CN113814010B - 多细胞、多组织共培养仿生微流控芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微流控芯片技术领域，具体为一种多细胞、多组织共培养仿生微流控芯片及其制备方法。本发明仿生微流控芯片由PDMS基片和玻片组成，基片上设计有多个功能单元以一定形式组合形成的复合结构，每个功能单元均设计有灌注通道、凝胶通道、稳压梯形柱、短梯形柱、开放式腔室；本发明微流控芯片可用于不同细胞、组织间的三维共培养，通道间能实现初始时相对独立，但营养物质、细胞因子等小分子互通。培养过程中能够实时观察各组分间的相互作用，并且开放腔室内可随时叠加不同实验操作。本芯片中功能单元个数可根据需求增加，实现芯片上的高通量。本发明兼容性强、成本低廉、操作简便。

Description

多细胞、多组织共培养仿生微流控芯片及其制备方法

技术领域

本发明属于微流控芯片技术领域，具体涉及多细胞、多组织共培养仿生微流控芯片的设计与制备方法。

背景技术

细胞之间的相互作用是多细胞生物的基本特征，对组织水平的发育和生理功能的发挥至关重要。细胞间的相互作用可以发生在不同细胞类型、不同组织结构之间，涉及范围十分广泛。作用的形式也复杂多样，可以是直接发生，例如在组织中细胞与细胞紧密连接形成稳定的细胞层，也可以通过细胞间分泌信号分子间接发生。为了获取更多有关生物学功能的信息，包括疾病的发生、干细胞发育和癌症的发展、转移等，观察细胞间相互作用的现象、解析其发生机制非常重要，这些信息进一步整合分析可以服务于药物筛选和组织工程等实际应用。

为了研究细胞间的相互作用，研究人员将两种或多种细胞类型进行共培养。现有共培养的标准方法包括将不同类型的细胞直接添加到同一培养皿中。又或者，在Transwell^®系统中共培养细胞，该系统由上下两个隔室组成，中间有多孔渗透膜隔开。这些系统均倾向于在平面上培养细胞，然而二维单层培养的细胞在细胞形态学、生理学和基因表达等方面都与体内真实的生理情况相差甚远。活组织中大多数细胞生长的微环境是细胞外基质(ECM)，它是一种纤维性质的环境，由复杂分子所组成，能够为细胞提供结构支持，从而使细胞三维生长。然而，创造一个与体内组织结构相似且可控的微环境具有一定的挑战性。为了开发更多生理相关的共培养细胞模型，微流体和器官芯片系统被用作研究细胞-细胞相互作用的先进方法和技术。

发明内容

本发明针对上述现有共培养技术的缺陷以及开发新型共培养系统的需求，提出一种多细胞、多组织共培养仿生微流控芯片及其制备方法。

本发明结合旋涂工艺与光刻技术，构建图案化的模板。由于聚二甲基硅烷（PDMS）具有良好的光学特性、绝缘性、热稳定性以及生物相容性，选取PDMS作为基片材料。将其预聚物和聚合剂以一定比例混合后倒于图案化模板上，固化形成PDMS基片。再将PDMS基片与玻璃基底通过等离子体处理或者用夹具进行紧密贴合，制备出多细胞、多组织共培养的仿生微流控芯片。利用上述微流控芯片，可实现体外多种细胞、类器官、组织的可视化长时程共培养，为基础科学问题的研究、治疗药物的筛选提供了高通量的创新性芯片平台，为个性化医疗的实现提供了可行性实施方案。

本发明提供的多细胞、多组织共培养仿生微流控芯片,由PDMS基片和玻片组成；其中，所述PDMS基片上设计有多个功能单元以一定形式组合形成的复合结构，每个功能单元均设计有灌注通道、凝胶通道、稳压梯形柱、短梯形柱、开放式腔室；参见图1和图2所示。其中：

