JP2007529203A - 統合細胞操作及び測定方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は参考として本明細書に組込む仮特許出願第60/552,892号(出願日2004年3月12日)の優先権を主張する。
37C.F.R.1.71(e)に従い、出願人は本開示の一部が著作権保護の対象となる素材を含むことを明記する(限定されないが、例えば図表、デバイス写真又は司法権で著作権保護が適用可能であるかもしくはその可能性のある本願の他の任意要素)。著作権者は特許商標局の特許ファイル又は記録に含まれるものである限り、何人が特許文献又は特許開示をファクシミリ複製しようと異議を唱えないが、それ以外の全著作権を留保する。
本発明は細胞及び/又は他の生物材料の分析及び/又は操作を伴い、他の用途に応用することができる方法及び/又はシステム及び/又は装置に関する。特定態様では、本発明は流体媒体中で細胞等の対象を操作し、場合によりその所定操作を実施するための各種構造を含む方法及び/又はシステム及び/又は装置に関する。別の特定態様では、本発明は細胞のパッチクランプ分析及び/又は細胞エレクトロポレーション及び/又は他の細胞アッセイもしくは操作のための方法、システム及び/又はデバイスに関する。
本発明は特定態様では、マイクロフルイディックチャネルと一体化したミクロン規模のラテラル細胞トラップジャンクションを使用する改善された細胞操作を提供する方法及び/又はデバイスに関する。特定態様における細胞固定又はトラップ孔は一般に主フルイディックチャネルの側壁又は類似の構造に開口として配置される。本明細書では、この形状をラテラル孔又はジャンクションと言う。
本発明と各種特定側面及び態様は本願の図面及び詳細な説明を参照すると更によく理解されよう。分かりやすくするために、本明細書ではデバイス、方法及び概念を特定例について記載する。しかし、本発明とその各種側面は各種デバイス及びシステムにも応用することができる。従って、本発明は特許請求の範囲及び等価物の記載以外には限定されない。
従来のパッチクランプ記録はガラスピペットの先端を細胞の膜に配置するためにマイクロマニピュレーターを使用することにより無振動環境で実施される。ピペット先端を通して注意深く加えられる負圧により膜はピペットに陥入し、ほぼギガオーム以上の抵抗シールがピペットと細胞の間に形成される。全細胞記録では、負圧又は電流の2回目の印加により捕獲された膜が破裂し、ピペット電極と細胞の細胞質の間に連続性が得られる。電圧クランプモードでは、膜をプリセット電位にクランプし、この電位を維持するために必要な電流を記録する。各種試薬の存在下に各種電気的プロトコールによる電流記録を使用してイオンチャネル特性を決定する。
図2A−Cは本発明の各種態様による細胞操作デバイスの各側面の例を示す。各例は本発明の特定態様によるラテラル細胞トラップジャンクションを示す。これらのジャンクションは例えば低ノイズパッチチャネル記録の重要な特徴として、細胞レザバーとチャネルの静電結合を劇的に低下させる。水平面の孔により、僅か約10−20ミクロン間隔の多重平行部位が可能である。従って、少容量のチャネル結合薬剤を投与することができる一方で、多数の部位で平行してチャネル活動に及ぼす効果を記録及び/又は観察することができる。各種作製例では、高スループットの廉価な方法であるポリジメチルシロキサン(PDMS)等のエラストマーのマイクロ成形を使用してデバイス全体を作製する。
別の態様では、本発明の特定態様による高密度集積細胞操作システムは細胞位置の可視化と制御を改善する。特定態様では、本発明は全細胞電気生理学的試験を製造し易いマイクロフルイディックラブオンチップデバイスと統合することができる。本明細書の別の箇所に記載するように、特定態様では、このようなデバイスはポリジメチルシロキサン(PDMS)又は類似もしくは同様の性質をもつ材料のマイクロ成形により作製される。特定態様では、集積基板の孔に細胞を保持するので、ピペット型記録に比較して振動絶縁の必要がない。本発明は特定態様では非常に高密度の孔配置でもこれを達成できる。特定態様によると、本発明の細胞操作デバイスは標準顕微鏡を使用して複数の細胞を含む細胞の直接可視化も可能である。
