CN107881106B - 一种阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

一种阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片，该芯片包括自上而下依次封接的流动层、控制层、薄膜层和玻璃层；所述流动层由阵列式细胞培养区、缓冲结构区、细胞接种微管道、左进液微管道、中央进液微管道和右进液微管道组成；阵列式细胞培养区上设有若干阵列式培养U型凹槽；缓冲结构区内设有若干U型微柱；控制层由若干微泵组成，微泵采用由一个入口和若干个微腔串联组成末端封闭结构。本发明可开展流体剪切力动态加载和两种以上生化因子/药物对细胞的区域化处理，以及处理细胞与未处理细胞之间的相互作用研究，突破了惯用的细胞培养与处理模式，有利于模拟不同生理或病理情况下组织中细胞的流体微环境和生化微环境。

Description

一种阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片及其制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及阵列式细胞培养微流控芯片技术领域，具体涉及一种阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片及其制备方法和应用。
背景技术
基于微流控芯片的细胞培养是生命科学研究的重要技术手段，有利于在与体内复杂体系相比简单、可控的环境中获取丰富的细胞结构与功能信息。然而，当前常用的微流控芯片实现的培养基定期更新、代谢废物及时排除的可控化细胞培养，均是在均一环境中的群体细胞培养与研究(Kim S.H.，Ahn K.，Park J.Y.，Responses of human adipose-derived stem cells to interstitial level of extremely low shear flowsregarding differentiation，morphology，and proliferation.Lab Chip，2017，DOI：10.1039/c7lc00371d)，较少能做到细胞的阵列式培养和流体剪切力动态加载，以及对某一个或某几个区域的细胞做定向的生化因子/药物处理，更难以实现在同一空间内实时观察处理细胞与未处理细胞之间的相互作用(Pang L.，Liu W.，Tian C.，et al.，Constructionof single-cell arrays and assay of cell drug resistance in an integratedmicrofluidic platform.Lab Chip，2016，16，4612-4620)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够实现阵列式细胞培养，流体剪切力动态加载和药物/生化因子对细胞的区域化处理的微流控芯片，该芯片改变了惯用的细胞培养与处理模式，发挥了微流控芯片系统功能全面性的特点。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片，该芯片包括自上而下依次封接的流动层、控制层、薄膜层和玻璃层；所述流动层由阵列式细胞培养区、缓冲结构区、细胞接种微管道、左进液微管道、中央进液微管道和右进液微管道组成，所述细胞接种微管道用于向流动层输入细胞，所述中央进液微管道、左进液微管道和右进液微管道分别作为中央的培养基进液微管道和两侧的生化因子/药物进液微管道，用于为阵列式培养的细胞提供培养基，实现流体剪切力加载和生化因子/药物区域化处理；所述阵列式细胞培养区上设有若干用于单个或数个细胞的捕获的阵列式培养U型凹槽；所述缓冲结构区内设有若干U型微柱；所述控制层由若干用于对流动层细胞、培养基和生化因子/药物的输入进行时间和空间的控制，以及细胞培养区流体剪切力的加载的微泵组成，所述微泵采用由一个入口和若干个微腔串联组成末端封闭结构，该微腔的宽w为100-400μm，长/为100-900μm。