所述灌注通道，用于灌注各种类型流体，例如灌注培养基、细胞悬液、药物溶液等；该灌注通道的结构为：两端有进样口，可连接灌注系统，中间为连续的通道结构。

所述凝胶通道，用于灌注各种粘度的凝胶以及凝胶混合液；其结构为：两端有进样口，可连接灌注系统，中间为连续的通道结构，在通道内壁两侧均匀排布有梯形柱。

所述稳压梯形柱、短梯形柱有若干个，分布在凝胶通道内壁两侧；其中，短梯形柱均匀排布凝胶通道内壁中间，成一阵列，稳压梯形柱排布在短梯形柱阵列的两侧；凝胶通道内壁两侧分布的梯形柱长短不一，两个梯形柱之间形成毛细被动阀，利用“接触角滞后现象”改变局部的毛细力方向，控制液体流动，进而将凝胶状物质有效限制在凝胶通道内。其中，稳压梯形柱相对于短梯形柱长度较长，稳压梯形柱与短梯形柱的宽度和高度一致，能在凝胶通道被灌注时分散压力，避免溶液渗漏到相邻通道中。

对应于一个凝胶通道，灌注通道有两个，对称地排布于凝胶通道两侧。

所述开放式腔室，在凝胶通道的一侧，与该侧的灌注通道连通；为开顶设计，提供可直接进行操作的芯片上开放环境，能够随时取放细胞、类器官、生物组织等实验材料。

本发明中，每个芯片上可集成功能单元1-10个，优选为4个。

一个芯片中，多个功能单元的凝胶通道可以共享同一个进样口，方便凝胶进样时从一个进样口注入，流通填满所有凝胶通道，减少凝胶进样的重复操作。

一个芯片中，多个功能单元之间的灌注通道可根据需求进行连通，连通的灌注通道可以减少重复的灌注操作。若每个功能单元所需灌流的液体不同，灌注通道可设计为不连通、相互独立，减少功能单元之间的串扰。

一个芯片中，多个功能单元的开放式腔室相互独立，互不影响，每个开放式腔室为一个单独的反应池。

本发明中，灌注通道和凝胶通道长度为1-50mm，宽度为100-2000µm，高度为10-200µm；优选通道长度为8mm，宽度为1mm，高度为60µm。

本发明中，稳压梯形柱上底长度为100-850µm，下底长度为250-1000µm，下底长度大于上底长度；优选为上底400 µm，下底550µm。

本发明中，短梯形柱上底长度为10-400µm，下底长度为100-500µm，下底长度大于上底长度；优选为上底150 µm，下底300µm。

本发明中，梯形柱之间形成的毛细被动阀长度为10-500µm，优选为50 µm。

本发明中，开放式腔室为圆形，其直径为0.5-5 mm，深度不限；优选直径为2 mm。

本发明提供的多细胞、多组织共培养仿生微流控芯片的制备方法，具体步骤如下：

（1）用光刻技术制作具有特定结构图案的模板，操作包括旋涂光刻胶、软烘焙、紫外曝光、后烘、显影、坚膜、硅烷化处理等步骤。

（2）将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物与聚合剂以质量比为（8-15）:1的比例充分混合均匀后，离心去除气泡；

（3）将混合离心好的PDMS浇筑在模板上，真空去除气泡后，加热直至PDMS固化；

（4）将固化的PDMS芯片从模板上揭下，根据需求打进样孔和开放式腔室；

（5）通过等离子体处理或者利用夹具将PDMS芯片和玻片紧密贴合，确保液体不渗漏；

本发明的多细胞、多组织共培养仿生微流控芯片，其使用时的操作流程为：

（1）将制备好的微流控芯片置于80℃烘箱24 h，恢复通道内的疏水性；

（2）芯片使用前，紫外照射30 min灭菌；

（3）将凝胶溶液注入凝胶通道，待凝胶凝固后，可在灌注通道内灌流液体；

（4）开放式腔室可随时进行实验操作，不受凝胶通道和灌注通道影响。

本发明的多细胞、多组织共培养仿生微流控芯片设计具有如下特点：

芯片上设计的梯形柱之间能形成稳定的毛细被动阀，利用“接触角滞后现象”改变局部的毛细力方向,从而控制液体流动，实现多条通道分别进样时互不串扰；

设计中增加的较长稳压梯形柱能有效分散凝胶通道进样时的液体压力，确保毛细被动阀不破裂，满足更大范围内各种粘度的凝胶能平稳、匀速地充满整个凝胶通道；

开放式腔室可集成多种实验方法和操作，突破了微流控芯片内容物较难取出的局限；

功能单元式的设计可重复叠加组合，比传统单一结构的微流控芯片更能满足高通量的需求。

本发明微流控芯片可用于不同细胞、组织间的三维共培养，通道间能实现初始时相对独立，但营养物质、细胞因子等小分子互通。培养过程中能够实时观察各组分间的相互作用，并且开放腔室内可随时叠加不同实验操作。本芯片由功能单元重复组合而成，排列组合个数可根据需求增加，实现芯片上的高通量。

