corning)
甲苯(Sigma，货号为244511)
程序：
微流体模具的制备
1.将硅晶片模板置于铝箔覆盖的10cm培养皿中
2.在干净的搅拌杯中使用搅拌棒混合33g的10∶1(A∶B试剂比)SylgardPDMS
3.将经混合的PDMS倒入培养皿中的硅晶片上
4.对PDMS/培养皿抽真空40分钟，以去除所有空气
5.将培养皿置于烤箱中，在80℃孵育30分钟
6.从烤箱取出培养皿，使其在室温冷却30分钟
7.轻轻从培养皿中取出铝箔/晶片/PDMS模具
8.使用剃须刀片在晶片底面上轻轻地在铝箔/PDMS中切出“X”，并剥离以暴露出硅晶片的底面
9.轻压PDMS模具的边缘以从模具中释放出硅晶片
10.将PDMS模具切成芯片，并为每个芯片打孔(或者可以先打孔)
11.通过在微通道和芯片上部上拉粘性胶带两次来清洁每个模具，以除去灰尘和PDMS碎片
芯片制造
1.在干净的搅拌杯中用玻璃搅拌棒混合6g的5∶1(A∶B试剂比)SylgardPDMS
2.将5克经混合的PDMS混合物溶于玻璃烧杯中的20mL甲苯，用玻璃搅拌棒使其混匀
3.以4000rpm，30秒将PDMS甲苯溶液旋转包被至显微镜载玻片(75×50mm)上
4.将流体模具(上述)置于显微镜载玻片，使得一薄层PDMS胶涂覆PDMS微流体模具的微通道侧
5.将流体模具置于商业化的聚-L-赖氨酸载玻片上
6.将微流体芯片置于真空烤箱，于80℃孵育24小时
Metamorph显微镜操作步骤
材料：
MetaMorph(Premier版)：Molecular Device
显微镜：Nikon-TE2000S(外荧光显微镜)
样品
操作：
1.按如下操作顺序开启显微镜：(i)明视野光源(光一)，(ii)荧光光源-氙灯(光二)，(iii)CCD监测仪，(iv)相机，以及(v)计算机(如果它还没开启的话)。
＊＊＊在开启显微镜之前，请确保氙灯完全冷却，并且每次使用时，氙灯至少开启30分钟。
2.将载玻片置于载物台上。
3.打开Metamorph程序(通过点击桌面上的图标)，并下拉获取菜单选择“Acquire(获取)”。
＊＊＊有两种查看图像的选择：
1)在目镜上观察时，PORT旋钮(在相机的右侧)应转至“EYE(目镜)”
2)在显示器上观察时，PORT旋钮转至“SIDE(侧面)”。这也是CCD相机的使用选项。
4.在“获取对话框窗口”的设置中或使用选项面板选择适当的滤光镜。这将设置不同的选项，包括明视野、DAPI、FITC、TRITC、Cy5和Li-cor。还可在此时设定包括数字转换器、增益(gain)和曝光时间的操作参数，。
＊＊＊a)在拍摄荧光图像时，我们推荐“数字转换器”使用“1MHz”以及“增益”为“3(4×)”。
b)调整曝光时间使荧光强度介于2000(像素)到65535的范围内(通常介于0.1-10s之间)。
对于明视野，曝光时间应约为50ms。
对于DAPI，曝光时间应约为10ms。
对于FITC，曝光时间应约为100-500ms。
对于TRITC，曝光时间应约为200-2000ms。
对于Cy5，曝光时间应约为500-2000ms。
对于Li-cor，曝光时间应约为1-10s。
5.点击“Show live”来查看图像。使用对焦旋钮对焦图像并使用“ASI”控制框上的位置来操纵杆移动载玻片。
6.点击“Acquire(获取)”以获取所需图像。
＊＊＊在拍摄荧光图像之前，使用Nikon控制框上的按钮关闭明视野光。
7.下拉“File(文件)”菜单并选择“Save as(另存为)”保存图像。
8.拍照后，按如下操作顺序关闭显微镜：(i)Metamorph软件，(ii)荧光光源，(iii)明光源，(iv)CCD监测仪和相机，以及(v)计算机。
使用MetaMorph进行多重细胞打分：
1.打开一组上述操作保存的图像(DAPI和FITC、TRITC、CY5或Li-COR)
2.在“Apps”菜单下点击“Multiple Cell Scoring(多重细胞打分)”
3.点击“All Nuclei(所有细胞核)”，并通过“W1 source image(W1来源图像)”激活图像
4.根据每个细胞核的大小(来自DAPI图像)，设置“Approximate min width(合适的最小宽度)”和“Approximate max width(合适的最大宽度)”参数
5.根据信号和背景之间的最小像素差异(来自DAPI图像)，设置“Intensity above local background(高于局部背景的强度)”参数
6.点击“FITC(或TRITC、CY5、Li-COR)”，通过“W2source image(W2来源图象)”激活图像
7.根据每个细胞质区域的大小(来自FITC图像)，设置“Approximate min width(合适的最小宽度)”和“Approximate max width(合适的最大宽度)”参数
8.根据信号(每个细胞质区域)和背景之间的最小像素差异(来自FITC图像)，设置“Intensity above local background(高于局部背景的强度)”参数
9.点击“Apply(应用)”
10.点击“Open log(开始记录)”
11.点击“Log data(记录数据)”，数据将自动导出到Excel。
12.“Integrated intensity(累积强度)”或“Average intensity(平均强度)”值可用于分析(类似于FACS分析的直方图或散点图)
芯片中胶质母细胞瘤的免疫细胞化学操作步骤
材料：
24通道聚-L-赖氨酸包被的细胞培养芯片
细胞培养基：
500mL Dulbecco′s Modified Eagle培养基(Invitrogen，货号为11965-118)
50mL胎牛血清(Omega Scientific，货号FB-01)
5mL青霉素-链霉素/L-谷氨酰胺(Invitrogen-Gibco)
4％多聚甲醛(Electron Microscope Sciences)
Triton X-100(Fluka)
甲醇
磷酸盐缓冲液(PBS)(Mediatech，Inc，货号21040136)
正常山羊血清(NGS)(Fisher)
牛血清白蛋白(Sigma)
N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷(NDBM)(Pierce，货号89902，89903)
Zenon小鼠IgG标记试剂盒(Invitrogen/Molecular Probes)
HiLyte750标记试剂盒-NH2(Dojindo，LK16-10)
DAPI细胞核染色试剂(Molecular Probes，货号35033A)
抗体(＊当您收到抗体时请进行分装抗)
细胞系和同源细胞：
U87
U87-PTEN
U87-EGFR
U87-EGFRvIII
U87-EGFRvIII/PTEN
自动移液器：
多通道移液器(来自Matrix Technologies Corporation，两种推荐的移液器产品号为2239和2139)
单通道移液器(来自Matrix Technologies Corporation，移液器产品号为1029)
操作步骤：
细胞加载：
1.将芯片置于生物安全柜中用紫外线照射消毒15分钟。
2.使用细胞培养基清洗每个通道两次(每次4μL)；移液器的加载速度为6μL/s。使用移液器吸头(与真空连接)排除废液。
3.向每个通道中加载含30％FBS的4μL细胞培养基。
4.将芯片置于培养皿中，并向培养皿中滴入0.5mL无菌水以保持湿润。
5.将培养皿置于培养箱中24小时。
6.从培养箱中取出培养皿。使用4μL细胞培养基清洗每个通道两次；移液器的加载速度为6μL/s。使用移液器吸头(与真空连接)排除废液。
7.使用移液器以0.55μL/s的加载速度向每个通道中加载4μL细胞悬液(对于细胞培养来说为8×105个细胞/mL(～3200个细胞)，对于免疫染色来说为2×106个细胞/mL(～8000个细胞))。
8.将芯片放入培养箱中(37℃，5％CO2)。
9.将芯片于培养箱中过夜，以确保细胞的良好贴附。
提示：
芯片中有时可能会产生气泡。在入口处滴一滴培养基将有助于减少芯片中产生气泡的机会。
免疫染色：
所有用于染色的溶液都通过移液器以0.55μL/s的加载速度加载。类似地，使用真空来排掉废液。
1.将芯片置于冰上，通过加载4μL4℃(冷)的PBS来清洗细胞样品。
2.向每个通道中加载4μL 4％的多聚甲醛以尽快地固定细胞样品。在室温下孵育芯片15分钟，接着使用4μL PBS冲洗3次。
3.向每个通道中加载4μL透化溶液(含0.3％Triton X-100的PBS)来使细胞透化。室温孵育15分钟。随后，使用4μL PBS清洗通道3次。
4.准备封闭溶液，其由PBS中的10％NGS、0.1％NDBM和3％牛血清蛋白组成。加载4μL，在室温保持1小时。
5.向每个通道中加入4μL Zenon荧光团标记的抗体溶液并在4℃避光孵育过夜。接着使用4μL PBS清洗3次。
抗体溶液制备：
1.避光，加入15μL(9∶1)Zenon IgG标记试剂至1μg抗体溶液中。
2.等待5分钟。
3.加入15μL(9∶1)Zenon IgG封闭溶液至混合物。
4.等待5分钟。
5.将适当稀释度的抗体加入含有10％NGS、0.1％NDBM和3％牛血清蛋白的PBS中。
6.加载到芯片中。
6.向每个通道中加入4μL 4％的多聚甲醛以固定细胞样品。室温下孵育芯片15分钟，接着使用4μL PBS冲洗3次。
7.向每个通道中注入4μL DAPI(10μg/mL)染色试剂5分钟，接着使用4μL PBS清洗通道3次。
8.使用Nikon-TE2000显微镜检测荧光。
提示：
在EGFR染色的情形中，因为抗hEGFR的抗体直接与HiLyte Fluor 750缀合，所以不需要制备抗体溶液。请参阅“经HiLyte Fluor750标记之抗体的操作步骤”。
实施例C：用于对在接受激酶抑制剂治疗的小鼠和人中的PI3K途径生物标志物定量的纳米技术
本实施例利用技术和临床专业知识之间的协同作用来开发、优化和验证作为胶质母细胞瘤诊断工具的微流体集成纳米电传感器。我们为此实施例设定了以下目标：
1)扩展我们针对胶质母细胞瘤的微流体测定，以更好地在单细胞水平表征癌细胞混合群
2)开始优化我们针对临床胶质母细胞瘤样品进行这些基于微流体之测定的能力，从而在单细胞水平表征它们的信号传导。
3)使用一系列补充性方法开发新的血清生物标志物和细胞表面标志物，并开始验证其中一些新标志物。
1)用于胶质母细胞瘤多参数测量的基于芯片之微流体集成测定的开发和改良
1a)芯片开发和分析中的进展：
我们的联合小组最近展示了微流体细胞分析平台，其基于微流体细胞阵列与半自动化移液器和荧光显微镜相结合，用于在单细胞分辨率下对参与PI3K信号途径的信号事件进行分析。我们最初关注的是EGFR/PI3K信号传导轴。凭借基础机制的研究以及将其转化到临床中，我们已经：1)证明调节PI3K信号传导之两种关键蛋白(突变的表皮生长因子受体EGFRvIII和PTEN肿瘤抑制蛋白)的共表达与胶质母细胞瘤患者对EGFR激酶抑制剂的临床反应显著相关，并鉴定出与PTEN丢失有关之抗性的机制(Mellinghoff等，NEJM 2005)；2)开发了克服由PTEN丢失所介导之对EGFR激酶抑制剂产生抗性的策略(Wang等，Cancer Res.2006)，其正在进行临床试验；3)鉴定出可对EGFR激酶抑制剂具有敏感性的另一些EGFR突变(Lee等，PLoS Medicine 2006)。我们也开始意识到获得性抗性的挑战，并发现胶质母细胞瘤细胞可凭借其产生抗性的一些潜在途径(Mellinghoff等，Clinical Cancer Res.2007)。
许多经遗传改造的胶质母细胞瘤细胞(即U87、U87-PTEN、U87-EGFR、U87-EGFRvIII和U87-EGFRvIII/PTEN)以及原代细胞已在所述设备中成功地培养，可定量地分析细胞中受体(EGFR和EFGRvIII)、蛋白酶(PTEN)、磷酸化的激酶(p-Akt、pmTOR和p-S6)的表达水平。在此实施例中，我们的研究关注于(i)开发强大的且可重复的操作步骤用于免疫染色和图像采集/分析，以实现我们的基于芯片之细胞分析测量的最佳动态范围，以及(ii)在微流体细胞阵列和机器人移液器之间建立用户友好型界面，以允许在密切相关的微环境中进行大规模的信号传导分析。
(i)开发强大的且可重复的操作步骤用于免疫染色和图像采集/分析，以实现我们的基于芯片之细胞分析测量的最佳动态范围。虽然我们的微流体细胞分析平台可用于生成信号传导途径模式的直方图，而原先用于细胞固定、透化和抗体处理的条件/技术以及半自动化移液器和荧光显微镜的操作参数应进一步优化，以实现最佳的保真度和测量动态范围。因此，可利用我们的基于芯片之细胞分析测量值来鉴定出细胞信号网络中的小变动。基于系统性方法，我们测试了甲醛、甲醇、丙酮、Triton X-100的不同组合以获得最佳的固定和透化条件。此外，使用Zenon小鼠IgG标记试剂盒和HiLyte荧光团试剂标记磷酸化特异性抗体，从而在个体细胞中对不同的信号传导事件同时进行多重颜色分析。对荧光团标记之抗体的不同浓度进行了研究。通过研究各种条件下显示的对阴性和阳性对照系统获得之两个直方图的最高分离能力来确定最优条件。本文中，我们所提供的实施例确定了用于p-S6免疫染色的最佳抗体浓度。在此情形中，阳性对照是具有扩大的p-S6信号的U87-EGFRvIII胶质母细胞瘤细胞；阴性对照是经雷帕霉素处理的U87细胞，其中p-S6的上游信号被阻断了。使用不同浓度的(0、0.045、0.45和4.5μg/mL)经Zenon标记的p-S6抗体处理两组样品。使用倒置荧光显微镜来获取荧光图像(图11A)，进而通过MetaMorph程序(Molecular Device)来分析图像。需注意的是，通过再次系统性优化来确定操作/分析参数。如图11B所示，4.5μg/mL的抗体浓度得到最佳的阳性和阴性对照的分离。在图像分析过程中，除了累积荧光强度以外，还获得一个令人感兴趣的信息，即个体细胞的铺展表面积。我们注意到细胞表面积有一些变化。这个可变因素可通过用累积荧光强度除以个体细胞的表面积予以消除，从而得到非常尖锐的直方图(图11C)。与从流式细胞分析系统获得的直方图相比，所得的基于平均强度的直方图给出了针对捕获小信号传导事件的更好的精度和动态范围。目前，已通过系统性研究建立了用于EGFR、EFGRvIII、PTEN和p-S6免疫染色的四种标准操作方法。
图11A-11C显示了在微流体细胞分析平台中用于p-S6染色的最佳抗体浓度。a)在不同的抗p-S6抗体浓度下(0、0.045、0.45和4.5μg/mL)获得的阳性对照(U87-EGFRvIII)和阴性对照(雷帕霉素处理的U87)的显微图像。b)使用MetaMorph程序获得个体细胞的累积荧光强度，以及获得p-S6表达水平的直方图。显然，4.5μg/mL的抗体浓度得到了阳性对照和阴性对照的最佳分离效果。c)p-S6的平均表达水平可通过用累积荧光强度除以个体细胞的细胞表面积而得到。通过消除与细胞表面积相关的因素，直方图的显著尖锐了，使得两个直方图得以更好地分离。
以下描述针对PI3K/Akt信号传导途径的免疫染色操作步骤的集合，以及对相关信号传导网络的一些探索。下面，我们描述了该方法的某些方面，以通过使用此微流体细胞分析平台来表征分子异质性的实体胶质母细胞瘤肿瘤样品。
(ii)在微流体细胞阵列和机器人移液器之间建立用户友好型界面，以允许在密切相关的微环境中进行大规模信号传导分析。
原先的微流体细胞分析平台使用半自动化的移液器来依次处理细胞加载、培养基更换、固定、透化和抗体染色。除了流体注入以外，大部分的操作/处理实际上是手动控制的。因此，大量的劳动和不可避免的操作失误制约了对这一用于需要大规模研究之应用的半自动化方法的进一步探究。在与我们的同事(Mike van Dam和Chris Behrenbruch教授)的合作中，开发了在微流体细胞阵列和机器人移液器之间的用户友好型界面(图12A)。我们的目标是实现从最初的细胞培养/培养基更换到免疫染色的自动化操作，从而可进行大规模细胞培养/测定用于高通量的信号传导途径分析。这样的用户友好型界面包括两个定制设计的单元：芯片支架(图12B)和移液器吸头阵列(图12C-12E)。设计机器人移液器用于处理96、396和/或1536孔板。为了利用现有的设备(适合于孔板平台尺寸的芯片支架)，可将其直接安装在该机器人系统的两个平板支架上而不需要进一步改造。目前，一个芯片支架可以容纳4个微流体芯片，而微流体芯片上具有40个细胞培养/测定室。值得注意的是，细胞培养室每个入口和出口孔的位置都被登记为1536孔板中的特定孔位置。因此，可以应用原先开发用于处理1536孔板的程序来设置我们的微流体细胞培养和测定的自动化操作。机器人移液器带有8个独立控制的吸头，其具有精度为5nL的分配和抽取液体样品的能力。为了将我们的微流体芯片与所述机器人移液器集成化，我们将8个吸头重新组装成不同取向，其中这8个吸头被分为4对，分别平行处理四个细胞培养室。在每对吸头中，相对较长的吸头负责样品分配，而较短的吸头负责样品抽取。基于PDMS之微流体芯片的弹性赋予了吸头与微流体芯片入口之间的良好密封，并容许微小的构建缺陷。图12C示意一对吸头如何在微流体细胞培养室中处理样品/溶液更换。半自动化方法需花费约20分钟完成例行的细胞培养基更换，与之不同的是，使用该机器人系统完成同样的过程可少于10秒钟(图12D和12E)。
