CN108918370B - 一种用于检测贴壁细胞浓度的方法及其装置 - Google Patents
一种用于检测贴壁细胞浓度的方法及其装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108918370B CN108918370B CN201810681035.4A CN201810681035A CN108918370B CN 108918370 B CN108918370 B CN 108918370B CN 201810681035 A CN201810681035 A CN 201810681035A CN 108918370 B CN108918370 B CN 108918370B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- unit
- focusing
- groove
- pdms
- mold
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 53
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 53
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 53
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims description 30
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims description 30
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 25
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 25
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 25
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 claims description 19
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 14
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000001312 dry etching Methods 0.000 claims description 7
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000000465 moulding Methods 0.000 claims description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 5
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 claims 5
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 5
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 claims 5
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 16
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 84
- 229920002120 photoresistant polymer Polymers 0.000 description 11
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000001259 photo etching Methods 0.000 description 5
- 238000004528 spin coating Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 238000005253 cladding Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- FFUAGWLWBBFQJT-UHFFFAOYSA-N hexamethyldisilazane Chemical compound C[Si](C)(C)N[Si](C)(C)C FFUAGWLWBBFQJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003754 machining Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 2
- 239000011241 protective layer Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004506 ultrasonic cleaning Methods 0.000 description 2
- -1 Polydimethylsiloxane Polymers 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 238000010981 drying operation Methods 0.000 description 1
- 230000002888 effect on disease Effects 0.000 description 1
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- KFZUDNZQQCWGKF-UHFFFAOYSA-M sodium;4-methylbenzenesulfinate Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S([O-])=O)C=C1 KFZUDNZQQCWGKF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
- G01N15/075—Investigating concentration of particle suspensions by optical means
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Optical Measuring Cells (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于检测贴壁细胞浓度的方法及其装置；涉及生物检测技术领域；以微流控芯片为平台，利用散斑聚焦效应，通过检测平行光穿过不同浓度的呈凸透镜形状的贴壁细胞溶液后所得到的不同光强来检测细胞浓度；所述的微流控芯片包括输入单元、准直单元、聚焦单元耦合单元；该方法简单，操作方便，并可有效提高检测的灵敏度，尤其对于细胞浓度在0.1×106~1×106 cells/ml可有效测定；本装置可通过MEMS工艺可以大批量制作，成本较低，同时操作简便，避免了常规的细胞染色处理，可实现高灵敏度快速贴壁细胞浓度检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及细胞浓度检测技术领域，特别是涉及一种基于聚焦散斑效应原理的贴壁细胞浓度检测方法及其检测装置。
背景技术
目前在生物学研究中，细胞计数技术得到越来越广泛的应用。很多疾病和药物方面的研究都需要得知某些特定细胞的数量：一方面可以根据组织环境中的目标细胞数量判断疾病病情；另一方面，在药物筛选中，可以通过组织中特定细胞数量的增减变化判断测试药物对于疾病是否有明显的疗效。常用的计数方法包括库尔特计数法、流式细胞计数法、人工计数法等。库尔特计数采用小孔电阻原理，测量颗粒的大小和数量，得出各颗粒的大小，统计出颗粒度的分布，是一种简便、快捷、有效的测定方法，不破坏样品，特别适于连续测定，但是该方法只能用于对单一种类的细胞实现计数，而不能对混合的细胞进行区分及计数，同时需要消耗较长的检测时间。人工计数具有操作工作量大，且重现性不好，人为因素影响和误差较大。流式细胞计数相对准确．但操作比较繁琐，耗时长，其设计成本高达近百万，体积巨大而受到限制；同时需要经过前期培训的专业人员才能操作，操作过程比较复杂，检测时间较长。在微电子机械系统（MEMS）技术高速发展条件下，以低功耗、易集成、微体积、微重量而著称的微流控细胞计数脱颖而出，逐渐受到细胞计数研究领域的关注。随着光学技术的不断进步，以微机械加工的微流控芯片为平台，利用光学技术实现对细胞浓度高精度、高灵敏度的测量成为可能。
贴壁细胞(adherent cells)这类细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子在该表面上生长，繁殖。活体体内的细胞当离体置于体外培养时大多数均以贴壁方式生长，主要包括正常细胞和肿瘤细胞，比如成纤维细胞，骨骼组织（骨及软骨），心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺皮肤神经胶质细胞，内分泌细胞，黑色素细胞及各种肿瘤细胞等。在多种情况下，需要对这类贴壁细胞的浓度进行检测。
发明内容
本发明克服现有对细胞浓度检测技术存在的问题，提供基于聚焦散斑效应原理的，可提高检测灵敏度的一种贴壁细胞浓度检测方法及其检测装置。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为。
一种用于检测贴壁细胞浓度的方法，包括以下步骤：
a）将待测贴壁细胞溶液静置于底面为凸透镜形状的模具，贴壁细胞均匀贴附在模具底面，形成凸透镜形状，之后移除模具，形成以贴壁细胞构成的聚焦单元（503）。
b）使平行光通过所述的聚焦单元（503），汇聚形成聚焦光斑。
c）承接聚焦光斑，并检测聚焦光斑的光强，得到对应的贴壁细胞浓度。