本发明设计的仿生微流控芯片具有如下优点：

（1）兼容性强、成本低廉、生物相容性好、操作简便；

（2）可实现不同细胞、类器官、组织的共培养，相较于其他共培养体系，具有实时可视化、试剂消耗少、样本量需求少的优势；

（3）功能单元可重复增加、排列组合，满足高通量的需求，可大大提高实验效率，有望成为高效药物筛选平台；

（4）长短不一的梯形柱设计使得形成的毛细被动阀稳定可靠，重复性好，适用于各种粘度的凝胶。

附图说明

图1为四个功能单元组合形成的多细胞、多组织共培养仿生微流控芯片结构图示。

图2为功能单元结构图示。

图中标号：1为灌注通道；2为凝胶通道；3为开放式腔室；4为短梯形柱；5为稳压梯形柱；6为毛细被动阀。

具体实施方式

下面结合实例和附图，对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不仅限于此。

一种肿瘤类器官和自组装血管网络共培养的仿生微流控芯片，包括四个功能单元（图1），每个单元设计有灌注通道、凝胶通道、稳压梯形柱、短梯形柱、毛细被动阀、开放式腔室（图2）。其中，凝胶通道内通入纤维蛋白原和内皮细胞的混合液，使其自组装形成血管网络。然后在开放式腔室内加入肿瘤类器官，实时观测肿瘤类器官与血管网络之间的相互作用。也可加入药物对共培养系统进行干预，评价药物对于肿瘤以及血管的影响。

该仿生微流控芯片中，灌注通道、凝胶通道的长度为8mm，宽度为1 mm，高度为60µm。稳压梯形柱的上底为400 µm，下底为550µm；短梯形柱的上底为150 µm，下底为300µm；梯形柱之间形成的毛细被动阀长度为50µm。这样的结构能够在凝胶通道注射3mg/mL纤维蛋白原时将其有效限制在凝胶通道内，避免其渗漏到相邻的通道里。

本发明提供的肿瘤类器官和自组装血管网络共培养的仿生微流控芯片的制备方法，具体步骤如下：

（1）用光刻技术制作带有设计图案的硅模板，步骤包括有旋涂光刻胶、软烘焙、紫外曝光、后烘、显影、坚膜、硅烷化处理。具体操作为：以1700rpm的转速在硅片上均匀旋涂一层光刻胶SU-8 2050，然后将硅片依次置于65℃加热台5 min，95℃加热台25 min以完成软烘焙步骤；待硅片冷却后，将带有设计图案的菲林胶片置于光刻胶上方，紫外曝光30s；再将硅片依次置于65℃加热台5 min，95℃加热台10 min以完成后烘步骤；随后将硅片置于显影液中显影9min；显影完的硅片上可见清晰的由光刻胶固化形成的图案，再将硅片置于150℃热台上坚膜30min；最后用三甲基氯硅烷对硅片和光刻胶表面进行硅烷化处理。

（2）将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物与聚合剂以质量比为10:1的比例充分搅匀混合，离心去除气泡；

（3）将混合离心好的PDMS浇筑在模板上，再通过真空去除气泡后，置于80℃烘箱1h使其固化；

（4）将固化的PDMS芯片从硅模板上揭下，打孔器打直径1 mm的进样孔和直径2 mm的开放式腔室；

（5）通过等离子体处理后将PDMS芯片和玻片键合，随后将整块微流控芯片置于80℃烘箱24 h，恢复通道内的疏水性；

（6）芯片使用前，紫外照射30 min灭菌。

本发明芯片突破了传统Transwell^®小室高成本、低通量的局限，为体外多种细胞、组织的共培养提供了可替代方案，突出优势为成本低廉、操作简单、高通量、与各类实验技术兼容性好、透明可视化。在本发明芯片上能够诱导内皮细胞在体外自组装形成可灌注的血管网络，实时在线观察血管网络生成的动态生物学过程以及肿瘤类器官与血管网络之间的相互作用。并且肿瘤类器官可随时取出进行免疫组化染色、蛋白质印记、转录组测序等检测。由于芯片上试剂消耗少、多功能单元叠加等特点，能够满足高通量药物初筛的需求。综上，本发明肿瘤类器官和自组装血管网络共培养仿生微流控芯片可用于研究肿瘤及其周围血管微环境之间的相互作用，是一种理想的体外研究模型。此外，本芯片还可作为肿瘤药物初筛的测试平台。