图12A-12F显示了用于以自动化方式进行大规模信号传导分析的机器人移液器。a)设计用于孔板平台的机器人移液器。b)定制设计的、与孔板平台尺寸一致的芯片支架允许机器人系统与微流体芯片之间便利的界面。c)该示意图表明一对移液器吸头如何在微流体细胞培养室中分配和抽取样品/溶液。d)四对移液器从试剂槽加载固定溶液。e)正在进行中的自动化染色。f)用于制备具有固定芯片高度的微流体芯片而定制设计的复本(replicate)。
根据本发明的一个实施方案，可以使用机器人系统完成针对PI3K/Akt信号传导途径分析的新的免疫染色操作步骤。可以使图像采集和处理自动化，从而为我们的微流体细胞分析技术提供包括样品制备、图像采集和数据分析的完整的解决方案。
1b)应用该技术进行包含在分子异质性样品中的PI3K信号传导途径关键节点的多参数测量。此设备显然可应用于胶质母细胞瘤的分析，但也可能对其它癌症类型的分析具有相当重要的作用。胶质母细胞瘤细胞中上游信号蛋白EGFR、EGFRvIII和PTEN的单细胞定量检测：
我们已在单细胞水平定量胶质母细胞瘤细胞中PI3K信号传导上游标志物方面取得了重大进展。本文中，我们展示了如何以高度量化的方式、在单细胞分辨率的水平上同时对PI3K途径的多种信号传导蛋白进行定量分析。此外，我们还展示了这些数据可以使用与流式细胞分析数据分析相类似的方式进行分析，以便于直接比较，并允许在复杂的异质性混合物中分析信号传导特征，包括在靶向分子的治疗前后。
图13显示了在芯片上对6种同源胶质母细胞瘤细胞系(不同在于EGFR、EGFRvIII和PTEN)进行免疫荧光染色。图14显示，与流式细胞分析比较，对同样的样品进行定量分析。如所示，该基于芯片的方法可以像流式细胞分析一样表征单细胞中的这些关键上游标志物，但所需的细胞却少得多。
图13显示了在芯片上对胶质母细胞瘤细胞PI3K途径上游标志物(EGFR、EGFRvIII和PTEN)的多参数测量。
图14显示了对EGFRvIH、EGFR、PTEN的检测，在芯片上和利用流式细胞分析平行运行同样的细胞悬液——流式细胞分析与芯片的比较。芯片上的定量检测与流式细胞分析检测相吻合，但前者需要少得多的细胞。
图15显示了对来自分子复杂异质性胶质母细胞瘤样品的单个细胞中PI3K信号传导(p-EGFR、p-akt、p-S6)的定量测量。这六种同源胶质母细胞瘤细胞系培养在一起作为复杂的混合物，然后在芯片上分析EGFR、akt和S6的磷酸化水平。这些数据以“流式细胞分析”的格式绘图。如图所示，akt和S6的磷酸化在所有缺失PTEN的细胞中相对上调，而相对于野生型受体，致癌基因突变体EGFRvIII大大增强了组成型EGFR的磷酸化。因此，很明显，表达EGFRvIII的缺失PTEN的肿瘤细胞(蓝点)(占混合物的六分之一)是PI3K信号激活最强的细胞，这与我们先前的研究结果一致(Mellinghoff等，NEJM 2005)，而这可以在分子异质性肿瘤样品中基于单细胞进行测量。
胶质母细胞瘤细胞中PI3K途径下游信号传导效应物——Akt和S6的单细胞定量检测
已知，组成型活化的EGFR、EGFRvIII的表达以及PTEN肿瘤抑制因子的丢失与PI3K信号传导的组成型活化有关(Mellinghoff等.NEJM，2005)。因此，预计这些信号传导蛋白应当在上述表达EGFRvIII和/或PTEN丢失的细胞被活化。因此，我们进一步在过表达EGFRvIII和PTEN丢失的上述的细胞中利用芯片分析了这些下游标志物。如下面图15所示，其中所述6种同源胶质母细胞瘤细胞被混合(U87、U87-PTEN、U87-EGFR、U87-EGFR-PTEN、U87-EGFRvIII和U87-EGFRvIII-PTEN)，并在芯片上分析，以“流式细胞分析”的格式呈现数据，很明显，通过测量akt和S6的磷酸化，在表达EGFRvIII和PTEN缺失的肿瘤细胞中观察到PI3K信号传导途径的组成型活化。这些结果表明了在复杂异质性肿瘤中鉴定独特的和临床相关的分子标志物的可行性。
在分子异质性胶质母细胞瘤样品中测量PI3K信号传导：
早已认识到，胶质母细胞瘤是所有肿瘤中分子异质性最高的肿瘤之一，因此得名“多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme)”。这种异质性是指在一个肿瘤中各细胞显著的表型差异和分子差异。因此，该实施例的一个目的是开发用于表征在这些分子水平不同之个体细胞中的信号传导途径的工具。上面图13-16展示了利用我们已开发的微流体集成芯片测量细胞混合物中PI3K信号途径关键蛋白质的能力。接下来的展示中，进一步显示了该基于芯片的方法如何能够在胶质母细胞瘤中挑选出个体细胞群以及如何表征肿瘤中包含在“稀有”细胞中的信号传导。在下面的图16中，我们以1∶1的比例混合了两种同源胶质母细胞瘤细胞类型(U87-PTEN和U87-EGFRvIII)，并检测了这些细胞群是否可以利用芯片以及利用流式细胞分析进行区分。如下所示，可以鉴定出两个不同的细胞群(见图16)。
图16显示了在芯片上对分子异质性细胞群的表征。将U87-PTEN和U87-EGFRvIII细胞以1∶1的比例混合，并利用芯片(左图)和流式细胞分析(右图)进行检测。如所示，可以利用芯片检测分子异质性样品。
为了确定我们是否能够基于关键信号传导标志物的表达在芯片上鉴定“稀有”细胞群，我们将U87(95％)和U87-PTEN-EGFR(5％)细胞混合，并在芯片上检测该细胞群。如下面的图16所示，我们能够检测到经测量占细胞群之7.4％(+/-2％)的稀有细胞群。这也与流式细胞分析的评估一致，但是其需要的细胞数少得多(几十至几百个，而非上千个)。这就提出了一种可能性，我们将能够基于关键信号传导或细胞表面标志物鉴定稀有的细胞亚群，例如脑癌干细胞。
图17显示了在细胞群中利用芯片检测“稀有细胞”。在芯片上分析U87细胞(95％)和U87-EFGF-PTEN细胞(5％)的混合物。如所示，我们可以检测到经测量占7.4％(+/-2％)的稀有细胞群。
临床实体肿瘤样品中关键信号传导途径的多参数测量
单细胞分析领域的大部分研究进展来自非实体肿瘤，如白血病和淋巴瘤，它们可以很容易地分离成单细胞悬液用于表征。对于实体癌来说，主要挑战之一是使这些基于技术的方法可用于表征实体肿瘤样品中的信号传导。我们在这方面已经开始取得重大进展。作为重要的中间步骤，我们已开始研究由C.David James(UCSF)和Jann Sarkaria(Mayo clinic)开发的人连续传代胶质母细胞瘤颅内异种移植物(Sarkaria等，Mol.Cancer Ther.2006)。这些模型由保留了胶质母细胞瘤之主要特征(例如，在正常培养和异种移植系统中缺失的EGFRvIII的表达)的连续传代人肿瘤组成。使用这种模型使我们利用可更新的临床资源(其为针对各种目的和意图的分子异质性临床实体肿瘤样品，与直接来自手术室的样品很相似)尽可能地优化我们的方法。下面，我们将展示在这方面的诸多进展。与此同时，我们正在优化我们的从来自手术室的实体瘤样品到芯片(无需进行显著改变肿瘤之分子组成的组织培养)的制备技术。我们在这一领域也取得了重大进展。我们现在已经开发了一种方法，使我们直接从肿瘤样品制备芯片。主要的障碍是难于使细胞“贴附在”固体芯片上。现在我们已开发了一些办法来克服这一困难，而其并不改变肿瘤细胞的信号传导特征。
实体GBM肿瘤样品中EGFRvIII和PI3K信号传导的多参数测量
为了开始分析临床实体样品中的EGFRvIII和PI3K信号传导，我们使用了来自James/Sarkaria模型系统的GBM 39。在获得一块实体肿瘤后，我们用胶原酶和机械方法对其进行分离，并优化一系列将其移至芯片上的方法以随后进行PI3K信号传导分析。如下所示，我们展示了就我们所知首次在实体GBM样品中对PI3K信号途径的关键节点进行单细胞定量。数据表明肿瘤具有EGFRvIII的表达和显著的PI3K途径活化(见图18)。
图18显示了在临床实体胶质母细胞瘤样品中检测PI3K信号传导。我们分析了源自体内连续传代之GMB模型(Sarkaria James，Mol.CancerTher.2006)的临床实体胶质母细胞瘤样品GBM 39中EGFRvIII、PTEN的表达和S6的磷酸化(作为PI3K信号传导的读数)。同时对U87-EGFRvIII-PTEN和U87-PTEN细胞进行了分析，以提供比较的基础。注意在GBM39中EGFRvIII的表达(左图)和PI3K信号传导的活化(右图)。据我们所知，这是第一次在实体GBM样品中对EGFRvIII和PI3K信号传导进行单细胞定量测量。
解决测量关键信号传导蛋白(PTEN测量)之内源性水平的挑战。我们注意到这样的挑战，即我们的一些抗体不能提供理想的信噪比。当用于表达水平较低的某些内源性蛋白(如PTEN)时，这就成为一个挑战。我们已应用酪胺信号放大(tyramide signal amplification)策略来提高我们检测PTEN的信噪比，使得我们能够检测出内源性水平的PTEN，同时使我们能够继续多重测量反应。在下面的图19中，注意到该方法使我们不仅能够在PTEN过表达的情况下而且对于内源性PTEN表达均检测到和量化PTEN的表达，而在PTEN缺失的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFS)中检测不到PTEN的表达。这些数据表明，我们可能敏感地且特异性地检测低水平的内源性蛋白用于测量。在接下来的描述中，我们的目标是进一步完善这一方法(见图19)。
图19显示了对低水平内源性PTEN的检测。使用酪胺信号放大技术，我们能够测量：a)过表达系统U87-EGFR-PTEN中的PTEN，左图；NIH3T3细胞中内源性低水平的PTEN，中图；以及PTEN缺失的MEF中PTEN的缺失，右图。下面，PTEN表达未定量。
2.开发在单细胞水平进一步评估癌症途径的技术
我们已开始使用DEAL、DNA编码的抗体文库以及开发新的细胞表面标志物来开发用于分离和富集单细胞群的新策略。
2a)DEAL技术——我们已验证了基于DEAL的方法根据EGFR表达来分选细胞的能力。我们目前正在研究将新的细胞表面标志物与这一方法相结合。我们已开发了一系列新的细胞表面标志物，其已被流式细胞仪和Western免疫印迹所验证，我们计划将它们整合到此DEAL策略中。
2b)检测新的细胞表面蛋白和分泌蛋白。我们已取得相对于20例正常脑组织样品的来自临床样品(63例GBM)的全基因表达数据，并鉴定了潜在的可能在GBM细胞中高度过表达的细胞表面标志物。然后，我们在一大群GBM和三级胶质瘤患者中分析了它们的表达，以证实这些标志物在GBM中的mRNA水平过表达(以及它们相对于三级肿瘤来说在GBM中的显著过表达)。然后，我们进而检测了它们在GBM细胞系中的蛋白质表达水平，然后在一系列来自进行尸检之患者的相匹配的胶质母细胞瘤/正常组织对中检测它们的蛋白质表达水平。随后，我们开始在体外分析这些标志物与EGFR/PI3K信号传导轴之间的潜在关系。迄今为止，我们已鉴定出10种潜在的细胞表面标志物，包括：PSCLR1、CXCR4和PTRPZ1(也被鉴定为分泌蛋白——参见下面的方法2)。
2c)鉴定和验证新的分泌蛋白：
通过对来自胶质母细胞瘤患者和非肿瘤患者的脑组织样品中差异基因表达的全面MPSS数据分析，发现了约5000个基因在胶质母细胞瘤脑组织样品中差异表达。选择了在脑中表达相对富集的38个基因用于靶向筛选胶质母细胞瘤患者的血清样品，以作为针对胶质母细胞瘤的候选血液诊断生物标志物。在ISB开发的基于质谱的靶向蛋白质组学方法中，首先将来自血清样品的蛋白质消化成肽，用称为iTRAQ(来自Applied Biosystems)的稳定同位素标记试剂对所有肽进行N-端标记。可用iTRAQ试剂对来自多达4个样品的肽进行差异标记，以测量四个不同样品中百余种蛋白质的相对丰度。为了克服由于样品复杂性所导致的通过质谱难于定量血清中低丰度蛋白质的问题，使用了两种技术：(1)可利用基于免疫亲和的去除方法选择性地去除几种优势血清蛋白；(2)通过在iTRAQ标记的混合物中增加所选肽段的总量可以显著增加质谱对低丰度肽的检测——低成本合成来自38种候选血液蛋白标志物的84个肽段，并与一种iTRAQ试剂混合，而来自正常人和肿瘤患者的两个肽段样品则使用另两种iTRAQ试剂进行标记。本实验的数据分析是目前正在进行之中。作为后续工作，我们已分离出25组匹配的成对样品(肿瘤和正常脑)，并已开始通过质谱来筛选差异表达的蛋白质。
2d)这些新技术与以分子为导向之临床试验的整合：
我们正在进行用VEGF抑制剂阿瓦斯丁(Avastin)(与CPT-11联用)治疗患者的临床试验，我们现在可以证明对于复发性恶性胶质瘤患者，阿瓦斯丁使肿瘤发展的时间延长至近4倍，从平均56天(95％CI＝49-97)延长至209天(95％CI＝122-272)，并且使总存活天数增至近两倍，从平均184天(95％CI＝171-225)增至340天(95％CI＝251-424)。阿瓦斯丁明显的临床效果一定会改变对恶性胶质瘤患者的护理标准。此外，我们具有相当大数量的明确的临床响应者(以及无响应者)，和在诊断时获得的冰冻组织(以及石蜡组织)，以及虽有临床响应但治疗失败的一组患者中的冰冻组织以及在治疗前、临床响应期间和治疗失败时收集的血清，这样的事实提供了用于鉴定针对该药物响应的分子决定因素以及鉴定有效的靶向组合的显著协作的分子/临床资源。我们具有较大数量的明确的临床响应者(以及无响应者)，和在诊断时获得的冰冻组织(以及石蜡组织)，以及虽有临床响应但治疗失败的一组患者中的冰冻组织以及在治疗前、具有临床响应期间以及治疗失败时收集的血清。我们要解决以下问题：1)增加的血管是否更倾向于对阿瓦斯丁产生临床响应(这将与加州大学洛杉矶分校著名的血管生成专家Luisa Iruela-Arispe博士合作完成)，2)在响应期间，受VEGF调节的下游信号途径是否被重新活化及其机制。被促进VEGF表达的关键途径(即EGFR/PI3K信号传导)驱动的肿瘤是否对阿瓦斯丁更敏感？除了验证这些具体的假设，我们将应用整体筛选策略。这些包括CGH阵列用于检测与敏感性和抗性相关的目的染色体区域(将在MSKCC由Mellinghoff博士完成)，以及与全基因表达数据整合(在UCLA和MSKCC完成)。此外，通过我们的纳米系统生物学癌症中心(NanoSystems Biology Cancer Center)，我们已开始与Lee Hood博士合作，利用表面等离子体共振来促进对血清样品中数千种蛋白质的定量检测。这将使我们能够鉴定与敏感性和获得性抗性相关的蛋白质标志物。
3.针对新GBM靶标之鉴定的系统生物学方法：
3a)靶向Src家族激酶：靶向EGFR/PI3K信号传导为胶质母细胞瘤的分子靶向治疗的潜在疗效提供了“原理验证”。鉴定新的药物靶标是下一个关键步骤。我们已开发并应用了系统生物学方法来鉴定胶质母细胞瘤中的新分子靶标。将来自GBM样品的全基因表达数据与分子相互作用数据库整合以鉴定潜在的可靶向途径，我们已鉴定出Src家族激酶(Srcfamily kinases，SFKS)Fyn、Lyn和Src作为胶质母细胞瘤的分子靶标。我们使用来自胶质母细胞瘤临床样品的全转录组数据来鉴定和验证作为关键分子靶标的Src家族激酶(SFK)Fyn、Lyn和Src。我们显示，这些激酶在多达50％的胶质母细胞瘤患者中都是过表达和持续磷酸化的，并使用siRNA、小分子抑制剂和过表达研究来证实SFK对于促进胶质母细胞瘤侵袭是充分且必要的，并且我们已证实小分子抑制剂达沙替尼(一种可安全地施用于对具有伊马替尼抗性CML之患者的化合物)抑制胶质母细胞瘤侵袭，促进肿瘤衰退与细胞凋亡，在体内大大增强了小鼠模型的生存(见图20)。
在图20中，SFK是在GBM中对达沙替尼敏感的分子靶标。A，B)在多达50％的GBM中观察到SFK磷酸化的升高。C，D)短期的达沙替尼治疗(灰色阴影)导致肿瘤衰退(通过光学发光成像来测量，与DavidJames博士合作)，并在体内显著增强了人颅内连续传代GBM异种移植物模型的存活。E，F)达沙替尼抑制SFK磷酸化并在体内促进细胞凋亡。
3b)在体内研究mTOR介导之抑制的机制：我们在PTEN缺失的胶质母细胞瘤复发患者中进行mTOR抑制剂雷帕霉素的临床试验，并鉴定出敏感性和抗性的关键因素(Cloughesy等2007，PLoS Medicine，印制中)。我们显示：1)mTOR抑制剂雷帕霉素以潜在治疗性水平存在于体内肿瘤组织中，2)雷帕霉素在所有患者中显著抑制mTOR信号传导，但抑制程度不尽相同(从10％～80％的途径抑制)，以及3)途径抑制的程度是至关重要的。大于50％的mTOR途径抑制显著抑制了增殖；较低程度的mTOR抑制不转化为生物学或临床响应。我们进一步证明，这并非由于细胞内在抗性所致，而更可能与药物在体内不能充分靠近其靶标有关。最后，我们研究了生长抑制与持续的临床响应之间的关系，并在近一半的患者中发现Akt介导反馈回路的证据。这种Akt介导的反馈回路与获得性临床抗性显著相关。这些发现具有重要意义。首先，它们表明在未来的临床试验中，开发用于记录胶质母细胞瘤患者中足够的靶标抑制的方法非常关键，以便于解释临床活动。其次，这些发现还指出联合阻断EGFR/mTOR的意义(上述1.2项中也给出同样建议)。第三，针对Akt介导之反馈回路的数据表明了联合抑制PI3K/mTOR以更好地抑制该途径以及抑制上游反馈回路的重要性。这些想法将很快在一系列临床试验(除了EGFR/mTOR抑制剂试验以外)中付诸实施(见图21)。
