CN111057649A - 一种微流控芯片及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微流控芯片及其制备方法与应用，包括微通道层(1)和其下方的弹性膜层(2)，所述的微通道层(1)内设有形变通道(101)和气压通道(104和105)。通过配置两模块的位置和尺寸实现不同形变模式；所述气压通道模块通过外加气压使该通道腔体结构发生弹性形变，从而对形变通道模块底部的弹性膜施加作用力。与现有技术相比，本发明基于微流控技术，通过优化结构设计，整合形变通道模块和气压通道模块，实现多种机械形变方式；芯片制作简单，无需芯片多层对准操作。
Description
技术领域
本发明涉及属于微流控芯片技术领域，尤其是涉及一种可提供机械形变的微流控芯片。
背景技术
力学刺激广泛存在于生物体的骨、皮肤和心血管组织中，对细胞形态及细胞的增殖、分化、迁移等行为具有重要影响。故研究细胞在材料表面机械形变作用下的行为，对研究与开发相应的组织工程支架与生物材料具有重要的指导意义。在正常生理条件下，细胞往往受到复杂形变因素的影响，如血管内皮细胞和心肌细胞等，在生长过程中受到拉伸、剪切等的影响。而且，施力的方向往往不是单轴的，而可能是多个轴向的。常规细胞培养方法无法模拟细胞真实的力学环境，因此需要开发新型的、可提供多种机械形变方式的生物学研究装置。
近年来，微流控技术在生物医学领域得到了快速发展。微流控芯片结合了微加工技术和表面化学，能够构建精细的空间结构，为细胞提供接近于生理或病理条件的微环境，并且可以在单细胞水平上对细胞进行原位动态观察。Hub等(Huh,D.,Matthews,B.D.,Mammoto,A.,Montoyazavala,M.,Hong,Y.H.,&Ingber,D.E.(2010).Reconstitutingorgan-level lung functions on a chip.Science,328(5986),1662-1668.)采用的微流控芯片可以为黏附于膜上的细胞提供流体剪切力和拉伸力。其制作方法是将弹性膜组装在两块刻有微通道的硅橡胶片层材料中间。该芯片设计精巧，但制作工艺复杂，需要对上、下两片层进行严格的对准操作，而且三层材料需要两两接合、细胞拉伸实验时连接管路繁杂，容易导致漏液、漏气等问题。利用类似方法工作还包括中国专利申请动脉血管模拟微流控装置(申请号201110404504.6)、可机械拉伸的微流控芯片细胞培养装置(申请号201310043685.3)、以及最新研究工作(Sorba,F.,Poulin,A.,Ischer,R.,Shea,H.,&Martin-Olmos,C.(2019).Integrated elastomer-based device for measuring themechanics of adherent cell monolayers.Lab on a Chip.)。这些工作均是将弹性膜整合在三层结构中，需要芯片多层对准操作，制备和实验操作复杂，不易推广。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作简单、无需对准、可重复性好的微流控芯片及其制备方法与应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种微流控芯片，其特征在于，包括微通道层(1)和其下方的弹性膜层(2)，所述的微通道层(1)内设有形变通道(101)和气压通道。
所述的形变通道(101)和气压通道之间通过薄壁隔开。
所述的形变通道(101)、薄壁和气压通道的宽度比为1：(0.05-0.5)：(0.1-1)。
所述的薄壁和弹性膜层(2)均由弹性高分子材料制成，包括硅橡胶、天然橡胶等。
所述的形变通道(101)两端分别设有与其连通的流体入口(102)和流体出口(103)，所述的气压通道两端设有与其连通的气路开口。
所述的气压通道通过气路开口连接外加气压泵系统，通过外加气压使气压通道腔体结构发生弹性形变，从而对形变通道(101)及底部的弹性膜层(2)施加作用力。