优选的，所述的底面为凸透镜形状的模具为铁质容器。为了使细胞在限定的透镜范围内进行贴壁，通过高精度机械加工制作了铁质的底部为凸透镜形状的模具，将模具置于使用多聚赖氨酸处理过的硅片上，这样处理之后的硅片可以使细胞在较短时间进行贴壁，缩短检测时间，提高本发明的实用性。之后将贴壁细胞溶液置于模具内静置一段时间，由于贴壁细胞本身的生长特性，细胞将随机均匀的铺满模具底部范围，构成凸透镜形状的单层细胞层，而此凸透镜形状的单层细胞层的折射率取决于构成其的贴壁细胞的密度；
一种用于检测贴壁细胞浓度的装置，包括光源（1）、多模光纤分光器（2）、高频振荡器（3）、功率计（4）以及微流控芯片（5）。
所述的微流控芯片（5）包括输入单元（501）、准直单元（502）、聚焦单元（503）、和耦合单元（504）。
所述的输入单元（501）由多个平行的沟槽单元组成，所述的沟槽单元由沟槽结构和插入沟槽结构内的多模光纤组成；所述的准直单元（502）由与沟槽单元数量相同且位置一一对应的多个准直透镜组成；所述的沟槽单元与准直透镜在一条水平线上；所述的聚焦单元（503）为排列成凸透镜状的待测贴壁细胞溶液构成用于聚焦从准直透镜出射的平行光；所述的耦合单元（504）为一个沟槽单元组成；所述的输入单元（501）、准直单元（502）、聚焦单元（503）和耦合单元（504）依次排列。
所述的光源（1）与多模光纤分光器（2）相连接，所述的多模光纤分光器（2）、高频振荡器（3）和微流控芯片（5）的输入单元（501）通过多个多模光纤相连接，所述的耦合单元（504）与功率计（4）相连接。
进一步的，所述的沟槽结构由硅片上刻蚀的沟槽和在聚二甲基硅氧烷（PDMS）上倒模形成的沟槽键合而成；所述的准直透镜为倒模在PDMS 上形成的准直透镜；优选的，硅片和PDMS 承载的所有结构的尺寸和相对位置相同，并分别在结构之外制备十字形对准标记，以确保硅片和 PDMS 上的对应结构可以精确键合。
进一步的，所述的硅片上刻蚀的沟槽是采用干法刻蚀形成的，所述的倒模在 PDMS上的沟槽是在PDMS 上采用光刻工艺完成，之后通过氧等离子机对硅片和 PDMS 的表面进行亲水处理，在双面光刻机下完成对准键合，从而形成中空的筒状结构。
硅片上的刻蚀沟槽采用干法刻蚀工艺完成，包括以下步骤：
1）选取硅片作为材料，并对硅片进行清洗、烘干、HDMS增粘处理。
2）在硅片上旋涂光刻胶作为保护层，然后将刻有沟槽结构图案的掩膜板置于硅片上。
3）对固定好的硅片进行紫外曝光。
4）曝光结束后，对硅片上的光刻胶进行显影操作。
5）对硅片进行干法刻蚀处理，清洗形成微流控芯片所需的硅片结构。
倒模在PDMS上的沟槽结构采用标准光刻工艺完成，包括以下步骤：
1）选取硅片作为材料，并对硅片进行清洗、烘干。
2）在硅片上旋涂光刻胶，然后将刻有沟槽结构图案的掩膜板置于硅片上固定。
3）对固定好的硅片进行曝光。
4）曝光结束后，对硅片上的光刻胶进行显影。
5）将液体状的 PDMS 浇筑到经过显影后的硅片上，进行倒模。
最后，用氧等离子清洗机分别处理硅片结构和倒模后的 PDMS 表面改变亲水性，在键合机下进行对准键合。
倒模在PDMS 上形成的准直透镜也是采用同样的方法形成。
更进一步优选的，所述的硅片上刻蚀的沟槽和倒模在 PDMS 上的沟槽相键合形成中空的筒状结构。
进一步的，所述的聚焦单元为两个，这样增强了对光线的聚焦能力，使得检测到的光强对细胞密度更加敏感。
进一步的，所述的光源为激光二极管。
微流控芯片整体结构尺寸较小，各个单元的尺寸均在微米级别。
使用多模光纤作为输入路径，因为不同模式的光束在光纤中是随机传播的，因此出射的光斑是一个随机的不规则光斑。为了减小这种效应，将多模裸光纤弯折固定在高频振荡器表面，当高频振荡器高频垂直振动时，固定在上面的多模光纤会产生一个多方向、多角度、随机的高频柔性应力，从而改变在光纤中分布的传输模式，而CCD探测器对信号的检测是对时间的一个积分，多模光纤在这种高频振动下，将会得到一个稳定、规则的光斑，如图5。
另外，为了防止细胞承载模具与硅片基底表面发生细胞液渗漏现象，在测试中使用了一个永磁铁将铁质的承载容器紧紧吸附在硅片基底表面。同时将一个培养皿粘附在铁质模具上面以承载适量的贴壁细胞培养基来维持细胞活性以完成贴壁过程。
图6所示为不同贴壁细胞浓度构成的聚焦透镜单元局部放大图。如图7所示，使用折射率计验证了细胞浓度（Hela）与折射率的对应关系。当细胞浓度在0.1×106~ 1×106cells/ml之间变化时，折射率与细胞浓度几乎成线性关系增长，当细胞浓度大于1×106cells/ml时，折射率趋于稳定。图8为实验中测得光强耦合效率与细胞浓度之间的对应关系，当细胞浓度在0.1×106~ 1×106 cells/ml之间变化时，耦合效率逐渐增大，分辨率达到了0.1×106 cells/ml；当细胞浓度大于1×106 cells/ml时，耦合效率不再发生变化。通过实验验证，本发明所设计的细胞浓度检测器可以实现对浓度在0.1×106~ 1×106 cells/ml范围内的贴壁细胞检测，且分辨率达到了0.1×106 cells/ml。
与现有技术相比本发明具有以下有益效果：本发明是以微流控芯片为平台，利用散斑聚焦效应，通过检测平行光穿过凸透镜形状的贴壁细胞形成聚焦光斑，并通过检测聚焦光斑的光强，来进行细胞计数，该方法简单，操作方便，并可有效提高检测的灵敏度，尤其对于贴壁细胞浓度在0.1 ×106~1×106 cells/ml可有效测定。本装置可通过MEMS工艺可以大批量制作，成本较低，同时操作简便，避免了常规的细胞染色处理，可实现高灵敏度快速细胞浓度检测。