图21显示开发用于在胶质母细胞瘤患者中测量mTOR之抑制效果的方法以及表明抗性促进反馈回路。A)我们开发了图像分析方法用于比较患者接受雷帕霉素治疗前后的生物标志物。B)该免疫组化方法通过传统的生化反方法来验证。C)雷帕霉素在体内显著抑制胶质母细胞瘤患者中的mTOR，以及D)抑制肿瘤细胞增殖，如通过Ki67所测量地。E)在一组患者中，雷帕霉素治疗通过Akt激活反馈回路(通过PRAS 40生物标志物测量)，这种激活显著缩短了肿瘤发展的时间。
3c)在体内测量EGFRvIII。我们开发了新的基于核酸的方法用于可靠地检测EGFRvIII突变体(Yoshimoto等，Clinical Cancer Res，2007，印制中)。我们之前显示过，EGFRvIII(在PTEN完好的情况下)使胶质母细胞瘤对EGFR抑制剂敏感(Mellinghoff等，NEJM 2005)。EGFRvIII还呈现出针对抗EGFRvIII之疫苗的独特的抗原性靶标。因此，可以保证在临床样品中的检测。然而，冰冻组织通常并不易得，特别是对于在社区中治疗的患者。因此，在用福尔马林固定的石蜡包埋(formalin-fixed paraffin embedded，FFPE)临床样品中检测EGFRvIII是一项主要挑战。我们开发了用于从常规处理的经福尔马林固定、石蜡包埋的胶质母细胞瘤活检样品中检测EGFRvIII的实时RT-PCR测定，其敏感性为92％，特异性为98％。该测定易于在病理实验室各处使用，以利于在胶质母细胞瘤患者中广泛地测试EGFRvIII突变。
B)其它实施方案：
B1：扩展的微流体测定。根据本发明的一些实施方案，可以继续扩展我们对胶质母细胞瘤关键信号途径的芯片分析。可以进一步增加目前所测量的信号传导蛋白的数量，评估我们在芯片上研究信号转导途径抑制剂之作用效果的能力(包括在混合的GBM细胞群中)，以及将这些芯片与上述细胞表面分选方法相结合。我们还可以开始更多地研究来自患者的新鲜肿瘤样品，以优化用于定量分子异质性以及用于优化芯片上样品培养的方法。
B2：在常规处理的临床样品中(以及在回顾性冰冻临床样品中)优化关键信号传导途径的检测。可将该方法应用于临床实体肿瘤样品，以优化临床实体样品的多参数测量。我们还旨在开发检测先前被冰冻的样品的方法，特别是来自进行基于分子之临床试验的患者的样品，因为这允许我们在已进行的试验中建立信号传导状态与靶向性治疗之响应之间的相关性。
B3：评估分子异质性是整体性还是局部的。已意识到胶质母细胞瘤中分子异质性的程度，但没有详细地研究。事实上，还不清楚肿瘤中局部异质性是否代表整个肿瘤，或者对于肿瘤的完整分子表征是否需要空间分配活检(spatially dispersed biopsy)。这个问题的答案对于为患者设计合理的联合治疗法以抑制抗药性具有明显重要的意义。这些工具的开发可有利于我们回答这个问题。
B4：单细胞水平上的癌症途径：我们可以使用针对上述细胞表面蛋白的抗体扩展我们的DEAL方法。我们还可以将这些DEAL方法与基于微流体的芯片整合。
B5：开发新的血清标志物：UCLA、ISB和CIT小组可整合他们潜在的血清标志物列表。UCLA和ISB均可获得血清样品以及肿瘤样品，我们可以使用基于ISB的方法进行对潜在血清蛋白质的更大规模的分析。
B6：对细胞表面标志物的其它鉴定和验证：我们可以继续分析列表中潜在的细胞表面标志物的表达，以确定基于这些标志物(利用DEAL和流式细胞分析)进行的分选是否可以鉴定具有不同表型和生化特性(以及对靶向药剂之敏感性和抗性的不同模式)的GBM细胞群。
实施例C：
目前的病理模型
目前的癌症诊断病理模型是基于癌细胞与其假定的原始细胞或其发育前体的显微相似性。根据组织形态学表现以及一些蛋白质标志物的存在或缺乏，病理学家总结出涉及肿瘤类型和分级的广泛的病理学诊断。通常，患者要接受相对毒性的、非特异性的治疗，如DNA损伤剂和辐射。虽然这种分类和附属的分级系统已被证明对于预测患者群体的总体存活以及对于沟通广泛的疾病分类信息有用24-29，但对于本质的分子途径损伤却只能获得相对有限的发现30。此外，使用现有的分类系统，不能监测在病程和对治疗之响应上显著不同的临床相关亚群。被认为是癌症诊断“黄金标准”的传统病理学检查可能不会非常适合靶向分子的疗法，这是因为基于形态学的谱系类型区别并未揭示有关分子网络的信息。
癌症是分子异质性疾病31-35。过去十年已清楚表明，同一组织类型的肿瘤中涉及的分子损伤有很大的不同。更重要的是，患有同一组织类型之癌症的患者对于治疗的响应可能完全不同，这取决于其肿瘤的分子组成。越来越多的证据表明在个体肿瘤中存在相当高的分子异质性，例如一小群重新生成的肿瘤干细胞，其可能是癌症复发的关键驱动因素。迫切需要开发强大的定量工具用于肿瘤中个体细胞内信号传导网络的多参数测量。现在很清楚，任何类型的癌症均可分类成一系列疾病，每种疾病都有自己的分子特征。传统的病理检测不能区分这些相关的肿瘤亚群，因为他们往往在显微层面上相同。
靶向治疗的出现使得开发出多种靶向特异性的药物(如激酶抑制剂36)，并已表明在一些类型的癌症中具有突出的效果6，37-42。靶向治疗的实施需要新的分子诊断方法用于鉴定和定量与造成癌症恶性转化之准确信号途径相关的疾病靶标。用于分子分析的常规技术(例如Western印迹)需要大量的组织，其受到动力学特征和单细胞特性的限制。分子诊断的关键挑战之一是在单细胞精确度下对分子不同的细胞中的信号途径进行多参数测量。
针对癌症病理学的系统方法
癌症是复杂的疾病
没有两种肿瘤是相同的。孤立地分析个体基因或蛋白质不可能产生重大的癌症诊断和治疗的突破。相反，针对癌症的系统生物学方法43-46目的在于确定造成癌症发生之特性(即其增殖能力、侵袭能力、对治疗抑制剂的抗性)的蛋白质和基因“模块”和网络。通过获取有关系统中关键要素之间相互关系的信息，即可了解和靶向高度个体化癌症之间的共同点。复杂输入的整合
该系统方法包括选取尽可能多的基因和蛋白质表达的分子特征以及现象信息作为输入，并使用图形模式将其整合成一套网络。随着越多的输入被整合，该网络的结构也被完善从而可以产生有关该系统如何运作的假设(或者对于癌症来说，它是如何出错的)。然后，可通过进行一系列系统性干扰并测量对该网络的影响(以及对表型特征如生长、侵袭、对治疗的响应等)来动态地验证这些假设。这样便可以修正这些假设，然后再进一步测试和完善。针对系统的更完整的分子“快照”是有可能的，这种高含量的知识可以转化为新的诊断和治疗工具，从而完善对癌症的病理性诊断。
针对癌症的系统方法需要新技术
使用目前可用的一套技术，真正系统水平的癌症评估是不可能实现的。然而，我们小组已处于正在被整合入系统生物学实验室的分子和纳米技术兴起的前沿。本文所述的微流体成像细胞分析(MIC)技术的开发和验证将有利于对癌症细胞和组织的新型病理检查，主要是，其整合了系统水平的诊断方法。
PI3K/Akt途径是癌症中的重要靶标
PI3K47是一种促进多种生物学功能(包括细胞增殖、存活和运动)48-51的脂质激酶。PI3K信号途径调节多种细胞过程，如增殖、生长、凋亡和细胞骨架重排。PI3K信号途径常常在多数人类癌症类型中失调52，53，往往与ERK途径相结合54-56。PI3K-AKT-mTOR途径57-61(和RAS/ERK途径62，63)可基于癌基因的活化和抑癌基因的缺失(其在胶质母细胞瘤中常见64-66)而失调。很大一部分癌细胞类型包含PI3K信号传导的负调节剂——肿瘤抑制基因PTEN的变化7-9，这导致PI3K途径的组成型活化。PI3K的上游——表皮生长因子受体(EGFR)常常过表达39，64，68-71，这常常与其组成型活化的EGFRvIII变体(及其它变体)有关71-75，常常导致PI3K和Ras/ERK信号传导的失调62。PI3K和RAS/ERK途径与其它信号传导级联联系很多，从而将与其它细胞表面活动、应激活化途径和细胞外基质蛋白质有关的信号进行整合。很明显，PI3K和ERK信号传导途径以及相关的信号传导分子是重要的治疗靶标。
通过流式细胞分析进行信号传导分析
流式细胞分析76-79可以追踪和分析个体癌细胞的信号传导事件。流式细胞分析独特的定量个体细胞之多重性质的能力可提供异质混合物中每个细胞的信息。细胞通常被固定和透化从而使各种试剂进入。使用缀合有荧光团的抗体检测具有目的信号分子的细胞，所述抗体对识别所述蛋白质是特异性的。流式细胞分析数据的单细胞分辨率和多参数性质可产生用于区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞的特征。因为细胞必须经过分离才能用于检测，所以流式细胞分析主要用于研究血液系统癌症80，81。来自实体瘤的贴附肿瘤细胞在进行流式细胞分析测量之前必须被分离或剥离。这样，细胞的信号传导途径有可能被干扰，并且有可能得到错误读数。流式细胞分析最大的局限性是需要大量的细胞样品(106数量级)，这使其无法与穿刺活检和其它微创活检采样技术相结合。
集成的微流体系统和“芯片实验室”的开发
因为具有许多内在优势包括节省样品、精确的流体传送、可扩展性和数字可控性，微流体系统成为处理肿瘤样品的理想平台82-87。可以在微流体设备中进行细胞培养和细胞测定72，88-97。可以将多个培养室整合到单个芯片中，从而允许高保真度的多参数分析。与基于微孔板的细胞培养系统不同，微流体芯片提供了三维的培养环境，其更好地模拟了体内微环境。受控的单向流体流动提高了生物测定的保真度。此领域的一些研究者包括斯坦福的Steven Quake博士、加州大学伯克利分校的Luke Lee博士、威斯康星大学Madison分校的David Beebe博士。Quake博士使用微流体生物反应器进行哺乳动物细胞的长期培养72以及在单细胞水平监测极少量细菌群98。用于哺乳动物细胞98-102和酵母的微流体细胞培养设备已在UCB开发并且现已成为商业产品。Beebe博士已通过利用微观所特有的扩散-限制混合和其它现象在芯片上获得了一些令人感兴趣的细胞微环境96，103，104。此研究领域得到了很好的发展和表征，现正进入一个时期，即可以可靠地利用“芯片实验室”设备以在其它停滞的或异常复杂的研究领域中加快急需的进展，但只有当经济和基于解决方案的主动性驱动时。
创新的技术平台：微流体成像细胞分析
本发明一些实施方案的MIC技术可以以极高的精确度和数据保真度进行定量的和多参数的免疫细胞化学(ICC)。我们对一些应用的目标是检测出一系列与造成癌症恶性转化之癌症信号网络相关的生物标志物。所得到的分子标志物可有助于更好地进行癌症诊断和实施靶向治疗。该MIC平台整合了三个功能模块，包括：(i)用于支持原发性肿瘤细胞培养的经济的基于PDMS的微流体细胞阵列芯片；(ii)用于进行细胞接种/培养和ICC的半自动化移液器或机器人移液器；以及(iii)相关数据采集系统(荧光显微镜)外加用于可扩展高含量分析的先进软件，其非常适合于临床癌症应用。已建立了一系列操作步骤，用于同时测量PI3K-Akt-mTOR和RAS-RAF-MAPK信号传导途径中6种生物标志物(EGFR、EGFRvIII、PTEN、pAKT、pS6和pERK)的表达/磷酸化水平。对来自原发性肿瘤组织的异质细胞群进行多参数信号传导分析现在是可能的。我们还显示了MIC技术追踪暴露于外源性刺激(例如药物和生长因子)之癌细胞中信号传导事件的动态变化的能力。我们还应用MIC技术检测超过一个途径的信号传导事件，例如，PI3K-AKT-mTOR和RAS-RAF-MAPK途径之间的交流和包括m-TOR、IRS1和pAKT的反馈相互作用。MIC技术的某些方面总结如下：
1.可进行体外分子诊断。MIC技术可以将微流体的优势(即，节省样品、快速、可扩展性、自动化和可重复性)运用到一套解决方案中，从而有助于临床病理学家在分子水平对个体癌症进行确凿的表征。我们正在倡导患者癌细胞中单细胞信号传导分析的概念。
2.显著节约样品。在生物学和临床实验室中常用的用于蛋白质定量的技术(如Western印迹和流式细胞术)对于单次测量至少需要104个细胞。MIC技术可以仅使用200个细胞在少于1.0μL培养基中定量4种信号分子。相比于Western印迹和流式细胞术，在MIC技术中抗体的消耗量显著减少。MIC技术中节省样品更好地允许其分析数量有限的不能使用Western印迹、流式细胞分析、ICC和免疫组织化学分析的珍贵的病理学和细胞学样品。MIC数据的单细胞分辨率和多参数性质明确区分了癌细胞和非癌细胞的信号传导标志物，从而解决了细胞和肿瘤的异质性问题，并远远超过了同类技术的表现。
3.操作节省成本以及使用简便。进行半自动化MIC测量的成本可以相当低。我们的制造策略可以降低MIC芯片的成本，由于其高附加值，因此在市场上极具竞争力。为实现更高的通量，可以以较低的成本投入获得适当的自动液体处理方案。荧光细胞分析图像可利用大部分配有合适的CCD相机和标准滤镜套件的荧光显微镜获得。
4.附加的细胞分选能力。特有的芯片制造策略可允许功能性表面方便地整合到MIC芯片的基底上。例如，链霉亲和素涂层或DNA阵列可被引入MIC芯片上以允许特异性针对癌细胞表面标志物的经生物素化和DNA绑定的抗体的固定，从而实现芯片上细胞捕获功能。可通过首先进行芯片上细胞分选，然后对一系列生物标志物进行MIC信号传导分析，来对癌细胞亚群的复杂信号传导进行。
5.大规模整合。MIC技术可以实现高通量的细胞培养和测定。多种哺乳动物细胞类型(包括但不限于癌细胞系和胚胎干细胞)可在培养室中培养，其通过对细胞处理和制备步骤进行整合和自动化从而允许多个分别的实验或者平行或者一式两份地进行。MIC技术可以得到可重复的高含量数据和定量分析，其可应用于大规模的药物筛选。
实施例研究和结果
微流体成像细胞分析(MIC)技术将微流体细胞阵列88，89与机器人移液器(用于进行样品制备和免疫细胞化学)和自动荧光显微镜(用于图像采集和分析)整合在一起。已使用MIC技术对信号网络中多种蛋白质检测进行定量和可重复的免疫细胞化学(ICC)，而其只使用少量的生物样品。使用多种胶质母细胞瘤细胞系以及经遗传改变的和原发性胶质母细胞瘤细胞验证MIC技术。与PI3K-AKT-mTOR和RAS-RAF-MAPK途径均相关的6种信号蛋白(包括受体酪氨酸激酶(EGFR和EGFRvIII)、磷酸酶(PTEN)和磷酸化蛋白(pAkt、pS6和pERK))的表达/磷酸化水平可在单细胞精确度下平行定量。值得注意的是，在暴露于外源性刺激(例如生长因子和激酶抑制剂)之后，这些蛋白质的动态变化可以被动态监测，这提供了更好地了解胶质母细胞瘤细胞如何响应药物治疗组合的有力工具。同时，Wu博士的研究小组一直在研究受PTEN控制的肿瘤发生的分子机制。PTEN是第二最易缺失的人肿瘤抑制基因11-13，19，20。还发现PTEN突变是引起三种常染色体显性遗传肿瘤易感综合症的原因。Wu博士的实验室已构建了用于途径分析的多个同源细胞系以及体内肿瘤模型，用于了解小鼠中PTEN控制肿瘤发生的分子和遗传机制22，107-109，Mischel博士的临床病理学专业知识将MIC技术应用到临床。
半自动化的MIC技术
MIC技术的实施方案(图22)具有：基于PDMS的微流体细胞阵列芯片、用于进行细胞接种/培养和免疫细胞化学(ICC)的半自动移液器、用于图像采集和分析的自动荧光显微镜和相关软件。所述细胞阵列芯片采用软光刻技术、随后使用未固化的PDMS膜通过O2等离子体键合或直接附着而构建。典型的细胞阵列芯片可容纳24个细胞培养室(尺寸为7000μm(长)×1000μm(宽)×80μm(高)，总容积为560nL)。根据细胞类型，约200至2000个细胞可容纳在一个细胞培养室中。在培养室的两端各具有一个入口和出口通道，其可将培养基和试剂运送给培养的细胞。所述半自动化移液器直接插入所述入口，样品/溶液的体积和流速受到精确地数字控制。在我们的“概念验证”研究中，测试遗传学和生物化学定义的胶质母细胞瘤细胞(包括亲代U87细胞和信号蛋白过表达的经遗传修饰的U87细胞(U87、U87-PTEN、U87-EGFR、U87-EGFRvIII和U87-EGFRvIII/PTEN))以及原发性肿瘤组织来验证MIC技术的该实施方案。在实验中，将细胞阵列芯片置于潮湿的培养箱中(5％CO2，37℃)。PDMS是气体可透过的，可以在培养箱环境和培养室中细胞培养基之间快速交换气体。
图22讨论了微细胞成像细胞分析仪(MIC)技术的概念概述：(a)从患者获取的分散的胶质母细胞瘤细胞被引入微流体细胞阵列芯片通过MIC技术进行多参数分析。(b)使用半自动化移液装置进行细胞接种/培养和ICC。(c)芯片上ICC处理的样品被装入荧光显微镜用于图像采集接着使用图像细胞分析程序进行分析(Metamorph，Molecular Devices Inc.)以单细胞分辨率定量信号蛋白质的表达。
