CN108384713A - 一种细胞迁移用微流控芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞迁移用微流控芯片及其制备方法，自上而下设有流动层、控制层、薄膜层和玻璃层；所述流动层由金字塔形网络结构、细胞培养区、细胞迁移区、主管道和进液微管道组成；所述控制层由若干微阀组成。本发明还提供了微流控芯片的制备方法。本发明可在主管道和细胞迁移区形成生化因子/药物浓度梯度，有利于在同一个芯片内研究不同浓度生化因子/药物对细胞迁移的作用，突破了惯用的单浓度生化因子/药物对细胞迁移作用的研究模式。本发明还可实现细胞外基质微环境构建和靶细胞与基质细胞共培养，用于细胞外基质和基质细胞对靶细胞的趋触性研究。由此可见，本发明可结合生化因子/药物浓度梯度与细胞微环境模拟研究细胞迁移。
Description
技术领域
本发明涉及一种微流控芯片及其制备方法，具体地说，涉及一种结合细胞微环境模拟与生化因子/药物浓度梯度研究细胞迁移的微流控芯片及其制备方法。
背景技术
微流控芯片技术 (Microfluidics) 是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块几平方厘米的芯片上，自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的研究与应用中展现出巨大的潜力，现已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等多学科交叉的崭新研究领域。目前广泛应用的生物芯片 (micro-arrays)，如基因芯片、蛋白质芯片等只是微流量为零的点阵列型杂交芯片，功能非常有限，而微流控芯片具有更广泛的类型、功能与用途，可以开发出微型细胞培养与研究系统，以及基因与蛋白质测序、质谱和色谱等分析系统，成为细胞、分子生物学和生物分析化学研究中极为重要的技术手段。除此之外，随着现代生物学研究模式的转变，细胞微环境模拟微流控芯片研究已经引起了诸多研究者的关注，并在细胞、亚细胞、生物大分子水平上得到不断扩展，主要应用于细胞活性与形态、细胞功能和细胞组分三个方面的研究。
现有技术中，还没有结合细胞微环境模拟与生化因子/药物浓度梯度研究细胞迁移的微流控芯片及其制备方法的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞迁移用微流控芯片及其制备方法。
其具体技术方案为：
一种细胞迁移用微流控芯片，自上而下设有流动层1、控制层2、薄膜层3和玻璃层4；所述薄膜层3用于控制层2与玻璃层4的封接；所述流动层1由金字塔形网络结构6、细胞培养区8、细胞迁移区9、主管道10和第一进液微管道5、第二进液微管道7组成；所述控制层2由第一微阀11，第二微阀12，第三微阀13，第四微阀14，第五微阀15组成。
进一步，所述微流控芯片流动层1、控制层2和薄膜层3的材料为聚二甲基硅氧烷，或者已知的弹性高分子材料。
进一步，所述金字塔形网络结构6包含4~8排蛇形微管道16，各排包含2 ~ 12个蛇形微管道16，每排与相邻一排的蛇形微管道16错列排布，每排内的蛇形微管道16间距为100~ 500 μm，每个蛇形微管道宽度均为20 ~ 100 μm。
进一步，所述第一进液微管道5、第二进液微管道7汇聚于主管道10；所述培养基第一进液微管道5为两个对称的进液微管道，宽度为20 ~ 100 μm，作为培养基、生化因子/药物进液微管道，为细胞培养区提供培养基，形成生化因子/药物浓度梯度，所述第二进液微管道7宽度为50~300 μm，用于输入构建细胞微环境所需的生化因子和基质细胞。
进一步，所述金字塔形网络结构6的蛇形微管道16用于使注入第一进液微管道5的培养基、生化因子/药物通过不断的分流、汇聚、混合，形成不同浓度后汇入主通道10，最终在主通道10内建立生化因子/药物浓度梯度。
