CN105713835A - 一种基于微流控芯片的多功能区域细胞三维共培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于微流控芯片的多功能区域细胞三维共培养方法,该芯片由高度较低的中央主通道及两侧高度较高的侧通道组成,主通道与侧通道之间由喇叭样栅栏结构连接。该方法的具体步骤如下:(1)将上述芯片的主通道的进样口中分别加入具有不同组成的胶原溶液,并在出口处加负压,三种胶原溶液流入主通道并在层流原理作用下形成边界明显的功能区域;(2)芯片通过紫外照射过夜灭菌后,在注入主通道的胶原溶液中直接混入细胞,可以实现细胞接种。本发明设计的微流控芯片可以通过一步法构建具有多个独立功能区域的细胞三维培养体系,在体外复杂细胞微环境构建中具有重要应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及细胞三维共培养及其应用领域,具体涉及一种基于微流控芯片的多功能区域细胞三维共培养方法。
背景技术
细胞三维共培养体系是细胞间相互作用及细胞微环境构建的重要平台。与传统二维培养体系相比,细胞三维培养更接近于体内细胞的生长状态,因此更有利于细胞表型的维持及细胞微环境的模拟,其研究结果可以更真实的反应出体内情况。而细胞共培养体系是细胞间相互作用研究的重要手段,包括细胞间的趋化、识别、穿透等多种行为及其相关基质。
目前,细胞实验室最常用的细胞共培养方法为Trans-well,该方法是在孔板中将不同种类的细胞分别培养在聚碳酸酯膜的上下两边,从而实现细胞的非接触式共培养及诱导迁移研究。但Trans-well方法为常规的细胞的二维培养体系,并且上下分布的细胞接种方法不利于镜下观察及图像数据的采集。基于这一需求,研究者们在微流控芯片上建立了三维细胞共培养的方法,该方法可以形成左右两个不同的功能区域,并实现细胞的三维培养来对细胞相互作用进行研究(IntegrativeBiology,2012,4,522–530)。但是该方法形成的功能区域只有两个,无法满足复杂实验条件的需要,并且该方法需要两次灌胶的操作,耗时较长,可能会对细胞状态产生影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于微流控芯片的多功能区域细胞三维共培养新方法,以解决以往细胞实验中无法构建复杂的共培养体系及二维培养与体内实际条件不符合等问题。
一种微流控芯片,该该芯片由高度较低的中央主通道及两侧高度较高的侧通道组成,主通道与侧通道之间由喇叭样栅栏结构连接;主通道的一侧具有三个主通道进样口,另一端有主通道出口,每个侧通道有侧通道进样口和侧通道出样口。
所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成,两层的材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物(PDMS),上层PDMS带有通道结构,下层PDMS为不带有结构的PDMS,两层PDMS间通过等离子体处理后封接。
主通道结构较低为70-80微米,两侧通道结构较高为150-160微米,喇叭样栅栏结构高为70-80微米,喇叭开口为60-150微米渐变。
一种基于微流控芯片的多功能区域细胞三维共培养方法,采用上述芯片,该方法的具体步骤如下:
(1)将上述芯片的主通道的进样口中分别加入具有不同组成的胶原溶液,并在出口处加负压,三种胶原溶液流入主通道并在层流原理作用下形成边界明显的功能三个区域;同时,在胶原溶液在通道高度差及喇叭样结构的作用下产生表面张力差,从而不会从主通道流入两侧通道;
(2)芯片通过紫外照射过夜灭菌后,在注入主通道的胶原溶液中直接混入细胞,可以实现细胞接种。
所述胶原溶液也可以是其它可固化的聚合物溶液,如聚乙二醇或海藻酸钠。
所述步骤(1)芯片中产生的功能区域数量由中央主通道的层流分布数量所决定,总数量为中央主通道的层流分布数量加2。
两侧的侧通道也可作为功能区域用于细胞接种或生化因子的施加。
在不同的功能区域添加不同类型的细胞或生化因子可以实现复杂的细胞共培养体系及微环境构建。
本发明的通道高度差异是通过制备模板时二次甩胶及曝光实现的,即在制备模板过程中第一次甩胶并曝光中央通道及栅栏结构,之后在其上面再次甩胶并曝光出侧通道结构。因此,中央通道及栅栏结构的高度是由第一层胶的厚度决定的,而侧通道结构的高度是由两次甩胶的总高度决定的。
本发明提供的基于微流控芯片的多功能区域细胞三维共培养新方法中,在主通道中灌入胶原时,主通道的一侧具有三个进样口,而另一端只有一个出口;当在三个进样口中加入不同组成的胶原后,在另一端加负压,三种胶原溶液在负压作用下流入主通道,并且由于微尺度下层流的作用三中流体各自保持在一定区域内直至37度半小时胶原固化形成三个功能区域。调节主通道进样口端进样通道的数量可以形成不同数量的功能区域,另外两侧的侧通道也可作为功能区域用于细胞接种或生化因子的施加。胶原固化后整个芯片具有多个功能化区域,可用于多因素刺激、三维培养条件下的细胞侵袭、细胞间相互作用、血管形成等相关领域的研究。
使用本发明提供的方法进行区域化细胞接种及生化因子施加后,在各个液池中加入培养基来维持细胞的营养环境并在37度5%二氧化碳培养箱内进行培养。