芯片上细胞培养条件的优化和细胞生长的定量
根据本发明的一个实施方案，我们使用细胞阵列芯片来确定最佳表面涂层，以及最佳的细胞供给时间表，以维持芯片培养的细胞。玻璃/PDMS基底上的聚-L-赖氨酸(PLL)涂层对于培养亲代和经遗传修饰的U87细胞系来说是最佳的。为了维持从胶质母细胞瘤患者组织中分离的原发性胶质母细胞瘤细胞，我们开发了在玻璃/PDMS表面上用Matrigel进行逐层(layer-by-layer)包被的方法。此外，我们证实在12～36小时的供给周期可以使胶质母细胞瘤细胞增殖至少10天。生存力测定(例如，来自Invitrogen的Calcein AM或MitoTracker Red)显示了此设备中细胞的生存力。GBM的生长速率通过在不同时间点计数细胞数来定量。虽然细胞增殖的抑制作用已在其它微流体细胞培养设备中有所报道103，但此细胞阵列芯片中胶质母细胞瘤细胞的生长速率与在常规培养皿中观察到的110相当。此外，我们还开发了多种将新近分离/释放的细胞固定到细胞阵列芯片基底上的直接附着方法。我们可以放入一层组织粘附蛋白(Cell TakTM)以固定悬液中的细胞，使得能够对新近分离的细胞进行MIC测量(见图26和28)。我们还将链霉亲和素和DNA涂层引入我们的细胞阵列芯片基底上，由此生物素化和经DNA缀合的捕获剂(例如抗体)可固定于表面上从而有利于基于芯片的细胞分选。
图26显示了使用MIC技术平行进行信号传导分析。使用4种单独的细胞系(左，即U87(绿色)、U87-EGFR(蓝色)、U87-PTEN(黄色)和U87-EFGR/PTEN(粉色))以及它们的混合物(右)平行检测和定量四种信号分子(包括EGFR、PTEN、pAKT和pS6)。在两种不同的条件(即细胞在MIC芯片上铺展前(下)和后(上))下进行MIC测量。获得单独细胞系和细胞混合物的5种颜色免疫染色(即DAPI、抗EGFR抗体(Cy7)、抗PTEN抗体(TRITC)、抗pAKT抗体(Cy5)和抗pS6抗体(FITC))的重叠显微图像(中)。在成像细胞术分析后，使用3维(3D)散点图来显示此多参数分析的能力——所述四种不同类型的细胞在空间上被分为四个不同的群体。细胞混合物的测量重现(右)了单独测量所得的结果(左)。
图28显示了使用3维散点图的两个不同视角来表明在MIC芯片中分析的脑肿瘤细胞样品的细胞异质性。在此图中可鉴定出三种类型的细胞——蓝色圆圈(正常神经元细胞)、红色圆圈(单损伤的脑癌细胞)和绿色圆圈(双损伤的脑癌细胞)。
使用过表达和缺失细胞进行基于芯片的免疫细胞化学(ICC)的定量分析
一般地，ICC使用各种荧光团标记的抗体来识别细胞中特异性蛋白质分子。由于抗体试剂很昂贵，因此在常规宏观水平上进行参数测定的优化(试剂浓度、操作步骤等)是不切实际的。因此，ICC方法只能检测细胞中靶蛋白质的存在/缺失，并且在ICC处理的样品中荧光信号并不反映靶蛋白质的绝对量。所述MIC技术的建立基于完全优化的操作步骤，其确保ICC的可靠性和可重复性。为了实现广泛的蛋白质表达/磷酸化水平测量的精确性，我们对每种抗体进行了ICC操作步骤的系统性优化。使用相应的低/高表达细胞系系统110(分别为U87与U87-EGFR、U87与U87-EGFRvIII、U87与U87-PTEN、经曲西立滨(Triciribine)处理的U87-EGFRvIII与EGFRvIII以及经雷帕霉素处理的U87与U87-EGFRvIII)测试了与PI3K-AKT-mTOR途径相关的5种目的信号蛋白(即EGFR、EGFRvIII、PTEN、pAKT和pS6)。我们能够测试多种ICC试剂以及用于细胞固定、膜透化和抗体染色的条件，以及用于控制试剂/溶液体积和所应用流速的半自动化移液器的操作参数。优化的条件使用4％多聚甲醛固定细胞和0.3％Triton X-100进行细胞膜透化。将高度特异性抗体(抗EGFR抗体(BD Pharmigen)、抗EGFRvIII抗体(Dako)、抗PTEN抗体(Cascade)、抗pAKT抗体(Cell Signaling)和抗pS6抗体(Cell Signaling))的每一个与不同的荧光团(分别在750nm(Cy7)、647nm(Cy5)、555nm(TRITC)、647nm(Cy5)和488nm(FITC)发射荧光)缀合。基于类似的方法，我们能够使用各受控制的细胞系优化针对pERK(RAS-RAF-MAPK途径中的一个信号结点)的MIC操作步骤(数据未显示)。
将包含经ICC处理之细胞的MIC芯片安装于用于图像采集的荧光显微镜(Nikon TE2000S)上。对显微镜和CCD相机(Photomatrix，CascadeII)的操作参数(即图像曝光时间和EM增益)也进行了优化，以实现荧光图像的最佳信噪比。使用MetaMorph程序(Molecular Devices)来定量个体细胞中的特异性荧光信号并产生细胞分析直方图。在每组测量中，在图像分析后得到了一对分别针对低表达和高表达细胞样品的直方图。微调MIC条件和成像参数的目的是实现两个直方图的最大分离。好的分离对于定量多个信号蛋白来说至关重要。图23显示了对经FITC标记的pS6抗体浓度的微调过程，以获得在U87-EGFRvIII细胞(具有持续的高水平pS6)和经雷帕霉素处理的U87细胞(具有低水平的pS6，其由于雷帕霉素抑制mTOR所致)中定量pS6磷酸化的最佳动态范围。我们发现，在4.5μg/mL的抗pS6抗体浓度给出了pS6阳性和阴性细胞之间荧光信号最佳对比。每个ICC实验只使用700nL的pS6抗体溶液(约2.5ng抗体)，这表明与常规的使用显微镜盖玻片的ICC方法相比，至少节省了两个数量级的样品。此外，信号分子的定量具有高度可重复性。除了pS6定量以外，通过类似的优化方法，也获得了用于其它信号蛋白(包括EGFRvIII、EGFR、PTEN和pAKT)的最佳ICC操作步骤。
图23显示了对用于可定量之ICC的经FITC标记的pS6抗体浓度的优化。a)在不同抗pS6抗体浓度(即0、0.045、0.45和4.5μg/ml)存在下获得的U87-EGFRvIII(pS6+)和经雷帕霉素出理之U87(pS6-)的显微图像。b)使用MetaMorph进行细胞分析图像分析，显示出4.5μg/mL的抗体浓度给出了pS6阳性和阴性细胞之间的最好分离。c)细胞铺展表面积平均值和背景消减改善了直方图的峰分离并减少了带宽(宽度)。
图24概述了使用最优的ICC条件和操作参数，在个体细胞中检测EGFRvIII、EGFR、PTEN、pAKT和pS6的动态范围。这些结果已通过使用同样细胞样品的Western印迹测量所验证。通过应用(i)细胞铺展表面积平均值(排除细胞大小的差异)和(ii)背景消减，每对直方图之间的分离得到改善，并且每个直方图的带宽也尖锐了，这反映出MIC技术显著改进的动态范围和灵敏度。
图24显示了在最优的ICC条件下，MIC技术用于EGFRvIII、EGFR、PTEN、pAKT和pS6单细胞分析的动态范围。a)在对照细胞系中检测5种信号蛋白的Western印迹数据，b)经ICC处理之细胞的荧光显微图像，c)在个体细胞中定量5种信号蛋白的动态范围的改善。细胞铺展面积平均值和背景消减提高了用于定量的动态范围。
确定遗传损伤的主要挑战之一是测量某特定肿瘤抑制基因的杂合性缺失(LOH)，这是因为(i)组织中的内部信号相对较低，以及(ii)周围的正常组织表达正常水平的肿瘤抑制基因，其产生了显著的背景信号。PTEN是在人类癌症中发现的第二易于缺失的肿瘤抑制基因，并且PTEN负调节PI3K-AKT-mTOR途径。为了测试使用MIC技术在原代细胞(其中PTEN基因表达水平为2、1或0)中定量PTEN表达的可行性，使用了2组小鼠同源细胞系，包括：(i)PTEN ES细胞系(即p8(+/-)和CaP8(-/-))以及(ii)MEF细胞系(即PTENloxp/loxp(+/+)和PTENΔloxp/Δloxp(-/-))。如图25所示，MIC技术得到2对直方图，这表明MIC技术能够在各样品组(即p8(+/-)与CaP8(-/-)和PTENloxp/loxp(+/+)与PTENΔloxp/Δloxp(-/-))中区分杂合性(LOH)和全PTEN缺失。使用同批细胞样品，通过MIC技术获得的结果与Western印迹技术测得的结果相一致。MIC测量的每组测量只消耗2000个细胞，而需要106个细胞才能获得可靠的信号。还可利用MIC技术检测PTEN的下游信号节点——pAKT，结果表明PTEN负调控PI3K-AKT-mTOR途径。
图25显示了对两组小鼠同源细胞系(包括(i)PTEN ES细胞系，即p8(+/-)和CaP8(-/-)，以及(ii)MEF细胞系，即PTENloxp/loxp(+/+)和PTENΔloxp/Δloxp(-/-))中PTEN表达和pAKT磷酸化的定量。分别使用106和2000个细胞平行进行Western印迹和MIC测量。MIC技术能够区分杂合性丢失(LOH，p8(+/-)与CaP8(-/-))和完全PTEN缺失(PTENloxp/loxp(+/+)与PTENΔloxp/Δloxp(-/-))。通过MIC技术获得的结果与Western印迹观察到的结果相一致。还利用MIC技术检测PTEN的下游信号节点——pAKT，结果表明PTEN负调控PI3K-AKT-mTOR途径。
在由四种细胞类型组成的细胞混合物中平行检测四种信号分子
MIC技术能够平行检测个体细胞中的若干信号分子，从而可以获取组织样品中的细胞异质性。为了证明这一点，我们使用个体细胞系(即U87、U87-EGFR、U87-PTEN和U87-EGFR/PTEN)和人工细胞混合物(包含1∶1∶1∶1的所述四种细胞系)进行(图26)四种信号分子(即EGFR、PTEN、pAKT和pS6)的平行检测。在两种不同的条件(即细胞铺展前后)下进行MIC测量，以比较细胞形态如何影响信号传导分析。将独立开发的ICC条件相结合，从而用含有经Cy7标记的抗EFGR抗体、经Cy5标记的抗pAKT抗体、经TRITC标记的抗PTEN抗体和经FITC标记的抗pS6抗体的抗体混合物处理微芯片种经多聚甲醛固定并用去垢剂透化的细胞混合物，其产生多色染色(DAPI、抗EGFR抗体(Cy7)、抗PTEN抗体(TRITC)、抗pAKT抗体(Cy5)和抗pS6抗体(FITC)。合并从不同荧光通道采集的图像以显示四种信号分子的共定位。通过进行细胞分析图像分析，获得了个体细胞中EGFR、PTEN、pAKT和pS6的水平。通过多参数分析，3维(3D)散点图(X、Y和Z轴分别代表EGFR、PTEN和pS6)区分了不同的细胞类型。如图26所示，4种不同类型的细胞几乎完全被分为四个不同的群体。同时，我们还测试了一种温和的细胞剥离方法：在37℃使用TryPEL Express(Invitrogen)处理15分钟，以对细胞信号传导事件影响尽可能小的方式从培养瓶收获细胞。使用这种处理方法，将新近剥离的细胞固定于用粘附基质(Cell-TakTM)包被的微流体通道上。随后的MIC测量显示，粘附的“圆细胞”与完全铺展形态的稳定细胞所观察到的信号传导模式非常类似。这种温和的细胞剥离方法被应用于分离手术切除的脑肿瘤组织，以对原代细胞的信号传导模式的影响尽可能小。使用MIC技术对雷帕霉素进行单细胞药代动力学研究
ICC方法常用来检测细胞中靶蛋白质的存在/缺失，但由于数据重复性差，它不适于蛋白质表达/磷酸化的定量。基于上文所述的MIC技术进行定量的能力，我们试图将MIC技术应用于雷帕霉素的药代动力学测定。雷帕霉素是一种靶向mTOR的强效抑制剂，mTOR是PI3K信号途径的一个关键信号分子。雷帕霉素对mTOR的抑制作用可通过监测下游信号分子pS6的激活来定量。使用MIC技术在个体细胞中对由雷帕霉素引起的pS6水平的下调进行定量(图27)。在这种情形中，将U87细胞培养在微流体细胞阵列芯片中，其中将含有不同浓度(即0、0.2、0.5、2.0、5.0和20nM)雷帕霉素的细胞培养基引入不同组的细胞培养室。所得到的由数千个单细胞数据组成的直方图确实反映出剂量依赖性的抑制作用。可通过绘制平均pS6水平与对应的雷帕霉素浓度来获得剂量依赖曲线，得到2.69nM的IC50值。该IC50由基于Western印迹的定量方法得以验证(1.0nM)，其中每个数据点需要106个细胞。
图27显示了用不同浓度雷帕霉素处理的个体细胞中pS6表达水平的定量。a)将U87细胞培养在微流体细胞阵列芯片中，其中细胞培养基中含有0、0.2、0.5、2.0、5.0、20nM的雷帕霉素。b)利用MIC技术对个体细胞中由雷帕霉素引起的pS6水平下调进行定量。对应于不同剂量雷帕霉素的六个直方图反映了雷帕霉素抑制作用的不同水平，c)通过绘制pS6水平与对应的雷帕霉素浓度可以获得剂量依赖曲线。从该剂量依赖曲线可以推导出IC50值(2.69nM)。利用MIC技术测得的IC50由Western印迹得以验证，其每个数据点需要106个细胞。所得到的剂量依赖曲线得出IC50值为1.0nM。
使用脑肿瘤组织进行MIC技术的临床验证
使用胶质母细胞瘤细胞系进行的MIC技术的成功展示鼓励我们在临床环境下测试MIC体外分子诊断技术。我们能够将我们的首次验证研究与现有的关注于脑肿瘤靶向治疗的临床试验相结合。所招募和测试的是加州大学洛杉矶分校医学院的一组临床上良好表征的脑癌患者。脑肿瘤常含有高比例的癌细胞，因此是验证MIC技术的非常好的模型系统。到目前为止，我们能够在MIC芯片上进行定量/多参数的ICC来测量手术切除的七例脑肿瘤(即不同级别的胶质瘤)中的分子标志物(即，EGFR、EGFRvIII、PTEN、pAKT和pS6)。为了确保对细胞尽可能低的干扰，我们的联合小组开发并建立了一种温和且快速的肿瘤分离操作步骤(在37℃使用TryPEL Express处理15分钟)来处理新近分离的肿瘤组织。如图28所示，从小儿脑肿瘤组织中鉴定出三个细胞亚群，这反映出肿瘤的内在组织异质性以及不同细胞类型的特征。对于接受靶向药物(例如，雷帕霉素)治疗的患者，观察到他们的肿瘤细胞中pS6磷酸化水平显著降低(数据未显示)，这表明治疗引起信号传导抑制。目前，MIC芯片涉及对人前列腺癌和膀胱癌，以及白血病细胞系和其它患者样品的进一步验证。自动化样品制备/免疫染色——在微流体细胞阵列芯片与机器人移液系统之间创建用户友好型界面，从而在紧密相关的微环境中进行大规模细胞信号传导分析
原来的MIC平台使用人工操作的半自动化移液器来依序进行样品制备和ICC。所述移液器通过数字化控制流速和体积，但其余的操作/过程事实上均是手动操作的。一般地，人的参与会引起操作者差异和误差，因此，为了应用于高通量和/或多步骤的研究，半自动化的MIC平台需要升级。已开发了在微流体细胞阵列芯片与机器人移液器之间的用户友好型界面(图28A-28B)。我们的目标是建立从最初的细胞加载和培养(包括培养基更换)到免疫染色的全自动化操作，从而可以进行复杂的大规模细胞培养/测定以用于高通量信号网络分析。
用于自动化样品制备和染色的机器人移液器的设计
所述用户友好型界面的机械方面包括两个定制设计的组件：即芯片支架(图29A-29B)和移液器吸头阵列(图29A-照片和29E-示意图)。机器人移液系统(Nanodrop II，Innovadyne)被设计用于处理96、384和/或1536孔板。为了符合这些标准构造，该芯片支架被设计成具有与孔板相同的形状(footprint)，从而使得可以直接与机器人系统(和其它孔板系统)对接。目前，一个芯片支架可以容纳4个微流体细胞培养芯片，每个微流体芯片具有30～40个细胞培养室。细胞培养室每个入口和出口孔的位置都相应于1536孔板中的孔位置。因此，原来为处理1536孔板所开发的程序可进行简单地优化并用于在MIC芯片上进行样品制备和ICC。
图29显示了根据本发明的一个实施方案，以自动化方式进行大规模信号分析的机器人移液系统。a)设计用于在孔板模式中处理样品和试剂的机器人移液系统。b)与孔板形状一致的定制设计的芯片支架，其允许机器人系统与细胞阵列芯片之间方便而准确地对接。c)定制的模具，用于制备具有固定的标准芯片高度的芯片。d)具有30个细胞培养室的细胞阵列芯片。e)配有四对移液器的芯片的截面图，f)示意图，说明一对移液器吸头如何在微流体细胞培养室中用来分配和抽取样品/溶液。
图30显示在MIC芯片12中分析的12例脑肿瘤样品的3维散点图，其表明个体肿瘤样品具有显著不同的细胞异质性。
图31显示使用等级聚类法用于分析和定量给定患者样品中的细胞异质性。
芯片支架和对齐系统的设计
芯片支架是关键组件，其可以根据机器人移液系统的坐标系统确保微流体芯片的精确位置和取向。移液吸头精确地与细胞培养室入口和出口对齐。对芯片的机械压力和钳夹机制的组合确保了芯片方便和一致的定位，并容许组装中的细微差异。