附图说明
图1为本发明微流控芯片的结构示意图。
图2为本发明贴壁细胞浓度检测装置的结构示意图。
图3为实例1在两种状态下光强耦合效率随聚焦透镜折射率变化的仿真图。
图4为实例2在两种状态下光强耦合效率随聚焦透镜折射率变化的仿真图。
图5为光斑实验效果图。
图6为不同细胞浓度构成的聚焦透镜局部放大图。
图7为聚焦单元中折射率与不同细胞浓度之间的关系。
图8为光强耦合效率与细胞浓度之间关系。
其中，1为光源，2为多模光纤分光器，3为高频振荡器，4为功率计，5为微流控芯片，501为输入单元，502为准直单元，503为聚焦单元，504为耦合单元。
具体实施方式
下面结合实施例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。
实施例1
一种用于检测贴壁细胞浓度的装置，包括光源1、1×5的多模光纤分光器2、高频振荡器3、功率计4以及微流控芯片5；其中，光源1为激光二极管。
微流控芯片5包括输入单元501、准直单元502、聚焦单元503、和耦合单元504。
输入单元501由五个平行的沟槽单元组成，所述的沟槽单元由沟槽和插入沟槽内的多模光纤组成；所述的沟槽采用干法刻蚀在硅片上刻蚀的沟槽和采用光刻工艺倒模在PDMS 上的沟槽键合形成中空的筒状结构。采用氧等离子机处理硅片和PDMS表面完成键合。所有沟槽的尺寸完全相同，宽为260 μm，高为125 μm。所用光纤的尺寸为62.5/125μm、数值孔径NA=0.275，其中内芯折射率Nr=1.491，包层折射率Nd=1.46542。
准直单元502由与沟槽单元位置一一对应的五个准直透镜组成；五个准直透镜分别倒模在PDMS 上。用于准直输入单元501中光纤出射的光，准直透镜的半径R1= 403.55 μm、透镜间距L=200 μm和距离光纤的距离M=444.802 μm。
聚焦单元503由排列成凸透镜状的待测贴壁细胞溶液构成，用于聚焦从准直透镜出射的平行光，为了使细胞在一定范围内进行贴壁，通过高精度机械加工制作了铁质的底部为凸透镜形状的模具，将透镜模具置于使用多聚赖氨酸处理过的硅片上，再在该模具内放置待测的贴壁细胞溶液，为了增强聚焦能力，本发明设计了两个大小不同的聚焦单元503。第一个聚焦单元503的尺寸为：半径Ra=4 mm，厚度A=1.05 mm；第二个聚焦单元503的尺寸为：半径Rc = 2.5 mm，厚度C = 1.05 mm，两个透镜间的距离B = 1 mm。
所述耦合单元504为一个沟槽单元，该沟槽中插入与输入单元501中相同尺寸的多模光纤，用来检测由聚焦单元503聚焦后所得到的光强，当聚焦单元503中的细胞浓度改变时，所检测到得能量也随之改变，由此得到细胞浓度，耦合单元504距离聚焦单元503的距离D=3.3 mm。
光源1与1×5的多模光纤分光器2相连接，1×5多模光纤分光器2、高频振荡器3和微流控芯片5的输入单元501通过五个多模光纤相连接，耦合单元504与功率计4相连接。
该装置的使用方法是：
将待测贴壁细胞溶液静置于底面为凸透镜形状的模具，贴壁细胞均匀贴附在容器底面，形成凸透镜形状，之后移除模具，形成以贴壁细胞构成的聚焦单元（503）；开启光源1，发射光通过多模光纤经1×5多模光纤分光器2、高频振荡器3进入输入单元501，再通过准直单元502形成平行光，平行光通过聚焦单元（503），汇聚形成聚焦光斑；耦合单元504将光斑承接，并通过连接的功率计4检测出聚焦光斑光强。对照光强与细胞浓度的关系曲线得到对应的细胞浓度。
实施例2
在实施例1的基础上，改变多模光纤的尺寸，其具体参数为具体参数为50/125 μm、数值孔径NA=0.275，其中内芯折射率Nr=1.491，包层折射率Nd=1.46542。
准直单元502由倒模在PDMS上的准直透镜组成，准直透镜的数量为六个，用于准直输入单元501中光纤出射的光，准直透镜的半径R1= 403.55 μm、透镜间距L=200μm和距离光纤的距离M=467.529 μm；
所述聚焦单元503的尺寸保持与实例1的尺寸完全相同。
所述耦合单元504由硅片衬底上的一个沟槽单元组成，该沟槽中插入与输入单元501中相同尺寸的多模光纤，用来检测由聚焦单元503聚焦后所得到的光强，当聚焦单元503中的细胞浓度改变时，所检测到的能量也随之改变，由此得到细胞浓度，耦合单元504距离聚焦单元503的距离D=3.5 mm。
实施例3
微流控芯片5的制备方法包括分别制备输入单元501、准直单元502、聚焦单元503、和耦合单元504。
其中，输入单元501中的沟槽结构由硅片上刻蚀的沟槽和集成在 PDMS 上的沟槽键合而成；
硅片上的刻蚀沟槽采用干法刻蚀工艺完成，包括以下步骤：
1）选取硅片作为材料，并对硅片使用丙酮、异丙醇、酒精溶液依次超声清洗20min，烘干待用。
2）HDMS增粘处理：该处理过程在真空环境下完成，首先抽真空到4000 Pa，之后通入HMDS 到大气压80000 Pa，之后再进行抽真空，重复两次，最后通入保护气氮气到90000Pa 大气压，环境温度为130℃，整个过程大约需要40 min。