Claims (8)

1.一种多细胞、多组织共培养仿生微流控芯片,其特征在于，由PDMS基片和玻片组成；其中，所述PDMS基片上设计有多个功能单元以一定形式组合形成的复合结构，每个功能单元均设计有灌注通道、凝胶通道、稳压梯形柱、短梯形柱、开放式腔室；其中：

所述灌注通道，用于灌注各种类型流体；其结构为：两端有进样口，可连接灌注系统，中间为连续的通道结构；

所述凝胶通道，用于灌注各种粘度的凝胶以及凝胶混合液；其结构为：两端有进样口，可连接灌注系统，中间为连续的通道结构；所述灌注通道和凝胶通道长度为1-50mm，宽度为100-2000µm，高度为10-200µm；

所述稳压梯形柱、短梯形柱若干个，分布在凝胶通道内壁两侧；其中，短梯形柱均匀排布凝胶通道内壁中间，成一阵列，稳压梯形柱排布在短梯形柱阵列的两侧；凝胶通道内壁两侧分布的梯形柱长短不一，两个梯形柱之间形成毛细被动阀，利用“接触角滞后现象”改变局部的毛细力方向，控制液体流动，进而将凝胶状物质有效限制在凝胶通道内；其中，稳压梯形柱相对于短梯形柱的长度较长，稳压梯形柱与短梯形柱的宽度和高度一致，能在凝胶通道被灌注时分散压力，避免溶液渗漏到相邻通道中；所述稳压梯形柱上底长度为100-850µm，下底长度为250-1000µm，下底长度大于上底长度；所述短梯形柱上底长度为10-400µm，下底长度为100-500µm，下底长度大于上底长度；

对应于一个凝胶通道，灌注通道有两个，对称地排布于凝胶通道两侧；

所述开放式腔室，在凝胶通道的一侧，与该侧的灌注通道连通；为开顶设计，提供可直接进行操作的芯片上开放环境，用于随时取放实验材料。

2.根据权利要求1所述的仿生微流控芯片,其特征在于，每个芯片上集成的功能单元为1-10个。

3.根据权利要求1所述的仿生微流控芯片,其特征在于，单个芯片中，多个功能单元的凝胶通道共享同一个进样口，方便凝胶进样时从一个进样口注入，流通填满所有凝胶通道，减少凝胶进样的重复操作。

4.根据权利要求3所述的仿生微流控芯片,其特征在于，单个芯片中，多个功能单元之间的灌注通道根据需求进行连通，连通的灌注通道可以减少重复的灌注操作；若每个功能单元所需灌流的液体不同，灌注通道设计为不连通、相互独立，减少功能单元之间的串扰。

5.根据权利要求4所述的仿生微流控芯片,其特征在于，单个芯片中，多个功能单元的开放式腔室相互独立，互不影响，每个开放式腔室为一个单独的反应池。

6.根据权利要求1-5之一所述的仿生微流控芯片,其特征在于，所述梯形柱之间形成的毛细被动阀长度为10-500µm。

7.根据权利要求1-5之一所述的仿生微流控芯片,其特征在于，所述开放式腔室为圆形，其直径为0.5-5 mm。

8.如权利要求1-7之一所述的仿生微流控芯片的制备方法,其特征在于，具体步骤如下：

（1）用光刻技术制作具有特定结构图案的模板；

（2）将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物与聚合剂以质量比为（8-15）:1的比例充分混合均匀后，离心去除气泡；

（3）将混合离心好的PDMS浇筑在模板上，真空去除气泡后，加热直至PDMS固化；

（4）将固化的PDMS芯片从模板上揭下，根据需求打进样孔和开放式腔室；

（5）通过等离子体处理或者利用夹具将PDMS芯片和玻片紧密贴合，确保液体不渗漏。

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