机器人移液系统具有8个独立控制的移液器吸头，每个都能够以5nL精确度分配和抽取液体样品。为了整合MIC芯片与机器人移液系统，我们将8个吸头分成用于处理四个细胞培养室的4对(图29E)。在每对吸头中，一个负责分配流体，另一个用于收集“废”液。我们的设计利用了基于PDMS之微流体芯片的弹性，从而在每个移液器吸头和微流体芯片的入口之间实现液体密封，以消除微流体培养室中难以攻克的气泡问题。吸头的直径约为1.0mm，PDMS的孔径约为400μm，因而允许定位错误的合理容忍度。图29F示意一对吸头如何同时处理微流体细胞培养室中的样品/溶液加载和排除。左边的吸头从试剂槽中吸取新的培养基或试剂，然后密封于入口孔上部的PDMS芯片的顶部。液体被注入通道，并从出口推出。此废液被第二个吸头抽出。半自动化的移液方法需要约20分钟完成芯片上定期的细胞培养基更换，与此不同的是，通过机器人系统完成同样的过程可少于10分钟。设计并构建了特殊的模具(图29C)用于大量生产尺寸一致的芯片，因为芯片厚度对于液体密封的形成来说是不可或缺的。
用户友好型控制界面
除了界面的机械方面以外，还有重要的软件组件。我们已开发了非常灵活的程序界面来执行通用的“操作步骤/菜单”(细胞加载、培养基更换、ICC等)，其由XML文件中设定的标准化步骤组成。每个操作步骤具体化为试剂位置、分配体积、分配速度等。用户只需选择“菜单”来自动执行。该软件允许具体规定哪些芯片(以及每个芯片哪些行)应加载新的培养基和试剂，以用于更复杂的涉及不同细胞类型或不同处理的研究。
基于从20例脑肿瘤患者中获得的组织样品进行的临床验证
所招募和测试的是加州大学洛杉矶分校医学院的一组临床上良好表征的脑癌患者。脑肿瘤常含有高比例的癌细胞，因此是验证MIC技术的非常好的模型系统。到目前为止，我们能够在MIC芯片上进行定量/多参数的ICC来测量手术切除的七例脑肿瘤(即不同级别的胶质瘤)中的分子标志物(即，EGFR、EGFRvIII、PTEN、pAKT和pS6)。为了确保对细胞尽可能低的干扰，我们的联合小组开发并建立了一种温和且快速的肿瘤分离操作步骤(在37℃使用TryPEL Express处理15分钟)来处理新近分离的肿瘤组织。使用三维对数散点图来使每个单细胞中的蛋白质表达和磷酸化水平可视化。每个患者都有不同的点分布和聚类，这反映出肿瘤的内在组织异质性以及不同细胞类型的特征。图30显示了从12例脑肿瘤患者中获得的结果。
双参数点图已被用来显示上游蛋白PTEN和EGFR与下游蛋白pAKT和pS6的关系。PTEN、EGFR、pAKT和pS6之高表达和低表达的阈值通过所有患者的统计数据获得。我们还可以得到每个亚群中细胞的百分比。等级聚类分析同时显示了所述4种蛋白的表达水平，以及每个亚群细胞的相似性。
实施例：开发用于对脑肿瘤和脑肿瘤干细胞进行分子分析的基于微流体的成像细胞分析(MIC)
数据显示，包含添加有表皮生长因子和成纤维细胞生长因子之无血清培养基的体外神经干细胞(NSC)培养系统当用于培养人原发性肿瘤分离物时，富集并维持了引发肿瘤的/致瘤细胞群(称为“脑肿瘤干细胞”(brain tumor stem cells，BTSC))。这些细胞表达神经干细胞基因(Nakano等)，具有非表面附着生长的特性以及形成称为“神经球”的特征性球形聚集体。与其依赖于附着的“非干细胞”对应物(其在包含基于血清之培养基的体外培养系统中富集)不同的是，这些推测的BTSC满足癌症干细胞生物学特性的大部分原则，它们自我更新，能够多潜能分化，以及当异种移植时可形成肿瘤(其可再现其来源之亲本肿瘤的许多方面)。最近的数据表明，长时间传代的患者BTSC细胞系的生长和能力可模拟患者肿瘤的临床进程，因此，该体外模型可作为独立的预后因素(Laks等)。
BTSC理论(源自正常神经发育过程中发现的A、B和C型神经祖细胞)的另一组成部分是，这些BTSC可能比其它脑肿瘤细胞的子代更加静息且更少有丝分裂活动，而最静息的细胞保留了大部分“干细胞样”特征，分裂快速的细胞具有更有限的祖细胞能力。这已被假定为这些细胞具有“化疗抗性”的原因之一，仅仅因为直到特异性削弱细胞信号途径的已知靶向分子的药物类别出现，临床上最常用的化疗方式才能靶向具有高度有丝分裂活性的细胞。
作为基于微流体的成像细胞分析(MIC)之概念验证的目的信号途径是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途径，因为它的失调涉及脑肿瘤的发生与脑癌干细胞的演变和维持。在单细胞分辨率下同步进行多节点(pS6、PTEN、pAkt和EGFR)分析允许研究原发性肿瘤中的每个细胞、培养的脑肿瘤干细胞和非干细胞的子代中的这些组分。该MIC系统通过比较患者的脑肿瘤样品以及他们的非BTSC和BTSC富集的子代(体外第一次传代)鉴定出有价值的途径内和途径间差异并鉴定出个体化BTSC分子“标志物”，其揭示了惊人的途径相似性用以区分干细胞(NS，“神经球”)和非干细胞(SC，“血清细胞”)。尽管其意义还不明确，但观察到的最引人注意的量变是在单细胞水平上NS样品中EGFR和pS6的表达较之SC样品要低(图32)。
源自MIC的对化疗敏感和化疗抗性现象的分析得到一些数据，这些数据可以基于针对化疗的途径响应来进一步详细表征BTSC。例如，在患者的BTSC细胞系中出现至少2种新的化疗现象，并且这与亲本肿瘤的世界卫生组织(WHO)临床诊断无关。第一个是雷帕霉素诱导的化疗激活，其是由于在单细胞水平活化的pAkt解除了mTOR的反馈抑制所致(图33A)。最近加州大学洛杉矶分校的雷帕霉素对GBM的一期临床试验显示，这一现象在半数的临床患者中发生。
此外，在多种BTSC细胞系的测试中，对化疗响应的新预测模型显示，EGFR的信号传导是通过Akt实现的。对该模型的预测最初来自于观察到在预处理样品中当EGFR表达与pAkt显著相关时，EGFR阻断消除了这种处理后的相关性，并且可以在单细胞水平减少活化的Akt的表达量(图33B)。这两个现象中的Akt活化的提示使人们对BTSC生物群落特别关注，因为Akt信号被认为对于维持干细胞的恶性表型是非常重要的。
这项发明通过各实施方案已进行了详细描述，通过上述内容，在不脱离广义含义的本发明的前提下可进行改动和修改，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，权利要求所限定的内容旨在涵盖落入本发明真正精神范围内的所有这些改动和修改。
参考文献——发明详述部分
1.Kleihues，P.& Ohgaki，H.Phenotype vs genotype in the evolution of astrocytic brain tumors.Toxicologic pathology 28，164-170(2000).
2.von Deimling，A.et al.Subsets of glioblastoma multiforme defined by molecular genetic analysis.Brain pathology (Zurich，Switzerland)3，19-26(1993).
3.Lang，F.F.，Miller，D.C.，Koslow，M.& Newcomb，E.W.Pathways leading toglioblastoma multiforme：a molecular analysis of genetic alterations in 65astrocytic tumors.Journal of neurosurgery 81，427-436(1994).
4.Kleihues，P.& Ohgaki，H.Primary and secondary glioblastomas：from concept to clinical diagnosis.Neuro-oncology 1，44-51(1999).
5.Louis，D.N.，Holland，E.C.&Cairncross，J.G.Glioma classification：a molecular reappraisal.The American journal of pathology 159，779-786(2001).
6.Rich，J.N.et al.Phase II trial of gefitinib in recurrent glioblastoma.J Clin Oncol22，133-142(2004).
7.Barber，T.D.，Vogelstein，B.，Kinzler，K.W.& Velculescu，V.E.Somatic mutations of EGFR in colorectal cancers and glioblastomas.The New England journal of medicine 351，2883(2004).
8.Marie，Y.et al.EGFR tyrosine kinase domain mutations in human gliomas.Neurology 64，1444-1445(2005).
9.Rich，J.N.，Rasheed，B.K.& Yan，H.EGFR mutations and sensitivity to gefitinib.The New England journal of medicine 351，1260-1261；author reply 1260-1261(2004).
10.Smith，J.S.et al.PTEN mutation，EGFR amplification，and outcome in patients with anaplastic astrocytoma and glioblastoma multiforme.Journal of the National Cancer Institute 93，1246-1256(2001).
11.Aldape，K.D.et al.Immunohistochemical detection of EGFRvIII in high malignancy grade astrocytomas and evaluation of prognostic significance.Journal of neuropathology andexperimental neurology 63，700-707(2004).
12.Ekstrand，A.J.et al.Genes for epidermal growth factor receptor，transforming growth factor alpha，and epidermal growth factor and their expression in human gliomas in vivo.Cancer research 51，2164-2172(1991).
13.Frederick，L.，Wang，X.Y.，Eley，G.&James，C.D.Diversity and frequency of epidermal growth factor receptor mutations in human glioblastomas.Cancer research 60，1383-1387(2000).
14.Sugawa，N.，Ekstrand，A.J.，James，C.D.&Collins，V.P.Identical splicing of aberrant epidermal growth factor receptor transcripts from amplified rearranged genes in human glioblastonas.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87，8602-8606(1990).
15.Wong，A.J.et al.Structural alterations of the epidermal growth factor receptor gene in human gliomas.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89，2965-2969(1992).
16.Batra，S.K.et al.Epidermal growth factor ligand-independent，unregulated，cell-transforming potential of a naturally occurring human mutant EGFRvIII gene.Cell Growth Differ 6，1251-1259(1995).
17.Choe，G.et al.Analysis of the phosphatidylinositol 3′-kinase signaling pathway in glioblastoma patients in vivo.Cancer research 63，2742-2746(2003).
18.Huang，H.S.et al.The enhanced tumorigenic activity of a mutant epidermal growth factor receptor common in human cancers is mediated by threshold levels of constitutive tyrosine phosphorylation and unattenuated signaling.The Journal of biological chemistry 272，2927-2935(1997).
19.Li，B.et al.Mutant epidermal growth factor receptor displays increased signaling through the phosphatidylinositol-3kinase/AKT pathway and promotes radioresistance in cells of astrocytic origin.Oncogene 23，4594-4602(2004).
20.Sordella，R.，Bell，D.W.，Haber，D.A.&Settleman，J.Gefitinib-sensitizing EGFRmutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways.Science 305，1163-1167(2004).
21.Weinstein，I.B.Cancer.Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer.Science 297，63-64(2002).
22.Ermoian，R.P.et al.Dysregulation of PTEN and protein kinase B is associated with glioma histology and patient survival.Clin Cancer Res 8，1100-1106(2002).
23.Bianco，R.et al.Loss of PTEN/MMAC1/TEP in EGF receptor-expressing tumor cells counteracts the antitumor action of EGFR tyrosine kinase inhibitors.Oncogene 22，2812-2822(2003).
24.Stephens，P.et al.Lung cancer：intragenic ERBB2 kinase mutations in tumours.Nature 431，525-526(2004)，
25.Hay，N.The Akt-mTOR tango and its relevance to cancer.Cancer cell 8，179-183(2005).
26.Nave，B.T.，Ouwens，M.，Withers，D.J.，Alessi，D.R.& Shepherd，P.R.Mammalian target of rapamycin is a direct target for protein kinase B：identification of a convergence point for opposing effects of insulin and amino-acid deficiency on protein translation.The Biochemical journal 344 Pt 2，2427-431(1999).
27.Scott，P.H.，Brinn，G.J.，Kohn，A.D.，Roth，R.A.& Lawrence，J.C.，Jr，Evidence of insulin-stimulated phosphorylation and activation of the mammalian target of rapamycin mediated by a protein kinase B signaling pathway.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95，7772-7777(1998).