別の態様では、本発明のラテラルトラップジャンクションを高スループット細胞分析用大規模集積システムに組込むことができる。図7A及びBは本発明の特定態様によるラテラルトラップジャンクションと複数のマイクロフルイディック制御層をもつ集積細胞操作システムの構造例を示す。本例のシステムは線形中央チャンバーを備える完全集積システムを示す。例えばシリコン、ガラス、セラミック等の適切な任意材料から作製することができる最下位(緑色)基板上にパターニングした記録用電極(金色で示す)を配置する。トラップチャネルと中央チャネルは中間層でエラストマー弁部位と一体化している。最上位には弁チャネル制御層を構成する。図7Bでは、制御流体チャネルの作動により14個の細胞が線形チャネルのラテラルジャンクションにトラップされている状態を模式的に示す。
図8は本発明の特定態様による集積細胞操作デバイスの作動例を示すブロック図である。同図は本明細書に記載するように1個以上のトラップチャネルに負圧を使用して細胞レザバーから細胞をロードして孔にトラップする方法の1例を示す。この一般作動デザインは円形、線形、又は湾曲を含む本発明の任意細胞操作デバイス構造に応用することができる。この一般作動デザインは細胞を容易にトラップでき、容易に光学特性を決定でき、複数の単一細胞の分析のために細胞を1回ロードすればよく、高スループットで小型の薬剤を使用できる。
本明細書に記載するシステムとデバイスはフォトリソグラフィー、ナノ加工、又はマイクロフルイディック加工の分野で周知の任意技術又は方法を使用して作製することができる。本開示を補い、本発明の特定態様による付加的な独立した新規側面を解説するために、作製方法の例の詳細を以下に記載する。
本開示を補うために、別の作製方法の例を以下に記載する。これらの教示から自明の通り、各種材料及び/又は製造方法に対応するように及び/又は本明細書に記載するものとは異なる構成を提供するように本方法に多くの変更を行うことができる。
本明細書全体に記載する本発明の特定態様による各種デバイス例で実験を実施した。所定態様では、直径12〜17μmのヒト腫瘍細胞株(HeLa)をパッチクランプシール抵抗実験に使用した。細胞を導入する前に、全気泡を排出するように注意しながらリン酸緩衝食塩水(PBS)を流体ネットワークに充填した。20mV方形パルスを印加し、電流応答を測定することにより主チャネルにおける参照Ag/AgCl電極とラテラルパッチチャネルにおけるパッチ電極の電気接続を確認した。
本構造例では、光学顕微鏡により細胞トラップを確認した。細胞を中央チャンバーに懸濁し、負圧(28kPa)をパッチキャピラリーに加えることにより順次パッチ孔に誘導した。システムの1例では、トラップに必要な合計時間は細胞1個当たり3秒未満である。(図6Aに模式的に示す)トラップされた細胞は図6Cに示すように暗視野顕微鏡を使用して可視化することができる。
パッチクランプデバイスにおける1つの重要なパラメーターはギガオームシールを形成する能力である。初期実験では、トラップされた細胞の27%が250MΩを上回る付加抵抗であり(平均301M)、細胞の5%でギガオームシールが得られた。親水性ガラス様表面がギガシール形成の要件であると従来は考えられていた(6,19)が、これらの結果は本発明が疎水性エラストマー表面にギガオームシールを形成できることを立証するものである。実験結果によると、本発明のデバイスを使用すると、更に弱いシール抵抗(例えば約100Mよりも大)でも全細胞電流を20pAまで正確に記録できることが分かった。