3）使用匀胶机将AZ P4620 正性光刻胶旋涂在经过HMDS 处理的硅片基底上，以低速500 r/min，持续10 s，之后以4000r/min 的速度持续30s 完成匀胶操作，胶厚约为6.5 μm；之后在电热板上进行前烘操作，参数为100℃，90 s；在硅片上旋涂光刻胶作为保护层，然后将刻有沟槽结构图案的掩膜板置于硅片上。
4）对固定好的硅片进行紫外曝光：曝光时间为30 s。
5）曝光结束后，对硅片上的光刻胶进行显影操作，显影选用AZ400K 显影液，将其与水以1:3 的体积比配制，时间为45 s。
6）对硅片进行干法刻蚀处理：利用购买自英国SPTS 公司，型号为LE0765LPX DSI的刻蚀机完成。其具体参数为：腔内气压为60mTorr、源功率为3000 W、下电极的功率为230W、C4F8 的通入流量为230 cm3/min、SF6 的通入流量为350 cm3/min，清洗形成微流控芯片所需的硅片结构。
集成在PDMS 上的沟槽采用标准光刻工艺完成，包括以下步骤：
1）选取硅片作为材料，并对硅片使用丙酮、异丙醇、酒精溶液依次超声清洗20min，烘干待用。
2）在硅片上基底上滴加大约4 ml 的SU-8 2050 光刻胶；2）匀胶机开始以100rpm/second 的加速度加速到500 rmp，之后维持5 s；3）最后以500 rpm/second 的加速度加速到1250 rpm，经过30 s 后，便可得到125 μm 厚的光刻胶层。
3）对固定好的硅片进行曝光，曝光时间为50 s。
4）曝光结束后，对硅片上的光刻胶进行显影，显影时间为11 min。
5）将液体状的 PDMS （A 胶（基本成分）：B 胶（固化剂）=10:1）浇筑到经过显影后的硅片上，进行倒模。最后，用氧等离子清洗机分别处理硅片结构和倒模后的PDMS 表面改变亲水性，其具体参数为：硅片结构，功率400W，气流量300 sccm，时间3 min；PDMS结构，功率300 W，气流量150 sccm，时间3 min，最后在键合机下进行对准键合形成沟槽结构。
用上述的方法将准直单元502的准直透镜也同样倒模在PDMS上。
将五条尺寸相同的多模光纤插入五个沟槽结构中形成沟槽单元，将这五个沟槽单元平行固定，在每个沟槽单元所在的水平位置对应设置一个倒模在PDMS上的准直透镜，五个直透镜形成准直单元502，在准直单元502之后是一个呈凸透镜状的贴壁细胞体形成的聚焦单元503，聚焦单元503之后固定一个沟槽单元，所述的一个沟槽单元构成耦合单元504。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。
Claims (8)
1.一种用于检测贴壁细胞浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）将待测贴壁细胞溶液静置于底面为凸透镜形状的模具内，贴壁细胞均匀贴附在模具底面，形成凸透镜形状，之后移除模具，形成由贴壁细胞构成的聚焦单元（503）；
b）使平行光通过所述的聚焦单元（503），汇聚形成聚焦光斑；
c）承接聚焦光斑，并检测聚焦光斑的光强，得到对应的贴壁细胞浓度。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测贴壁细胞浓度的方法，其特征在于，所述的底面为凸透镜形状的模具为铁质模具。
3.一种用于实施如权利要求1所述的检测贴壁细胞浓度的方法的检测贴壁细胞浓度的装置，其特征在于，包括光源（1）、多模光纤分光器（2）、高频振荡器（3）、功率计（4）以及微流控芯片（5）；
所述的微流控芯片（5）包括输入单元（501）、准直单元（502）、聚焦单元（503）和耦合单元（504）；
所述的输入单元（501）由多个平行的沟槽单元组成，所述的沟槽单元由沟槽结构和插入沟槽结构内的多模光纤组成；所述的准直单元（502）由与沟槽单元数量相同且位置一一对应的多个准直透镜组成；所述的沟槽单元与准直透镜在一条水平线上；所述的聚焦单元（503）由排列成凸透镜状的待测贴壁细胞溶液构成，用于聚焦从准直透镜出射的平行光；所述的耦合单元（504）由一个沟槽单元组成；所述的输入单元（501）、准直单元（502）、聚焦单元（503）和耦合单元（504）依次排列；
所述的光源（1）与多模光纤分光器（2）相连接，所述的多模光纤分光器（2）、高频振荡器（3）和微流控芯片（5）的输入单元（501）通过多个多模光纤相连接，所述的耦合单元（504）与功率计（4）相连接。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测贴壁细胞浓度的装置，其特征在于，所述的沟槽结构由硅片上刻蚀的沟槽和在PDMS上倒模形成的沟槽键合而成；所述的准直透镜为倒模在PDMS 上形成的准直透镜。
5.根据权利要求4所述的一种用于检测贴壁细胞浓度的装置，其特征在于，所述的硅片上刻蚀的沟槽是采用干法刻蚀形成的，所述的倒模在 PDMS 上的沟槽是在PDMS 上采用光刻工艺形成的。
6.根据权利要求4或5所述的一种用于检测贴壁细胞浓度的装置，其特征在于，所述的硅片上刻蚀的沟槽和倒模在PDMS上形成的沟槽相键合形成中空的筒状结构。
7.根据权利要求3所述的一种用于检测贴壁细胞浓度的装置，其特征在于，包括两个相平行的聚焦单元（503）。