通过配置形变通道(101)和气压通道的位置和尺寸实现不同形变模式，形变模式包括单轴拉伸或双轴拉伸。如，将形变通道(101)位于中间，两侧设置相互连通的气压通道，其中形变通道长10mm，宽1mm，两侧气压通道每侧长5mm，宽0.5mm，平行通道之间的间隔0.1mm。
一种微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：通过刻蚀技术制备表面带图案的模板，然后将预聚物浇铸在模板上，固化、脱模、打孔后获得微通道层(1)；
步骤2：在硅片表面高速旋涂预聚物，固化后获得弹性膜层(2)；
步骤3：将微通道层(1)和弹性膜层(2)两部分接合，结合方式为等离子处理和热压合技术相结合，具体为：将微通道层(1)和弹性膜层(2)置于一同置于等离子体处理仪中，设置功率为100W，时间为90s，处理完毕后立即取出，将微通道层(1)含有微通道形状的一面与弹性膜层(2)对接、压紧，60～80℃热烘10～20min即可。
步骤1和步骤2中的预聚物为PDMS预聚物和交联剂以10:1的质量比均匀混合，真空脱除气泡获得。固化条件为60～80℃加热固化6～12h。
一种微流控芯片的应用，其特征在于，将所述微流控芯片用于力学刺激对细胞行为影响的相关研究；以及模拟人体器官和组织在力学刺激下的生理病理环境的相关研究。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)基于微流控技术，通过优化结构设计，整合形变通道模块和气压通道模块的微流控芯片，实现多种机械形变方式；
(2)微流控芯片的制作方法简单，无需复杂的芯片多层对准操作。
(3)现有技术中用三层材料是为了使膜的上下表面都需施加流体剪切力和拉伸力，而本申请只要在膜一侧的材料中设置可形变的微通道即可，使在膜上贴附的细胞等被拉伸物可以达到与三层相同的拉伸效果，即如图4所示，在负压增加的情况下，中间形变通道的形变量趋势与三层一致。
(4)现有三层细胞拉伸装置，在实验时连接管路繁杂，容易导致漏液、漏气等问题，本发明减少了需要连接管路的进出口，只保留一个流体进口和一个流体出口，以及两个气体进出口，简化连接管路，减少泄露。
附图说明
图1为本发明所述微流控芯片的结构示意图，其中：
1为刻有微通道的厚层，101为形变通道，102为流体入口，103为流体出口，104为气压通道a、105为气压通道b，106气路开口a、107为气路开口b，108薄壁a、109为薄壁b；
2为弹性膜。
图2为本发明所述微流控芯片的控制系统示意图。
图3为本发明所述微流控芯片复原状态和拉伸状态的示意图。
图4为使用本发明所述微流控芯片进行单轴拉伸的实验测试图：(a)形变通道模块底部弹性膜未拉伸对照组；(b)形变通道模块底部弹性膜单轴拉伸幅度10％的状态。
图5为使用本发明所述微流控芯片进行单轴周期性拉伸后，粘附在形变通道模块底部弹性膜上细胞微丝骨架染色结果：(a)细胞未拉伸对照组；(b)细胞拉伸幅度为10％，频率为1Hz，拉伸时长为2.5h。
图6为使用本发明所述微流控芯片进行双轴拉伸的实验测试图：(a)形变通道模块底部弹性膜未拉伸对照组；(b)形变通道模块底部弹性膜双轴拉伸幅度10％的状态。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可由商业途径获得。
实施例1、单轴拉伸微流控芯片的制备方法
(1)掩膜板的制作
根据具体实验要求，利用计算机辅助设计软件(CAD)设计和绘制微流控芯片微通道的结构，利用高精度打印设备制作掩膜板。
(2)硅片模板的制作
取3寸硅片，用Piranha溶液(98％浓硫酸：30％双氧水＝3:1)浸泡1h，用超纯水清洗3遍，经氮气吹扫后烘干备用；将上述硅片置于真空干燥器中，用200μL六甲基二硅氧烷气相表面处理10min；取SU-8 2150光刻胶旋涂于经疏水化处理的硅片上，形成约300μm厚的膜层；将硅片放置于烘胶台上，65℃下进行前烘。然后将旋涂有光刻胶的硅片紧贴于具有微通道形状的掩膜板上，经高强度紫外光照处理。将曝光后的硅片置于烘胶台上，在温度为95℃的条件下进行后烘；而后用SU-82150显影液(丙二醇-甲醚醋酸酯)浸没硅片，缓慢摇晃结晶皿10-15min，除去未曝光部分的光刻胶；再用异丙醇、超纯水先后冲洗，经氮气吹干后自然冷却、保存待用。