別の態様では、上記のような新規側面の一部を使用し、マイクロフルイディック送達を利用して試薬をサンプル領域に迅速添加及び除去するためのデバイス及び/又は方法が提供される。当業者に自明の通り、これらの側面は上記細胞トラップ及び/又はパッチクランプ技術と有効に組合せることができ、あるいは別個に使用してもよい。利点としては、マイクロ成形により非常に簡単に作製できることと、デバイスの所定領域に試薬を迅速(t=30ms)に添加及び除去できるという点が挙げられる。サンプル領域はトラップされた細胞、デバイス基板上の接着細胞、又はマイクロアレイスポット等の他の反応斑を含むことができる。高スループット薬剤スクリーニング用途と迅速な反応速度の理解には制御された時間スケール下の試薬濃度の変化が重要である。
特定態様では、主チャネル内の流れは層流プロフィルに従うため、注入チャネルとターゲットサンプル領域の間の距離は重要なパラメーターではない。従って、多数の注入チャネルを配列するだけで複数の試薬を添加することができる。図15では注入チャネルn1−5に該当試薬をプレロードし、入口圧力P1−5(t)により個々に制御する。圧力印加は一度に1個のチャネルのみがオンになるか又は複数のチャネルが同時にオンになるようにタイミングをとることができる。図15ではチャネルn4がオンの状況を示す。これは例えば、チャネル4の出口のみに流体流が存在するようにP1−3<P0、P5<P0、及びP4>P0に設定することにより実施することができる。
添加した試薬とターゲットサンプルの相互作用の用量応答関係を得るためには、ターゲットサンプル領域に任意濃度の試薬を添加できることが有用である。このような構成を図16に示す。出口で所望試薬濃度を得るためには、注入チャネルの上流でマイクロフルイディックミキサーを使用することができる。一方の入口を試薬レザバーと接続し、他方をストック溶液のレザバーと接続する。同図では、出口n1の濃度Coutは2つの入口P1及びP1’の圧力と濃度から簡単に計算される。
各種細胞アッセイ(電気生理学的試験、生存性、膜完全性)には試薬の細胞(即ちサンプルターゲット=哺乳動物細胞)送達が必要である。試薬を細胞サンプルに迅速に添加及び除去するためには、細胞をサンプルターゲット領域に固定する必要がある。本発明の特定態様によると、これは本明細書に記載するようにトラップチャネルと主流体チャネルの交点に細胞をトラップすることにより実施することができる(図17)。これらのトラップ部位を整列させ、実験後にトラップチャネルに正圧を加えることにより、トラップした細胞を排出させ、後続実験のために新たな細胞をトラップできるようにする。細胞がサンプル領域にトラップされている間に、上記のように試薬を添加することができる。
本発明の別の特定態様によると、細胞をデバイスの主チャネルで培養することにより細胞をサンプルに固定することもできる。細胞懸濁液を主チャネルに導入し、細胞を沈降させて基板に付着させる。付着後に、細胞供給と酸素化を維持するために主チャネルに培地を流すことができる。細胞がサンプル領域で基板に固着した後に、これらの細胞に上記のように所望試薬を添加することができる。特定例では、上部が開放したチャネルを構成することにより、ターゲット領域で接着細胞から従来の電気生理学的記録を行うためにガラスピペットを導入することができる。あるいは、上記のような集積システム又はデバイスを使用して電気生理学的記録を実施することもできる。
本発明の別の特定態様によると、注入チャネルをオン位置からオフ位置に迅速に転換するためには注入チャネルに印加される圧力をPON>P0からPOFF<P0(P0はこの場合も主チャネル内の圧力である)に迅速に転換する必要がある。これは図19に示すように高速三方ソレノイド弁(例えば、Leeバルブ)を使用することにより実施することができる。弁の一方の入口は大気圧に接続されており(即ちPOFF)、他方は加圧レザバーに接続されている(PON)。弁の出口は図示するように注入チャネルに供給する試薬レザバーに接続されている。
本発明の別の特定態様によると、マイクロフルイディックチップの流体インターフェース及び電気的インターフェースの両者として機能するように中空Ag/AgCl円筒形電極の構成を上記パッチクランプシステム等のマイクロフルイディックシステムと併用することができる。特定態様では、流体はこれらの中空電極を流れるので、電気的接続と流体接続が設定される。このため、パッチクランプ用途で多用されていた壊れ易く、煩瑣で高価なAg/AgClペレット電極が不要になり、マイクロフルイディック回路も最小限になる。
上述のように、特定細胞プロセスのアッセイの確認と検証後に、特定態様では可能な活性化合物をスクリーニングするため、対象を疾患関連分類に予想分類するため、物質の毒性を試験するため等の目的で本明細書に記載するデバイス及び/又はシステムを診断又は研究環境で使用する。本発明の方法によるデバイスは研究者、医師、医療従事者、病院、実験室、患者、企業及び他の機関により各種目的に利用することができる。例えば、デバイスは他の臨床及び疫学的関連用途のうちで特に疾患診断、疾患の重篤度の評価、疾患の将来の発病の予測、発病の将来の合併症の予測、疾患予後の診断、患者の危険の評価、現行薬剤治療応答の評価、現行非薬物療法応答の評価、患者に最適な投薬又は治療の決定、及び患者に最適な付加診断試験の決定に適用することができる。パッチクランプを使用して測定可能な細胞特性が確認されているほぼ任意の疾患、症状、又は状態を評価することができる。
本発明の方法は局所又は分散データ環境で実施することができる。例えば、局所計算環境に関する1態様では、ユーザー入力及び出力特徴を備える計算装置と本発明の特定態様によるパッチクランプデバイスをリンクする。分散環境では、単一コンピューター、多重プロセス型コンピューター、あるいは複数のコンピューターで方法を実施することができる。
本発明の特定態様によるデバイスは場合によりキットとして使用者に提供される。一般に、本発明のキットは本明細書に記載する方法に従って作製した1個以上のパッチクランプデバイスを含む。大半の場合には、キットは適切な容器にパッケージングされた診断用センサーを含む。キットは一般に更に1種以上の付加試薬、例えば基板、チューブ及び/又は他の助剤、血液サンプルを収集するための試薬、緩衝液(例えば赤血球溶解用緩衝液、白血球溶解用緩衝液)、ハイブリダイゼーションチャンバー、カバースリップ等と、例えば上述のような本発明の統計的方法を含むソフトウェアパッケージと、集計データベースにアクセスするためのパスワード及び/又はアカウント番号を含む。キットは場合により更に対象物質を検知するためのキットコンポーネントの好ましい使用方法の詳細を記載した命令セット又はユーザーマニュアルを含む。
本発明は特定用途向け集積回路(ASIC)又はプログラマブル論理デバイス(PLD)の回路で全体又は一部を具体化することができる。このような場合には、本発明は本明細書に記載するように作動するASIC又はPLDを作成するために使用可能なコンピューターにより解読可能な記述言語で具体化することができる。
本発明の細胞及び他のデータの収集及び分析とデータベースの集計、保存及びアクセスのための集積システムは一般に配列検索及び/又は分析用命令セットを含むソフトウェアと、場合により高スループットサンプル制御ソフトウェア、画像分析ソフトウェア、収集データ解釈ソフトウェア、ディジタルコンピューターに機能的に連結された宛先(例えば検出装置)へソースからの溶液を移送するためのロボット制御アーマチュア、対象データをディジタルコンピューターに入力するため又は分析演算もしくはロボット制御アーマチュアによる高スループットサンプル移送を制御するための入力装置(例えばコンピューターキーボード)の1種以上を備えるディジタルコンピューターを含む。場合により、集積システムは更にパッチクランプデバイスをプローブするための電子シグナル発生器及び検出スキャナーを含む。スキャナーは例えば細胞膜の電気的特性の測定等によりハイブリダイズ及び/又は結合した被疑リガンドの存在又は強度の測定を行うために分析ソフトウェアとインターフェースすることができる。
以上、本発明を各種特定態様について記載したが、本発明はこれらの態様に限定されない。本発明の精神に含まれる変更は当業者に自明である。
Claims (43)