优选地，所述微流控芯片流动层、控制层和薄膜层的材料均为聚二甲基硅氧烷，或者已知的弹性高分子材料。
优选地，所述阵列式细胞培养区上设有10-50排的U型凹槽，每排包含10-20个U型凹槽，相邻两排的U型凹槽错列排布，且相邻两排间距为25-100μm，每排内的U型凹槽的间距为25-100μm；U型凹槽的长L为25-100μm，宽W为25-100μm，由2个方形微柱和3-5个近似梯形微柱组成，梯形微柱之间的间距G为2.5-7.5μm。
优选地，所述缓冲结构区内设有2-5排的U型微柱微柱，U型微柱与U型凹槽对应设置，且其长、宽与所述U型凹槽一致。
优选地，所述左进液微管道、中央进液微管道和右进液微管道连接在一个主管道上，左进液微管道与中央进液微管道之间的夹角以及中央进液微管道与右进液微管道之间的夹角均为30-60°；所述中央进液微管道为宽度不变的直管道，宽度为50-200μm；所述左进液微管道和右进液微管道分为宽度不同的两段，入口段宽度为50-200μm，接近主管道处的宽度为10-25μm；主管道的宽度为60-250μm。
优选地，所述细胞接种微管道、左进液微管道、中央进液微管道和右进液微管道的横截面高度相同，均为30-100μm；阵列式细胞培养区和缓冲结构区的横截面高度相同，均为30-100μm。即：管道横截面的高度相同，阵列式细胞培养区和缓冲结构区的微结构横截面高度相同，且与管道横截面高度相同。
优选地，所述控制层微泵共有四个微泵结构相同，其中一个微泵位于中央进液微管道正下方，另外两个微泵分别位于左进液微管道和右进液微管道的正下方，微泵位于主管道正下方，所述微泵采用由一个入口和三个微腔串联组成末端封闭结构，三个微腔的长度比例为1∶2∶3。
优选地，所述微泵为气动微泵，使用时，压力为1-2psi的压缩气体进入微泵，驱动三个微腔依次膨胀变形，挤压位于其正上方的微管道，微泵驱动频率为1-2Hz，实现进液微管道中液体流动。
本发明还提供了上述阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
第一步，将设计好的流动层和控制层结构制成光掩模；
第二步，将光刻胶涂膜于硅片，进行紫外曝光和显影，制得流动层和控制层芯片模板；
第三步，将聚二甲基硅氧烷或其他已知的弹性高分子材料覆盖于流动层和控制层模板表面，烘烤固化，在显微镜下将流动层和控制层校对粘合；
第四步，将聚二甲基硅氧烷或其他已知的弹性高分子材料涂膜于玻璃层表面，烘烤固化；
第五步，将粘合好的流动层与控制层封装于涂有薄膜的玻璃层上，制成微流控芯片。
上述的阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片可用于单个或数个细胞的阵列式培养，以及生化因子/药物区域化作用和流体剪切力动态加载的细胞生物学研究；具体包括如下步骤：
步骤1、驱动位于主管道正下方的微泵将细胞悬液通过细胞接种微管道输入芯片，待细胞均匀分布在阵列式细胞培养区的U型凹槽后，停止驱动微泵，将芯片静置于细胞培养箱0.5-3h使细胞贴壁，待细胞贴壁后驱动中央进液微管道正下方的微泵，使培养基通过培养中央进液微管道输入阵列式细胞培养区，实现细胞培养过程中的培养基实时更新；
步骤2、根据实验需求，驱动位于中央进液微管道正下方的微泵，使培养基以0.5-20μL·min-1的速度通过中央进液微管道输入阵列式细胞培养区，实现流体剪切力加载的实时控制；
步骤3、根据实验需求，驱动微泵，分别通过中央进液微管道和左进液微管道和右进液微管道向阵列式细胞培养区输入培养基和所需生化因子/药物，生化因子/药物在阵列式细胞培养区扩散形成浓度梯度，使不同区域U型凹槽中的细胞接受不同浓度生化因子/药物的作用，从而实现细胞区域化处理的时间和空间控制；