(3)微流控芯片微通道层的制作
取一定量的PDMS预聚物(Sylgard 184 Silicone Elastomer Base)和交联剂(Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent)以10:1的质量比均匀混合，真空脱除气泡，而后将该混合物倒入装有上述硅片模板的培养皿中，70℃加热固化12h，自然冷却后将含有微通道形状的PDMS胶层从硅片模板上剥离，然后用打孔器在形变通道的两端和气压通道的对应位置打孔。
(4)微流控芯片弹性膜的制作
取一定量的PDMS预聚物(Sylgard 184 Silicone Elastomer Base)和交联剂(Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent)以10:1的质量比均匀混合，真空脱除气泡，利用匀胶旋涂仪将该混合物均匀涂布于经过疏水化处理的硅片上，旋涂完毕后70℃加热固化6h。
(5)微流控芯片的组装
将刻有微通道的PDMS厚层与弹性膜一同置于等离子体处理仪中，设置功率为100W，时间为90s，处理完毕后立即取出，将微通道层含有微通道形状的一面与弹性膜对接、压紧，70℃热烘15min，然后用刀片在厚层与弹性膜接触的边缘刻画，沿长轴方向小心将厚层和弹性膜一起揭下。
(6)微流控芯片与流体控制器和气压泵系统的连接
将制作完成的微流控芯片用环氧树脂胶固定于镂空培养皿的底部，通过金属管接头和聚四氟乙烯软管与流体控制器和气压泵系统相连接，微流控芯片与控制系统的连接如图2所示。
得到的微流控芯片结构如图1所示，包括微通道层1和其下方的弹性膜层2，所述的微通道层1内设有形变通道101，以及其两侧分别设置的气压通道a104和气压通道b105，其中气压通道a104与形变通道101之间通过薄壁b109隔开，气压通道a105与形变通道101之间通过薄壁a108隔开，所述的形变通道101两端分别设有与其连通的流体入口102和流体出口103，检测时，流体可以从流体入口102进入，从流体出口103流出。气压通道a104一端设有与其连通的气路开口a106，气压通道b105一端设有与其连通的气路开口b107，气压通道通过气路开口连接外加气压泵系统，通过外加气压使气压通道腔体结构发生弹性形变，从而对形变通道101及底部的弹性膜层2施加作用力。
所述的形变通道101、薄壁和气压通道a104的宽度比为1：0.05-0.5：0.1-1。气压通道a104的宽度与气压通道b105的宽度相同。
实施例2、单轴拉伸微流控芯片的拉伸测试
在微流控芯片的弹性膜表面超声喷涂罗丹明染料，待其干燥后，将微流控芯片接入流体控制器和气压泵系统，测量负压为-200mbar条件下弹性膜的形变量，结果如图4所示，与拉伸前相比，经负压拉伸后的弹性膜拉伸幅度为10％，且长时间拉伸后移除负压形变能立即回复，完全可以满足模拟体内实验的要求。
实施例3、单轴拉伸对细胞行为的影响
下面以人包皮成纤维细胞(HFF)为例，说明本发明提供的微流控芯片可用于细胞力学刺激的相关研究。
(1)细胞接种
首先对微流控芯片进行灭菌，灭菌顺序如下：先将微流控芯片放入超净台用紫外照射30min，随后将微流控芯片的形变通道101先后用75％酒精、灭菌PBS、细胞培养基冲洗3遍；取在常规细胞培养瓶中培养、显微镜下观察融合度约80％的细胞消化、离心后配制成细胞密度约为2.5×105个/ml的细胞悬液，通过形变通道模块的流体入口102将细胞悬液注入上述已灭菌微流控芯片的形变通道101中，将微流控芯片放置于温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的细胞培养箱中，2h后，细胞黏附于形变通道101底部的弹性膜2上，再将形变通道101的流体入口102和流体出口103与流体控制器相连，为细胞连续培养提供新鲜的培养基。
(2)细胞拉伸与观测
