CN105170208B - 一种微阵列芯片的制备方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微阵列芯片的制备方法，包括选取目标芯片、选取辅助芯片、芯片对接以及芯片分离等步骤，通过操控目标芯片和辅助芯片表面的母液液滴和缓冲液液滴融合后分裂，从而改变对应的液滴中的组分，得到的目标芯片即为所述微阵列芯片，所述微阵列芯片的亲水区域吸附有目标液滴，所述目标液滴为多个不同组分的液滴组成的液滴阵列。本发明还公开了利用该方法制备的微阵列芯片。本发明可同时操控多个液滴进行融合及分离，从而形成浓度梯度、机械梯度、多组分化学、细胞密度以及各向异性凝胶等液滴微阵列，在生物学分析和凝胶液滴的制备方面有着广阔前景。

Description

一种微阵列芯片的制备方法及其产品

技术领域

本发明属于微流体芯片技术领域，更具体地，涉及一种微阵列芯片的制备方法及其产品。

背景技术

近年来，微流体系统在化学工程、生物工程以及转化医学等领域产生重大影响。这种微流体系统结合材料科学，化学工程，微机电加工等技术可以对样品进行进样、预处理、加样、取样、反应、检测等一系列的操作。通过建立大规模集成的操作系统，使得分析、筛选通量更高，更为简单有效。因其是在微米尺度的操作，同时还能节约样品成本，提高每一单元实验的准确度。微流体系统的发展，带来的将是筛选和检测成本的大幅下降和效率的提高。因为发展微流体系统有极其巨大的经济价值，尤其是在药物筛选，转化医学等高精尖成本巨大的行业之中。

人体组织细胞生长于复杂的三维微环境，细胞之间的相互作用以及细胞与胞外环境(物理微环境，化学微环境，胞外基质材料)的相互作用不但调控着细胞的分化和稳态，还影响着细胞的微生理事件。研究表明，细胞的三维微环境与癌症，纤维化疾病和自身免疫疾病等机体病症有着密不可分的联系。而传统的二维组织模型无法在体外重建体内的复杂多因素三维细胞微环境。体外重建三维细胞微环境将大大加快包括细胞相互作用、干细胞分化在内的多个基础研究领域，从而加速个体化医疗的发展。

研究者们基于不同的技术手段实现了三维细胞微环境的构建，其中包括光刻，微机器人组装，微流控组装，电稳态组装，超声组装和磁力组装。这些方法可以空间异质地组装多细胞组分、多化学组分以及多物理组分。如CN201110347232公开了一种微流控浓度梯度液滴生成芯片及生成装置，在基片上加工生成了一条样品分散通道、多条试剂通道、多条不互溶相通道、一条液滴反应和检测通道，通过泵驱动液流，完成液滴的分散和浓度梯度的生成。但是这些方法因而其成本相对较大、操作较为繁琐，并没有高通量、高效率地组装复杂三维微环境，难以真正应用于工业程度的高通量筛选。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种微阵列芯片的制备方法与产品，其目的在于通过基础芯片表面的亲水区域吸附液滴，并控制不同组分的液滴进行融合与分离，从而改变液滴的成分，进一步高效率地组装形成具有复杂三维微环境的微阵列芯片。

为实现上述目的，按照本发明的一方面，提供了一种制备微阵列芯片的方法，包括以下步骤：

(1)选取目标芯片：所述目标芯片表面具有多个亲水区域，每个所述亲水区域吸附有一个缓冲液液滴；

(2)选取辅助芯片：所述辅助芯片表面在所述步骤(1)中的目标芯片每个亲水区域的对应位置，具有数量相同或数量不等的一个或多个亲水区域，每个所述亲水区域吸附有一个母液液滴；

(3)芯片对接：将所述目标芯片的表面与所述辅助芯片的表面相对贴近，使得目标芯片的亲水区域吸附的缓冲液液滴，与辅助芯片对应位置的亲水区域吸附的母液液滴融合；

(4)芯片分离：待缓冲液液滴和母液液滴融合5秒以上，使得对应的缓冲液液滴和母液液滴中的组分由于扩散而趋向一致或者完全达到一致，将辅助芯片移去，得到的目标芯片即为所述微阵列芯片，所述微阵列芯片的每个亲水区域吸附有一个目标液滴，所述目标液滴为所述缓冲液液滴与所述母液液滴融合后分离而获得，所述目标液滴的体积与原来对应的缓冲液液滴的体积相同，其成分由于和母液液滴融合而发生了改变，所述改变为含有组分的改变或者组分浓度的改变。

其中，所述缓冲液液滴和母液液滴为水、溶液或者悬浊液，且所述缓冲液液滴和母液液滴分别在所述目标芯片和辅助芯片表面投影的形状与对应的亲水区域的形状相同，体积与亲水区域的面积正相关。

优选地，所述目标芯片的亲水区域的面积相同，此时所述目标液滴的体积也相同，则更方便在同一因素下进行药物或细胞的研究。

作为进一步优选地，所述缓冲液液滴具有相同的浓度。

优选地，所述辅助芯片表面在所述步骤(1)中的目标芯片每个亲水区域的对应位置，都具有N个亲水区域，其吸附的母液液滴分别为第一液滴、第二液滴至第N液滴，所有第i液滴的组分分别相同，而第一液滴至第N液滴的组分不完全相同；其中，N为大于等于2的整数，i为1～N的任意整数，则所述目标液滴为跟第一液滴至第N液滴融合后分离获得，其中含有第一液滴至第N液滴的组分。

优选地，所述步骤(2)中的辅助芯片为多个辅助芯片，在所述步骤(3)和步骤(4)中，所述多个辅助芯片依次与目标芯片对接后分离，可以将多个辅助芯片的母液融合于目标液滴中。