步骤4、驱动位于中央进液微管道正下方的微泵，通过中央进液微管道向阵列式细胞培养区输入细胞形态、功能检测试剂或细胞固定液，用于流体剪切力处理或生化因子/药物区域化处理后的细胞形态功能检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的微流控芯片选用聚二甲基硅氧烷或其他弹性高分子材料，具有良好的生物兼容性、热稳定性和气体通透性，适宜细胞长期培养；透明、自发荧光微弱，适宜采用显微镜技术和荧光染色技术，实时动态观察细胞。
2、本发明的微流控芯片阵列式细胞培养区的U型凹槽，便于实现单个或数个细胞的捕获的阵列式培养。
3、本发明的微流控芯片控制层各个微泵可按实验需求单独或同时开启，可以实现流动层细胞、培养基和生化因子/药物输入的时间和空间控制，以及细胞培养区流体剪切力的加载。
4、本发明的微流控芯片可开展流体剪切力动态加载和两种以上生化因子/药物对细胞的区域化处理，以及处理细胞与未处理细胞之间的相互作用研究，突破了惯用的细胞培养与处理模式，有利于模拟不同生理或病理情况下组织中细胞的流体微环境和生化微环境，研究细胞的结构功能及细胞之间的相互作用。
附图说明
图1为本发明实施例阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片的结构分解示意图。
图2为本发明实施例中流动层和控制层的结构示意图。
图3为本发明实施例中阵列式细胞培养区U型凹槽和缓冲区U型微柱结构示意图。
图4为本发明实施例中微泵结构示意图。
图5为本发明实施例中处于静止状态的控制层微泵结构示意图。
图6为本发明实施例中控制层微泵驱动后三个微腔依次变形引起培养基进液微管道内液体流动示意图。
图7为本发明实施例中显微镜明场下微流控芯片内成骨样细胞IDG-SW3阵列式培养图标尺＝50μm。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片，该芯片包括自上而下依次封接的流动层1、控制层2、薄膜层3和玻璃层4；所述流动层1由阵列式细胞培养区5、缓冲结构区6、细胞接种微管道7、左进液微管道8、中央进液微管道9和右进液微管道10组成，所述细胞接种微管道7用于向流动层输入细胞，所述中央进液微管道9、左进液微管道8和右进液微管道10分别作为中央的培养基进液微管道和两侧的生化因子/药物进液微管道，用于为阵列式培养的细胞提供培养基，实现流体剪切力加载和生化因子/药物区域化处理；所述阵列式细胞培养区5上设有若干用于单个或数个细胞的捕获的阵列式培养U型凹槽16；所述缓冲结构区内设有若干U型微柱17；所述控制层2由若干用于对流动层细胞、培养基和生化因子/药物的输入进行时间和空间的控制，以及细胞培养区流体剪切力的加载的微泵组成，所述微泵采用由一个入口和若干个微腔串联组成末端封闭结构，该微腔的宽w为100-400μm，长/为100-900μm。
如图2和图3所示。阵列式细胞培养区包含30排U型凹槽，每排包含18个U型凹槽，每排与相邻一排的U型凹槽错列排布，各排间距为50μm，每排内的U型凹槽间距为20μm；U型凹槽长L为60μm，宽W为20μm，由2个方形微柱和3个近似梯形微柱组成，梯形微柱之间的间距G为4.5μm。缓冲结构区各包含2排U型微柱，U型微柱的方向以及长、宽与上述U型凹槽一致。所述左进液微管道8、中央进液微管道9和右进液微管道10连接在一个主管道11上，左进液微管道8与中央进液微管道9之间的夹角以及中央进液微管道9与右进液微管道10之间的夹角均为45°；中央进液微管道为宽度不变的直管道，宽度为150μm；两侧进液微管道分为宽度不同的两段，入口段宽度为150μm，接近主管道处的宽度为20μm；主管道的宽度为200μm。
如图2和图4所示，控制层由4个微泵组成，结构相同，分别位于中央的培养基进液微管道、两侧的生化因子/药物进液微管道和主管道正下方。每个微泵由1个入口和3个微腔串联组成末端封闭结构，微腔宽w为600μm，长/分别为为300、600、900μm。
阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片的制作以聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片制作为例：
1、采用感应耦合等离子体刻蚀技术制备流动层模板，采用软光刻技术制备控制层模板。流动层模板的厚度为40μm，控制层模板的厚度为100μm。
2、微流控芯片的制备：将PDMS预聚物和交联剂按质量比10∶1混匀，浇注于流动层模板，加热固化；将PDMS预聚物和交联剂按质量比15∶1混匀，涂膜于控制层模板，加热固化；将流动层和控制层PDMS在显微镜下校对粘合，在设计部位打孔；将该双层粘合于已涂膜了PDMS薄膜层的玻璃层表面；加入促进各层粘合，最终得到PDMS微流控芯片。
实施例2：
控制层微阀13对培养基进液微管道9内液体驱动方式如图5、图6所示。当微泵13处于静止状态时，培养基进液微管道9内液体也处于静止状态，如图5所示；当用2psi的压力、1Hz频率驱动微泵13后，微泵13的3个微腔18、19、20依次变形，驱动培养基进液微管道9内液体流动，如图6所示，从而达到培养基的实时更新。
实施例3：
本实施例以微流控芯片内成骨样细胞IDG-SW3阵列式培养为例。
步骤1、预处理微流控芯片。首先将制备好的实施例1中的微流控芯片进行紫外线照射灭菌，然后对流动层微管道和细胞培养区进行蛋白包被采用I型胶原蛋白，0.15mg/mL，37℃，2h，再用不含血清的α-MEM培养基润洗流动层微管道和细胞培养区。
步骤2、制备成骨样细胞IDG-SW3悬液。采用常规细胞培养方法培养IDG-SW3细胞，胰蛋白酶消化获取对数生长期细胞，800rpm 5min离心细胞悬液去除胰蛋白酶，将细胞重悬于含10％胎牛血清的α-MEM培养基中，细胞密度调整为0.5×106个细胞/mL。
步骤3、接种细胞。以2psi气体压力、2Hz频率驱动主管道11正下方的微泵15，通过细胞接种微管道7将IDG-SW3细胞接种于阵列式细胞培养区的U型凹槽，如图7所示，停止驱动微泵，将芯片静置与细胞培养箱2h，使细胞贴壁。
步骤4、芯片内培养细胞。以2psi气体压力、1Hz频率驱动培养基进液微管道9正下方的微泵13，使培养基通过培养基进液微管道输入阵列式细胞培养区，实现细胞培养过程中的培养基实时更新。利用倒置显微镜定时观察、记录细胞的生长状态。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片，其特征在于，该芯片包括自上而下依次封接的流动层(1)、控制层(2)、薄膜层(3)和玻璃层(4)；所述流动层(1)由阵列式细胞培养区(5)、缓冲结构区(6)、细胞接种微管道(7)、左进液微管道(8)、中央进液微管道(9)和右进液微管道(10)组成，所述细胞接种微管道(7)用于向流动层输入细胞，所述中央进液微管道(9)、左进液微管道(8)和右进液微管道(10)分别作为中央的培养基进液微管道和两侧的生化因子/药物进液微管道，用于为阵列式培养的细胞提供培养基，实现流体剪切力加载和生化因子/药物区域化处理；所述阵列式细胞培养区(5)上设有若干用于单个或数个细胞的捕获的阵列式培养U型凹槽(16)；所述缓冲结构区内设有若干U型微柱(17)，所述控制层(2)由若干用于对流动层细胞、培养基和生化因子/药物的输入进行时间和空间的控制，以及细胞培养区流体剪切力的加载的微泵组成，所述微泵采用由一个入口和若干个微腔串联组成末端封闭结构，该微腔的宽w为100-400μm，长l为100-900μm；
所述阵列式细胞培养区(5)上设有10-50排的U型凹槽(16)，每排包含10-20个U型凹槽，相邻两排的U型凹槽错列排布，且相邻两排间距为25-100μm，每排内的U型凹槽的间距为25-100μm；U型凹槽(16)的长L为25-100μm，宽W为25-100μm，由2个方形微柱和3-5个近似梯形微柱组成，梯形微柱之间的间距G为2.5-7.5μm；