28.Fry，M.J.Phosphoinositide 3-kinase signalling in breast cancer：how big a role might it play？Breast Cancer Res 3，304-312(2001).
29.Hu，Q.，Klippel，A.，Muslin，A.J.，Fantl，W.J.&Williams，L.T.Ras-dependent induction of cellular responses by constitutively active phosphatidylinositol-3kinase.Science 268，100-102(1995).
30.Lee，A.V.&Yee，D.Insulin-like growth factors and breast cancer.Biomedicine &pharmacotherapy＝Biomedecine & pharmacotheraple 49，415-421(1995).
31.Scheid，M.P.&Woodgett，J.R.Phosphatidylinositol 3’kinase signaling in mammary tumorigenesis.Journal of mammary gland biology and neoplasia 6，83-99(2001).
32.Delbeke，D.& Martin，W.H.PET and PET-CT for evaluation of colorectal carcinoma.Seminars in nuclear medicine 34，209-223(2004).
33.Dimitrakopoulou-Strauss，A.et al.Prognostic aspects of 18F-FDG PET kinetics in patients with metastatic colorectal carcinoma receiving FOLFOX chemotherapy.J Nucl Med 45.1480-1487(2004).
34.Truant，S.et al.Prospective evaluation of the impact of [18F]fluoro-2-deoxy-D-glucosepositron emission tomography of resectable colorectal liver metastases.The British journal of surgery 92，362-369(2005).
35.Rohren，E.M.et al.The role of F-18 FDG positron emission tomography in preoperative assessment of the liver in patients being considered for curative resection of hepatic metastases from colorectal cancer.Clinical nuclear medicine 27，550-555(2002).
36.Wong，C.Y.et al.Metabolic response after intraarterial 90Y-glass microsphere treatment for colorectal liver metastases：comparison of quantitative and visual analyses by 18F-FDG PET.J Nucl Med 45，1892-1897(2004).
37.Rohren，E.M.，Turkington，T.G.&Coleman，R.E.Clinical applications of PET in oncology.Radiology 231，305-332(2004).
38.Bos，R.et al.Biologic correlates of (18)fluorodeoxyglucose uptake in human breast cancer measured by positron emission tomography.J Clin Oncol20，379-387(2002).
39.Chung，J.K.et al.Comparison of [18F]fluorodeoxyglucose uptake with glucose transporter-1expression and proliferation rate in human glioma and non-small-cell lung cancer.Nuclear medicine communications 25，11-17(2004).
40.Kurokawa，T.et al.Expression of GLUT-1glucose transfer，cellular proliferation activity and grade of tumor correlate with [F-18]-fluorodeoxyglueose uptake by positron emission tomography in epithelial tumors of the ovary.International journal of cancer 109，926-932(2004).
41.Pugachev，A.et al.Dependence of FDG uptake on tumor microenvironment.International journal of radiation oncology，biology，physics 62，545-553(2005).
42.Rajendran，J.G.et al.Hypoxia and glucose metabolism in malignant tumors：evaluation by[18F]fluoromisonidazole and [18F]fluorodeoxyglucose positron emission tomography imaging.Clin Cancer Res 10，2245-2252(2004).
43.Kato，H.et al.Correlation of 18-F-fluorodeoxyglucose (FDG)accumulation with glucose transporter (Glut-1)expression in esophageal squamous cell carcinoma.Anticancer research 23，3263-3272(2003).
44.Koga，H.et al.Differential FDG accumulation associated with GLUT-1expression in a patient with lymphoma.Annals of nuclear medicine 17，327-331(2003).
45.Yen，T.C.et al.18F-FDG uptake in squamous cell carcinoma of the cervix is correlated with glucose transporter 1 expression.J Nucl Med 45，22-29(2004).
46.Sankhala，K.K.et al.Early response evaluation of therapy with AP23573(an mTORinhibitor)in sarcoma using [18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose (FDG)positron emission tomography (PET)scan.J Clin Oncol23，9028(2005).
47.Park，T.H.&Shuler，M.L.Integration of cell culture and microfabrication technology.Biotechnol Prog 19，243-253(2003).
48.Fu，A.Y.，Chou，H.P.，Spence，C.，Arnold，F.H.& Quake，S.R.An integrated microfabricated cell sorter.Anal Chem 74，2451-2457(2002).
49.Xia，Y.N.& Whitesides，G.M.Soft lithography.Angewandte Chemie-International Edition 37，551-575(1998).
50.Quake，S.R.&Scherer，A.From micro-to nanofabrication with soft materials.Science 290，1536-1540(2000).
51.Unger，M.A.，Chou，H.P.，Thorsen，T.，Scherer，A.&Quake，S.R.Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.Science 288，113-116(2000).
52.Elowitz，M.B.，Levine，A.J.，Siggia，E.D.&Swain，P.S.Stochastic gene expression in asingle cell.Science 297，1183-1186(2002).
53.Raser，J.M.&O′Shea，E.K.Control of stochasticity in eukaryotic gene expression.Science 304，1811-1814(2004).
54.Colman-Lerner，A.et al.Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.Nature 437，699-706(2005).
55.Pedraza，J.M.&.van Oudenaarden，A.Noise propagation in gene networks.Science 307，1965-1969(2005).
56.Rosenfeld，N.，Young，J.W.，Alon，U.，Swain，P.S.&Elowitz，M.B.Gene regulation at the single-cell level.Science 307，1962-1965(2005).
57.George，T.C.et al.Distinguishing modes of cell death using the ImageStream multispectral imaging flow cytometer.Cytometry A 59，237-245(2004).
58.Burns，N.et al.Large-scale analysis of gene expression，protein localization，and gene disroption in Saccharomyces cerevisiae.Genes & development 8，1087-1105(1994).
59.Elowitz，M.B.& Leibler，S.A synthetie oscillatory network of transcriptional regulators.Nature 403，335-338(2000).
60.Huh，W.K.et al.Global analysis of protein localization in budding yeast.Nature 425，686-691 (2003).
61.Kahana，J.A.，Schnapp，B.J.&Silver，P.A.Kinetics of spindle pole body separation in budding yeast.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92，9707-9711(1995).
62.Sawin，K.E.&Nurse，P.Identification of fission yeast nuclear markers using random polypeptide fusions with green fluorescent protein.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93，15146-15151(1996).
63.Tarnok，A.，Valet，G.K.&Emmrich，F.Systems biology and clinical cytomics：The 10thLeipziger Workshop and the 3rd International Workshop on Slide-Based Cytometry，Leipzig，Germany，April 2005.Cytometry A 69，36-40(2006).
64.Fertig，N.，Blick，R.H.&Behrends，J.C.Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.Biophysical journal 82，3056-3062(2002).
65.Schmidt，C.，Mayer，M.&Vogel，H.A Chip-Based Biosensor for the Functional Analysis of Single Ion Channels We thank E.Ermanntraut，L.Giovangrandi，T.Wohland，A.Brecht，M.Kohler，C.Bieri，D.Stamou，and R.Hovius for advice.This work was supported by the Swiss National Science Foundation (Priority Program for Biotechnology)and by an interdepartmental grant of the Swiss Federal Institute of Technology Lausanne (EPFL，Project Microtechnique 96).Angewandte Chemie(International ed 39，3137-3140(2000).
66.Seo，J.，Ionescu-Zanetti，C.，Diamond，J.，Lal，R.& Lee，L.P.Integrated multiple patch-clamp array chip via lateral cell trapping junctions.Applied Physics Letters 84，1973-1975(2004).
67.Wheeler，A.R.et al.Microfluidic device for single-cell analysis.Analytical chemistry 75，3581-3586(2003).
68.Hong，J.W.，Studer，V.，Hang，G.，Anderson，W.F.& Quake，S.R.A nanoliter-scale nucleic acid processor with parallel architecture.Nature biotechnology 22，435-439(2004).
69.Wu，H.，Wheeler，A.&Zare，R.N.Chemical cytometry on a picoliter-scale integrated microfluidic chip.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101，12809-12813(2004).
70.Gao，J.，Yin，X.F.&Fang，Z.L.Integration of single cell injection，cell lysis，separation and detection of intracellular constituents on a microfluidic chip.Lab on a chip 4，47-52(2004).
71.Mischel，P.S.，Cloughesy，T.F.&Nelson，S.F.DNA-microarray analysis of brain caneer：molecular classification for therapy.Nat Rev Neurosci 5，782-792(2004).
72.O′Neil，R.G.，Wu，L.&Mullani，N.Uptake of a fluorescent deoxyglucose analog(2-NBDG)in tumor cells.Mol Imaging Biol 7，388-392(2005).
73.Zou，C.，Wang，Y.&Shen，Z.2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement.Journal of biochemical and biophysical methods 64，207-215(2005).
参考文献——实施例C
1.Hehlmann，R.，Hochhaus，A.&Baccarani，M.Chronic myeloid leukaemia.Lancet 370，342-50(2007).
2.Goldman，J.M.&Druker，B.J.Chronic myeloid leukemia：current treatment options.Blood 98，2039-42(2001).
3.Mohamed，A.N.，Pemberton，P.，Zonder，J.&Schiffer，C.A.The effect of imatinib mesylate on patients with Philadelphia chromosome-positive chronic myeloid leukemia with secondary chromosomal aberrations.Clin Cancer Res 9，1333-7(2003).
4.Shepherd，F.A.et al.Erlotinib in previously treated non-small-cell lung cancer.N Engl J Med 353，123-32(2005).
5.Engelman，J.A.，Luo，J.&Cantley，L.C.The evolution of phosphatidylinositol 3-kinases as regulators of growth and metabolism.Nat Rev Genet 7，606-19(2006).
6.Sharma，S.V.，Bell，D.W.，Settleman，J.&Haber，D.A.Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer.Nat Rev Cancer 7，169-81(2007).
7.Mischel，P.S.&Cloughesy，T.F.Targeted molecular therapy of GBM.Brain Pathol 13，52-61(2003).
8.Murron，J.R.Modulating multidrug resistance：can we target this therapy？Clin Cancer Res 8，633-5(2002).
9.Levitzki，A.Protein kinase inhibitors as a therapeutic modality.Acc Chem Res 36，462-9(2003).
10.Rooha-Lima，C.M.，Soares，H.P.，Raez，L.E.&Singal，R.EGFR targeting of solid tumors.Cancer Control 14，295-304(2007).
11.Cairns，P.et al.Frequent inactivation of PTEN/MMAC1in primary prostate cancer.Cancer Res 57，4997-5000(1997).
12.Pesche，S.et al.PTEN/MMAC1/TEP1 involvement in primary prostate cancers.Oncogene 16，2879-83(1998).
13.Feilotter，H.E.，Nagai，M.A.，Boag，A.H.，Eng，C.&Mulligan，L.M.Analysis of PTENand the 10q23 region in primary prostate carcinomas.Oncogene 16，1743-8(1998).
14.Bargonetti，J.& Manfredi，J.J.Multiple roles of the tumor suppressor p53.Curr Opin Oncol 14，86-91(2002).
15.McNeil，C.M.et al.c-Myc overexpression and endocrine resistance in breast cancer，JSteroid Biochem Mol Biol 102，147-55(2006).
16.Ferretti，G.，Felici，A.，Papaldo，P.，Fabi，A.&Cognetti，F.HER2/neu role in breast cancer：from a prognostic foe to a predictive friend.Curr Opin Obstet Gynecol 19，56-62(2007).
17.Shi，Y.，Yan，H.，Frost，P.，Gera，J.&Lichtenstein，A.Mammalian target of rapamycin inhibitors activate the AKT kinase in multiple myeloma cells by up-regulating the insulin-likegrowth factor receptor/insulin receptor substrate-1/phosphatidylinositol 3-kinase cascade.Mol Cancer Ther 4，1533-40(2005).
18.Barabasi，A.L.&Oltvai，Z.N.Network biology；understanding the cell′s functional organization.Nat Rev Genet 5，101-13(2004).
19.Li，J.et al.PTEN，a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain，breast，and prostate cancer.Science 275，1943-7(1997).
20.Steck，P.A.et al.Identification of a candidate tumour suppressor gene，MMAC1，atchromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers.Nat Genet 15，356-62(1997).
21.Lesche，R.et al.Cre/loxP-mediated inactivation of the murine Pten tumor suppressor gene.Genesis 32，148-9(2002).
22.Freeman，D.J.et al.PTEN tumor suppressor regulates p53 protein levels and activity througb phosphatase-dependent and-independent mechanisms.Cancer Cell 3，117-30(2003).
23.Wu，X.et al.Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.Mech Dev 101，61-9(2001).
24.Varmus，H.The new era in cancer research.Science 312，1162-5(2006).
25.Mittler，M.A.，Walters，B.C.&Stopa，E.G.Observer reliability in histological grading of astrocytoma stereotactie biopsies.J Neurosurg 85，1091-4(1996).
26.Chang，J.H.et al.The impact of a multidisciplinary breast cancer center on recommendations for patient management：the University of Pennsylvania experience.Cancer 91，1231-7(2001).
27.McGowan，L.&Nomis，H.J.The mistaken diagnosis of carcinoma of the ovary.Surg Gynecol Obstet 173，211-5(1991).
28.Epstein，J.L.，Walsh，P.C.&Sanfilippo，F.Clinical and cost impact of second-opinion pathology.Review of prostate biopsies prior to radical prostatectomy.Am J Surg Pathol 20，851-7(1996).
29.Arbiser，Z.K.，Folpe，A.L.&Weiss，S.W.Consultative (expert)second opinions in soft tissue pathology.Analysis of problem-prone diagnostic situations.Am J Clin Pathol 116，473-6(2001).
30.Coblentz，T.R.，Mills，S.E.&Theodorescu，D.Impact of second opinion pathology in the definitive management of patients with bladder carcinoma.Cancer 91，1284-90(2001).
31.Stingl，J.&Caldas，C.Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancerstem cell hypothesis.Nat Rev Cancer 7，791-9(2007)，
32.Jou，Y.S.et al.Clustering of minimal deleted regions reveals distinct genetic pathways of human hepatocellular carcinoma.Cancer Res 64，3030-6(2004).
33.Celis，J.E.et al.Proteomic strategies to reveal tumor heterogeneity among urothelial papillomas.Mol Cell Proteomics 1，269-79(2002).
34.Haskill，S.，Kivinen，S.，Nelson，K.& Fowler，W.C.，Jr.Detection of intratumor heterogeneity by simultaneous multiparameter flow cytometric analysis with enzyme and DNA markers.Cancer Res 43，1003-9(1983).
35.Schilsky，R.L.Clinical implications of tumor heterogeneity.Haematol Blood Transfus 31，278-82(1987).
36.Baselga，J.Targeting tyrosine kinases in cancer：the second wave.Science 312，1175-8(2006).
37.Wilhelm，S.et al.Discovery and developnent of sorafenib：a multikinase inhibitor for treating cancer，Nat Rev Drug Discov 5，835-44(2006).
38.Krause，D.S.&Van Etten，R.A.Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.N EnglJ Med 353，172-87(2005).
39.Hynes，N.E.& Lane，H.A.ERBB receptors and cancer：the complexity of targeted inhibitors.Nat Rev Cancer 5，341-54(2005).
40.Bjornsti，M.A.&Houghton，P.J.The TOR pathway：a target for cancer therapy.Nat Rev Cancer 4，335-48(2004).
41.Sebolt-Leopold，J.S.& English，J.M.Mechanisms of drug inhibition of signalling molecules.Nature 441，457-62(2006).
42.Sawyers，C.Targeted cancer therapy.Nature 432，294-7(2004).
43.Heath，J.R.，Phelps，M.E.&Hood，L.NanoSystems biology.Mol Imaging Biol 5，312-25(2003).
44.Hood，L.，Heath，J.R.，Phelps，M.E.&Lin，B.Systems biology and new technologies enable predictive and preventative medicine.Science 306，640-3(2004).
45.Pepperkok，R.&Ellenberg，J.High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.Nat Rev Mol Cell Biol 7，690-6(2006).
46.Megason，S.G.& Fraser，S.E.Imaging in systems biology.Cell 130，784-95(2007).
47.Toker，A.&Cantley，L.C.Signalling through the lipid products of phosphoinositide-3-OH kinase.Nature 387，673-6(1997).
48.Vivanco，I.&Sawyers，C.L.The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer.Nat Rev Cancer 2，489-501(2002).
49.Myers，M.P.et al.The lipid phosphatase activity of PTEN is critical for its tumor supressor function.Proc Natl Acad Sci USA 95，13513-8(1998).
50.Li，J.et al.The PTEN/MMAC1 tumor suppressor induces cell death that is rescued by the AKT/protein kinase B oncogene.Cancer Res 58，5667-72(1998).
51.Dahia，P.L.et al.PTEN is inversely conelated with the cell survival factor Akt/PKBand is inactivated via multiple mechanismsin haematological malignancies.Hum Mol Genet 8，185-93(1999).
52.Sordella，R.，Bell，D.W.，Haber，D.A.&Settleman，J.Gefitinib-sensitizing EGFRmutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways.Science 305，1163-7(2004).
53.Luo，J.，Manning，B.D.&Cantley，L.C.Targeting the PI3K-Akt pathway in human cancer：rationale and promise.Cancer Cell 4，257-62(2003).