作为进一步优选地，所述多个辅助芯片为行辅助芯片和列辅助芯片，所述多个辅助芯片表面在所述步骤(1)中的目标芯片每个亲水区域的对应位置，具有一个亲水区域，所述目标芯片与所述多个辅助芯片的亲水区域排列为相同的矩形阵列；在所述矩形阵列中，所述目标芯片的亲水区域的面积相同，所述行辅助芯片表面位于同一行的亲水区域的面积不同，位于同一列的亲水区域的面积相同，所述列辅助芯片表面位于同一行的亲水区域的面积不同，位于同一列的亲水区域的面积相同。

作为进一步优选地，所述行辅助芯片的缓冲液液滴与母液液滴具有浓度不同的第一组分，所述列辅助芯片的缓冲液液滴与母液液滴具有浓度不同的第二组分，可以使得形成的目标液滴在同一行上具有浓度不同的第一组分，浓度相同的第二组分，在同一列上具有浓度相同的第一组分，浓度不同的第二组分。

优选地，所述母液液滴和/或缓冲液液滴中含有凝胶因子，则所述目标液滴中也含有凝胶液滴，在所有步骤之后，还包括步骤(5)：将所述步骤(4)中的的目标液滴固化，固化后的目标液滴为凝胶液滴，该凝胶液滴形成了一个相对封闭的内环境，以减少环境因素对微阵列芯片表面液滴的影响。

作为进一步优选地，在所述步骤(4)中，待缓冲液液滴和母液液滴融合5秒至15分钟，使得对应的缓冲液液滴和母液液滴中的组分由于扩散而趋向一致但并未达到完全一致时，即将辅助芯片移去，并立刻进入步骤(5)，使得固化的目标液滴在不同方向有着不同组分。

按照本发明的另一个方面，还提供了一种用上述方法制备的微阵列芯片。

优选地，所述微阵列芯片表面具有多个独立的亲水区域，且每个所述亲水区域吸附有一个目标液滴，所述目标液滴在微阵列芯片表面投影的形状与所述亲水区域的形状相同，所述目标液滴的体积与所述亲水区域的面积正相关。

按照本发明的另一个方面，还提供了一种用于上述制备方法的基础芯片，包括衬底以及衬底表面的多个独立的亲水区域，所述多个独立的亲水区域由疏水区域相分隔，且每个独立的亲水区域用于吸附一个液滴。该基础芯片既可以用作目标芯片，也可以用作辅助芯片。

上述基础芯片的制备方法如下：

(1)根据所需疏水区域与亲水区域的形貌，设计并制备出PDMS(聚二甲基硅氧烷)印章，所述PDMS印章包括凸起部与凹陷部，所述凸起部的形貌对应疏水区域，所述凹陷部的形貌对应亲水区域；

(2)将PDMS印章与衬底用等离子体处理；其中，所述衬底表面光滑且带有亲水基团；所述亲水基团为羟基、羧酸基、磺酸基、磷酸基、氨基、季铵基等；在常规实验过程中，玻璃基片、表面带有二氧化硅氧化层的硅片以及石英片优选作为衬底使用；其中，等离子体所用的气体为惰性气体、空气、含氧气体(如O₂、CO和CO₂)、或者含氮气体(如N₂、HN₃、NO₂和NO)；

(3)将所述PDMS印章的凸起部与所述衬底表面键合后剥离，使得该衬底表面与所述凸起部键合的区域残留一层纳米级的PDMS薄膜，从而转换为疏水区域，所述衬底表面未与所述凸起部键合的区域即为亲水区域，即制备成所述基础芯片；其中，键合的时间与等离子体处理所用的气体的种类、处理的功率、时间，以及等离子体设备的老化程度都有关，可能为1s～2h之间不等。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有下列有益效果：

1、本发明利用了基础芯片表面亲水区域的吸附特性，直接同时对多个液滴同时进行操作，从而形成复杂的浓度梯度或者凝胶机械强度梯度微阵列，操作过程简单快速；

2、制备形成的微阵列芯片处于一个相对开放的环境中，更便于后续对微液滴的分析和研究；

3、利用多个辅助芯片与目标芯片对接和分离，可以形成多种组分的正交浓度梯度；

4、利用本发明，可在缓冲液液滴和母液液滴中的组分扩散未达到平衡时即对液滴进行固化，从而制备不同方向有不同组分或者机械强度梯度的凝胶液滴，对于研究高通量筛选，药物筛选，组织工程，干细胞分化，个性化医疗，个性化疾病模型等领域都有着重要意义。

附图说明

图1是实施例1中玻璃基片的制备过程示意图；

图2是实施例4中微流体芯片的荧光检测示意图；

图3是实施例6中微液滴阵列形成的示意图；

图4是实施例6中药物浓度梯度微液滴阵列形成的示意图；

图5是实施例7中细胞密度梯度微液滴阵列形成的示意图；

图6是实施例8中荧光浓度梯度微液滴阵列的验证结果；

图7是实施例9中细胞密度梯度微液滴阵列的验证结果；

图8是实施例12中细胞密度梯度和药物浓度梯度正交微阵列形成的示意图；

图9是实施例17中双组分微凝胶阵列形成的示意图；

图10是实施例21中互补的多组分化学微环境形成的示意图；

图11是实施例21中互补的多组分化学微环境的荧光检测结果；

图12是实施例22中立体微凝胶阵列形成的示意图；

图13是实施例22中立体微凝胶阵列的荧光成像检测图；

在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：其中1-玻璃基片；2-PDMS印章；3-疏水区域；4-亲水区域；5-缓冲液液滴6-吸管；7-药物a溶液液滴；8-药物浓度梯度液滴阵列的形成；9-细胞a悬液；10-细胞密度梯度微液滴阵列的形成；11-浓度梯度正交微液滴阵列的形成；12-细胞b悬液；13-双组分微凝胶阵列；14-含有Fluorescein的凝胶液滴15-含有罗丹明的凝胶液滴；16-z轴方向为不同细胞组分的凝胶液滴。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供了一种制备微阵列芯片的方法，包括选取基础芯片、芯片对接以及芯片分离等步骤，通过操控目标芯片和辅助芯片表面的母液和缓冲液融合后分裂，从而改变对应的液滴中的组分。其中，所述基础芯片为一个目标芯片以及一个至多个辅助芯片，所述基础芯片包括衬底以及衬底表面的多个独立的亲水区域，所述多个独立的亲水区域由疏水区域相分隔，且每个独立的亲水区域用于吸附一个液滴，所述液滴的体积与对应的亲水区域的面积正相关。