所述左进液微管道(8)、中央进液微管道(9)和右进液微管道(10) 连接在一个主管道(11)上，左进液微管道(8)与中央进液微管道(9)之间的夹角以及中央进液微管道(9)与右进液微管道(10)之间的夹角均为30-60°；所述中央进液微管道(9)为宽度不变的直管道，宽度为50-200μm；所述左进液微管道(8)和右进液微管道(10)分为宽度不同的两段，入口段宽度为50-200μm，接近主管道(11)处的宽度为10-25μm；主管道(11)的宽度为60-250μm；
所述控制层微泵共有四个微泵(12、13、14、15)，结构相同，所述微泵分别位于左进液微管道、中央进液微管道、右进液微管道、主管道的正下方，所述微泵采用由一个入口和三个微腔串联组成末端封闭结构，三个微腔的长度比例为1∶2∶3。
2.如权利要求1所述的阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片流动层(1)、控制层(2)和薄膜层(3)的材料均为聚二甲基硅氧烷，或其他已知的弹性高分子材料。
3.如权利要求1所述的阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片，其特征在于，所述缓冲结构区(6)内设有2-5排的U型微柱(17)，U型微柱(17)与U型凹槽(16)对应设置，且其长、宽与所述U型凹槽(16)一致。
4.如权利要求1所述的阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片，其特征在于，所述细胞接种微管道(7)、左进液微管道(8)、中央进液微管道(9)和右进液微管道(10)的横截面高度相同，均为30-100μm；阵列式细胞培养区(5)和缓冲结构区(6)的横截面高度相同，均为30-100μm。
5.如权利要求1-4任一项所述的阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步，将设计好的流动层和控制层结构制成光掩模；
第二步，将光刻胶涂膜于硅片，进行紫外曝光和显影，制得流动层和控制层芯片模板；
第三步，将聚二甲基硅氧烷或其他已知的弹性高分子材料覆盖于流动层和控制层模板表面，烘烤固化，在显微镜下将流动层和控制层校对粘合；
第四步，将聚二甲基硅氧烷或其他已知的弹性高分子材料涂膜于玻璃层表面，烘烤固化；
第五步，将粘合好的流动层与控制层封装于涂有薄膜的玻璃层上，制成微流控芯片。
6.如权利要求1-4任一项所述的阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1、驱动位于主管道(11)正下方的微泵(15)将细胞悬液通过细胞接种微管道(7)输入芯片，待细胞均匀分布在阵列式细胞培养区(5)的U型凹槽(16)后，停止驱动微泵(15)，将芯片静置于细胞培养箱0.5-3h使细胞贴壁，待细胞贴壁后驱动中央进液微管道(9)正下方的微泵(13)，使培养基通过培养中央进液微管道(9)输入阵列式细胞培养区(5)，实现细胞培养过程中的培养基实时更新；
步骤2、根据实验需求，驱动位于中央进液微管道(9)正下方的微泵(13)，使培养基以0.5-20μL·min-1的速度通过中央进液微管道(9)输入阵列式细胞培养区(5)，实现流体剪切力加载的实时控制；
步骤3、根据实验需求，驱动微泵(13、12、14)，分别通过中央进液微管道(9)和左进液微管道(8)和右进液微管道(10)向阵列式细胞培养区(5)输入培养基和所需生化因子/药物，生化因子/药物在阵列式细胞培养区(5)扩散形成浓度梯度，使不同区域U型凹槽中的细胞接受不同浓度生化因子/药物的作用，从而实现细胞区域化处理的时间和空间控制；
步骤4、驱动位于中央进液微管道(9)正下方的微泵(13)，通过中央进液微管道(9)向阵列式细胞培养区(5)输入细胞形态、功能检测试剂或细胞固定液，用于流体剪切力处理或生化因子/药物区域化处理后的细胞形态功能检测。
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