54.Choe，G.et al.Analysis of the phosphatidylinositol 3′-kinase signaling pathway in glioblastoma patients in vivo.Cancer Res 63，2742-6(2003).
55.Li，B.et al.Mutant epidermal growth factor receptor displays increased signaling through the phosphatidylinositol-3kinase/AKT pathway and promotes radioresistance in cells of astrocytie origin.Oncogene 23，4594-602(2004).
56.Huang，H.S.et al.The enhanced tumorigenic activity of a mutant epidermal growth factor receptor common in human cancers is mediated by threshold levels of constitutive tyrosine phosphorylation and unattenuated signaling.J Biol Chem 272，2927-35(1997).
57.Sun，H.et al.PTEN modulates cell cycle progression and cell survival by regulating phosphatidylinositol 3，4，5，-trisphosphate and Akt/protein kinase B signaling pathway.ProcNatl Acad Sci USA 96，6199-204(1999).
58.Stambolic，V.et al.Negative regulation of PKB/Akt-dependent cell survival by the tumor suppressor PTEN.Cell 95，29-39(1998).
59.Wu，X.，Senechal，K.，Neshat，M.S.，Whang，Y.E.&Sawyers，C.L.The PTEN/MMAC1 tumor suppressor phosphatase functions as a negative regulator of the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway.Proc Natl Acad Sci USA 95，15587-91(1998).
60.Di Cristofano，A.&Pandolfi，P.P.The multiple roles of PTEN in tumor suppression.Cell 100，387-90(2000).
61.Hanahan，D.&Weinberg，R.A.The hallmarks of cancer.Cell 100，57-70(2000).
62.Feldkamp，M.M.，Lala，P.，Lau，N.，Roncari，L.&Guha，A.Expression of activatedepidermal growth factor receptors，Ras-guanosine triphosphate，and mitogen-activated protein kinase in human glioblastoma multiforme specimens.Neurosurgery 45，1442-53(1999).
63.Lokker，N.A.，Sullivan，C.M.，Hollenbach，S.J.，Israel，M.A.&Giese，N.A.Platelet-derived growth factor(PDGF)autocrine signaling regulates survival and mitogenic pathways in glioblastoma cells：evidence that the novel PDGF-C and PDGF-D ligands may play a role in the development of brain tumors.Cancer Res 62，3729-35(2002).
64.Vogt，P.K.，Bader，A.G.&Kang，S.PI 3-kinases：hidden potentials revealed.Cell Cycle 5，946-9(2006).
65.Mellinghoff，I.K.et al.Molecular determinants of the response of glioblastomas to EGFR kinase inhibitors.N Engl J Med 353，2012-24(2005).
66.Workman，P.，Clarke，P.A.，Guillard，S.&Raynaud，F.I.Drugging the PI3kinome.Nat Biotechnol24，794-6(2006).
67.Batra，S.K.et al.Epidermal growth factor ligand-independent，unregulated，cell-transforming potential of a naturally occurring human mutant EGFRvIII gene.Cell Growth Differ 6，1251-9(1995).
68.Bell，D.W.et al.Epidermal growth factor receptor mutations and gene amplification innon-small-cell lung cancer：molecular analysis of the IDEAL/INTACT gefitinib trials.J ClinOncol23，8081-92(2005).
69.Hirsch，F.R.et al.Increased epidermal growth factor receptor gene copy number detected by fluorescence in situ hybridization associates with increased sensitivity to gefitinib in patients with bronchioloalveolar carcinoma subtypes：a Southwest Oncology Group Study.J Clin Oncol23，6838-45(2005).
70.Zhao，J.J.&Roberts，T.M.PI3kinases in cancer：from oncogene artifact to leading cancer target.Sci STKE 2006，pe52(2006).
71.Ji，H.et al.Epidermal growth factor receptor variant III mutations in lung tumorigenesis and sensitivity to tyrosine kinase inhibitors.Proc Natl Acad Sci USA 103，7817-22(2006).
72.Gomez-Sjoberg，R.，Leyrat，A.A.，Pirone，D.M.，Chen，C.S.&Quake，S.R.Versatile，fully automated，microfluidic cell culture system.Anal Chem 79，8557-63(2007).
73.Yamazaki，H.et al.Amplification of the structurally and functionally altered epidermal growth factor receptor gene(c-erbB)in human brain tumors.Mol Cell Biol 8，1816-20(1988).
74.Wong，A.J.et al.Structural alterations of the epidermal growth factor receptor gene in human gliomas.Proc Natl Acad Sci USA 89，2965-9(1992).
75.Ekstrand，A.J.，Sugawa，N.，James，C.D.&Collins，V.P.Amplified and rearranged epidermal growth factor receptor genes in human glioblastomas reveal deletions of sequences encoding portions of the N-and/or C-terminal tails.Proc Natl Acad Sci USA 89，4309-13(1992).
76.Perez，O.D.&Nolan，G.P.Slmultaneous measurement of multiple active kinase states using polychromatic flow cytometry.Nat Biotechnol 20，155-62(2002).
77.Krutzik，P.O.&Nolan，G.P.Intracellular phospho-protein staining techniques for flowcytometry：monitoring single cell signaling events.Cytometry A 55，61-70(2003).
78.Krutzik，P.O.，Crane，J.M.，Clutter，M.R.&Nolan，G.P.High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry.Nat Chem Biol 4，132-42(2008).
79.Hale，M.B.&Nolan，G.P.Phospho-specific flow cytometry：intersection of immunology and biochemistry at the single-cell level.Curr Opin Mol Ther 8，215-24(2006).
80.Irish，J.M.et al.Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells.Cell 118，217-28(2004).
81.Sachs，K.，Perez，O.，Pe′er，D.，Lauffenburger，D.A.&Nolan，G.P.Causal protein-signaling networks derived from multiparameter single-cell data.Science 308，523-9(2005).
82.Thorsen，T.，Maerkl，S.J.&Quake，S.R.Microfluidic large-scale integration.Science 298，580-4(2002).
83.Brittain，S.，Paul，K.，Zhao，X.M.&Whitesides，G.Soft lithography and microfabrication.Physics World 11，31-36(1998).
84.Kirby，B.J.，Shepodd，T.J.&Hasselbrink，E.F.Voltage-addressable on/off microvalves for high-pressure microchip separations.Journal of Chromatography A 979，147-154(2002).
85.Unger，M.A.，Chou，H.P.，Thorsen，T.，Scherer，A.&Quake，S.R.Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.Science 288，113-6(2000).
86.Lee，C.C.et al.Multistep synthesis of a radiolabeled imaging probe using integrated microfluidics.Science 310，1793-6(2005).
87.Wang，J.et al.Integrated microfluidics for parallel screening of an in situ click chemistry library.Angew Chem Int Ed Engl45，5276-81(2006).
88.Yu，Z.T.K.et al.An integrated microfluidic chip for parallel culture and multiparametric analysis of murine and human cell lines.(in revision).
89.Kamei，K.et al.An integrate microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells.(submitted).
90.Chin，V.I.et al.Microfabricated platfom for studying stem cell fates.Biotechnol Bioeng 88，399-415(2004).
91.Takayama，S.et al.Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks.Proc Natl Acad Sci USA 96，5545-8(1999).
92.El-Ali，J.，Sorger，P.K.&Jensen，K.F.Cells on chips.Nature 442，403-11(2006).
93.Gu，W.，Zhu，X.，Futai，N.，Cho，B.S.&Takayama，S.Computerized microfluidic cell culture using elastomeric channels and Braille displays.Proc Natl Acad Sci USA 101，15861-6(2004).
94.Chung，B.G.et al.Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device.Lab Chip 5，401-6(2005).
95.Kim，L.，Vahey，M.D.，Lee，H.Y.&Voldman，J.Microfluidic arrays for logarithmically perfused embryonic stem cell culture.Lab Chip 6，394-406(2006).
96.Abhyankar，V.V.&Beebe，D.J.Spatiotemporal micropatterning of cells on arbitrary substrates.Anal Chem 79，4066-4073(2007).
97.Abhyankar，V.V.，Bittner，G.N.，Causey，J.A.&Kamp，T.J.B.，D.J..HUMANEMBRYONIC STEM CELL CULTURE IN MICROFLUIDIC CHANNELS.7th International Conference on Miniaturized Chemical and Blochemlcal Analysts Systems，17(2003).
98.Nevill，J.T.，Cooper，R.，Dueck，M.，Breslauer，D.N.&Lee，L.P.Integrated mícrofluìdic cell culture and lysis on a chip.Lab Chip 7，1689-95(2007).
99.Zhang，M.Y.et al.Mierofluidic environment for high density hepatocyte culture.Biomed Microdev 10，117-21(2008).
100.Lee，P.J.，Hung，P.J.，Rao，V.M.&Lee，L.P.Nanohter scale microbioreactor array for quantitative cell biology.Biotechnol Bioeng 94，5-14(2006).
101.Di Carlo，D.，Wu，L.Y.&Lee，L.P.Dynamic single cell culture array.Lab Chip 6，1445-9(2006).
102.Hung，P.J.，Lee，P.J.，Sabounchi，P.，Lin，R.&Lee，L.P.Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays.Biotechnol Bioeng 89，1-8(2005).
103.Yu，H.，Meyvantsson，I.，Shkel，I.A.&Beebe，D.J.Diffusion dependent cell behavior in microenvironments.Lab Chip 5，1089-95(2005).
104.Yu，H.，Alexander，C.M.& Beebe，D.J.A plate reader-compatible microchannel array for cell biology assays.Lab Chip 7，388-91(2007).
105.Starkuviene，V.&Pepperkok，R.The potential of high-content high-throughput microscopy in drug discovery.Br J Pharmacol 152，62-71(2007).
106.Carpenter，A.E.Image-based chemical screening.Nat Chem Biol 3，461-5(2007).
107.Lei，Q.et al.NKX3.1stabilizes p53，inhibits AKT activation，and blocks prostate cancer initiation caused by PTEN loss.Cancer Cell 9，367-78(2006).
108.Wang，S.et al.Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.Cancer Cell 4，209-21(2003).
109.Wang，S.et al.Pten deletion leads to the expansion of a prostatic stem/progenitor cell subpopulation and tumor initiation.Proc Natl Acad Sci USA 103，1480-5(2006).
110.Wang，M.Y.et al.Mammalian target of rapamycin inhibition promotes response to epidermal growth factor receptor kinase inhibitors in PTEN-deficient and PTEN-intact glioblastoma cells.Cancer Res 66，7864-9(2006).
111.Liliental，J.et al.Genetic deletion of the Pten tumor suppressor gene promotes cell motility by activation of Rac1 and Cdc42 GTPases.Curr Biol 10，401-4(2000).
112.Stiles，B.et al.Essential role of AKT-1/protein kinase B alpha in PTEN-controlledtumorigenesis.Mol Cell Biol22，3842-51(2002).
113.Li，G.et al.PTEN deletion leads to up-regulation of a secreted growth factor pleiotrophin.J Biol Chem 281，10663-8(2006).
114.Shen，W.H.et al.Essential role for nuclear PTEN in maintaining chromosomal integrity.Cell 128，157-70(2007).
115.Jiao，J.et al.Murine cell lines derived from Pten null prostate cancer show the critical role of PTEN in hormone refractory prostate cancer development.Cancer Res 67，6083-91(2007).
116.Chang，C.J.，Freeman，D.J.&Wu，H.PTEN regulates Mdm2expression through the P1 promoter.J Biol Chem 279，29841-8(2004).
117.Yu，Y.& Bradley，A.Engineering chromosomal rearrangements in mice.Nat Rev Genet 2，780-90(2001).
118.Gurney，J.G.& Kadan-Lottick，N.Brain and other central nervous system tumors：rates，trends，and epidemiology.Curr Opin Oncol 13，160-6(2001).
119.Smith，J.S.et al.PTEN mutation，EGFR amplification，and outcome in patients with snap lastic astrocytoma and glioblastoma multiforme.J Natl Cancer Inst 93，1246-56(2001).
120.Ermoian，R.P.et al.Dysregulation of PTEN and protein kinase B is associated with glioma histology and patient survival.Clin Cancer Res 8，1100-6(2002).
其它参考文献
Laks，D.R.*，Masterman-Smith，M*，Visnyei，K.，Angenieux，B.，Liau，L.，Lazareff，J.，Mischel，P.S.，Cloughesy，T.，Horvath，S.，Kornblum，H.I.Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma.Stem Cells (In Press)*Both authors contributed equally to this work.
2.Nakano，I.，Masterman-Smith，M.，Saigusa，K.，Paucar，A.，Horvath，S.，Shoemaker，L.，Watanabe，M.，Negro，A.，Bajpal，R.，Howes，A.，Lelievre，V.，Waschek，J.A.，Lazareff，J.A.，Freije，W.A.，Liau，L.M.，Gilbertson，R.J.，Cloughesy，T.F.，Geschwlnd，D.H.，Nelson，S.F.，Mischel，P.S.，Terskikh，A.V.，Kornblum，H.I.Matemal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors，including brain tumor stem cells.Journal of Neuroscience Research 200886：48-60.
3.Kornblum，H.I.，Geschwind，D.H.，Nakano，I.，Dougherty，J.D.，Lazareff，J.A.，Mischel，P.S.，Masterman-Smith，M.，Huang，J.“Compositions and Methods for Diagnosing and Treating Brain Cancer and Identifying Neural Stem Cells.”U.S.application 11/576，444based on international patent application PCT/US05/035355
2007年的出版物
1.Parsa A，Waldron J，Panner A，Crane C，Parney I，Barry J，Cachola K，Murray J，Jensen M，Mischel PS，Stokoe D and Pieper R.(2007)Loss of tumor suppressor PTEN function increases B7-H1 expression and immunoresistance in glioma.Nature Medicine，13(1)：84-8.
2.Mellinghoff IK，Cloughesy TF，Mischel PS(2007).PTEN loss as a mechanism of resistance to EGFR tyrosine kinases inhibitors，Clinical Cancer Research，13(2)：378-381.
3.Thomas RK，Baker AC，DeBiasi RM，Winckler W，LaFramboise T，Lin WM，Wang M，Feng W，Zander T，MacConnaill LE，Lee JC，Nicoletti R，Hatton C，Goyette M，Girard L，Majmudar K，Ziaugra L，Wong K，Gabriel K，Beroukhim R，Peyton M，Barretina J，Dutt，A，Emery C，Greulich H，Shah K，Sasaki H，Gazdar A，Minna J，Armstrong SA，Mellinghoff IK，Hodi FS，Dranoff G，Mischel PS，Cloughesy TF，Nelson SF，Liau LM，Mertz K，Rubin MS，Moch H，Loda M，Catalona W，Fletcher J，Signoretti S，Kaye F，Anderson KC，Demetri GD，Dummer R，Wagner S，Herlyn M，Sellers WR，Meyerson M，and Garraway LA (2007).High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer.Nat Genet 39(3)：347-51.
4.Carlson MR，Pope WB，Horvath S，Braunstein JG，Nghiemphu P，Tso CL，MellinghoffI，Lai A，Liau LM，Mischel PS，Dong J，Nelson SF，Cloughesy TF.(2007)Relationship between survival and edema in malignant gliomas：role of vascular endothelial growth factor andneuronal pentraxin 2.Clin Cancer Res.13(9)：2592-8.
5.Nakano I，Masterman-Smith M，Saigusa K，Paucar AA，Horvath S，Shoemaker L，Watanabe M，Negro A，Bajpai R，Howes A，Lelievre V，Waschek JA，Lazareff JA，Freije WA，Liau LM，Gilbertson RJ，Cloughesy TF，Geschwind DH，Nelson SF，Mischel PS，Terskikh AV，Komblum HI.(2007)Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors，including brain tumor stem cells J Neurosci Res.
6.Beroukhim R，Getz G，Nghiemphu L，Barretina J，Hsueh T，Linhart D，Vivanco I，Lee JC，Huang JH，Alexander S，Du J.Tweeny K，Thomas RK，Shah K，Soto H，Pemer S，Prensner J，Debiasi RM，Demichelis F，Hatton C，Rubin MA，Garraway LA，Nelson SF，Liau LM，Mischel PS，Cloughesy TF，Meyerson M，Golub TA，Lander ES，Mellinghoff IK，Sellers WR.(2007)Assessing the Signifieance of Chromosomal Aberrations in Cancer：Methodology and Application to Glioma，PNAS，in press.
7.Yoshimoto K，Dang J，Zhu S，Nathanson D，Huang T，Dumon R，Seligson DB，Yong WH，Xiong Z，Rao N，Winter H，Chakravarti A，Bigner DD，Mellinghoff IK，Horvath S，CaveneeWK，Cloughesy TF，Mischel PS.(2007)Development of real-time RT-PCR assay for detectingEGFRv IIIin formalin-fixed paraffin-embedded glioblastoma samples.Clinical Cancer Research，in press.