8.根据权利要求3所述的一种用于检测贴壁细胞浓度的装置，其特征在于，所述的光源（1）为激光二极管。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810681035.4A CN108918370B (zh) | 2018-06-27 | 2018-06-27 | 一种用于检测贴壁细胞浓度的方法及其装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810681035.4A CN108918370B (zh) | 2018-06-27 | 2018-06-27 | 一种用于检测贴壁细胞浓度的方法及其装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108918370A CN108918370A (zh) | 2018-11-30 |
| CN108918370B true CN108918370B (zh) | 2020-10-09 |
Family
ID=64422839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810681035.4A Active CN108918370B (zh) | 2018-06-27 | 2018-06-27 | 一种用于检测贴壁细胞浓度的方法及其装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108918370B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1791944A2 (en) * | 2004-03-12 | 2007-06-06 | The Regents Of The University Of California | Methods and apparatus for integrated cell handling and measurements |
| CN106133524A (zh) * | 2014-02-28 | 2016-11-16 | 苏黎世联邦理工学院 | 通过质谱细胞术对组织样品的多重成像 |
| CN107523604A (zh) * | 2017-10-19 | 2017-12-29 | 广东海洋大学 | 一种细菌粘附细胞的快速检测方法及应用 |
| US10429294B2 (en) * | 2015-04-02 | 2019-10-01 | University Of Washington | Optical painting and fluorescence-activated sorting of adherent cells |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2534402A (en) * | 2015-01-22 | 2016-07-27 | Idea Biomedical Ltd | Auto-focussing method and device |
| KR20170122338A (ko) * | 2016-04-26 | 2017-11-06 | 성균관대학교산학협력단 | 적외선 분광법을 이용한 세포 부착 배양용 기재의 품질분석 방법 |
-
2018
- 2018-06-27 CN CN201810681035.4A patent/CN108918370B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1791944A2 (en) * | 2004-03-12 | 2007-06-06 | The Regents Of The University Of California | Methods and apparatus for integrated cell handling and measurements |
| CN106133524A (zh) * | 2014-02-28 | 2016-11-16 | 苏黎世联邦理工学院 | 通过质谱细胞术对组织样品的多重成像 |
| US10429294B2 (en) * | 2015-04-02 | 2019-10-01 | University Of Washington | Optical painting and fluorescence-activated sorting of adherent cells |
| CN107523604A (zh) * | 2017-10-19 | 2017-12-29 | 广东海洋大学 | 一种细菌粘附细胞的快速检测方法及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 激光扫描共聚焦显微镜技术简介;李鹏云;《泸州医学院学报》;20061231;469-470 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108918370A (zh) | 2018-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105136744B (zh) | 一种基于微流控芯片粒子捕获式的单粒子散射测量装置 | |
