KR102171936B1 - 표면장력을 이용한 미세유체 플랫폼 상에서의 액체 패터닝 및 세포고정화 방법 - Google Patents

표면장력을 이용한 미세유체 플랫폼 상에서의 액체 패터닝 및 세포고정화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표면장력을 이용한 미세유체 플랫폼 상에서의 액체 패터닝 및 세포고정화 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 액체 패터닝 방법을 사용하여, 화학적 처리나 부가 장비 없이 미세 구조의 배열 형태만을 이용하여 미세유체 장치 상의 원하는 위치에 원하는 모양으로 액체/세포 패터닝이 가능하다. 또한, 액체와 세포의 종류에 관계 없이 패터닝이 가능하고, 기존의 기술로는 불가능했던 3 종류 이상의 유체에 대한 패터닝이 가능하며, 5초 이내의 빠른 시간 내에 패터닝이 가능하다.

Description

표면장력을 이용한 미세유체 플랫폼 상에서의 액체 패터닝 및 세포고정화 방법{A method for liquid patterning and cell immobilization in microfluidic platform using surface tension}
본 발명은 생화학 연구를 위한 미세유체 플랫폼 상에서 원하는 위치에 액체나 세포를 고정화시킬 수 있는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 미세구조와 액체의 표면 장력만을 사용하여 추가 공정이나 부가 장비 없이 미세유체 플랫폼 표면의 원하는 위치에 액체를 패터닝하는 방법, 또는 MEMS 공정을 이용하여 제작한 미세구조를 포함하는 플라스틱 칩 내에 빠르게 원하는 모양으로 액체 또는 세포를 패터닝하는 방법에 관한 것이다.
미세유체에 기반한 연구는 더 작은 부피의 제제를 사용하여 더 빠르고 감도 높은 탐지 결과를 제공하기 때문에, 통상적인 연구실 수준의 분석 공정에 비해 여러 가지 장점을 가지고 있다. 미세유체 기술은 단일 칩 상에 전체 연구의 병합을 가능하게 한다. 고급 랩온어칩(lab-on-a-chip) 기술에 대하여, 미세유체 장비는 다양한 기능을 병합하기 위해 혼합기, 유체 분리 채널 및 밸브 같은 복잡한 3차원 구조물을 필요로 한다. 미세유체에 대한 연구는 세포 기반 연구 및 다른 응용 연구의 실시에 점차적으로 사용 빈도가 증가하고 있다. 미세유체를 기반으로 하는 생화학 연구에서 가장 중요한 활용은 고효율의 스크리닝 방법이다. 고효율 스크리닝은 세포 대사, 세포 간 상호작용, 진단 및 신약 개발 같은 바이오의약 연구에 필수적인 수단인데, 미세유체 플랫폼은 미세구조를 이용하는 층류(laminar flow), 저확산(low diffusion), 세포분석 및 흐름제어 같은 고효율 스크리닝에 관한 많은 장점을 가지고 있다. 또 다른 미세유체 활용 분야는 장기-온-칩(organ-on-chip)이다. 이는 살아 있는 장기의 기능 및 병리생리학을 이해하기 위한 세포와 조직에 대한 탐구 기술이다. 현재까지의 통상적인 생체 외(in vitro) 방법은 3차 구조 및 공생-배양 같은 복잡한 사항들을 단순히 모방한다는 한계점을 가지고 있다. 하지만, 미세유체 기술은 미세유체공학, 유체 분리, 세포 포지셔닝, 3차원 복합세포 배양, 조화된 흐름 및 시공적인 변화를 사용하여 실제 장기를 성공적으로 모방할 수 있다. 고효율 스크리닝 및 장기-온-칩 활용에 대하여, 고정된 관심영역(Region of Interest, ROI)은 자료 분석 및 세포 포지셔닝에 관한 중요한 항목이었다. 기존에는 표면에 화학물질을 코팅하는 화학적 패터닝, 세포외 기질(ECM) 패터닝, 광학적 트위저(tweezer), 액적 형성, 자외선 경화성 물질을 이용한 패터닝, 또는 지속적으로 유체를 흘려주면서 원하는 미세 구조에 세포를 가두는 방법 등의 ROI를 고정시키는 다양한 방법들을 사용하였다. 하지만, 상기 기재된 방법들은 ROI를 효율적으로 고정시킬 수 있으나 추가적인 공정(예, 지속적인 유체의 흐름, 광경화성 물질의 사용) 또는 장비(예, 광 조사 장치)를 필요로 한다.