开启活细胞工作站，控制工作站内CO2、O2浓度分别为5％、20％，并将输出气体加湿后通入工作站，开启加热模块，控制适配器、盖板温度分别为37℃、38℃。取出细胞培养箱中的微流控芯片，置于活细胞工作站载物台上。在相差模式下观察，设置合适的拍摄位点、长时拍摄的总时间及时间间隔；打开气压泵系统的控制软件，设置输出正弦压力的大小为-200mbar(对应的拉伸应变为10％)，频率为1Hz；将气压通道模块的气路开口106、107与气压泵系统相连，开启气压泵系统，同时开启活细胞工作站软件的长时拍摄模式，对周期性单轴拉伸力持续刺激下的细胞进行原位动态监测。
(3)细胞周期性单轴拉伸实验结果
图5展示了拉伸应变为10％时，拉伸前后HFF细胞的骨架形态变化，由图可知，拉伸前细胞骨架为无序排布状态，拉伸后细胞骨架沿着拉伸方向的垂直方向排布，说明周期性单轴拉伸对HFF的细胞骨架排列具有重要影响。
实施例4、双轴拉伸微流控芯片的制备和拉伸测试
利用计算机辅助设计软件(CAD)设计如图6所示的形变通道结构(其他结构设计参照实施例1)，利用高精度打印设备制作掩膜板。微流控芯片的制备流程与实施例1相同。待芯片制作完成后，双轴拉伸芯片的拉伸方式和观测方式与实施例3相同。结果如图6所示，当设置输出正弦压力的大小为-250mbar，频率为1Hz时，弹性膜在两个轴向上的拉伸幅度均为10％。
实施例5、微流控芯片模拟人体血管组织在周期性拉伸刺激下的生理环境
(1)制作与实施例1中相同的微流控芯片
(2)将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种至微流控芯片内，并进行连续灌流及周期性拉伸下的细胞培养，接种及培养方法与实施例3中所述相同。其中，根据所模拟的血管生理环境不同，可设定灌流速度为1-20μL/min，拉伸幅度为5-10％，拉伸频率为1-3Hz，培养时间为1天至4周。
(3)内皮细胞在培养过程中同时受到流体剪切力和周期性拉伸力，并且此两种力互相垂直，这与内皮细胞在人体生理环境下受到的力学刺激相一致，从而说明本发明中的微流控芯片可以模拟血管组织的部分生理环境。
Claims (9)
1.一种微流控芯片，其特征在于，包括微通道层(1)和其下方的弹性膜层(2)，所述的微通道层(1)内设有形变通道(101)和气压通道。
2.根据权利要求1所述的一种微流控芯片，其特征在于，所述的形变通道(101)和气压通道之间通过薄壁隔开。
3.根据权利要求2所述的一种微流控芯片，其特征在于，所述的形变通道(101)、薄壁和气压通道的宽度比为1：(0.05-0.5)：(0.1-1)。
4.根据权利要求2所述的一种微流控芯片，其特征在于，所述的薄壁和弹性膜层(2)均由弹性高分子材料制成。
5.根据权利要求1所述的一种微流控芯片，其特征在于，所述的形变通道(101)两端分别设有与其连通的流体入口(102)和流体出口(103)，所述的气压通道两端设有与其连通的气路开口。
6.根据权利要求1所述的一种微流控芯片，其特征在于，所述的气压通道通过气路开口连接外加气压泵系统，通过外加气压使气压通道腔体结构发生弹性形变，从而对形变通道(101)及底部的弹性膜层(2)施加作用力。
7.根据权利要求1所述的一种微流控芯片，其特征在于，通过配置形变通道(101)和气压通道的位置和尺寸实现不同形变模式，形变模式包括单轴拉伸或双轴拉伸。
8.一种如权利要求1所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：通过刻蚀技术制备表面带图案的模板，然后将预聚物浇铸在模板上，固化、脱模、打孔后获得微通道层(1)；
步骤(2)：在硅片表面高速旋涂预聚物，固化后获得弹性膜层(2)；
步骤(3)：将微通道层(1)和弹性膜层(2)两部分接合。
9.一种如权利要求1所述的微流控芯片的应用，其特征在于，将所述微流控芯片用于力学刺激对细胞行为影响的相关研究；以及模拟人体器官和组织在力学刺激下的生理病理环境的相关研究。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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