- 細胞を容易にトラップでき、容易に光学特性を決定でき、複数の単一細胞の分析のために細胞を1回ロードすればよい集積マイクロフルイディックパッチクランプアレイチップに1個以上の対象細胞を導入する段階を含む細胞の1種以上の特性の検出方法。
- ディープエッチングを使用して幅の狭いパッチチャネルを規定する高さパターンを形成することにより型を作製する段階と;
幅の広い接続領域用のパターンを付加する段階と;
硬化性材料を型に導入して硬化させる段階と;
硬化した材料を型から取出す段階と;
チューブの接続用穴を開ける段階と;
前記穴を介してチューブをレザバーに接続し、細胞及び/又は電解液をロードし、パッチチャネルに吸引力を加える段階を含む集積パッチクランプデバイスの製造方法。 - 更に前記型がシリコンから作製される請求項2に記載の方法。
- 更に前記型がセラミックから作製される請求項2に記載の方法。
- 更に前記型が金属又は金属合金から作製される請求項2に記載の方法。
- 更に前記型が表面マイクロマシニング技術を使用して形成される請求項2に記載の方法。
- 更に幅の狭いパッチチャネルを規定する前記パターンが反応性イオンディープエッチングを使用して形成され;
更にフォトレジストを使用して幅の広い接続領域のパターンを付加する請求項2に記載の方法。 - 更に前記成形用材料がポリジメチルシロキサン(PDMS)と硬化剤を含む請求項2に記載の方法。
- 更にその後、成形したデバイスをPDMS薄層に結合し、スピンキャストした後にガラス基板上に硬化させる段階を含む請求項2に記載の方法。
- 更にその後、成形したデバイスをPDMS薄層に結合し、スピンキャストした後にまず部分的に硬化させてからガラス基板に結合する段階を含む請求項2に記載の方法。
- 基板と;
細胞を流体媒体中に保持することが可能な主レザバーと;
前記主レザバーの側面に形成された少なくとも1個のラテラル開口と;
前記少なくとも1個のラテラル開口に機能的に接続された少なくとも1個のトラップチャネルを含み;
前記主レザバー内の細胞が前記トラップチャネル内の負圧により前記ラテラル開口に選択的に固定できるように構成されている細胞トラップデバイス。 - 更に前記基板が長さと幅と厚みを含む三次元構造であり、前記厚みが最小寸法であり;
前記主レザバーの前記側面が前記厚みとほぼ平行である請求項11に記載のデバイス。 - 更に前記基板が長さと幅と厚みを含む三次元構造であり、前記厚みが最小寸法であり;
前記主レザバーの前記側面が前記厚みとほぼ平行である請求項11に記載のデバイス。 - 更に前記主レザバーと前記トラップチャネルの間に電気的特性を測定するための少なくとも2個の電気接続部を含む請求項11に記載のデバイス。
- 更に前記ラテラル開口が約3ミクロン×3ミクロン未満の有効寸法をもつ請求項11に記載のデバイス。
- 更に前記主チャネルに少なくとも3個のラテラル開口を含み、前記ラテラル開口が40ミクロン未満の間隔で配置されている請求項11に記載のデバイス。
- 更に前記ラテラル開口が独立パッチチャネルとして機能するように電気的に接続されている請求項16に記載のデバイス。
- 更に前記ラテラル開口が独立パッチチャネルとして機能するように電気的に接続されており、30ミクロン未満の間隔の多重平行パッチ部位を提供するように水平面に配置されている請求項16に記載のデバイス。
- 更に100μm〜1000μmのパッチ部位間距離の多重平行パッチ部位を提供するようにパッチチャネルが水平面に配置されている請求項17に記載のデバイス。
- 更に前記デバイスの適当な位置まで物質を移動させるためのマイクロフルイディックフィーチャーを含む請求項11に記載のデバイス。
- 基板と;
前記基板の最大寸法に平行に配置されており、流体媒体中に細胞を保持することが可能な主レザバーと;
前記主レザバーの側面に形成されており、少なくとも一部が複数のトラップチャネルと機能的に接続された複数のラテラル開口と;
流体中の細胞を前記主レザバーに導入するためのマイクロフルイディック入口と;