所述液滴的体积与对应的亲水区域的面积的相关性与许多因素有关，例如亲水区域的形状、面积，以及液滴的组分。优选地，所述独立的亲水区域的形状为圆形、规则多边形且直径小于5mm，所述液滴的体积与对应的亲水区域的面积相关性较大。当液滴包含表面活性剂时，液滴的表面张力变小，从而液滴的体积与对应的亲水区域的面积的相关性变小，而当液滴中包含凝胶因子时，液滴的内聚力变大，从而能使在亲水区域的面积较大时，液滴的体积还能与对应的亲水区域的面积具有较大的相关性。

根据研究对象的不同，液滴的成分可以为水、溶液或者悬浊液，其中，溶液优选为药物溶液、荧光素溶液以及凝胶因子溶液等常用于微阵列芯片的溶液，悬浊液优选为细胞悬浊液、细菌悬浊液或者纳米颗粒悬浊液。

将液滴添加于基础芯片表面时，可以直接用吸管滴加液滴，使液滴自动吸附于亲水区域，形成液滴微阵列，也可以用移液枪或者滴管吸取液滴选择性地划过某一部分的亲水区域，使得这一部位的亲水区域吸附所操作的液滴，然后用同样的方法使其它部位的亲水区域吸附不同成分的液滴，使得形成的液滴微阵列中的液滴包含不完全相同的成分。例如基础芯片的亲水区域在某一行上对齐排列时，用移液枪吸取一种液滴从所有位于该行的亲水区域表面划过，则该行的亲水区域表面都吸附了此种液滴；可以用同样的方法使另一行的亲水区域表面吸附不同成分的液滴；从而使同一基础芯片表面吸附多个不同成分的液滴。还可以将基础芯片浸入液体中，使表面的亲水区域自然吸附形成液滴。

所述基础芯片的制备方法如下：

(1)根据所需的亲水区域和疏水区域的形貌设计出光刻掩膜；当使用阴模光刻胶，如AZ-50时，掩膜的形貌与所需疏水区域的形貌相同，使用阳模光刻胶，如SU-8时，掩膜的形貌与所需亲水区域的形貌相同；

(2)利用阴模光刻或者阳模光刻，制备出具有相应形貌的PDMS(聚二甲基硅氧烷)印章，所述PDMS印章包括凸起部与凹陷部，所述凸起部的形貌对应疏水区域，所述凹陷部的形貌对应亲水区域；

(3)将PDMS印章与衬底用等离子体处理；其中，所述衬底表面光滑且带有亲水基团；所述亲水基团为羟基、羧酸基、磺酸基、磷酸基、氨基、季铵基等；在常规实验过程中，玻璃基片、表面带有二氧化硅氧化层的硅片以及石英片优选作为衬底使用；由于玻璃基片价格便宜，而且是透明材料更便于操作，而做为最优选的材料；其中，等离子体所用的气体为惰性气体、空气、含氧气体(如O₂、CO和CO₂)、或者含氮气体(如N₂、HN₃、NO₂和NO)等能提供材料表面能的等离子气体，优选为O₂或O₃；

(4)将所述PDMS印章的凸起部与所述衬底表面键合后剥离，使得该衬底表面与所述凸起部键合的区域残留一层纳米级的PDMS薄膜，从而转换为疏水区域，所述衬底表面未与所述凸起部键合的区域即为亲水区域，即制备成所述基础芯片；其中，键合的时间与等离子体处理所用的气体的种类、处理的功率、时间，以及等离子体设备的老化程度都有关，可能为1s～2h之间不等。

除了该制备方法外，还有其它方法也能制备出有类似功能的基础芯片，例如在硅片上制备出图案化的光刻胶涂层，利用表面改性的方法降低光刻胶涂层以外区域的表面能(例如用氟气的等离子体处理)，从而形成疏水区域，再溶去光刻胶，从而形成亲水区域。

利用上述基础芯片制备微阵列芯片的具体步骤如下：

(1)选取目标芯片：所述目标芯片表面具有多个亲水区域，每个所述亲水区域吸附有一个缓冲液液滴；

(2)选取辅助芯片：所述辅助芯片表面在所述步骤(1)中的目标芯片每个亲水区域的对应位置，具有数量相同或数量不等的一个或多个亲水区域，每个所述亲水区域吸附有一个母液液滴；

(3)芯片对接：将所述目标芯片的表面与所述辅助芯片的表面相对贴近，使得目标芯片的亲水区域吸附的缓冲液液滴，与辅助芯片对应位置的亲水区域吸附的母液液滴融合；

(4)芯片分离：待缓冲液液滴和母液液滴融合5秒以上，使得对应的缓冲液液滴和母液液滴中的组分趋向一致，将辅助芯片移去，得到的目标芯片即为所述微阵列芯片，所述微阵列芯片的每个亲水区域吸附有一个目标液滴，所述目标液滴的体积与对应的亲水区域在所述步骤(1)中吸附的缓冲液液滴的体积相同；根据缓冲液液滴和母液液滴的体积和组分不同，所需融合的时间也不相同，液滴中的组分扩散越快，液滴的体积越小，所需融合的时间则越短。