본 발명의 목적은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 기존 방법들의 문제점인 추가 공정이나 부가 장비 없이 미세 구조의 배열 형태만을 이용하여, 기존 방법들보다 빠른 시간 내에 미세유체 플랫폼 상의 원하는 위치에 원하는 모양으로 액체를 패터닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 기존의 방법으로는 실시할 수 없었던 3종류 이상의 액체를 패터닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 고효율 스크리닝 및 장기-온-칩 방법에 활용할 수 있는 액체의 패터닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 일 구체예에서, 1) 미세조류 세포의 부유액을 알지네이트 용액(8%, w/v)과 1:1 부피비율로 혼합하여 최종 세포수가 3x106 내지 7x106 세포/ml인 혼합물을 제조하고; 2) 상기 혼합물을 마이크로채널 내로 주입하며; 3) 염화칼슘(CaCl2, 10%, w/v)과 혼합한 배양 배지를 상기 마이크로채널 내로 도입하여 알지네이트를 중합화하여 세포를 포스트 배열 내에 포획하며; 4) 상기 마이크로채널에 40kPa 내지 80kPa 압력의 흡인 펌프를 사용하여 흡인하는 것을 포함하는 마이크로채널 내 포스트 배열 내부에 미세조류 세포를 패터닝하는 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 3) 단계에서 포획된 세포의 수는 5 내지 10 세포인 것을 특징으로 하는 방법을 제공하였다.
다른 일 구체예에서, 1) 신경세포를 매트리젤과 혼합하는 세포 농도 3x106 내지 10x106 세포/ml인 혼합물을 제조하고; 2) 상기 혼합물을 마이크로채널 내로 도입하며; 3) 상기 마이크로채널에 40kPa 내지 80kPa 압력의 흡인 펌프를 사용하여 흡인하여 신경세포를 포획하는 것을 포함하는 마이크로채널 내 포스트 배열 내부에 신경 세포를 패터닝하는 방법을 제공하였다.
또 다른 일 구체예에서, 1) 혈관세포(10x106 내지 20x106/ml)를 피브리노겐 용액(소과 피브리노겐 2.5mg/ml, 아프로티닌(aprotinin, 0.15 U/ml), 트롬빈 0.5 U/ml, 용매 PBS)으로 부유시키고; 2) 상기 재부유된 혈관세포를 마이크로채널 내로 도입하며; 3) 상기 마이크로채널에 40kPa 내지 80kPa 압력의 흡인 펌프를 사용하여 흡인을 실시하여 ROI 상에 세포를 남겨두고; 4) 상온에서 상기 세포 부유액을 굳히며; 5) 상기 마이크로채널에 폐 섬유아세포(1x106 내지 2x106 /ml)를 도입하며; 6) 4 내지 5일간 EGM-2 배양 배지를 신선하게 공급하는 것;를 포함하는 마이크로채널 상의 포스트 배열 내에 혈관세포를 패터닝하는 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 혈관세포는 인간 제정맥 내피세포(HUVEC)이고, 상기 패터닝은 5초 이내에 실시되며, 상기 패터닝하는 포스트 배열의 포스트 사이 간격은 80μm 내지 120μm 이고, 기타 포스트 배열의 포스트 사이 간격은 450μm 내지 550 μm이며, 상기 마이크로채널의 높이는 80μm 내지 120μm이고 포스트의 직경은 80μm 내지 120μm인 것을 특징으로 하는 방법을 제공하였다.
또 다른 일 구체예에서, 본 발명에 따라 제조된 혈관 패터닝을 사용하여 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하였다.
또 다른 일 구체예에서, 1) 자외선(UV) 경화성 물질 또는 하이드로젤을 3가지 유체에 첨가하고; 2) 미세구조를 갖춘 마이크로채널에 첫 번째 유체를 채우고 흡인을 실시하여 첫 번째 유체를 패터닝하며; 3) 상기 마이크로채널에 자외선을 조사하여 발색 및 경화를 진행하며; 4) 상기 마이크로채널에 두 번째 유체를 채우고 흡인을 실시하여 두 번째 유체를 패터닝하고; 5) 상기 마이크로채널에 자외선을 조사하여 발색 및 경화를 진행하며; 6) 상기 마이크로채널에 3번째 유체를 채우고 패터닝을 실시하는 것을 포함하는 3가지 유체를 마이크로채널 상에 패터닝하는 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 전 단계의 패터닝된 유체가 다음 단계 유체의 패터닝을 위한 미세구조 역할을 하고, 상기 하이드로젤은 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin), 매트리젤(matrigel), 알지네이트(alginate)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법을 제공하였다.
본 발명에 따른 액체 패터닝 방법을 사용하여, 화학적 처리나 부가 장비 없이 미세 구조의 배열 형태만을 이용하여 미세유체 장치 상의 원하는 위치에 원하는 모양으로 액체/세포 패터닝이 가능하다. 또한, 액체와 세포의 종류에 관계 없이 패터닝이 가능하고, 기존의 기술로는 불가능했던 3 종류 이상의 유체에 대한 패터닝이 가능하며, 5초 이내의 빠른 시간 내에 패터닝이 가능하다.
도 1은 마이크로채널 내의 액체가 건조되는 동안 여러 가지 간격을 갖는 미세 구조들 사이에 형성된 계면의 형태 변환을 나타낸 것이다(도 1a-곡률 반지름 감소, 도 1b-곡률 반지름 증가).
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 미세구조 배열을 이용한 액체의 패터닝 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 미세구조의 배열을 이용하여 액체를 패터닝하는 방법(도 3a) 및 그 결과(도 3b)를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 세포를 원하는 위치에 원하는 모양으로 패터닝한 결과(도 4a-미세조류, 도 4b-신경세포, 도 4c 및 도 4d-혈관세포)를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따라 3 종류의 액체를 패터닝하는 방법(도 5a) 및 그 결과(도 5b 및 도 5c)를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
포스트 간격에 따른 계면 동력학
액체-기체 접촉면에서 곡률의 반지름은 액체의 표면 장력 및 압력 차이와 관련되어 있다. 상기 곡률 반지름은 Young-Laplace 방정식((Frank M. White, Fluid mechanics, McGraw Hill, 6th edition, p33), △p=γ(1/R1+1/R2))에 의해 나타낼 수 있다. 본 발명에서, 마이크로채널의 높이(100μm)를 고정하였으므로, R2는 일정하다는 것이 예측될 수 있다. 따라서, 포스트 간의 곡률 반지름은 R1(R1=1/△p/γ-1/R2)으로 나타내었고 이는 압력이 증가할수록 곡률 반지름도 증가한다는 것을 의미하였다. 도 1은 액체 건조 과정 중 다양한 포스트 공간에 대한 액체-기체 접촉면에서의 계면 동력학을 나타내고 있다. 마이크로채널은 소프트리소그래피에 의한 PDMS를 이용하여 복제되었고, 표면은 에어프라즈마 처리하여 친수성이 되었다. 마이크로채널의 높이는 100μm이고 포스트 간격은 100, 200, 300 및 400μm이다. 마이크로채널을 탈이온수로 채우고 상온에서 건조시켜서 계면 곡률을 측정하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 계면동력학 공정은 2 단계로 나뉘어질 수 있다. 1 단계는 곡률 반지름이 Lmax/2보다 짧다. 액체 건조 중에, 액체 부피가 감소하기 때문에 액체-기체 접촉면의 압력차는 증가하였다. 1 단계에서, 곡률반지름은 Young-Laplace 방정식에 따라 감소하였다. 도 1a의 현미경 이미지는 건조 과정 중에 감소하는 반지름을 나타내었다. 반지름이 감소하기 때문에, 곡률의 상단부는 액체 방향으로 전진하게 된다. 하지만, 계면의 위치는 포스트 간격에 따라 달랐다. 넓은 간격의 계면이 더 좁은 간격의 계면보다 더 전진한 형태이다. 계면은 반지름이 Lmax/2이 될 때까지 전진하였다.
반지름이 Lmax/2이 되면, 계면의 형태 변화는 2 단계로 전환되었다. 곡률 반지름은 Lmax/2보다 낮게 감소할 수 없지만 액체의 부피는 점차 감소된다. 따라서, 2 단계에서는, 곡률 반지름이 감소하는 부피에 맞춰서 증가하였다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 가장 넓은 간격에서의 계면은 반지름이 증가함에 따라 전진하게 되고 또한 곡률 반경의 증가에 따라 간격이 좁은 곳의 계면은 후퇴하였다.