本发明提供的优点在于:
1、一步法实现多个胶原区域的灌注,耗时短;
2、可获得多个功能区域且该区域数量可控;
3、为细胞提供三维生长环境;
4、所有功能区域都是横向分布的,有利于观察及实验数据的采集;
附图说明
图1微流控芯片结构示意图,1主通道,2侧通道,3喇叭样栅栏结构,4主通道进样口,5主通道出口,6侧通道进样口,7侧通道出样口。
图2本发明方法芯片中功能化区域形成、划分实物图表征(40倍);
图3具有多功能区域微流控芯片用于肿瘤微环境诱导内皮细胞出芽的研究(40倍);
图4具有多功能区域微流控芯片用于肿瘤微环境诱导内皮细胞血管生成的研究(40倍)。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明,但并不因此而限制本发明。
一种微流控芯片如图1所示,该该芯片由高度较低的中央主通道1及两侧高度较高的侧通道2组成,主通道与侧通道之间由喇叭样栅栏结构3连接;主通道的一侧具有三个主通道进样口4,另一端有主通道出口5,每个侧通道有侧通道进样口6和侧通道出样口7。
所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成,两层的材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物(PDMS),上层PDMS带有通道结构,下层PDMS为不带有结构的PDMS,两层PDMS间通过等离子体处理后封接。
主通道1较低为70-80微米,两侧通道2结构较高为150-160微米,喇叭样栅栏结构3高为70-80微米,喇叭开口为60-150微米渐变。
实施例1
制备好本发明的微流控芯片,超净台内紫外照射过夜灭菌。按照常规比例配备30微升的4mg/ml胶原溶液并等分为三份(每份10微升)储存在冰袋上待用。细胞传代后用一份胶原溶液重悬待用。将上述含有细胞的胶原溶液加入到中央通道的中部液池;另外两份空白胶原溶液分别加入到中央通道的中两边液池;在中央通道的另一端抽真空,三种液体以层流形式流入到通道内,37度半小时胶原固化,形成具有中间为细胞区域,两侧为空白胶原区域的胶原分布结构,在两边侧通道中加入培养基进行细胞培养(图2),证明了本发明可控形成多功能区域的可行性。
实施例2
基于实施例一中多功能区域形成方法,在中央通道的中部液池中加入含有内皮细胞的胶原,两侧液池加入空白胶原溶液不变。胶原固化后在左边侧通道中加入培养基;在右边侧通道中加入肿瘤细胞与内皮细胞共培养。如图3所示,48小时后,内皮细胞在肿瘤细胞的诱导作用下向右侧迁移出芽,而左侧加入培养基通道的对照组则未见内皮细胞向该方向出芽,这一实验一次性的内完成了共培养细胞相互作用研究及其空白对照实验,体现了本发明的优越性。另外在该体系进行更长时间的培养后,中央通道中的内皮细胞在肿瘤微环境的作用下形成了血管样的网络结构,进一步证明了肿瘤微环境促进血管的形成作用(图4)。
Claims (8)
1.一种微流控芯片,其特征在于该该芯片由高度较低的中央主通道及两侧高度较高的侧通道组成,主通道与侧通道之间由喇叭样栅栏结构连接;主通道的一侧具有三个主通道进样口,另一端有主通道出口,每个侧通道有侧通道进样口和侧通道出样口。
2.按照权利要求1所述的一种微流控芯片,其特征在于所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成,两层的材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物(PDMS),上层PDMS带有通道结构,下层PDMS为不带有结构的PDMS,两层PDMS间通过等离子体处理后封接。
3.按照权利要求1所述的一种微流控芯片,其特征在于主通道较低,为70-80微米,两侧通道结构较高,为150-160微米,喇叭样栅栏结构高为70-80微米,喇叭开口为60-150微米渐变。
4.一种基于微流控芯片的多功能区域细胞三维共培养方法,采用上述芯片,其特征在于该方法的具体步骤如下:
(1)将上述芯片的主通道的进样口中分别加入具有不同组成的胶原溶液,并在出口处加负压,三种胶原溶液流入主通道并在层流原理作用下形成边界明显的功能区域;同时,在胶原溶液在通道高度差及喇叭样结构的作用下产生表面张力差,从而不会从主通道流入两侧通道;
(2)芯片通过紫外照射过夜灭菌后,在注入主通道的胶原溶液中直接混入细胞,可以实现细胞接种。
5.按照权利要求4所述基于微流控芯片的多功能区域细胞三维共培养方法,其特征在于:胶原溶液也可以是其它可固化的聚合物溶液,如聚乙二醇或海藻酸钠。
6.按照权利要求4所述基于微流控芯片的多功能区域细胞三维共培养方法,其特征在于:步骤(1)芯片中产生的功能区域数量由中央主通道的层流分布数量所决定,总数量为中央主通道的层流分布数量加2。
7.按照权利要求4所述基于微流控芯片的多功能区域细胞三维共培养方法,其特征在于两侧的侧通道也可作为功能区域用于细胞接种或生化因子的施加。
8.按照权利要求4所述基于微流控芯片的多功能区域细胞三维共培养方法,其特征在于:在不同的功能区域添加不同类型的细胞或生化因子可以实现复杂的细胞共培养体系及微环境构建。
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