当所述目标芯片的亲水区域的面积相同时，所述目标液滴的体积相同。

优选地，所述辅助芯片表面在所述步骤(1)中的目标芯片每个亲水区域的对应位置，具有数量相同的N个亲水区域，其吸附的母液液滴分别为第一液滴、第二液滴至第N液滴，所有第i液滴的母液中组分的浓度相同，而第一液滴至第N液滴的母液中组分的浓度可能不同,其中，N为大于等于2的整数，i为1～N的任意整数。所述组分为纳米颗粒、细胞、细菌或者药物，该方法，可以操控目标芯片上的缓冲液液滴与第一液滴至第N液滴同时进行融合。

优选地，所述步骤(1)中的辅助芯片为多个辅助芯片，在所述步骤(3)和步骤(4)中，所述多个辅助芯片依次与目标芯片对接后分离。

作为进一步优选地，所述一个或多个辅助芯片表面在所述步骤(1)中的目标芯片每个亲水区域的对应位置，具有一个亲水区域，且所述母液液滴与缓冲液液滴中组分的浓度不同，所述辅助芯片表面的亲水区域的面积不同，该方法可以用于在微阵列芯片上形成浓度梯度的多个液滴。其原理在于，假设一个对应的缓冲液液滴与母液液滴的体积分别为m和n，液滴中组分的浓度分别为x和y，母液液滴与缓冲液液滴融合后，第一组分在融合的微液滴中完全平均分布；则融合后的第一组分的含量为(xm+yn)/(m+n)，该公式可变形为：当所述目标芯片的亲水区域的面积相同时，缓冲液液滴的体积相同，即m值恒定，对于同一对液滴而言，x、y和m都是定值，但由于母液液滴的体积不完全相同，n为变化值；由该公式可知，如果y>x，当n较大时，融合后的目标液滴里组分的浓度也较高，分裂后的目标液滴里的组分的浓度也会较高；分裂后的目标液滴体积仍然与亲水区域的面积大小正相关，因此分裂后的目标液滴的体积仍然相同，而一组分的浓度与相对应的母液液滴的体积正相关；反之，如果y<x，则分裂后的目标液滴中所含第一组分的比例与相对应的母液液滴的体积负相关。因此形成的微阵列芯片中所有液滴具有相同的体积，而含有不同浓度的组分。该微阵列芯片可用于高通量筛选，例如，当组分为药品时，目标液滴形成了不同浓度梯度的药品液滴，组分为凝胶因子时，目标液滴形成了不同浓度梯度的机械强度凝胶液滴。

作为进一步优选地，所述多个辅助芯片为行辅助芯片和列辅助芯片，述目标芯片与所述多个辅助芯片的亲水区域排列为相同的矩形阵列；在所述矩形阵列中，所述目标芯片的亲水区域的面积相同，所述行辅助芯片表面位于同一行的亲水区域的面积不同，位于同一列的亲水区域的面积相同，所述列辅助芯片表面位于同一行的亲水区域的面积不同，位于同一列的亲水区域的面积相同。作为进一步优选地，所述组分为第一组分和第二组分，所述行辅助芯片的缓冲液液滴与母液液滴具有浓度不同的第一组分，所述列辅助芯片的缓冲液液滴与母液液滴具有浓度不同的第二组分，制备所得的微阵列芯片中的目标液滴，在所述矩形陈列中，同一行上具有相同的第二组分，不同的第一组分，同一列上具有相同的第一组分，不同的第二组分。

优选地，所述母液液滴和/或缓冲液液滴中含有凝胶因子，在所有步骤之后，还包括步骤(5)：将所述步骤(4)中的的目标液滴固化，形成凝胶液滴。

其中，所述的固化方法与对应的凝胶因子的种类相关，例如当凝胶因子为低温琼脂糖时，可以在琼脂糖的熔点之上的温度对液滴进行操作，待冷却后即固化；当凝胶因子为PEGDA时，紫外光照射即可进行固化；凝胶因子为海藻酸钠时，可通过添加CaCl₂溶液进行固化；凝胶的机械强度和孔隙大小则与凝胶因子分子的大小和凝胶因子的浓度有关。通过对凝胶因子的分子大小和浓度进行选择，可以制备不同机械强度的凝胶液滴，从而使得凝胶液滴有不同的透过率。例如当研究对象为细菌或细胞的迁移时，需要孔隙较大的凝胶液滴，而在固定细胞前提下，进行小分子药物的研究时，则需要孔隙较小的凝胶液滴。

作为进一步优选地，在所述步骤(4)中，待缓冲液液滴和母液液滴融合5秒至15分钟，使得对应的缓冲液液滴和母液液滴中的组分由于扩散而趋向一致但并未达到完全一致时，即将辅助芯片移去，并立刻进入步骤(5)，使得形成的凝胶液滴中的组分在液滴中具有浓度梯度的分布，可以制得不同方向上具有不同组分分布的凝胶液滴。

利用上述方法制备得到的微阵列芯片，其表面具有多个独立的亲水区域，且每个所述亲水区域吸附有一个目标液滴，所述目标液滴在微阵列芯片表面投影的形状与亲水区域的形状相同，所述目标液滴的体积与亲水区域的面积正相关。

利用本发明的方法，不仅制备获得了微阵列芯片，还制备获得了微阵列芯片中的凝胶液滴，该凝胶液滴可以为水平方向成分不同的各向异性凝胶液滴，也可以为竖直方向成分不同的各向异性凝胶液滴，或者不同方向上机械强度不同的各向异性凝胶液滴。