포스트 기하학을 이용한 액체 패터닝
2.1 액체 패터닝
도 2a는 포스트 기하학을 이용한 마이크로채널 내 액체 패터닝 공정을 나타내었다. 액체는 청색 염료를 혼합한 탈이온수이고, 상온에서 건조시켰다. 상기 기재된 바와 같이, 계면은 더 넓은 간격에서 가장 많이 전진하며 좁은 간격의 계면에서는 상대적으로 거의 전진을 하지 않았다. 이러한 현상을 이용하여, 포스트의 간격은 특정 영역에서 액체를 분리하도록 고안되었다. 마이크로채널의 높이는 100μm이고 포스트의 직경은 100μm이다. 액체 분리에 사용된 네 가지 포스트 간의 간격은 100μm이고, 다른 포스트 간의 간격은 500μm이다. 도면에 기재된 바와 같이, 더 좁은 간격의 포스트 배열은 '장벽' 역할을 하였고 액체는 특정 영역 내에 포획되었다.
액체 패터닝 공정에서, 계면 동력학은 두 계면이 접촉할 경우 흥미로운 현상을 나타내었다. 도 2b는 두 계면의 접촉 후에 계면 동력학을 나타내었다. 액체가 건조됨에 따라, 두 계면은 서로 가까워졌다. 접촉 후에는, 접촉 지점이 '보이지 않는 포스트' 역할을 하였다. 즉, 하나의 계면이 2개의 계면으로 분리되었고 계면의 형태는 접촉 지점에 따라 변화하였다.
2.2 계면 동력학의 모델화
COMSOL Multiphysics(Comsol, Inc., Palo Alto, CA)를 사용한 2차원 시뮬레이션을 실시하여, 액체-기체 접촉면에서 포스트 배열(post array)에 대한 계면 동력학을 예측하였다.
미세유체 플랫폼 상에서의 빠른 액체 패터닝
3.1 미세유체 장치의 제조
마이크로유체 플랫폼 상의 빠른 액체 패터닝에 대한 새로운 기술은 표면 장력 및 계면 동력학을 사용하여 개발되었다. 특정 기하학을 갖춘 포스트 배열을 포함하는 미세유체 장치를 고안하여 제조하였다. 미세유체 장치의 높이는 100μm이고 포스트 간의 간격은 100μm이다. 이 방법에 대하여, 미세유체 장치의 표면은 물에 기반한 액체를 사용하기 위해 친수성이어야 한다. 액체 패터닝의 형태는 포스트 배열의 모양에 의해 조절될 수 있는데, 포스트 간의 간격이 채널 높이보다 좁아야 안정적으로 액체를 포획할 수 있다. 도 3a는 빠른 액체 패터닝 기술의 방법을 설명하고 있다.
한편, 미세유체 장치는 소프트 리소그래피(soft lithography) 및 급속 조형(rapid prototyping)을 사용하여 제조하였다. 마스터 몰드(master mold)는 실리콘 웨이퍼(silicon, Boise, ID) 상에 두꺼운 음극 SU8 감광성 재료(MicroChem, Newton, MA)을 패터닝하여 제조하였다. 양각된 채널을 갖춘 양성 모형(positive replica)은 폴리디메틸실록산(PDMS; Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI)을 마스터에 대하여 몰딩함으로써 제조하였다. 경화성 폴리디메틸실록산은 벗겨내었고, 날카로운 바늘을 사용하여 구멍을 뚫어서 저장소 또는 유체의 상호접속 용도로 사용하였다. 폴리디메틸실록산은 에어-플라즈마 생성기(펨토 사이언스)로 처리시에 유리 슬라이드 상에 거꾸로 접착시켜서 미세유체 장치를 완성하였다.
3.2 액체 패터닝
미세유체 장치를 제조한 후, 마이크로채널은 액체로 채웠다. 액체 패터닝 중에, 마이크로채널 안쪽의 액체는 60kPa 압력의 흡인 펌프를 사용하여 흡인하였다. 흡인하는 동안, 액체는 포스트 배열 내부에 포획되었다. 도 3b는 고안된 포스트 배열 내부에 포획된 패턴화된 액체를 나타내었다. 액체 패터닝 중에, 포스트 형태는 적절한 목적에 따라 변형될 수 있으므로, 포스트의 형태는 중요한 요소가 될 수 없다. 이러한 방법을 사용하여 패턴화된 액체는 추가적인 표면 처리 또는 장비 없이 5초 이내에 획득할 수 있었다.