前記ラテラル開口に負圧を加えるための1個以上のマイクロフルイディックトラップ接続部を含み;
前記主レザバー内の細胞が前記ラテラル開口に選択的に固定されるように構成されている多重細胞トラップデバイス。 - 更に前記基板がエラストマーから形成されており;
前記ラテラル開口が約3ミクロン×3ミクロン未満の横断面をもち;
前記ラテラル開口が約3ミクロン×3ミクロン未満の横断面をもつトラップチャネルに機能的に接続されている請求項21に記載のデバイス。 - 基板と;
前記基板の最大寸法と平行に配置されており、細胞を主チャネルに流体懸濁保持するための手段と;
前記基板に形成されており、細胞を流体懸濁保持するための前記手段と機能的に接続されたラテラル細胞トラップ手段と;
細胞を前記ラテラルトラップ手段に選択的に固定するように前記ラテラル細胞トラップ手段に負圧を加えるための手段を含む多重細胞トラップデバイス。 - 更に前記細胞保持手段と前記ラテラルトラップ手段の間に電気的特性を測定するための手段を含む請求項23に記載のデバイス。
- マイクロフルイディック送達を利用してサンプル領域に試薬を迅速に添加及び除去するデバイスであって、
サンプル領域と;
主チャネルと;
1個以上の注入チャネルを含み;
作動中に、ほぼ一定の流体流が主チャネルに供給され、前記注入チャネルが時間の関数として圧力により駆動されている前記デバイス。 - 更に前記サンプル領域がトラップされた細胞、デバイス基板上の接着細胞、及び/又はマイクロアレイスポット等の他の反応斑を含むことができる請求項23に記載のデバイス。
- 更に前記デバイスがエラストマーマイクロ成形による非常に簡単な成形加工を使用して作製することができる請求項23に記載のデバイス。
- 更に前記主チャネルと前記注入チャネルがラテラル構成をもち、全チャネルがほぼ水平面に配置されている請求項23に記載のデバイス。
- 更に前記1個以上の注入チャネルが多数の注入チャネルのアレイを含む請求項23に記載のデバイス。
- 更に注入チャネルの上流に、試薬レザバーに接続された入口とストック溶液に接続された入口をもつマイクロフルイディックミキサーを含む請求項23に記載のデバイス。
- マイクロフルイディックアッセイチップを外部電気及び流体システムに接続するためのデバイスであって、複数の電気コネクターに接続された中空円筒形電気導体の構成を含む前記デバイス。
- 更に前記導体が前記アッセイチップ上の流体接続部と機能的に接続するように配置されている請求項31に記載のデバイス。
- 更に前記導体が外部流体システムとの流体カップリングと機能的に接続するように配置されている請求項31に記載のデバイス。
- 更に前記電気コネクターが電子試験システムの電気ソケットと機能的に接続するように配置されている請求項31に記載のデバイス。
- 更に前記中空円筒形電気導体がAg/AgClから構成される請求項31に記載のデバイス。
- 更に前記中空円筒形電気導体が金属/金属塩化物合金から構成される請求項31に記載のデバイス。
- 更に前記中空円筒形電気導体が金属/金属塩化物合金から構成される請求項31に記載のデバイス。
- 更に前記中空円筒形電気導体が導電性ポリマーから構成される請求項31に記載のデバイス。
- 更に前記中空円筒形電気導体が金属から構成される請求項31に記載のデバイス。
- 更に前記中空円筒形電気導体が導電性セラミックから構成される請求項31に記載のデバイス。
- 更に前記中空円筒形電気導体がマイクロフルイディックチップの流体インターフェースと電気的インターフェースの両者として機能するようにマイクロフルイディックシステムと併用することができる請求項31に記載のデバイス。
- 更に流体が前記中空電極を流れるにつれて電気及び流体接続が設定される請求項31に記載のデバイス。
- 更に前記中空電極が複数のマイクロフルイディックチップで再使用可能である請求項31に記載のデバイス。
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