实施例1玻璃基片的制备

步骤一：软光刻技术制作阳模

将光刻胶SU-8(1070)甩于洗净烘干的硅片上(700r 18s，2500r 60s)，前烘除去SU-8胶中的溶剂(65℃15min,95℃2hour)，使SU-8阳模与硅片更好地贴合，然后进行光刻(3.5mJ/cm²)，光刻采用的掩膜板是根据阳模的形状来设置的，其中光刻的时间为60s；然后置于热平板上进行后烘(65℃15min,95℃2hour)，使阳模与硅片更加贴合，之后经显影液显影后，再进行坚膜(135℃)1小时以上，达到SU-8与硅片的紧密贴合的效果，即可得具微结构的SU-8阳模，测得其高度约20μm。

步骤二：PDMS印章的制备

制作出阳模后，再用快速成型方法将阳模的微结构复制到PDMS印章上。即将PDMS单体与交联剂按10:1混合，待混合完全后然后将PDMS倒于阳模上，将固化后的PDMS揭起并切边即可得到厚约1cm的PDMS印章，PDMS印章的凸起部和阳模的形状相同。

步骤三：基片的制备

选择玻璃基片1作为基片，将PDMS印章2和玻璃基片1清洗干净并用氧等离子体处理后，将PDMS印章2与玻璃基片1键合，键合后立即将PDMS印章2剥下，使得玻璃基片与凸起部键合的区域残留一层纳米级的PDMS薄膜。玻璃基片1表面原本是亲水性质，但此时该区域变成了疏水区域3；而键合时与PDMS印章2上凹陷部相对的区域依然保持为亲水区域4。玻璃基片1的亲水区域4的大小和形状和PDMS印章2上凹陷部的大小和形状完全相同，如图1所示。

通过设计阳模或阴模，可以加工与亲水区域具有相应形貌的PDMS印章，进而得到带有所需亲水区域形状的基片。PDMS印章上除了带有微孔还可以带有微沟道，或者带有微孔和微沟道的组合。

实施例2

以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤一中采用AZ-50为光刻胶为AZ50,掩膜板根据PDMS印章凹陷部来设置，并利用AZ-50相应的制备工艺制备PDMS印章。

实施例3

以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，所述基片为表面有二氧化硅氧化层的硅片。

实施例4

以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，所述PDMS印章上为微沟道(如图2a所示)，或者微孔和微沟道的组合(如图2b所示)，将带有荧光染料的液滴添加于玻璃基片1之上，从显微镜下观察可见，液滴吸附于亲水区域表面而形成微流体，如图2所示，其中图2a的标尺长度为400μm，图2b的标尺长度为600μm。

实施例5

以所述的相同步骤重复实施例4，区别在于，所述微沟道为长20毫米宽200微米的长条形亲水区域。将缓冲液液滴用吸管添加于玻璃基片上，由于玻璃基片表面的亲疏水性的差异，液滴自动附着形成长20毫米宽200微米的微液流。将微电极分别插入长条形微液流的两端。利用微移液枪将蛋白质样品加样于液滴区域的一端。加样样品后，立刻在蛋白质样品一端加上0V电压，另一端加上110V电压。在样品中蛋白质的等电点大于液滴的pH时，蛋白质从加样断泳向另一端，在电泳过程中，带电荷不同的蛋白质在电泳中分开。

实施例6药物浓度梯度微液滴阵列芯片

步骤一：以实施例1所述方法分别加工两片玻璃基片1，分别为第1玻璃基片1和第2玻璃基片1，亲水区域的形状都为圆形，阵列都为17×17的矩形阵列，上下或左右相邻两个亲水区域圆心的距离都为2毫米。其中第1玻璃基片1的亲水区域的直径都为1毫米；而第2玻璃基片1亲水区域x轴方向的直径相同，y轴方向的亲水区域直径随行数的增加而增加(第1行直径为400μm，每行增加50μm，直至最后一行直径为800μm)。

步骤二：将缓冲液液滴5用吸管6滴加于第1玻璃基片1上，由于玻璃基片1上的亲疏水性的差异，液滴无法附着于疏水区域3，亲水区域4则自动吸附液滴，从而形成相应大小和形状的微液滴阵列，成为第1微流体芯片，如图3所示。用同样的方法将药物a溶液液滴7滴加于第2玻璃基片1上，制备获得第2微流体芯片。

步骤三：将两片微流体芯片面对面放置，通过显微镜对准使得两块玻璃基片1中的微液滴阵列对应；接着，我们通过将两块玻璃基片1上的微液滴彼此接触，将缓冲液微液滴阵列5和药物溶液微液滴阵列6互相混合，相对应的液滴通过扩散作用而浓度趋向一致；由于第2玻璃基片1上的微液滴6含有药物a，而第1玻璃基片1上的微液滴5不含药物，这个过程相当于第2玻璃基片1上的药物a微液滴被稀释，由于药物a微液滴的大小不同，而缓冲液微液滴的大小相同，所以同一列中的药物a微液滴被稀释的倍数也不同，从而形成了药物a的浓度梯度；待药物扩散后，将两组玻璃基片1分离从而分裂微液滴，由于玻璃基片1表面亲水区域的面积不变，分裂后的微液滴保持融合前的体积，从而第1玻璃基片1上形成了体积相同而药物浓度不同的微液滴阵列8，如图4所示。

实施例7细胞密度梯度微液滴阵列芯片

以所述的相同步骤重复实施例6，区别在于，以第3微流体芯片取代第2微流体芯片，以第3玻璃基片1取代第2玻璃基片1，以细胞a悬液9取代药物溶液，第3玻璃基片1位于同一列的亲水区域4直径相同，位于同一行的亲水区域4直径随列数的增加而增加(第1列直径为400μm，每列增加50μm，直至最后一列800μm)，第3玻璃基片1与吸附于表面的细胞密度梯度微液滴10构成了微阵列芯片，制备过程如图5所示。制备所得的微液滴阵列具有体积相同而细胞密度不同的微液滴。