생물학적 활용
4.1 개요
새로운 액체 패터닝 방법에 근거하여, 다양하고 독특한 생물학적 실험 플랫폼이 제조되었다. 도 4의 형광 이미지는 빠른 액체 패터닝 방법에 의해 만들어지는 패턴화된 세포 배열을 나타내었다. 세포 패턴을 제조하기 위해, 하이드로젤과 혼합된 세포 부유액을 마이크로포스트 배열을 포함하는 마이크로채널 내에 채웠다. 마이크로채널을 세포 부유액을 채운 후에, 세포 부유액은 흡인 펌프를 사용하여 흡인하였고, 세포 부유액은 포스트 배열 내부에 포획되었다.
4.2 이미지 획득
모든 채널은 PBS(Hyclone)을 사용하여 1회 세척한 후, 세포는 PBS로 희석시킨 4%(w/v) 파라포름알히드 내에서 15분간 고정시켰고, PBS 용액으로 희석시킨 0.15% 트리톤 X-100(Sigma)를 15분간 처리하였다. 시료는 PBS로 희석시킨 3% 소혈청 알부민(BSA, Sigma) 및 CD31(Alexa Fluor 1647, clone WM59(BioLegend))에 특이적인 마우스 단일클론 항체를 200:1 비율로 혼합시킨 혼합물을 사용하여 4˚C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 모세혈관 네트워크의 이미지는 공초점 현미경(Olympus FV1000)을 사용하여 획득하였다. Z-스택 이미지는 2um 두께마다 스캐닝을 실시하여 생성하였다. Z-스택 내 각각의 이미지는 Imaris(Bitplane, Switzerland)를 사용하여 겹침으로써 3차원 투사이미지를 구축하였다.
4.3 미세조류의 패터닝
도 4a는 실험 시작 후 3일 뒤에(Days in vitro 3) 포스트 배열 내부에 포획된 미세조류를 나타내었다. 세포 배열을 형성하기 위해, 클라미도모나스 레인하디티(chlamydomonas reinhardtii, 녹조류) 부유액을 알지네이트(A2033-100G, SIGMA-ALDRICH, Alginic acid sodium salt from brown algae) 용액(8%, w/v)와 혼합하였다. 세포 부유액과 알지네이트 용액 혼합물의 부피 비율은 1:1이고, 혼합물 내 최종 세포 수는 5x106 세포/ml 이었다. 세포 혼합물을 제조한 후, 혼합물은 마이크로채널 내로 넣고, 도 3A와 동일하게 흡인을 실시하였다. 마이크로채널의 높이는 100μm이고 포스트의 직경은 100μm이다. 세포 혼합물을 포스트 배열 내부에 포획한 후, 염화칼슘(CaCl2, 10%, w/v)과 혼합한 배양 배지를 마이크로채널에 채움으로써 알지네이트를 중합화하였다. 도 4a에 기재된 바와 같이, 5 내지 10 세포가 계획된 영역 내에 포획되었고, 세포는 회분식 배양에서와 같이 알지네이트 젤 내에서 잘 성장하였다.
4.4 세포의 패터닝
도 4b는 실험 시작 후 5일 뒤에(Days in vitro 5) 포스트 기하학을 이용한 계획된 신경 네트워크를 나타내었다. 매트리젤(Matrigel, Growth factor reduced (BD biosciences, 356231)과 혼합된 신경 세포는 마이크로채널 내로 주입하였고, 흡인을 실시하여 포스트 배열 내부에 세포 패턴을 형성하였다. 혼합물 내 세포의 농도는 6x106 세포/ml 이었다. 세포 포획 후에, 미세유체 장치는 37˚C 배양기에 3분간 두어서 매트리젤이 중합화되었고, 그 후에 마이크로채널을 배양 배지로 채웠다. 도 4b에 나타난 바와 같이, 신경 세포는 포스트 배열 내부에 잘 포획되었고 예상한 대로 계획된 네트워크를 형성하였다.