进一步，所述细胞培养区8为宽为200 ~ 1000 μm的弧形微管道，分布于主管道10两侧，用于细胞的接种和培养；所述细胞迁移区9由连接主管道10与其两侧细胞培养区8的多排平行细胞迁移微管道17组成，细胞迁移微管道17宽度为20 ~ 100 μm，细胞迁移微管道17长度不一，以主管道10为轴呈对称分布，长度为200 ~ 3000 μm，每排细胞迁移管道间隔50 ~ 200 μm，用于细胞的迁移；所述主管道10宽度为400 ~ 1000 μm，用于生化因子/药物浓度梯度的形成和细胞微环境的构建。
进一步，所述金字塔形网络结构6、细胞培养区8、细胞迁移区9、主管道10和第一进液微管道5、第二进液微管道7高度相同，为30 ~ 150 μm。
进一步，所述第一微阀11，第二微阀12，第三微阀13，第四微阀14，第五微阀15分别位于第二进液微管道7、细胞迁移区9与主管道10衔接处、主管道10与金字塔形网络结构6衔接处、主管道10与第二进液微管道7衔接处、细胞迁移区9与细胞培养区8衔接处正下方；每个微阀为末端封闭管道结构，宽为50 ~ 200 μm。
进一步，所述第一微阀11，第二微阀12，第三微阀13，第四微阀14，第五微阀15为气动微阀，工作原理是压力为1 ~ 20 psi的压缩气体进入微阀，驱动微阀膨胀变形，挤压位于其正上方的微管道，实现液体流动方向的有效控制；所述第一微阀11，第二微阀12，第三微阀13，第四微阀14，第五微阀15分别用于对流动层细胞、培养基和生化因子/药物、构建细胞微环境所需生化因子和基质细胞的输入进行时间和空间的控制。
一种本发明所述细胞迁移用微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
第一步，将设计好的流动层1和控制层2结构制成光掩模；
第二步，将光刻胶涂膜于硅片，进行紫外曝光和显影，制得流动层1和控制层2芯片模板；
第三步，将聚二甲基硅氧烷或其他已知的弹性高分子材料覆盖于流动层1和控制层2模板表面，80 ℃烘烤固化10 ~ 60 min，在显微镜下将流动层1和控制层2校对粘合；
第四步，将聚二甲基硅氧烷或其他已知的弹性高分子材料涂膜于玻璃层4表面，80 ℃烘烤固化5 ~ 20 min，形成薄膜层3；
第五步，将粘合好的流动层1与控制层2封装于涂有薄膜层3的玻璃层4上，制成微流控芯片。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的微流控芯片主要借助金字塔形网络结构的微管道使注入的生化因子/药物不断分流、汇聚、混合，形成不同浓度后再经分支管道汇入金字塔末端主管道，最终在主管道内建立物质浓度梯度。该结构能够快速建立物质浓度梯度，并且可以根据流速及微管道直径、网络结构的设计精确控制梯度类型，如线性、多峰型、对称或非对称型等。又因为细胞迁移区的细胞迁移管道的长度不一，因此细胞培养区中同一侧的细胞处于迁移管道较长位置的细胞所感受到的生化因子/药物浓度要低于处于迁移管道较短位置的细胞所感受到的生化因子/药物浓度。因此，通过金字塔形网络结构和细胞迁移管道可以构成持续可控的复合浓度梯度。
本发明的微流控芯片中的主管道除了用于形成可控的物质浓度梯度以外，还可用于细胞微环境的构建，如细胞赖以生存的细胞外基质构建和基质细胞培养，用于细胞外基质和基质细胞对细胞的趋触性研究。该功能主要是通过第二进液微管道输入构建细胞微环境所需的生化因子和基质细胞，实现细胞培养所需微环境的构建和处理。
本发明的微流控芯片中细胞迁移区的细胞迁移管道宽为20 ~ 100 μm，可实现细胞迁移的实时监测。
附图说明
图1为本发明实施例中细胞迁移用微流控芯片的结构分解示意图。
图2为本发明实施例中流动层和控制层的结构示意图。
图3为本发明实施例中细胞迁移区的细胞迁移微管道结构示意图。
图4为本发明实施例中主管道内物质浓度梯度图。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种细胞迁移用微流控芯片，如图1所示，芯片自上而下设有流动层1、控制层2、薄膜层3和玻璃层4；所述薄膜层3用于控制层2与玻璃层4的封接；所述流动层1由金字塔形网络结构6、细胞培养区8、细胞迁移区9、主管道10和第一进液微管道5、第二进液微管道7组成；所述控制层2由第一微阀11，第二微阀12，第三微阀13，第四微阀14，第五微阀15若干个微阀组成。
如图2所示，所述金字塔形网络结构6包含4排蛇形微管道16，自上而下每排各包含3、4、5、6个蛇形微管道16，每排与相邻一排的蛇形微管道16错列排布，每排内的蛇形微管道16间距为320 μm，每个蛇形微管道宽度均为50 μm。
如图2所示，所述第一进液微管道5、第二进液微管道7汇聚于主管道10；所述培养基第一进液微管道5为两个对称的进液微管道，宽度为50 μm，作为培养基、生化因子/药物进液微管道，为细胞培养区提供培养基，形成生化因子/药物浓度梯度，所述第二进液微管道7宽度为300 μm，用于输入构建细胞微环境所需的生化因子和基质细胞。
所述金字塔形网络结构6的蛇形微管道16用于使注入进液微管道5的培养基、生化因子/药物通过不断的分流、汇聚、混合，形成不同浓度后汇入主通道10，最终在主通道10内建立物质浓度梯度。
如图3所示，所述细胞培养区8为宽为300 μm的弧形微管道，分布于主管道10两侧，用于细胞的接种和培养；所述细胞迁移区9为连接主管道10与其两侧细胞培养区8的多排平行细胞迁移微管道17组成，细胞迁移微管道17为宽度不变的直管道，宽度为50 μm，细胞迁移微管道17长度不一，以主管道10为轴呈对称分布，最长的细胞迁移微管道17长度为2200μm，最短的细胞迁移微管道17长度为350 μm；每排细胞迁移管道间隔100 μm，用于细胞的迁移；所述主管道10为宽度不变的直管道，宽度为600 μm，用于生化因子/药物浓度梯度的形成和细胞微环境的构建。
所述金字塔形网络结构6、细胞培养区8、细胞迁移区9、主管道10和第一进液微管道5、第二进液微管道7高度相同，为50 μm。
如图2所示，所述第一微阀11，第二微阀12，第三微阀13，第四微阀14，第五微阀15分别位于第二进液微管道7、细胞迁移区9与主管道10衔接处、主管道10与金字塔形网络结构6衔接处、主管道10与第二进液微管道7衔接处、细胞迁移区9与细胞培养区8衔接处正下方；每个微阀为末端封闭管道结构，第一微阀11、第二微阀12、第五微阀15宽为50 μm，第三微阀13、第四微阀14宽度为200 μm。
所述第一微阀11，第二微阀12，第三微阀13，第四微阀14，第五微阀15为气动微阀，工作原理是压力为1 ~ 20 psi的压缩气体进入微泵，驱动微阀膨胀变形，挤压位于其正上方的微管道，实现液体流动方向的有效控制；所述第一微阀11，第二微阀12，第三微阀13，第四微阀14，第五微阀15分别用于对流动层细胞、培养基和生化因子/药物、构建细胞微环境所需生化因子和基质细胞的输入进行时间和空间的控制。
一种本发明所述细胞迁移用微流控芯片的制备方法，以聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片制备为例：
第一步，将设计好的流动层1和控制层2结构制成光掩模；
第二步，将光刻胶涂膜于硅片，进行紫外曝光和显影，制得流动层1和控制层2芯片模板；
第三步，将PDMS预聚物和交联剂按质量比为10:1混匀，覆盖于流动层1模板表面，80 ℃烘烤固化30 min；将PDMS预聚物和交联剂按质量比为15:1混匀，覆盖于控制层2模板表面，80 ℃烘烤固化19 min，在显微镜下将流动层1和控制层2校对粘合；
第四步，将PDMS预聚物和交联剂按质量比为10:1涂膜于玻璃层4表面，80 ℃烘烤固化13 min，形成薄膜层3；
第五步，将粘合好的流动层1与控制层2封装于涂有薄膜层3的玻璃层4上，制成微流控芯片。
实施例2
主管道10内建立物质浓度梯度方式如图4所示。以15 psi的气体压力驱动第一微阀11，封闭第二进液微管道7；通过第一进液微管道5的两个入口分别向金字塔型网络结构6的蛇形微管道16注入两种溶液，液体灌注流速为0.5 μL/min；两种溶液通过不断的分流、汇聚和混合，形成不同浓度后汇入主管道10，最终在主通道10内建立物质浓度梯度。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种细胞迁移用微流控芯片，其特征在于，自上而下设有流动层、控制层、薄膜层和玻璃层；所述薄膜层用于控制层与玻璃层的封接；所述流动层由金字塔形网络结构、细胞培养区、细胞迁移区、主管道和第一进液微管道、第二进液微管道组成；所述控制层由第一微阀，第二微阀，第三微阀，第四微阀，第五微阀组成。
2.根据权利要求1所述的细胞迁移用微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片流动层、控制层和薄膜层的材料为聚二甲基硅氧烷，或者已知的弹性高分子材料。
3.根据权利要求1所述的细胞迁移用微流控芯片，其特征在于，所述金字塔形网络结构包含4~8排蛇形微管道，各排包含2 ~ 12个蛇形微管道，每排与相邻一排的蛇形微管道错列排布，每排内的蛇形微管道间距为100 ~ 500 μm，每个蛇形微管道宽度均为20 ~ 100 μm。
4.根据权利要求3所述的细胞迁移用微流控芯片，其特征在于，所述金字塔形网络结构的蛇形微管道用于使注入第一进液微管道的培养基、生化因子/药物通过不断的分流、汇聚、混合，形成不同浓度后汇入主通道,最终在主通道内建立生化因子/药物浓度梯度。
5.根据权利要求1所述的细胞迁移用微流控芯片，其特征在于，所述第一进液微管道、第二进液微管道汇聚于主管道；所述培养基第一进液微管道为两个对称的进液微管道，宽度为20 ~ 100 μm，作为培养基、生化因子/药物进液微管道，为细胞培养区提供培养基，形成生化因子/药物浓度梯度，所述第二进液微管道宽度为50 ~ 300 μm，用于输入构建细胞微环境所需的生化因子和基质细胞。
6.根据权利要求1所述的细胞迁移用微流控芯片，其特征在于，所述细胞培养区为宽为200 ~ 1000 μm的弧形微管道，分布于主管道两侧，用于细胞的接种和培养；所述细胞迁移区为连接主管道与其两侧细胞培养区的多排平行细胞迁移微管道组成，细胞迁移微管道宽度为20 ~ 100 μm，细胞迁移微管道长度不一，以主管道为轴呈对称分布，长度为200 ~3000 μm，每排细胞迁移管道间隔50 ~ 200 μm，用于细胞的迁移；所述主管道宽度为400 ~1000 μm，用于生化因子/药物浓度梯度的形成和细胞微环境的构建。
7.根据权利要求1所述的细胞迁移用微流控芯片，其特征在于，所述金字塔形网络结构、细胞培养区、细胞迁移区、主管道和第一进液微管道、第二进液微管道高度相同，为30 ~150 μm。
8.根据权利要求1所述的细胞迁移用微流控芯片，其特征在于，所述第一微阀，第二微阀，第三微阀，第四微阀，第五微阀结构相同，分别位于第二进液微管道、细胞迁移区与主管道衔接处、主管道与金字塔形网络结构衔接处、主管道与第二进液微管道衔接处、细胞迁移区与细胞培养区衔接处正下方；每个微阀为末端封闭管道结构，宽为50 ~ 200 μm。
9.根据权利要求1所述的细胞迁移用微流控芯片，其特征在于，所述第一微阀，第二微阀，第三微阀，第四微阀，第五微阀为气动微阀，工作原理是压力为1 ~ 20 psi的压缩气体进入微阀，驱动微阀膨胀变形，挤压位于其正上方的微管道，实现液体流动方向的有效控制；所述第一微阀，第二微阀，第三微阀，第四微阀，第五微阀分别用于对流动层细胞、培养基和生化因子/药物、构建细胞微环境所需生化因子和基质细胞的输入进行时间和空间的控制。
10.一种权利要求1所述细胞迁移用微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，将设计好的流动层和控制层结构制成光掩模；
第二步，将光刻胶涂膜于硅片，进行紫外曝光和显影，制得流动层和控制层芯片模板；
第三步，将聚二甲基硅氧烷或其他已知的弹性高分子材料覆盖于流动层和控制层模板表面，80 ℃烘烤固化10 ~ 60 min，在显微镜下将流动层和控制层校对粘合；
第四步，将聚二甲基硅氧烷或其他已知的弹性高分子材料涂膜于玻璃层表面，80 ℃烘烤固化5 ~ 20 min，形成薄膜层3；
第五步，将粘合好的流动层与控制层封装于涂有薄膜层的玻璃层上，制成微流控芯片。
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