CN110982667B - 一种单细胞分散微流控芯片及制备和操作方法 - Google Patents

一种单细胞分散微流控芯片及制备和操作方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110982667B
CN110982667B CN201911338048.2A CN201911338048A CN110982667B CN 110982667 B CN110982667 B CN 110982667B CN 201911338048 A CN201911338048 A CN 201911338048A CN 110982667 B CN110982667 B CN 110982667B
Authority
CN
China
Prior art keywords
module layer
layer
dispersion module
shear force
dispersion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911338048.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110982667A (zh
Inventor
庞龙
袁皓月
葛玉鑫
范江霖
范士冈
张军峰
靳亚茹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xian Medical University
Original Assignee
Xian Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xian Medical University filed Critical Xian Medical University
Priority to CN201911338048.2A priority Critical patent/CN110982667B/zh
Publication of CN110982667A publication Critical patent/CN110982667A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110982667B publication Critical patent/CN110982667B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
    • C12M45/02—Means for pre-treatment of biological substances by mechanical forces; Stirring; Trituration; Comminuting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明公开了一种单细胞分散微流控芯片，包括流体剪切力分散模块层、微结构阵列分散模块层以及它们中间的隔离粘附层，流体剪切力分散模块层主要用于较大尺寸(100～2000μm)的组织块或组织球进行单细胞分散。微结构阵列分散模块层是将小尺寸(100μm以下)的组织块或组织球进行单细胞分散。本发明还公开了该微流控芯片的制备方法和操作方法，具有操作简单快捷、低消耗的特点，能够广泛应用于多种平行高通量与多重复式单细胞操作与分析应用。