4.5 인공 혈관 제조
도 4c는 인공 혈관에 관한 것이다. 인공 혈관은 인간 제정맥 내피세포(HUVEC)를 폐 섬유아세포(LF)와 공통 배양하여 생산하였다. 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC, Lonza)를 내피 성장 배지(EGM-2, Lonza)에서 실험에 사용할 때까지 3회 내지 5회 계대배양하였다. 정상적인 인간 폐 섬유아세포(LF, Lonza)는 섬유아세포 성장 배지(FGM-2, Lonza) 내에서 10회까지 계대배양하였다. 세포 배양은 실험시 계대 또는 사용 이전에 80% confluence까지 실시하였다. 모든 세포는 습윤된 배양기 내 37˚C, 5% CO2 환경에서 유지 및 배양하였다. 세포를 회수한 후, HUVEC은 피브리노겐 용액(인산염으로 완충된 살린(Phosphate-buffered Saline, PBS, Hyclone) 내 2.5mg/ml bovine fibrinogen(Sigma), aprotinin(0.15 U/ml, Sigma) 및 thrombin(0.5U/ml, Sigma)으로 15x106/ml 세포수의 농도로 재부유시켜서 채널 내로 도입하였다. 그리고 나서, 흡인 펌프로 흡인을 실시하여 미세구조로 둘러싸인 ROI 상에 세포 부유액을 남겨 두었다. 상온에서 5분 동안 젤을 굳힌 후에, 채널에 EGM-2 배지 1.5x106 /ml 세포수 농도의 LF를 도입하였다. 미세유체 플랫폼은 37˚C, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 성숙한 혈관이 형성될 때까지, 세포 배양 배지를 신선한 EGM-2 배양 배지로 24시간마다 4~5일간 재-공급하였다. 5일 후에, HUVEC는 포스트 배열의 형태와 같은 가지가 있는 혈관을 형성하였다. 도 4c에 나타난 바와 같이, 발달된 혈관은 서로 연결되었고 잘 발달된 관을 포함하였다. 또한, 암세포와 혈관세포를 위치상으로 분리시켜둔 후 배양하면서 암세포의 전이 및 암세포에 의한 신생혈관 생성을 알 수 있고 이에 따른 약물 스크리닝이 가능하였다(도 4d).
여러 가지 유체의 패터닝
도 5에 기재된 방법에 따라 여러 가지 유체에 대한 패터닝을 실시하였다. 각각의 유체에는 UV 경화성 물질인 PEG-DA를 첨가하여 사용하였다. 첫 번째 유체를 도 5a와 같은 미세구조를 갖춘 채널에 채운 후에 흡인을 실시하면 미세구조들 사이에서 첫 번째 유체가 패터닝 된다. 패터닝 후에, UV에 노출(발색 진행)시켜 경화를 진행하였다. 이후, 두 번째 유체를 채운 후 흡인하면 이미 패터닝된 첫 번째 유체가 미세구조와 같은 역할을 하여 그 사이에 두 번째 유체가 패터닝 되고, 바깥쪽에 3번째 유체를 채움으로써 도 5b 및 도 5c에 나타낸 바와 같이 3 가지 종류의 액체 패터닝이 가능하게 된다. 미세구조의 배열 형태를 변화시키면 3 가지 종류 이상의 유체에 대한 패터닝이 가능하게 된다. 또한, UV 경화성 물질뿐만 아니라 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin), 매트리젤(matrigel), 알지네이트(alginate) 같은 하이드로젤을 사용하는 유체의 패터닝도 가능하였다.
지금까지 예시적인 실시예를 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시예로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에 따라 제조된 미세유체 플랫폼 상에서의 액체 패터닝 및 세포 고정화 방법은 질병 치료 혹은 세포 생물학 연구를 위한 약물 개발에 활용될 수 있으며, Lab-on-a-chip 및 Organ-on-chip에도 활용될 수 있다.

Claims (13)

1) 미세조류 세포의 부유액을 알지네이트 용액과 1:1 부피비율로 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
2) 상기 혼합물을, 복수 개의 포스트(post)가 목적하는 형태로 배열된 마이크로채널 내로 주입하는 단계;
3) 염화칼슘과 혼합한 배양 배지를 상기 마이크로채널 내로 도입하여 알지네이트를 중합화하고, 세포를 마이크로채널 상의 목적하는 형태의 포스트 배열 내에 포획하는 단계; 및
4) 상기 마이크로채널에 흡인 펌프를 사용하여 흡인을 실시하는 단계를 포함하고,
상기 복수 개의 포스트 중 좁은 간격을 갖는 포스트들 내에 세포가 포획되고, 넓은 간격을 갖는 포스트들 사이는 흡인을 통해 혼합물이 제거되는 것을 특징으로 하는 마이크로채널 내 포스트 배열 내부에 미세조류 세포를 패터닝하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 3) 단계에서 포스트 배열 내 포획된 세포의 수는 2 내지 15인 것을 특징으로 하는, 방법.
1) 신경세포를 매트리젤과 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
2) 상기 혼합물을 복수 개의 포스트가 목적하는 형태로 배열된 마이크로채널 내로 도입하는 단계;
3) 상기 마이크로채널에 흡인 펌프를 사용하여 흡인을 실시하여 포스트 배열 내에 신경세포를 포획하는 단계;를 포함하고,
상기 복수 개의 포스트 중 좁은 간격을 갖는 포스트들 내에 신경세포가 포획되고, 넓은 간격을 갖는 포스트들 사이는 흡인을 통해 혼합물이 제거되는 것을 특징으로 하는 마이크로채널 내 포스트 배열 내부에 신경 세포를 패터닝하는 방법.
1) 혈관세포를 피브리노겐 용액으로 부유시켜서 혈관세포 부유액을 형성하는 단계;
2) 상기 부유된 혈관세포를 복수 개의 포스트가 목적하는 형태로 배열된 마이크로채널 내로 도입하는 단계;
3) 상기 마이크로채널에 흡인 펌프를 사용하여 흡인을 실시하여 관심영역(ROI, Region of Interest) 상에 세포를 남겨두는 단계;
4) 상온에서 상기 혈관세포 부유액을 굳히는 단계;
5) 상기 마이크로채널에 폐 섬유아세포를 도입하는 단계;
6) 상기 폐 섬유아세포에 4 내지 5일간 EGM-2 배양 배지를 신선하게 공급하여 혈관세포와 폐 섬유아세포를 공동-배양하는 단계를 포함하며,
상기 피브리노겐 용액은 소과 피브리노겐 2.5mg/ml, 아프로티닌(aprotinin, 0.15 U/ml) 및 트롬빈 0.5 U/ml를 포함하고,
상기 복수 개의 포스트 중 좁은 간격을 갖는 포스트들 내에 혈관세포가 포획되고, 넓은 간격을 갖는 포스트들 사이는 흡인을 통해 혈관세포가 제거되는 것을 특징으로 하는 것인, 마이크로채널 상의 포스트 배열 내에 혈관세포를 패터닝하는 방법.
제 4항에 있어서,
상기 혈관세포는 인간 제정맥 내피세포(HUVEC)인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항 또는 3항에 있어서,
상기 패터닝은 5초 이내에 실시되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항, 제 3항 및 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 포획에 사용되는 패터닝에 필요한 포스트 사이 간격은 80μm 내지 120μm 이고, 상기 포스트 외 나머지 포스트 사이 간격은 450μm 내지 550 μm인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항, 제 3항 및 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 마이크로채널의 높이는 80μm 내지 120μm이고 포스트의 직경은 80μm 내지 120μm인 것을 특징으로 하는, 방법.
삭제
1) 자외선(UV) 경화성 물질 또는 하이드로젤을 3 종류 이상의 유체에 각각 첨가하는 단계;
2) 복수 개의 포스트가 목적하는 형태로 배열된 미세구조를 갖춘 마이크로채널에 첫 번째 유체를 채우고 흡인을 실시하여 첫 번째 유체를 패터닝하는 단계;
3) 상기 마이크로채널에 자외선을 조사하여 발색 및 경화를 진행하는 단계;
4) 상기 마이크로채널에 두 번째 유체를 채우고 흡인을 실시하여 두 번째 유체를 패터닝하는 단계;
5) 상기 마이크로채널에 자외선을 조사하여 발색 및 경화를 진행하는 단계; 및
6) 상기 마이크로채널에 세 번째 유체를 채우고 패터닝을 실시하는 단계를 포함하고,
상기 복수 개의 포스트 중 좁은 간격을 갖는 포스트들 내에 첫 번째 유체가 포획되고, 넓은 간격을 갖는 포스트들 사이는 흡인을 통해 첫 번째 유체가 제거되는 것을 특징으로 하는 3 종류 유체를 마이크로채널 상에 패터닝하는 방법.
제 10항에 있어서,
전 단계의 패터닝된 유체가 다음 단계 유체의 패터닝을 위한 미세구조 역할을 하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 10항에 있어서,
상기 하이드로젤은 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin), 매트리젤(matrigel) 및 알지네이트(alginate)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 10항에 있어서,
상기 흡인은 40kPa 내지 80kPa 압력의 흡인펌프를 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는, 방법.




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