8.Cloughesy TF，Koji Yoshimoto K，Nghiemphu P，Brown K，Dang J，Zhu S，Huseh T，C hen Y，Wang W，Youngkin D，Liau L，Martin N，Becker D，Bergsneider M，Lai A，Green R，Oglesby T，Koleto M，Trent J，Horvath S.Mischel PS*，Mellinghoff IK*Sawyers CL*(*Co-Senior and corresponding authors).(2007)Antitumor activity of rapamycin in patients with recurrent PTEN-deficient glioblastoma PLoS Medicine，in press
9.Under review：Lu，KV，Zhu SJ，Dang J，Yoshimoto K，Felciano RM，Richards DR，Laurance ME，Chen Z，Caldwell JS，Shah NP，Horvath S，Nelson SF，James CD，Bergers G，Lee F，Weinmann R，Mischel PS.The Src Tyrosine Kinases Fyn and Lyn are Dasatinib-Sensitive Molecular Target in Glioblastoma Patients.Submitted；revised manuscript under consideration at Cancer Cell.

Claims (29)

1.微流体系统，包括：
包含多个移液器的移液系统；
靠近所述移液系统放置的微流体芯片；
靠近所述微流体芯片放置的光学成像检测系统；以及
与所述光学成像检测系统连接的图像处理系统，
其中所述微流体芯片包含由所述微流体芯片之主体限定的多个细胞培养室，每个细胞培养室与由所述微流体芯片限定的输入通道和输出通道呈流体连通，以及
其中所述移液系统被构建和安置成以下至少一种：当所述微流体系统运行时，通过所述多个移液器将流体注入所述多个输入通道中，或者通过所述多个移液器从所述多个输出通道抽取流体。
2.根据权利要求1的微流体系统，其中所述多个细胞培养室的每个细胞培养室具有至少约200pL并小于约2.4μL的容积。
3.根据权利要求1的微流体系统，其中所述微流体芯片包括至少约10个细胞培养室。
4.根据权利要求1的微流体系统，其中所述成像系统具有足以分辨在所述细胞培养室中培养的分开之目的生物细胞之图像的分辨率。
5.根据权利要求1的微流体系统，其中所述微流体芯片的所述主体包含附着在基底上的PDMS层。
6.根据权利要求5的微流体系统，其中所述基底包括涂覆于其上的细胞外基质成分层以固定目的生物细胞。
7.根据权利要求1的微流体系统，其还包含构建并安排成具有通向所述微流体芯片的光路的照明系统，所述照明系统当运行时适于照亮所述细胞培养室中培养的细胞。
8.根据权利要求7的微流体系统，其中所述照明系统提供所述微流体芯片的白光照明。
9.根据权利要求7的微流体系统，其中所述照明系统包括激光，其以所需波长基本上呈单色的光用以照亮至少部分的所述微流体芯片。
10.根据权利要求9的微流体系统，其中所述光学成像检测系统被构建用于检测来自所述照明系统之所述激光在照亮至少部份的所述微流体芯片之后产生的弹性散射、荧光和非弹性散射光中的至少一种。
11.根据权利要求7的微流体系统，其中所述图像处理系统适用于分析来自所述光学成像检测系统的数据，其指示生物活性材料对在所述多个细胞培养室中培养的个体生物细胞的生物学功能或作用中的至少一种。
12.根据权利要求1的微流体系统，其中所述移液系统是自动化的机器人移液系统。
13.对多个细胞培养物进行自动化荧光成像的方法，所述方法包括：
i)将多个细胞物加载到微流体芯片的多个细胞培养室中，所述多个细胞培养室包括细胞外基质材料的表面涂层用于固定所述细胞培养物；
ii)向所述细胞培养物施加至少一种荧光探针，并在适当条件下孵育所述细胞培养物，以促进所述探针与所述细胞中或细胞上特异性靶标的结合；
iii)照亮所述细胞培养物，以促使所述荧光探针发射荧光；以及
iv)对来自所述多个细胞培养室之每一个中所述细胞的荧光进行成像，同时所述细胞培养物基本上保持固定于所述多个细胞培养室中，以提供有关所述细胞中或细胞上所述特异性靶标的信息。
14.根据权利要求13的方法，其中未结合的细胞外荧光探针通过步骤iv)之前的清洗而去除。
15.根据权利要求13或14的方法，其中将多种荧光探针施加于细胞培养物。
16.根据权利要求13至15中任一项的方法，其中所述细胞外基质材料选自纤连蛋白、层粘蛋白、Matrigel和RGD肽。
17.根据权利要求13至16中任一项的方法，其还包括以下步骤：
v)处理步骤iv)中获得的图像，以得到类似于流式细胞分析的数据。
18.根据权利要求17的方法，其还包括以下步骤：
vi)处理所述类似于流式细胞分析的数据，以获取途径差异的热图。
19.根据权利要求17至18中任一项的方法，其中所述类似于流式细胞分析的数据是2维或3维散点图或直方图。
20.根据权利要求13至19中任一项的方法，其中至少一种细胞培养物包括癌细胞。
21.根据权利要求20的方法，其中所述癌细胞是哺乳动物胶质母细胞瘤细胞或乳腺癌细胞。
22.根据权利要求21的方法，其中所述哺乳动物胶质母细胞瘤细胞选自胶质母细胞瘤细胞系U87和经遗传修饰的U87细胞(U87-PTEN、U87-EGFR、U87-EGFRvIII和U87-EGFRvIII/PTEN)。
23.根据权利要求21的方法，其中所述乳腺癌细胞选自MDA453(ErbB2+)、MDA361(ErbB2+)、BT474(ErbB2++)、SKBr3(ErbB2++)和JIMT1(ErbB2++，PTEN-)。
24.根据权利要求13至23中任一项的方法，其中每个培养室的容积为2pL～2.4μL。
25.根据权利要求24的方法，其中所述容积约为150nL。
26.确定细胞类型的至少一种目标特征的方法，其包括：
i)将基本纯的所述细胞类型培养物加载到权利要求1所述系统的细胞培养室中；以及
ii)在适当的条件下测定所述培养物，以测定所述细胞类型的至少一种目标特征。
27.根据权利要求26的方法，其中多个细胞培养物被测定。
28.根据权利要求26或27的方法，其中所述目标特征选自EGFRvIII、PTEN、mTOR、葡萄糖摄入和FDG摄入。
29.根据权利要求26、27或28的方法，其中测定多种特征。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103353452A (zh) * 2013-07-12 2013-10-16 北京惟馨雨生物科技有限公司 细胞载体芯片及利用其进行单细胞快速鉴定或分选的方法
WO2015002975A1 (en) * 2013-07-05 2015-01-08 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods, compositions and systems for microfluidic assays
CN108064343A (zh) * 2015-04-21 2018-05-22 基因泰克公司 用于前列腺癌分析的组合物和方法
CN109153968A (zh) * 2016-04-12 2019-01-04 联合细胞Ev股份公司 从生物流体样品中分离细胞外囊泡（ev）
CN109254018A (zh) * 2018-09-11 2019-01-22 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种放射性药物的药物代谢动力学成像检测系统
CN112041659A (zh) * 2018-02-06 2020-12-04 瓦罗贝克两合公司 微流体装置、系统、基础设施、其用途以及使用其用于基因工程改造的方法
US11180571B2 (en) 2017-04-03 2021-11-23 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies binding to STEAP-1
CN113939730A (zh) * 2019-05-13 2022-01-14 荷语布鲁塞尔自由大学 用于颗粒表征的方法和系统
CN116855366A (zh) * 2023-08-19 2023-10-10 北京航空航天大学 一种代谢指纹图谱可视化的细胞芯片及应用方法
US11982678B2 (en) 2009-04-13 2024-05-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Ensemble-decision aliquot ranking

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100233733A1 (en) * 2009-02-10 2010-09-16 Nodality, Inc., A Delaware Corporation Multiple mechanisms for modulation of the pi3 kinase pathway
US20100215644A1 (en) * 2009-02-25 2010-08-26 Nodality, Inc. A Delaware Corporation Analysis of nodes in cellular pathways
US9470616B2 (en) 2009-04-27 2016-10-18 E.I. Spectra, Llc Pipette instrument
US9606039B2 (en) * 2009-09-16 2017-03-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Multiphoton scanning flow cytometer for multicellular aggregates
JP2013516999A (ja) * 2010-01-20 2013-05-16 イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン 細胞画像取得および遠隔モニタリングシステム
ES2564855T3 (es) * 2010-11-12 2016-03-29 Abbvie Inc. Método y sistema óptico de alto rendimiento para determinar el efecto de una sustancia de ensayo sobre las células vivas
KR20220023960A (ko) * 2011-03-07 2022-03-03 더 거버닝 카운실 오브 더 유니버시티 오브 토론토 미세유체기술을 이용한 휴대용 세포 검출 및 분석 방법 및 시스템
US9562861B2 (en) * 2011-04-05 2017-02-07 Nalco Company Method of monitoring macrostickies in a recycling and paper or tissue making process involving recycled pulp
US9404864B2 (en) 2013-03-13 2016-08-02 Denovo Sciences, Inc. System for imaging captured cells
US10466160B2 (en) 2011-08-01 2019-11-05 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for retrieving and analyzing particles
ES2797448T3 (es) 2011-08-01 2020-12-02 Bio Rad Laboratories Sistema de captura de células
KR101242540B1 (ko) * 2011-08-19 2013-03-19 (주)로고스바이오시스템스 마이크로 칩
US9606102B2 (en) 2013-01-26 2017-03-28 Denovo Sciences, Inc. System and method for capturing and analyzing cells
US9856535B2 (en) 2013-05-31 2018-01-02 Denovo Sciences, Inc. System for isolating cells
US10391490B2 (en) 2013-05-31 2019-08-27 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for isolating and analyzing cells
CA3209478A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for cell culture device interconnection and fluidic device interconnection
GB201415804D0 (en) 2014-09-08 2014-10-22 Univ Singapore Assay Device
CA2962861A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 Chipcare Corporation Methods and devices for cell detection
CN107209095A (zh) 2014-11-28 2017-09-26 奇普凯尔公司 多重珠阵列测定
WO2016112172A1 (en) 2015-01-07 2016-07-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Microfluidic cell culture of patient-derived tumor cell spheroids
WO2016209735A1 (en) 2015-06-22 2016-12-29 Fluxergy, Llc Camera imaging system for a fluid sample assay and method of using same
US11371091B2 (en) 2015-06-22 2022-06-28 Fluxergy, Inc. Device for analyzing a fluid sample and use of test card with same
US10214772B2 (en) 2015-06-22 2019-02-26 Fluxergy, Llc Test card for assay and method of manufacturing same
WO2017066631A1 (en) * 2015-10-15 2017-04-20 Iowa State University Research Foundation, Inc. Miniaturized continuous-flow fermenting apparatus, systems, and methods
CN110505881A (zh) * 2017-03-31 2019-11-26 达纳-法伯癌症研究所有限公司 使用3d微流体细胞培养装置评价肿瘤细胞球体的方法
WO2018195452A2 (en) * 2017-04-20 2018-10-25 Biofluidica, Inc. Fluid-tight flow system to isolate biomarkers from a liquid sample
CN106990077A (zh) * 2017-06-15 2017-07-28 福建师范大学 一种基于多光子显微与微流控芯片技术的高通量筛选系统
WO2019046307A1 (en) 2017-08-29 2019-03-07 Celsee Diagnostics, Inc. SYSTEM AND METHOD FOR ISOLATING AND ANALYZING CELLS
US11707736B2 (en) * 2017-12-08 2023-07-25 Enuvio Inc. Microfluidic chip and method for making the same
JP2021528362A (ja) * 2018-03-20 2021-10-21 アブラクシス バイオサイエンス， エルエルシー ｍＴＯＲ阻害剤およびアルブミンのナノ粒子の投与を介して中枢神経系障害を処置する方法
US11513041B2 (en) 2018-10-19 2022-11-29 Polyvalor, Limited Partnership Medium-embedded samples
US10633693B1 (en) 2019-04-16 2020-04-28 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for leakage control in a particle capture system
US11273439B2 (en) 2019-05-07 2022-03-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for target material retrieval from microwells
SG11202112151UA (en) 2019-05-07 2021-12-30 Bio Rad Laboratories System and method for automated single cell processing
CN114302643B (zh) 2019-06-14 2024-02-27 伯乐实验室有限公司 用于自动化单细胞处理和分析的系统和方法
USD907244S1 (en) 2019-06-14 2021-01-05 Emd Millipore Corporation Cell imager
US11504719B2 (en) 2020-03-12 2022-11-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for receiving and delivering a fluid for sample processing
EP4164795A4 (en) 2020-06-12 2024-01-24 Biofluidica Inc DUAL-DEPTH THERMOPLASTIC MICROFLUIDIC DEVICE AND ASSOCIATED SYSTEMS AND METHODS

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030040104A1 (en) * 2001-08-27 2003-02-27 Emilio Barbera-Guillem Automated cell management system for growth and manipulation of cultured cells
US20070166816A1 (en) * 2002-03-12 2007-07-19 Surface Logix, Inc. Assay device that analyzes the absorption, metabolism, permeability and/or toxicity of a candidate compound
US20070243523A1 (en) * 2006-03-31 2007-10-18 Fluxion Biosciences Inc. Methods and Apparatus for the Manipulation of Particle Suspensions and Testing Thereof

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1343973B2 (en) * 2000-11-16 2020-09-16 California Institute Of Technology Apparatus and methods for conducting assays and high throughput screening
EP1336101B1 (en) * 2000-11-22 2006-02-08 The Regents Of The University Of California A method to measure the activation state of signaling pathways in cells
US20030082632A1 (en) * 2001-10-25 2003-05-01 Cytoprint, Inc. Assay method and apparatus
WO2005047863A2 (en) * 2003-11-10 2005-05-26 Platypus Technologies, Llc Substrates, devices, and methods for cellular assays
US20040027350A1 (en) * 2002-08-08 2004-02-12 Robert Kincaid Methods and system for simultaneous visualization and manipulation of multiple data types
US7250496B2 (en) * 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
JP2005027659A (ja) * 2003-06-20 2005-02-03 Nitto Denko Corp 細胞マイクロチップ
JP2007529203A (ja) * 2004-03-12 2007-10-25 ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア 統合細胞操作及び測定方法及び装置
US7564541B2 (en) * 2004-06-30 2009-07-21 Chemimage Corp System for obtaining images in bright field and crossed polarization modes and chemical images in raman, luminescence and absorption modes
WO2006127768A2 (en) * 2005-05-24 2006-11-30 The Regents Of The University Of California Microscale micropatterned engineered in vitor tissue
ES2865180T3 (es) * 2005-07-07 2021-10-15 Univ California Aparato para formación de cultivo celular
EP2530167A1 (en) * 2006-05-11 2012-12-05 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic Devices

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030040104A1 (en) * 2001-08-27 2003-02-27 Emilio Barbera-Guillem Automated cell management system for growth and manipulation of cultured cells
US20070166816A1 (en) * 2002-03-12 2007-07-19 Surface Logix, Inc. Assay device that analyzes the absorption, metabolism, permeability and/or toxicity of a candidate compound
US20070243523A1 (en) * 2006-03-31 2007-10-18 Fluxion Biosciences Inc. Methods and Apparatus for the Manipulation of Particle Suspensions and Testing Thereof

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11982678B2 (en) 2009-04-13 2024-05-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Ensemble-decision aliquot ranking
WO2015002975A1 (en) * 2013-07-05 2015-01-08 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods, compositions and systems for microfluidic assays
US11808767B2 (en) 2013-07-05 2023-11-07 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods, compositions and systems for microfluidic assays
US11480575B2 (en) 2013-07-05 2022-10-25 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods, compositions and systems for microfluidic assays
US10527626B2 (en) 2013-07-05 2020-01-07 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods, compositions and systems for microfluidic assays
CN103353452A (zh) * 2013-07-12 2013-10-16 北京惟馨雨生物科技有限公司 细胞载体芯片及利用其进行单细胞快速鉴定或分选的方法
CN103353452B (zh) * 2013-07-12 2016-08-17 上海合森生物科技有限公司 细胞载体芯片及利用其进行单细胞快速鉴定或分选的方法
CN108064343B (zh) * 2015-04-21 2021-07-09 基因泰克公司 用于前列腺癌分析的组合物和方法
CN108064343A (zh) * 2015-04-21 2018-05-22 基因泰克公司 用于前列腺癌分析的组合物和方法
CN109153968A (zh) * 2016-04-12 2019-01-04 联合细胞Ev股份公司 从生物流体样品中分离细胞外囊泡（ev）
US11180571B2 (en) 2017-04-03 2021-11-23 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies binding to STEAP-1
US11685790B2 (en) 2017-04-03 2023-06-27 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies binding to STEAP-1
CN112041659A (zh) * 2018-02-06 2020-12-04 瓦罗贝克两合公司 微流体装置、系统、基础设施、其用途以及使用其用于基因工程改造的方法
CN109254018B (zh) * 2018-09-11 2021-12-07 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种放射性药物的药物代谢动力学成像检测系统
CN109254018A (zh) * 2018-09-11 2019-01-22 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种放射性药物的药物代谢动力学成像检测系统
CN113939730A (zh) * 2019-05-13 2022-01-14 荷语布鲁塞尔自由大学 用于颗粒表征的方法和系统
CN116855366A (zh) * 2023-08-19 2023-10-10 北京航空航天大学 一种代谢指纹图谱可视化的细胞芯片及应用方法

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Publication number Publication date
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