| CN110237875B (zh) | 基于准贝塞尔光波导结构的免标记活细胞检测微流控芯片 | |
| Yang et al. | Selective pattern of cancer cell accumulation and growth using UV modulating printing of hydrogels | |
| CN107930712A (zh) | 基于纳米压印微流芯片的生物医学检测系统及其制作方法 | |
| Han et al. | Hydrophobic patterning‐based 3D microfluidic cell culture assay | |
| Zitzmann et al. | A novel microfluidic microelectrode chip for a significantly enhanced monitoring of NPY-receptor activation in live mode | |
| CN111057649A (zh) | 一种微流控芯片及其制备方法与应用 | |
| Azizipour et al. | Uniformity of spheroids-on-a-chip by surface treatment of PDMS microfluidic platforms | |
| CN108918370B (zh) | 一种用于检测贴壁细胞浓度的方法及其装置 | |
| CN108918369B (zh) | 一种用于检测贴壁细胞浓度的微流控芯片及其制备方法 | |
| Nikkhah et al. | Attachment and response of human fibroblast and breast cancer cells to three dimensional silicon microstructures of different geometries | |
| Hashimoto et al. | Applications of Polydimethylsiloxane: Microstructure of Functional Surface for Observation of Biological Cell Behavior | |
| CN210935016U (zh) | 一种基于太赫兹超材料的微流控芯片 | |
| Le Maout et al. | Directing cell migration on flat substrates and in confinement with microfabrication and microfluidics | |
| TWI548874B (zh) | 監測及紀錄病毒感染歷程及篩選疫苗之方法及系統 | |
| JP6124051B2 (ja) | 細胞培養シート、およびその製造方法、並びにこれを用いた細胞培養容器 | |
| Vanherberghen et al. | Microwell-based live cell imaging of NK cell dynamics to assess heterogeneity in motility and cytotoxic response | |
| Gao et al. | On-demand liquid microlens arrays by non-contact relocation of inhomogeneous fluids in acoustic fields | |
| Bose et al. | Fabrication and mechanical properties measurements of 3D microtissues for the study of cell–matrix interactions | |
| CN106047665B (zh) | 一种用于高通量细胞迁移研究的方法和细胞迁移研究系统 | |
| CN114755460A (zh) | miRNA精确寻址及超灵敏检测设备及方法 | |
| CN207756164U (zh) | 基于纳米压印微流芯片的生物医学检测系统 | |
| Lam et al. | Using biomimetic scaffold platform to detect growth factor induced changes in migration dynamics of nasopharyngeal epithelial cells | |
| CN106222708A (zh) | 提高电铸微流控镍模具寿命的方法及电铸微流控镍模具 | |
| Yang et al. | Side-view optical microscopy-assisted atomic force microscopy for thickness-dependent nanobiomechanics |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |