KR101201939B1 - 마이크로유체 어레이 플랫폼 및 이의 제조방법 - Google Patents

마이크로유체 어레이 플랫폼 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101201939B1
KR101201939B1 KR20100073552A KR20100073552A KR101201939B1 KR 101201939 B1 KR101201939 B1 KR 101201939B1 KR 20100073552 A KR20100073552 A KR 20100073552A KR 20100073552 A KR20100073552 A KR 20100073552A KR 101201939 B1 KR101201939 B1 KR 101201939B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell culture
microwell
array platform
microfluidic array
poly
Prior art date
Application number
KR20100073552A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120011609A (ko
Inventor
이상훈
에드워드 강
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to KR20100073552A priority Critical patent/KR101201939B1/ko
Publication of KR20120011609A publication Critical patent/KR20120011609A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101201939B1 publication Critical patent/KR101201939B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 마이크로유체 어레이 플랫폼 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명에 따른 마이크로유체 어레이 플랫폼은 1) 오목한 반구 형태의 마이크로웰(microwell), 및 2) 상기 마이크로웰 상에 구비되는 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버를 포함한다. 본 발명에 따른 마이크로유체 어레이 플랫폼은 하부층의 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내에서 형성된 배아체가 마이크로유체 어레이 플랫폼의 반전에 따라 상부층의 평평한 실린더 세포 배양 챔버로 자동으로 재배치되는 장점이 있다. 따라서, 배아체 형성 및 배아체 재배치가 종래의 배아체 배양방법의 문제점으로 지적되던 피펫 등을 이용한 수동적 조작 없이 단일 마이크로유체 장치의 내부에서 동시에 조절될 수 있다.

Description

마이크로유체 어레이 플랫폼 및 이의 제조방법{MICROFLUIDIC PLATFORM AND PREPARATION METHOD OF THE SAME}
본 발명은 마이크로유체 어레이 플랫폼 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 배아체의 크기를 조절하여 형성할 수 있고, 형성된 배아체를 성장, 분화시킬 수 있는 세포 배양 챔버로 자동적으로 재배치할 수 있는 마이크로유체 어레이 플랫폼 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
배아 줄기 세포는 자기재생(self-renew) 할 수 있고, 다양한 세포 형태로 분화될 수 있다. 무제한적인 다능성(pluripotency) 및 분화성의 잠재력에 기인하여, ES 세포는 재생 의학 및 세포 기판 치료에 있어서 매우 큰 관심을 받고 있다.
일반적으로, ES 세포는 배아체라 불리고 3개의 배엽으로 구성되는 세포 집합체를 자발적으로 형성한다. 시험관 내에서 배아체를 발생시키고 조절하기 위하여, 다양한 마이크로엔지니어링적 접근이 시도되고 있다. 예를 들면, 폴리(에틸렌 글리콜)(poly(ethylene glycol), PEG) 마이크로웰 어레이는 동질의 방식(homogeneous manner)으로 배아체를 발생시키는 데에 사용된다. 이러한 배아체는 형성된 후, ES 세포로부터 유도되는 내피세포(endothelial cell)의 배아체 크기 의존성을 연구하기 위하여 마트리젤(matrigel) 기판 상에 재배치될 수 있다. 그러나, 상기 PEG 마이크로웰 어레이 시스템은 추가적인 배아체 분화 유도 전에, 배아체를 수득하고 재배치하기 위하여 피펫을 이용한 수동 조작이 필요하다는 문제점이 있다.
한편, 배아체는 멤브레인 기반의 마이크로유체 플랫폼을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 마이크로유체 플랫폼은 배아체의 크기 조절에 대하여 큰 잠재력을 보유하나, 배아체를 수득할 수는 없다는 문제점이 있다. 이러한 접근 또한 배아체를 수득하고 이들을 라미닌(laminin) 기판에 재배치하기 위한 피펫이 필요하다는 문제점이 있다.
상기와 같이, 피펫을 이용하여 형성된 배아체를 수득하고 재배치하는 방법은, 피펫의 개구가 배아체의 크기와 거의 유사하기 때문에 피펫을 통한 유출은 배아체에 전단응력을 가하게 되고, 이에 따라 피펫팅이 부정확하면 배아체의 손상율이 커지게 된다.
따라서, 당 기술분야에서는 크기가 조절된 배아체를 형성할 수 있고, 피펫 등의 수동적인 조작 없이 형성된 배아체의 성장, 분화 등을 위하여 배아체를 재배치할 수 있는 장치, 방법 등에 대한 연구가 필요하다.
본 발명은 크기가 조절된 배아체를 형성할 수 있고, 피펫 등의 수동적인 조작 없이 형성된 배아체의 성장, 분화 등을 위하여 배아체를 재배치할 수 있는 마이크로유체(microfluidic) 어레이 플랫폼 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
이에 본 발명은,
1) 오목한 반구 형태의 마이크로웰(microwell), 및
2) 상기 마이크로웰 상에 구비되는 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버
를 포함하는 마이크로유체(microfluidic) 어레이 플랫폼을 제공한다.
또한, 본 발명은
a) 채널이 형성된 베이스 몰드 위에 폴리(디메틸실록산) 멤브레인을 결합시키고, 음압(negative pressure)을 가하여 상기 폴리(디메틸실록산) 멤브레인을 하부로 오목한 반구 형태로 변형시키는 단계,
b) 상기 오목한 반구 형태로 변형된 폴리(디메틸실록산) 멤브레인 상에 포토레지스트를 코팅하고, 광가교시킨 후, 분리하여 오목한 반구 형태의 마이크로웰용 마스터 몰드를 제조하는 단계,
c) 채널이 형성된 베이스 몰드 위에 폴리(디메틸실록산) 멤브레인을 결합시키고, 음압(negative pressure)을 가하여 상기 폴리(디메틸실록산) 멤브레인을 하부로 평평한 실린더 형태로 변형시키는 단계,
d) 상기 평평한 실린더 형태로 변형된 폴리(디메틸실록산) 멤브레인 상에 포토레지스트를 코팅하고, 광가교시킨 후, 분리하여 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버용 마스터 몰드를 제조하는 단계, 및
e) 상기 c) 및 d) 단계의 마스터 몰드로부터 오목한 반구 형태의 마이크로웰 및 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버를 각각 제조하고, 이를 플라즈마 처리공정을 이용하여 결합시키는 단계
를 포함하는 마이크로유체 어레이 플랫폼의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 오목한 반구 형태의 마이크로웰(microwell), 및 상기 마이크로웰 상에 구비되는 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버를 포함하는 마이크로유체(microfluidic) 어레이 플랫폼을 준비하는 단계,
2) 상기 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내에 줄기세포를 포함하는 배양액을 투입하여 배아체를 형성하는 단계,
3) 상기 마이크로유체 어레이 플랫폼을 뒤집은 후, 상기 2) 단계에서 형성된 배아체를 상기 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버로 재배치하는 단계, 및
4) 상기 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버 내에 배양액을 투입하여 배아체를 분화시키는 단계
를 포함하는 배아체의 배양방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로유체 어레이 플랫폼을 포함하는 랩온어칩(lab on a chip)을 제공한다.
본 발명에 따른 마이크로유체 어레이 플랫폼은 1) 오목한 반구 형태의 마이크로웰(microwell), 및 2) 상기 마이크로웰 상에 구비되는 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버를 포함한다. 본 발명에 따른 마이크로유체 어레이 플랫폼은 하부층의 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내에서 형성된 배아체가 마이크로유체 어레이 플랫폼의 반전에 따라 상부층의 평평한 실린더 세포 배양 챔버로 자동으로 재배치되는 장점이 있다. 따라서, 배아체 형성 및 배아체 재배치가 종래의 배아체 배양방법의 문제점으로 지적되던 피펫 등을 이용한 수동적 조작 없이 단일 마이크로유체 장치의 내부에서 동시에 조절될 수 있다. 또한, 시간에 따라 고정되는 세포 개수를 조절할 수 있기 때문에 형성되는 배아체의 크기를 원하는 대로 다양하게 조절할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일구체예에 따른 다층의 마이크로유체 어레이 플랫폼을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일구체예로서 오목한 반구 형태의 마이크로웰(너비: 500㎛, 깊이: 250㎛) 내 도킹된 세포수를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일구체예로서 오목한 반구 형태의 마이크로웰(너비: 500㎛, 깊이: 150㎛) 내 도킹된 세포수를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일구체예로서 오목한 반구 형태의 마이크로웰(너비: 500㎛, 깊이: 250㎛) 내 세포수에 대한 컴퓨터 시뮬레이션 분석결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일구체예로서 오목한 반구 형태의 마이크로웰(너비: 500㎛, 깊이: 150㎛) 내 세포수에 대한 컴퓨터 시뮬레이션 분석결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일구체예로서 다층의 마이크로유체 장치 내 배아체 형성 및 분화를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일구체예로서 실린더형 마이크로웰 내 도킹된 세포수를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일구체예로서 실린더형 마이크로웰 내 세포수에 대한 컴퓨터 시뮬레이션 분석결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일구체예로서 오목한 반구 형태 및 실린더형 마이크로웰 내 유선 패턴 및 속도 분포를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일구체예로서 오목한 반구 형태의 마이크로웰 및 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버의 제조를 위한 마스터 금형의 제조방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에 따른 마이크로유체 어레이 플랫폼의 일구체예는 1) 오목한 반구 형태의 마이크로웰(microwell), 및 2) 상기 마이크로웰 상에 구비되는 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버를 포함한다.
본 발명에 따른 마이크로유체 어레이 플랫폼에 있어서, 상기 1) 마이크로웰의 너비는 400 ~ 600㎛ 이고, 반구 형태의 오목한 깊이는 100 ~ 300㎛ 인 것이 바람직하나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 마이크로유체 어레이 플랫폼에 있어서, 상기 1) 마이크로웰 및 2) 세포 배양 챔버는 폴리(디메틸실록산)(poly(dimethylsiloxane), PDMS)을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 마이크로유체 어레이 플랫폼에 있어서, 상기 2) 세포 배양 챔버는 보다 균일한 배아체를 형성 및 배양하기 위하여 폴리-L-리신(poly-L-lysine, PLL), 라미닌(laminin) 및 산소 플라즈마로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 표면 처리될 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로유체 어레이 플랫폼에 있어서, 상기 2) 세포 배양 챔버의 너비는 1.5 ~ 2mm 이고, 깊이는 300 ~ 500㎛ 인 것이 바람직하나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 마이크로유체 어레이 플랫폼은 배아 줄기 세포(embryonic stem cells, ES 세포)를 배양하고 균일한 크기의 배아체(embryoid body, EB) 형성을 조절하기 위한 오목한 반구 형태의 마이크로웰(microwells)과, 위의 형성된 배아체(embryoid body, EB)를 특정 세포로 분화시키기 위한 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버를 포함한다. 본 발명에 따른 마이크로유체 어레이 플랫폼은 하부층의 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내에서 배양된 배아체가 다층의 마이크로유체 어레이 플랫폼의 반전에 따라 상부층의 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버로 자동으로 재배치되는 장점이 있다. 따라서, 배아체 형성 및 배아체 재배치가 종래의 배아체 배양방법의 문제점으로 지적되던 피펫 기반의 수동적인 조작 없이 단일 마이크로유체 장치의 내부에서 동시에 조절될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 마이크로유체 어레이 플랫폼의 제조방법의 일구체예는 a) 채널이 형성된 베이스 몰드 위에 폴리(디메틸실록산) 멤브레인을 결합시키고, 음압(negative pressure)을 가하여 상기 폴리(디메틸실록산) 멤브레인을 하부로 오목한 반구 형태로 변형시키는 단계, b) 상기 오목한 반구 형태로 변형된 폴리(디메틸실록산) 멤브레인 상에 포토레지스트를 코팅하고, 광가교시킨 후, 분리하여 오목한 반구 형태의 마이크로웰용 마스터 몰드를 제조하는 단계, c) 채널이 형성된 베이스 몰드 위에 폴리(디메틸실록산) 멤브레인을 결합시키고, 음압(negative pressure)을 가하여 상기 폴리(디메틸실록산) 멤브레인을 하부로 평평한 실린더 형태로 변형시키는 단계, d) 상기 평평한 실린더 형태로 변형된 폴리(디메틸실록산) 멤브레인 상에 포토레지스트를 코팅하고, 광가교시킨 후, 분리하여 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버용 마스터 몰드를 제조하는 단계, 및 e) 상기 c) 및 d) 단계의 마스터 몰드로부터 오목한 반구 형태의 마이크로웰 및 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버를 각각 제조하고, 이를 플라즈마 처리공정을 이용하여 결합시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 마이크로유체 어레이 플랫폼의 제조방법에 있어서, 상기 b) 및 d) 단계의 포토레지스트는 하기 화학식 1로 표시되는 SU-8을 포함할 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure 112010049248271-pat00001
본 발명에 따른 마이크로유체 어레이 플랫폼의 제조방법에 있어서, 상기 오목한 반구 형태의 마이크로웰용 마스터 몰드 및 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버용 마스터 몰드의 제조방법의 일구체예를 하기 도 10에 나타내었다.
또한, 본 발명에 따른 배아체의 배양방법은 1) 오목한 반구 형태의 마이크로웰(microwell), 및 상기 마이크로웰 상에 구비되는 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버를 포함하는 마이크로유체(microfluidic) 어레이 플랫폼을 준비하는 단계, 2) 상기 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내에 줄기세포를 포함하는 배양액을 투입하여 배아체를 형성하는 단계, 3) 상기 마이크로유체 어레이 플랫폼을 뒤집은 후, 상기 2) 단계에서 형성된 배아체를 상기 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버로 재배치하는 단계, 및 4) 상기 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버 내에 배양액을 투입하여 배아체를 분화시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 배아체의 배양방법에 있어서, 상기 2) 단계의 줄기세포를 포함하는 배양액의 유량은 0.02 ~ 0.05 ml/h 인 것이 바람직하나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 마이크로유체 어레이 플랫폼은 하부층의 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내에서 배양된 배아체가 다층의 마이크로유체 어레이 플랫폼의 반전에 따라 상부층의 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버로 자동으로 재배치되는 장점이 있다. 따라서, 배아체 형성 및 배아체 재배치가 종래의 배아체 배양방법의 문제점으로 지적되던 피펫 기반의 수동적인 조작 없이 단일 마이크로유체 장치의 내부에서 동시에 조절될 수 있다. 또한, 시간에 따라 고정되는 세포 개수를 조절할 수 있기 때문에 형성되는 배아체의 크기를 원하는 대로 다양하게 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로유체 어레이 플랫폼을 포함하는 랩온어칩(lab on a chip)을 제공한다.
그러므로, 본 발명에 따른 다층의 마이크로유체 어레이 플랫폼은 배아체로부터 유도되는 배아 줄기 세포의 분화에 대한 연구에 이용될 수 있다. 또한, 마이크로유체 장치를 온 칩 밸브 시스템(on-chip valve systems)에 결합시킴으로써, 팩터를 해석할 수 있는 개별적인 주소지정을 정확하게 조절할 수 있고, 이러한 플랫폼은 대량 방식에 있어서 세포 거동의 조절에 이용될 수 있다. 온 칩 밸브 시스템에 결합된 다층의 마이크로유체 어레이 플랫폼은 팩터 해석을 각각의 마이크로웰에 전달하고, 대량의 약물 검사를 수행하는 데에 사용될 수 있고, 이러한 플랫폼은 줄기 세포의 운명을 관리하고 마이크로환경 내에서 세포 해석 팩터 상호작용을 조절하는 도구의 제조에 사용될 수 있다.
하기 도 1은 본 발명의 일구체예로서, 균일한 크기의 배아체의 형성을 위한 오목한 반구 형태의 마이크로웰(하부층) 및 배아체의 재배치를 위한 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버(상부층)를 포함하는 3 × 3 다층의 마이크로유체 어레이 플랫폼을 나타낸 도이다.
보다 구체적으로 도 1의 a는 하부층에서 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내의 세포 도킹(docking)을 개략적으로 나타낸 것이고, 도 1의 b는 배지를 투입한 다층의 마이크로유체 어레이 플랫폼의 마이크로웰 내의 배아체 형성을 개략적으로 나타낸 것이다. 도 1의 c는 마이크로유체 어레이 플랫폼을 뒤집은 후, 오목한 반구 형태의 마이크로웰로부터 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버로 재배치된 배아체를 나타낸 것이다.
종래의 마이크로엔지니어링 방법과 관련된 피펫 기반의 수동적 세포 조작공정의 제한을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 균일한 크기의 배아체의 형성을 위한 오목한 반구 형태의 마이크로웰(하부층) 및 배아체의 재배치를 위한 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버(상부층)를 포함하는 3 × 3 다층의 PDMS 마이크로유체 어레이 플랫폼을 개발하였다(도 1 참조). 세포는 시린지 펌프(syringe pump)를 이용하여 마이크로유체 채널 내로 분산되고, 하부층의 오목한 반구 형태의 마이크로웰(너비: 500㎛, 깊이: 150 ~ 250㎛) 내에 들어가며, 그 결과 균일한 크기의 배아체가 형성된다(도 1의 a 및 b 참조). 오목한 반구 형태의 마이크로웰로부터 배아체를 얻기 위하여 마이크로유체 장치를 뒤집고, 얻은 배아체를 중력에 의하여 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버(너비: 2mm, 깊이: 500㎛)로 자발적으로 재배치하였다(도 1의 c 참조). 상기 플랫폼은 어떠한 피펫 기반의 수동적 세포 조작을 요구하지 않고, 배아체는 어떠한 종래의 물리적 및 기계적 조작 없이 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버로 재배치된다. 신경 시조 세포 및 뉴런 분화를 유도하기 위하여, 매체는 삼투 펌프(osmotic pump)를 이용하여 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버로 직각으로 쏟아진다. 도 1의 d는 3 × 3 다층의 마이크로유체 어레이의 상의 명암도 이미지를 나타낸 것이고, 도 1의 e는 오목한 반구 형태의 마이크로웰 및 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버의 단면 스캔 전자현미경(FE-SEM, JEOL 4701F, JAPAN) 이미지를 나타낸 것이다. 유체해석 모델(Computational fluidic dynamic, CFD) 시뮬레이션은 또한 오목한 반구 형태의 마이크로웰의 표면에 대하여 균일한 전단응력(shear stress)을 나타낸다(도 1의 f 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 > 다층의 마이크로유체 어레이 플랫폼( microfluidic array platform )의 제조
오목한 반구 형태의 마이크로웰 및 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버를 포함하는 다층의 마이크로유체 어레이 플랫폼을 박막의 폴리(디메틸실록산)(poly(dimethylsiloxane), PDMS) 멤브레인과 음압(negative pressure)을 이용하여 제조하였다(도 1 참조).
박막의 PDMS 멤브레인(두께: 10㎛)을 산소 플라즈마를 이용하여 베이스 마이크로채널의 상부에 결합시켰다. PDMS 베이스 마이크로채널을 지지하는 아크릴계 챔버의 홀을 통하여 진공펌프(40 ~ 50kPa의 음압)를 이용하여 음압(negative pressure)에서 제조하였고, 그 결과로서 깊은 마이크로웰(너비: 500㎛, 깊이: 250㎛)을 제조하였다. PDMS 멤브레인이 오목한 반구 형태를 갖추었을 때, SU-8 포토레지스트 용액으로 코팅하고, 1mm 두께의 글래스 슬라이드에 의하여 평평하게 하였다. 상기 SU-8 포토레지스트를 광가교시키기 위하여, 표면을 365nm의 자외선(강도: 6.8 mW/cm2)으로 10분 동안 조사하고, SU-8 층을 PDMS 멤브레인으로부터 분리하였다.
이와 유사하게, 얕은 오목한 반구 형태의 마이크로웰(너비: 500㎛, 깊이: 150㎛)을 20 ~ 30kPa의 음압을 이용하여 제조하였다. 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버는 베이스 마이크로채널의 깊이를 조절하여 제조하였고, 이는 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버의 반지름보다 작은 깊이를 가진다(도 1의 b 참조). 멤브레인을 베이스 마이크로채널의 상부에 결합시키고, 40 ~ 50kPa의 음압하에서 공기를 아크릴계 챔버 홀을 통하여 제거하였다.
최종적으로, 오목한 반구 형태의 마이크로웰 및 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버는 상기 제조한 두 개의 마스터 금형을 이용하여 제조하였다. 매체의 살포 및 세포 도킹을 위한 각각의 층의 주입구 및 배출구는 펀치하여 제조하였다. 상기 오목한 반구 형태의 마이크로웰 및 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버의 제조를 위한 마스터 금형의 제조방법의 일구체예는 하기 도 10에 나타내었다.
< 실험예 >
1) PDMS 표면 상태
상기한 PDMS 표면 상태는 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내에서 다양한 표면 처리, 예컨대, 폴리-L-리신(poly-L-lysine, PLL), 라미닌(laminin), 산소 플라즈마 등의 처리에 의하여 균일한 배아체를 생성하는데 최적화 되었다(표 1 참조).
[표 1]
Figure 112010049248271-pat00002
r: 상온
plasma: 산소 플라즈마 처리
PLL: 폴리-L-리신(poly-L-lysine)
+: 양의 효과
-: 음의 효과
2) 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내 세포 도킹 및 컴퓨터 시뮬레이션
마이크로채널 내 유체 흐름 곡선은 컴퓨터 유체 역학(computational fluid dynamics, COMSOL, MA)에 의하여 분석하였다. 마이크로유체 채널 내에서는 유체 패턴이 층류로 나타난 반면에, 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내에서 유체 패턴은 채널 깊이에 관계없이 곡선으로 나타났다. 낮은 매체 속도에서, 시드 세포는 중력에 의하여 마이크로웰의 하부로 이동하려는 경향이 있고, 마이크로웰의 하부 상의 유선(streamline)을 따라서 이동하게 된다. 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내에서, 세포는 하부에서 중앙의 유선을 따라서 이동한다. 세포는 유체 속도를 조절함으로써 균일하게 살포할 수 있다. 빠른 유체 속도에서는, 낮은 유량에서 세포가 쉽게 마이크로웰의 하부로 이동하는 것과는 달리 세포가 중력에 영향받지 않고 마이크로웰로부터 제거된다. 세포 도킹은 105개의 세포를 함유하는 배지(culture medium)를 비대칭의 채널에 0.02 to 0.1 mL/h의 유량으로 하나의 주입구에서 세 개의 반구형 채널로 분배하여 살포함으로서 분석하였다. 유체의 속도는 시린지 펌프를 이용하여 조절하였고, 세포수는 9개의 마이크로웰 내에서 측정되었다. 실험결과는 2D 컴퓨터 시뮬레이션을 통하여 비교하였다.
3) 다층의 마이크로유체 어레이 플랫폼 내 세포 살포
마이크로유체 장치는 오목한 반구 형태의 마이크로웰 및 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버를 포함하는 두 개의 PDMS 층으로 구성되었다. 각각의 층은 세포 도킹 및 배아체 분화를 평가하는 데에 이용되었다. 5 × 106 cells/mL의 농도의 세포를 세포 주입구를 통하여 투입하고, 시린지 펌프를 이용하여 3분 동안 0.05 mL/h의 평균 유량으로 살포하였다. 그 후, 삼투 펌프를 이용하여 0.1M 농도의 폴리(에틸렌 글리콜)(poly(ethylene glycol, PEG) 하에서 배지(culture medium)를 주입하였다.
다층의 마이크로유체 장치의 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내 균일한 세포의 도킹(docking)은 균일한 배아체 형성에 있어서 중요하다. 본 발명자들은 이러한 균일한 세포 도킹은 유체 유량의 조절에 의하여 조절될 수 있고, 오목한 반구 형태의 마이크로웰은 세포 도킹 능력이 실린더형보다 우수하다고 가정하였다. 따라서, 시린지 펌프로 유량 조건을 최적화하였고, 이러한 최적화된 유량은 CFD 분석에 의하여 확인할 수 있었다(도 2 내지 도 5 참조).
낮은 유량(0.02 mL/h)에서, 약 50%의 세포는 오목한 반구 형태의 마이크로웰(너비: 500㎛, 깊이: 250㎛) 내 보다 깊게 도킹하였다(도 2의 well number 1, 4 및 7 참조). 그러나, 높은 유량(0.1 mL/h)에서는 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내 웰당 8 ~ 12의 균일한 세포 도킹을 허용하였다. 이러한 차이는 유선형 패턴 속도에 기인한 것이고, 낮은 유량은 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내에서 얕은 유선형 패턴으로 나타나게 된다. 세포는 높은 유량에서 유선형 곡선의 속도로서 보다 쉽게 노출되고, 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내에서 균일한 세포 도킹을 허용한다.
또한, 얕은 마이크로웰(너비: 500㎛, 깊이: 150㎛) 내에서 세포 도킹을 관찰하였다(도 3 참조). 유량에 관계없이 깊은 마이크로웰보다 얕은 마이크로웰에서 보다 적은 세포가 도킹되었다. 그 결과로, 빠른 유체 속도 및 쉐어 방어성이 높은 마이크로웰이 다층의 마이크로유체 어레이 플랫폼 내에서 높은 세포 도킹 효과 및 보다 균일한 세포수를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
도 4 및 도 5는 세포수에 대한 마이크로입자 기반 컴퓨터 시뮬레이션 분석결과를 나타낸 것이다. 시뮬레이션 분석을 위하여, 세포로서 동일한 크기 및 밀도를 가지는 마이크로입자를 이용하였다. 깊은 마이크로웰 내 도킹되는 세포 수(도 4 참조)와 얕은 마이크로웰 내 도킹되는 세포 수(도 5 참조)는 유량의 감소에 따라 증가하였고, 빠른 유체 속도에서 세포 수는 보다 균일하였다.
마이크로웰의 모양이 세포 도킹 효율 및 균일한 세포 도킹을 조절할 수 있음을 평가하기 위하여, 실린더형 마이크로웰 내 세포 도킹을 분석하였다(도 7 내지 도 9 참조). 이러한 실린더형 마이크로웰에서, 대부분의 셀은 가장자리에 도킹되었고, 이는 불균일한 전단응력과 낮은 침투 속도 때문이다. 실린더형 마이크로웰 내 도킹된 세포수는 유량의 증가에 따라 증가하였고, 비균일한 세포 도킹으로서 나타났다(도 7 및 도 8 참조). 실린더형 마이크로웰의 입구 근처에서, 대부분의 세포는 쉽게 저지되고, 가장자리에 축적되었다(도 7의 well number 1, 4 및 7 참조). 이와 대조적으로, 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내 도킹된 세포수는 유량의 증가에 따라 감소하고, 균일한 세포 도킹이 이루어진다. 이는 유선형의 속도 패턴이 이러한 반구형의 마이크로웰과 유사하기 때문이고, 이는 빠른 유체 속도에 의하여 세포가 쉽게 제거될 수 있음을 보여준다. 따라서, 오목한 반구 형태의 마이크로웰은 실린더형의 마이크로웰과 비교하였을 때 보다 균일한 세포 도킹을 조절할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 시간에 따라 고정되는 세포 개수를 조절할 수 있기 때문에 형성되는 배아체의 크기를 원하는 대로 다양하게 조절할 수 있다.
4) 배아 줄기 세포 배양
쥐의 배아 줄기 세포로부터 유도된 배아체를 다층의 마이크로유체 어레이 플랫폼의 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내에서 4일 동안 배양하고, 폴리-L-리신(PLL, 20 μg/mL) 및 라미닌(5 μg/mL)으로 처리된 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버로 재배치 하였다. 배아체로부터 신경 시조 세포와 뉴런 분화를 유도하기 위하여, 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버로 재배치된 배아체를 삼투 펌프를 이용한 ITSFn(insulin/transferring/selenium/fibronectin) 배지로 8일 동안 추가로 배양하였다.
5) 면역 세포 화학( Immunocytochemistry )
평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버에서 12일 동안 배양된 배아체로부터 유도된 신경 시조 세포와 뉴런을 20분 동안 4%의 포름알데히드를 이용하여 고정시키고, 20분 동안 0.1%의 Triton-X100를 이용하여 투과성으로 만들었다. 세포를 3%의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)으로 차단하고, 신경세포필라멘트(neurofilaments, 1 : 1,000) 및 네스틴(nestin, 1 : 100)에 대한 일차항체를 이용하여 4℃에서 밤새 배양한 후, 이차항체를 이용하여 1.5시간 동안 배양하였다. 형광 전자현미경(Axio observer. A1, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 형광 이미지를 얻었다.
균일한 세포 도킹을 위한 유량 및 오목한 반구 형태의 마이크로웰의 깊이를 최적화한 후에, 다층의 마이크로유체 장치 내에서 배아체로부터 유도된 분화를 연구하였다.
오목한 반구 형태의 마이크로웰 내에서 균일한 배아체의 형성을 관찰한 결과, 세포가 균일하게 도킹되고(도 6의 a 참조), 배아체의 지름은 250 ~ 450㎛로 증가하였다(도 6의 b 참조). 활성분석법(live/dead assays)을 이용하여 실험한 결과, 3일 동안 상기 마이크로웰 내 배양된 대부분의 세포는 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버로 재배치를 수행한 후에도 생존한 상태로 남아있었고(도 6의 c 참조), 이는 배아체의 재배치를 위해서 다층의 마이크로유체 플랫폼을 뒤집는 것은 세포에 악영향을 미치지 않음을 나타낸다.
또한, 다층의 마이크로유체 장치 내에서 배아체로부터 유도된 신경 시조 세포 및 뉴런 분화를 평가하였다(도 6의 d 참조). 신경 시조 세포와 뉴런 분화를 유도하기 위하여, 다층의 마이크로유체 장치를 뒤집어서 마이크로웰로부터 배아체를 분리하고 이를 PLL과 라미닌으로 사전처리된 세포 배양 챔버로 자동적으로 재배치되도록 하였다. 배아체로부터 유도된 신경 시조 세포와 뉴런이 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버 내에서 단일 세포 단일층으로 형성되었다.
결론적으로, 본 발명은 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내에서 제어방식으로 균일한 배아체를 생성시킬 수 있고, 배아체를 단일 마이크로유체 장치 내부의 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버로 어떠한 피펫 기반의 수동적 세포 조작의 필요 없이 자동적으로 재배치할 수 있다.
그러므로, 본 발명에 따른 다층의 마이크로유체 어레이 플랫폼은 배아체로부터 유도되는 배아 줄기 세포의 분화에 대한 연구에 이용될 수 있다. 또한, 마이크로유체 장치를 온 칩 밸브 시스템(on-chip valve systems)에 결합시킴으로써, 팩터를 해석할 수 있는 개별적인 주소지정을 정확하게 조절할 수 있고, 이러한 플랫폼은 대량 방식에 있어서 세포 거동의 조절에 이용될 수 있다. 온 칩 밸브 시스템에 결합된 다층의 마이크로유체 어레이 플랫폼은 팩터 해석을 각각의 마이크로웰에 전달하고, 대량의 약물 검사를 수행하는 데에 사용될 수 있고, 이러한 플랫폼은 줄기 세포의 운명을 관리하고 마이크로환경 내에서 세포 해석 팩터 상호작용을 조절하는 도구의 제조에 사용될 수 있다.

Claims (10)

1) 오목한 반구 형태의 마이크로웰(microwell), 및
2) 상기 마이크로웰 상에 구비되는 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버
를 포함하는 마이크로유체(microfluidic) 어레이 플랫폼.
제1항에 있어서,
상기 1) 마이크로웰의 너비는 400 ~ 600㎛ 이고, 반구 형태의 오목한 깊이는 100 ~ 300㎛ 인 것을 특징으로 하는 마이크로유체 어레이 플랫폼.
제1항에 있어서,
상기 1) 마이크로웰 및 2) 세포 배양 챔버는 폴리(디메틸실록산)(poly(dimethylsiloxane), PDMS)을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로유체 어레이 플랫폼.
제1항에 있어서,
상기 2) 세포 배양 챔버는 폴리-L-리신(poly-L-lysine, PLL), 라미닌(laminin) 및 산소 플라즈마로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 표면 처리되는 것을 특징으로 하는 마이크로유체 어레이 플랫폼.
제1항에 있어서,
상기 2) 세포 배양 챔버의 너비는 1.5 ~ 2mm 이고, 깊이는 300 ~ 500㎛ 인 것을 특징으로 하는 마이크로유체 어레이 플랫폼.
a) 채널이 형성된 베이스 몰드 위에 폴리(디메틸실록산) 멤브레인을 결합시키고, 음압(negative pressure)을 가하여 상기 폴리(디메틸실록산) 멤브레인을 하부로 오목한 반구 형태로 변형시키는 단계,
b) 상기 오목한 반구 형태로 변형된 폴리(디메틸실록산) 멤브레인 상에 포토레지스트를 코팅하고, 광가교시킨 후, 분리하여 오목한 반구 형태의 마이크로웰용 마스터 몰드를 제조하는 단계,
c) 채널이 형성된 베이스 몰드 위에 폴리(디메틸실록산) 멤브레인을 결합시키고, 음압(negative pressure)을 가하여 상기 폴리(디메틸실록산) 멤브레인을 하부로 평평한 실린더 형태로 변형시키는 단계,
d) 상기 평평한 실린더 형태로 변형된 폴리(디메틸실록산) 멤브레인 상에 포토레지스트를 코팅하고, 광가교시킨 후, 분리하여 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버용 마스터 몰드를 제조하는 단계, 및
e) 상기 b) 및 d) 단계의 마스터 몰드로부터 오목한 반구 형태의 마이크로웰 및 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버를 각각 제조하고, 이를 플라즈마 처리공정을 이용하여 결합시키는 단계
를 포함하는 마이크로유체 어레이 플랫폼의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 b) 및 d) 단계의 포토레지스트는 하기 화학식 1로 표시되는 SU-8을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로유체 어레이 플랫폼의 제조방법:
[화학식 1]
Figure 112010049248271-pat00003
1) 오목한 반구 형태의 마이크로웰(microwell), 및 상기 마이크로웰 상에 구비되는 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버를 포함하는 마이크로유체(microfluidic) 어레이 플랫폼을 준비하는 단계,
2) 상기 오목한 반구 형태의 마이크로웰 내에 줄기세포를 포함하는 배양액을 투입하여 배아체를 형성하는 단계,
3) 상기 마이크로유체 어레이 플랫폼을 뒤집은 후, 상기 2) 단계에서 형성된 배아체를 상기 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버로 재배치하는 단계, 및
4) 상기 평평한 실린더 형태의 세포 배양 챔버 내에 배양액을 투입하여 배아체를 분화시키는 단계
를 포함하는 배아체의 배양방법.
제8항에 있어서,
상기 2) 단계의 줄기세포를 포함하는 배양액의 유량은 0.02 ~ 0.05 ml/h 인 것을 특징으로 하는 배아체의 배양방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 마이크로유체 어레이 플랫폼을 포함하는 랩온어칩(lab on a chip).
KR20100073552A 2010-07-29 2010-07-29 마이크로유체 어레이 플랫폼 및 이의 제조방법 KR101201939B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20100073552A KR101201939B1 (ko) 2010-07-29 2010-07-29 마이크로유체 어레이 플랫폼 및 이의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20100073552A KR101201939B1 (ko) 2010-07-29 2010-07-29 마이크로유체 어레이 플랫폼 및 이의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120011609A KR20120011609A (ko) 2012-02-08
KR101201939B1 true KR101201939B1 (ko) 2012-11-16

Family

ID=45835797

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR20100073552A KR101201939B1 (ko) 2010-07-29 2010-07-29 마이크로유체 어레이 플랫폼 및 이의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101201939B1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160103347A (ko) * 2015-02-24 2016-09-01 인제대학교 산학협력단 마이크로 공압 밸브 소자 및 그 제조방법
WO2019231265A1 (ko) * 2018-06-01 2019-12-05 주종일 3 차원 세포 배양용 미세유체칩 및 이를 이용한 3 차원 세포 배양방법
KR20200041760A (ko) * 2018-10-12 2020-04-22 인제대학교 산학협력단 공압 구동 방식의 세포 농축기, 이를 이용한 세포 농축방법, 미세유체 채널의 제조방법 및 공압 밸브의 제조방법

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107073758B (zh) * 2014-09-29 2019-05-03 微非特有限公司 微型半球阵列板的制备方法、包括微型半球阵列板的微流器件及利用微流器件的细胞集合体的培养方法
KR101899094B1 (ko) * 2017-02-09 2018-09-14 (주)아모레퍼시픽 마이크로플루이딕 디바이스
CN111218399A (zh) * 2018-11-23 2020-06-02 中国科学院大连化学物理研究所 一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片及其应用
KR102585071B1 (ko) * 2021-08-03 2023-10-04 국민대학교산학협력단 가이드 프레임, 가이드 프레임에 기반하여 형성된 마운팅 챔버, 마운팅 챔버를 이용한 제브라피쉬의 실험 환경 제공 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060292654A1 (en) 2005-06-28 2006-12-28 Inogen, S.A. Microwell plate
WO2009127647A2 (de) 2008-04-15 2009-10-22 Technische Universität Ilmenau Teilaktives mikrofluidisches system für die 3d-zellkultivierung sowie verfahren zu dessen perfusion
US20090298116A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Ye Fang Cell culture apparatus having different micro-well topography

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060292654A1 (en) 2005-06-28 2006-12-28 Inogen, S.A. Microwell plate
WO2009127647A2 (de) 2008-04-15 2009-10-22 Technische Universität Ilmenau Teilaktives mikrofluidisches system für die 3d-zellkultivierung sowie verfahren zu dessen perfusion
US20090298116A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Ye Fang Cell culture apparatus having different micro-well topography

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160103347A (ko) * 2015-02-24 2016-09-01 인제대학교 산학협력단 마이크로 공압 밸브 소자 및 그 제조방법
KR101708990B1 (ko) * 2015-02-24 2017-03-08 인제대학교 산학협력단 마이크로 공압 밸브 소자 및 그 제조방법
WO2019231265A1 (ko) * 2018-06-01 2019-12-05 주종일 3 차원 세포 배양용 미세유체칩 및 이를 이용한 3 차원 세포 배양방법
KR20200041760A (ko) * 2018-10-12 2020-04-22 인제대학교 산학협력단 공압 구동 방식의 세포 농축기, 이를 이용한 세포 농축방법, 미세유체 채널의 제조방법 및 공압 밸브의 제조방법
KR102127574B1 (ko) 2018-10-12 2020-06-29 인제대학교 산학협력단 공압 구동 방식의 세포 농축기, 이를 이용한 세포 농축방법, 미세유체 채널의 제조방법 및 공압 밸브의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20120011609A (ko) 2012-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101201939B1 (ko) 마이크로유체 어레이 플랫폼 및 이의 제조방법
CN105861309B (zh) 一种超疏水微坑阵列芯片及其制备方法与应用
CN107109341B (zh) 用于生成和培养3d细胞聚集体的方法和装置
Zhang et al. Applications of microfluidics in stem cell biology
Lin et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture
MichelleáGrandin Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells
Selimović et al. Microfabricated polyester conical microwells for cell culture applications
US20120064627A1 (en) Apparatus and method for culturing stem cells
US20140093962A1 (en) Non-adherent cell support and manufacturing method
Kim et al. Microwell fabrication methods and applications for cellular studies
Sun et al. Inkjet-printing patterned chip on sticky superhydrophobic surface for high-efficiency single-cell array trapping and real-time observation of cellular apoptosis
CN107881106B (zh) 一种阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片及其制备方法和应用
Yamada et al. Transient microfluidic compartmentalization using actionable microfilaments for biochemical assays, cell culture and organs-on-chip
Chang et al. Multilayer architecture microfluidic network array for combinatorial drug testing on 3D-cultured cells
Sakai et al. Detachably assembled microfluidic device for perfusion culture and post‐culture analysis of a spheroid array
Lee et al. Membrane-bottomed microwell array added to Transwell insert to facilitate non-contact co-culture of spermatogonial stem cell and STO feeder cell
US20200095526A1 (en) Production of cellular spheroids
Kang et al. Development of a multi-layer microfluidic array chip to culture and replate uniform-sized embryoid bodies without manual cell retrieval
He et al. Fabrication of micro-cages and caged tumor spheroids for microfluidic chip-based assays
US20150368599A1 (en) Design and hot embossing of macro and micro features with high resolution microscopy access
TWI588256B (zh) 單細胞擷取與培養之裝置與方法
US20210339242A1 (en) Microfluidic device with embedded cell culture chambers for high throughput biological assays
Hori et al. A three-dimensional cell culture method with a micromesh sheet and its application to hepatic cells
JP5943456B2 (ja) 生物学的対象物の分化制御方法及びその装置
Choi et al. Fabrication of microengineered templates and their applications into micropatterned cell culture

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161025

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171030

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181025

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191017

Year of fee payment: 8