实施例8荧光浓度梯度微液滴阵列芯片

以所述的相同步骤重复实施例6，区别在于，所述缓冲液液滴含有质量分数为10％的PEGDA溶液，药物溶液含有10％的PEGDA以及4μM(10^-6mol/L)Fluorescein，微液滴阵列的融合时间为3分钟，分裂后用500mW紫外线高于液滴50mm照射20秒固化成微凝胶，并进行荧光定量对Fluorescein的浓度进行检测，其化学浓度梯度结果如图6所示。其中横坐标表示微凝胶的行序，纵坐标表示微凝胶中Fluorescein的浓度，可以看到，每一行的微凝胶中的荧光素的浓度依次增加，形成了较好的化学浓度梯度。

实施例9

以所述的相同步骤重复实施例8，区别在于，以浓度为1.5×10⁶/ml的钙黄绿素染色的细胞取代荧光素，并用荧光成像的方法进行细胞计数，结果见图7。其中横坐标表示微凝胶的列序，纵坐标表示微凝胶中细胞的密度，可以看到，每一列的微凝胶中的细胞的密度依次增加，形成了较好的细胞密度梯度。

实施例10

以所述的相同步骤重复实施例9，区别在于细胞悬液中不含有PEGDA。形成微液滴阵列为从吸附玻璃基片的一端至远离玻璃基片的一端，机械强度逐渐变大的微凝胶形成的微阵列，该机械强度梯度微凝胶的性质可用于诱导干细胞分化。

实施例11

以所述的相同步骤重复实施例9，区别在于缓冲液液滴中不含有PEGDA，所形成凝胶液滴阵列为在z轴方向从下至上，机械强度逐渐变大的微凝胶形成的微阵列。

实施例12浓度梯度正交微液滴阵列芯片

步骤一：以实施例6所述方法在第1玻璃基片1上制备获得药物浓度梯度微阵列芯片。

步骤二：以所述的相同步骤重复实施例6，区别在于，以步骤一制得的药物浓度梯度微阵列芯片取代第1微流体芯片，以实施例7中的第3微流体芯片取代第2微流体芯片，结果如图8所示，在第1玻璃基片1上形成了细胞密度和化学浓度正交梯度环境微液滴阵列11，位于同一行的微液滴中所含的药物a浓度随列序依次增加，而所含的细胞a密度相同；位于同一列的微液滴中所含的药物a浓度相同，所含的细胞a密度随行序依次增加。此微阵列芯片可用于药物浓度对细胞作用的研究，如用于研究细胞的群体耐受性和群体凋亡。

实施例13

以所述的相同步骤重复实施例12，区别以于，以药物b溶液取代第3玻璃基片表面的细胞悬液，第1玻璃基片上形成的微液滴阵列为ab两种药物浓度梯度的正交阵列。

实施例14

以所述的相同步骤重复实施例12，区别在于，以质量分数为20％的PEGDA取代药物a，步骤二之后用500mW紫外线高于液滴50mm照射20秒固化成凝胶液滴，同一行的微液滴机械强度随着列序逐渐增加。

该微阵列芯片可以应用于生物力学研究和干细胞分化研究，如充间质干细胞(MSC)在不同强度的凝胶中分化成不同的细胞，在较高的强度环境下分化成骨细胞，随着凝胶的机械强度下降，还可以分化成软骨细胞，肌腱细胞，韧带细胞，肌腱细胞，神经细胞等等。

实施例15

以所述的相同步骤重复实施例13，并在步骤二之后，将第1玻璃基片和第4玻璃基片相对放置，使对应的微液滴融合；分离第1玻璃基片和第4玻璃基片，使融合的微液滴分裂，分离后的第1玻璃基片与吸附于表面的微液滴构成了所述微阵列芯片；所述第四玻璃基片表面吸附有与第1玻璃基片数量和排列相同的微液滴阵列，而该微液滴阵列为浓度均一的细胞悬液。则在形成的微阵列芯片上，微液滴阵列为含有浓度均一的细胞，且两种药物浓度梯度为正交排列的微阵列。

该微阵列芯片可用于研究药物对细胞的协同作用。例如当药物a为化疗药物，药物b为多药耐药反转药物，所述细胞悬液为肿瘤细胞悬液时，所述微阵列芯片用于研究化疗药物和多药耐药反转药物协同治疗肿瘤。

实施例16

以所述的相同步骤重复实施例12，并选取第4玻璃基片，且第4玻璃基片表面吸附有与第1玻璃基片数量和排列相同的微液滴阵列，微液滴中含有质量分数为20％的PEGDA，在步骤二之后，将第1玻璃基片和第4玻璃基片相对放置，使对应的微液滴融合；在PEGDA尚未扩散达到完全一致时，即分离第1玻璃基片和第4玻璃基片，使融合的微液滴分裂，然后对紫外光照射使所述微液滴固化成为微凝胶，第1玻璃基片与吸附于表面的微凝胶构成了所述微阵列芯片；则在形成的微阵列芯片上，微凝胶阵列为细胞密度和化学浓度正交排列，且机械强度从下至上逐渐变高的微凝胶阵列。

实施例17双组分微凝胶阵列芯片

步骤一：以所述的相同步骤重复实施例6，区别在于，第1玻璃基片1亲水区域阵列为17×17，上下或左右相邻两个中心的距离都为1200μm，亲水区域直径为400μm；而第2玻璃基片1的亲水区域阵列为34×17，每个亲水区域直径为150μm，一行的每两个亲水区域成对放置，成为一个亲水区域组，其对称点距上下或左右的对称点距离为1200μm，相对的亲水区域中心间距350μm。

步骤二：将缓冲液液滴滴加于第1玻璃基片1上，形成大小和形状相同的缓冲液液滴；用移液器或者毛细管划过第2玻璃基片1上的奇数行的亲水区域以滴加细胞a悬液9，再在偶数行用同样的方法滴加细胞b悬液12，便形成交错排列的细胞悬液阵列，每一对吸附于同一亲水区域组的微液滴组成一个液滴岛。这三种液滴中都含有质量分数为10％的PEGDA。

步骤三：将两组微液滴阵列面对面放置，通过显微镜对准使得第1玻璃基片1的亲水区域中心，与第2玻璃基片1中对称点一一对应；接着，我们通过将两块基片上的微液滴彼此接触使对应的微液滴混合而成分趋向一致，5分钟后分开并立刻用500mW紫外线高于样品50mm照射20秒使液滴固化，由于第2玻璃基片1上的成对微液滴之间有一定的间隔且细胞的扩散需要一定时间，固化后的微凝胶阵列中的异种细胞并未完全混合，而是每个微凝胶含有两个相对独立的细胞体系，如图9所示的双组分微凝胶阵列芯片13。

该芯片能用于可控的空间排列两种细胞，不同种类的细胞空间位置可控的排列可以诱导产生一些特殊的细胞行为学上的变化，比如迁移和分化，用于构建高通量的药物筛选模型，如两种细胞悬液中的细胞分别为内皮细胞(ECs)，和诱导充间质干细胞(MSC)，所述微阵列芯片用于研究ECs对MSC的诱导迁移及分化。

实施例18

以所述的相同步骤重复实施例17，区别在于，三种液滴中都不含有PEGDA，而第2玻璃基片的亲水区域阵列为34×17，奇数行的亲水区域每行的直径相同，每一列，亲水区域直径随行数的增加而增加(第1行直径为50μm，每行增加10μm，直至最后一行直径为210μm)，用于吸附药物溶液；偶数行的亲水区域每列的直径相同，每一行，亲水区域直径随列数的增加而增加(第1列直径为50μm，每列增加10μm，直至最后一列直径为210μm)，用于吸附细胞悬液，所形成的微阵列芯片功能与实施12类似，为细胞密度梯度和药物浓度梯度正交微阵列芯片。

实施例19

以所述的相同步骤重复实施例17，区别在于，第1玻璃基片亲水区域直径为800μm；而第2玻璃基片1的亲水区域阵列为51×17，同一行上的每三个亲水区域为一组，分别作为左、中、右亲水区域，同一组上的左、中、右亲水区域的中心间隔250μm，每个亲水区域的中心对称点与相邻亲水区域的中心对称点间距为1200μm；其中左亲水区域x轴方向的直径相同，y轴方向的直径随行数的增加而增加(第1行直径为50μm，每行增加10μm，直至最后一行直径为210μm)，用于吸附药物a溶液；右亲水区域y轴方向的直径相同，x轴方向的直径随列数的增加而增加(第1列直径为50μm，每列增加10μm，直至最后一列直径为210μm)，用于吸附药物b溶液，中亲水区域则直径都为50μm。所形成的微阵列芯片与实施15类似，微液滴阵列为含有浓度均一的细胞，且两种药物浓度梯度的正交排列的微阵列。

实施例20

以所述的相同步骤重复实施例17，区别在于，而第2玻璃基片上的亲水区域组包括两个到四个不规则排列的亲水区域，当第1玻璃基片和第2玻璃基片相对放置时，一个亲水区域组中的所有第2亲水区域在第1玻璃基片上的投影都和一个第1亲水区域有重合区域，使得相对应的第2液滴岛中所有的第2微液滴都与一个第1微液滴融合，而该第1亲水区域和其它不相对应的第2亲水区域没有重合部分，从而使得该第1微液滴不会与其它第2微液滴融合。

实施例21互补的多组分化学微环境芯片

步骤一：以实施例1所述方法加工一片玻璃基片1，亲水区域阵列为41×41，每一个单独的亲水性微区域阵列大小为直径800μm，相邻两个亲水区域中心的距离为1200μm。

步骤二：将Fluorescein浓度为500nM的2％琼脂糖溶液的液滴14滴加于玻璃基片1上，由于玻璃基片1上的亲疏水性的差异，疏水性区域液滴无法附着，亲水性区域则自动附着形成相应大小和形状的液滴，固化后则形成凝胶阵列。

步骤三：待琼脂糖凝胶冷却固化后，我们将甲基丙烯酸甲酯硅油(methacrylatesilane)滴加在玻璃基片1表面，几分钟后洗掉甲基丙烯酸甲酯硅油(也可采用氧离子体处理)，原来的疏水区域则转为亲水性；此时再将质量体积比为10％的PEGDA(聚乙二醇双丙烯酸酯,分子量1000)、光引发剂2-hydroxy-1-(4-(hydroxyethoxy)phenyl)-2-methyl-1-propanone(Irgacure2959,Ciba Geigy,0.05％w/v)以及500nM罗丹明15滴加于玻璃基片1上，待附着均匀后用500mW紫外线高于样品50mm照射20秒固化，如图10所示。

用荧光成像对微阵列中同一行相邻的八个液滴在液滴中心的连线的延长线进行检测，结果如图11所示，可以看到，两种成分通过扩散形成了互补的作用效果。

该微阵列芯片可用于研究凝胶微环境之间的相互作用，例如，每一个微凝胶中的信号分子如何扩散，以至调控相邻的微环境，或者每一个微凝胶中的药物缓释，从而影响周围的细胞。

实施例22立体微凝胶阵列芯片

步骤一：以实施例4所述方法加工一片玻璃基片1，亲水区域阵列为41×41，每一个单独的亲水区域直径为400μm，相邻两个亲水区域中心的距离为800μm。

步骤二：将含有10％的PEGDA的细胞a悬液加于第1玻璃基片1上，由于玻璃基片1上的亲疏水性的差异，疏水性区域液滴无法附着，亲水性区域则自动附着形成相应大小和形状的微液滴,然后500mW紫外线高于液滴50mm照射20秒使液滴固化成凝胶微液滴。

步骤三：将含有10％的PEGDA的细胞b悬液滴加于玻璃基片1之上，由于凝胶颗粒为亲水性，其它区域依然保持疏水性，第2层凝胶将形成于第1层凝胶之上，再用同样的方法进行固化后便形成具有两层不同细胞分子的立体凝胶微液滴阵列16，如图12所示。

用荧光成像的方法对凝胶微液滴阵列的侧面进行检测，结果如图13所示，图中的矩形边框宽度为300μm，由于细胞a和细胞b分别用DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)和DiO(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine,4-chlorobenzenesul-fonate salt)进行了染色，可以看到上下两层有分布均匀的荧光，证明该方法可以制备获得z轴方向分布均匀的凝胶微液滴。

实施例23

以所述的相同步骤重复实施例22，区别在于，每一个单独的亲水性微区域阵列大小为直径10μm，以四氧化三铁纳米颗粒的凝胶悬浊液取代细胞a悬液，以凝胶溶液取代细胞b悬液。将立体凝胶微阵列从玻璃基片上取下，获得直径为10μm的盘状凝胶颗粒，且盘状的底端具有磁性纳米颗粒。

实施例24

以所述的相同步骤重复实施例22，区别在于，以药物b溶液替代细胞b悬液，在步骤三之后，再进行步骤四：

将含有10％的PEGDA的细胞b悬液滴加于玻璃基片1之上，第3层凝胶将形成于第2层凝胶之上，再用同样的方法进行固化后便形成具有三层立体凝胶液滴阵列，从底层至顶层的成分分别含有细胞a、药物b和细胞b，该微阵列芯片可同时观察药品对两种细胞的作用效果。

实施例25

以所述的相同步骤重复实施例22，区别在于，在步骤三之后，再进行步骤四：

将含有10％的PEGDA的细胞c悬液滴加于玻璃基片1之上，第3层凝胶将形成于第2层凝胶之上，再用同样的方法进行固化后便形成具有三层立体凝胶液滴阵列，从底层至顶层的成分分别含有细胞a、b和c。

该微阵列芯片可用于组织工程或者药物模型，如在z轴方向分别排列组成不同种类的皮肤细胞，包括上皮细胞、成纤维细胞以及肥大细胞，或者血管细胞，包括血管上皮细胞、纤维细胞和肌肉细胞。

实施例26

以所述的相同步骤重复实施例25，区别在于，在步骤四之后，再将药物a溶液添加于第3层凝胶之上，形成的立体液滴阵列，从底层至顶层的成分分别含有细胞a、药物b、细胞b和药物a，该微阵列芯片可同时观察药品对两种细胞的作用效果，以及两种药物对细胞b的作用效果。

从以上实施例可以证实，我们可以对每一个微凝胶微环境在空间上的组成进行精确控制，不仅可以XY轴方向上定义不同的组分，还能在Z轴方向定义不同的组分。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种微阵列芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选取目标芯片：所述目标芯片表面具有多个亲水区域，滴加缓冲液液滴，使缓冲液液滴自动吸附于亲水区域，使得每个所述亲水区域吸附有一个缓冲液液滴；

(2)选取辅助芯片：所述辅助芯片表面在所述步骤(1)中的目标芯片每个亲水区域的对应位置，具有一个或多个亲水区域，滴加母液液滴，使母液液滴自动吸附于亲水区域，使得每个所述亲水区域吸附有一个母液液滴；

所述缓冲液液滴和母液液滴分别在所述目标芯片和辅助芯片表面投影的形状与对应的亲水区域的形状相同，体积与亲水区域的面积正相关；

(3)芯片对接：将所述目标芯片的表面与所述辅助芯片的表面相对贴近，使得目标芯片的亲水区域吸附的缓冲液液滴，与辅助芯片对应位置的亲水区域吸附的母液液滴融合；

(4)芯片分离：待缓冲液液滴和母液液滴融合5秒以上，将辅助芯片移去，得到的目标芯片即为所述微阵列芯片，所述微阵列芯片的每个亲水区域吸附有一个目标液滴。

2.如权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述目标芯片的亲水区域的面积相同。

3.如权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述辅助芯片表面在所述步骤(1)中的目标芯片每个亲水区域的对应位置，具有N个亲水区域，其吸附的母液液滴分别为第一液滴、第二液滴至第N液滴，所有第i液滴的母液的组分分别相同，i为一到N的任意整数。

4.如权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述辅助芯片为多个辅助芯片，所述多个辅助芯片依次与目标芯片对接后分离。

5.如权利要求4所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述目标芯片与所述多个辅助芯片的亲水区域排列为相同的矩形阵列，所述多个辅助芯片为行辅助芯片和列辅助芯片；所述目标芯片的亲水区域的面积相同，所述行辅助芯片表面位于同一行的亲水区域的面积不同，位于同一列的亲水区域的面积相同，所述列辅助芯片表面位于同一行的亲水区域的面积不同，位于同一列的亲水区域的面积相同。

6.如权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述母液液滴和/或缓冲液液滴中含有凝胶因子，还包括步骤(5)：将所述步骤(4)中的目标液滴固化。

7.如权利要求6所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，待缓冲液液滴和母液液滴融合5秒至15分钟，将辅助芯片移去。

8.一种微阵列芯片，其特征在于，利用权利要求1-7中任意一项所述方法制备。