Description

一种单细胞分散微流控芯片及制备和操作方法
技术领域
本发明属于细胞生物学及微流控芯片技术领域，具体涉及一种单细胞分散微流控芯片，还涉及一种单细胞分散微流控芯片分散微流控芯片的制备方法，还涉及一种单细胞分散微流控芯片分散微流控芯片的操作方法。
背景技术
肿瘤是仅次于心血管疾病的全球第二大杀手，研究表明肿瘤细胞的异质性为肿瘤发生、转移和耐药性的关键因素。肿瘤细胞的异质性的研究需要对肿瘤细胞进行不同亚群的分类和研究，而单个肿瘤细胞水平的研究逐渐成为了肿瘤细胞异质性研究的主要方法。但是单细胞水平的分析和研究的首要条件是如何将肿瘤组织块或肿瘤球分散成单细胞。
将肿瘤球或肿瘤组织分散成单个肿瘤细胞悬液的传统方法主要采用酶消化法，这种方法可以将肿瘤球或肿瘤组织分散成为高通量的单个肿瘤细胞。但是，目前大多数的酶都存在临床安全问题，因为这些酶都来自于动物。虽然合成酶的发展有助于缓解这些担忧，但是采用合成蛋白水解酶仍然会降低甚至破坏细胞膜蛋白的活性，而肿瘤细胞膜蛋白在肿瘤细胞识别和代谢中起到关键作用。因此迫切需要一种不依赖于生物或者化学特性而单纯依靠机械分散进行肿瘤球或组织单细胞分散的新方法。
随着微流控芯片技术的发展使机械分散单细胞成为可能，微流控芯片技术可以将传统的生物医学实验设备微型化，具有高度集成化、对细胞操控精确化，高通量等特点。目前基于微流控芯片技术进行单细胞机械分散主要包括了微结构分散法和流体剪切力分散法。微结构分散法通常采用间隔很小(20～50微米)的缝隙进行单细胞分散，这种方法的优点是可以不受流速的限制而进行单细胞分散，但是其缺点是由于缝隙很小，因此很容易发生微结构的堵塞从而影响单细胞分散效率。流体剪切力分散法主要是利用在特殊的收缩扩展管道中，高流速条件下产生的流体剪切力将组织块或者肿瘤球进行单细胞分散，其优点是不存在微管道堵塞的问题，而且可以产生高通量的单细胞，但是这种分散方法需要对流体的精确操控，而且往往需要进行多次分散操作。
发明内容
本发明第一个目的是提供一种单细胞分散微流控芯片，通过设计一种集合流体剪切力和微结构阵列的微流控芯片实现对组织块或肿瘤球首先进行流体剪切力分散，将组织块或肿瘤球先分散成为相对较小的组织块或肿瘤球，再采用微结构阵列分散成为单细胞，解决了现有微结构单细胞分散细胞的芯片容易堵塞造成样品浪费的问题。
本发明第二个目的是提供一种单细胞分散微流控芯片的制备方法，该方法操作简单，容易掌握。
本发明的第三个目的是提供一种单细胞分散微流控芯片的操作方法。
本发明所采用第一种的技术方案是，一种单细胞分散微流控芯片，包括流体剪切力分散模块层和微结构阵列分散模块层，流体剪切力分散模块层和微结构阵列分散模块层之间设有隔离粘附层；
流体剪切力分散模块层包括至少一组微管道构成，每组微管道包括收缩扩张微管道，收缩扩张微管道包括至少3组重复的收缩扩张管道单元；微结构阵列分散模块层包括至少一组微结构阵列，每组微结构阵列由5～10列多排复杂微结构构成，相邻的微结构阵列之间的距离为1000μm。
本发明采用第一种技术方案的特点还在于，
收缩扩展管道单元包括间隔排列的宽通道和窄通道，宽通道和窄通道的尺寸自流体剪切力分散模块层的入口方向到出口方向依次减小，宽通道与窄通道的尺寸关系如下：
Ln＝ln (1)
Dn＝Ln (2)
ln＝(3～5)dn (3)
Ln＝2Ln+1 (4)
ln＝2ln+1 (5)
Dn＝2Dn+1 (6)
dn＝2dn+1 (7)
其中，n为自然数，Ln为第n个宽通道管道长度，Ln+1为第n+1个宽通道管道长度，ln为第n个宽通道管道宽度，ln+1为第n+1个宽通道管道宽度，Dn为第n个窄通道管道长度，Dn+1为第n+1个窄通道管道长度，dn为第n个窄通道管道宽度，dn+1为第n+1个窄通道管道宽度。
相邻列复杂微结构之间的距离为70～100μm，复杂微结构的两端分别为三角形，两个三角形之间为长方形结构，其中，每列中相邻复杂微结构之间的距离P相等，相邻列中相邻复杂微结构之间的距离P的数值从自微结构阵列分散模块层的入口方向到出口方向依次减小，P的范围为25～75μm。
流体剪切力分散模块层、隔离粘附层和微结构阵列分散模块层的材质均为PDMS聚合物。
流体剪切力分散模块层的管道高度B1为125～500μm，微结构阵列分散模块层的管道高度B2为25～50μm，流体剪切力分散模块层与隔离粘附层的长度相等，微结构阵列分散模块层的长度小于隔离粘附层的长度，微结构阵列分散模块层与隔离粘附层的长度差B3为2 000μm。
本发明所采用的第二种技术方案为：一种单细胞分散微流控芯片的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1，制备流体剪切力分散模块层：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂，同时使用三甲基氯硅烷蒸汽处理流体剪切力分散模块层模具5min～10min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的流体剪切力分散模块层模具上，抽真空脱气并置于80℃～100℃烘箱中加热固化0.5h～1h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，并打孔制备筛选槽，清洗干净备用；
步骤2，制备微结构阵列分散模块层：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂，同时使用三甲基氯硅烷蒸汽处理微结构阵列分散层模具5min～10min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的微结构阵列分散层模具上，抽真空脱气并置于80℃～100℃烘箱中加热固化0.5h～1h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，并打孔制备筛选槽，清洗干净备用；
步骤3，制备隔离粘附层：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂，同时使用三甲基氯硅烷蒸汽处理隔离粘附层模具5min～10min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的隔离粘附层模具上，抽真空脱气并置于80℃～100℃烘箱中加热固化2h～3h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，清洗干净备用；
步骤4，将步骤1得到的流体剪切力分散模块层和步骤3得到的隔离粘附层粘接键合：
将隔离粘附层表面使用匀胶机涂抹一层质量比为5:1的PDMS基质和固化剂的混合物，并将隔离粘附层置于80℃～100℃烘箱中加热键合10～20min，然后将流体剪切力分散模块层贴合到隔离粘附层上并将其置于80℃～100℃烘箱中加热键合5h～10h；
步骤5，将步骤2得到的微结构阵列分散模块层和步骤4得到的贴合流体剪切力分散模块层的隔离粘附层粘接键合：
将隔离粘附层中未贴合流体剪切力分散模块层的表面使用匀胶机涂抹一层PDMS基质和固化剂的混合物，并将其置于80℃～100℃烘箱中，加热键合10～20min，然后将微结构阵列分散模块层贴合到隔离粘附层相应位置上，并将其置于80℃～100℃烘箱中，加热键合100h～200h，沿着微流控芯片三层结构侧面贴合处用胶水进行涂抹封闭微控芯片待用。
步骤5中微流控芯片的侧面的封闭还可以通过将PDMS基质和固化剂按照质量比10:1混合后涂抹到微控芯片三层结构侧面贴合处，置于80℃～100℃烘箱中，加热键合100h～200h使其牢固键合。
步骤4和步骤5中PDMS基质和固化剂的混合物中PDMS基质和固化剂的质量比均为20:1。
本发明所采用的第三种技术方案为：一种单细胞分散微流控芯片的操作方法，具体包括如下步骤：
步骤1，微控流控芯片使用前先使用紫外灯照射2h，然后灌入医用酒精进行消毒，最后灌入表面活性剂F127；
步骤2，在流体剪切力分散模块层和微结构阵列分散模块层中分别吸入不含血清的细胞培养液；
步骤3，将含有肿瘤球的细胞培养液通过流体剪切力分散模块层的入口吸入；
步骤4，将不含血清的细胞培养液冲洗流体剪切力分散模块层；
步骤5，将步骤1～4所吸的所有液体全部通过微结构阵列分散模块层排出到一个新的细胞培养皿，即可以得到本发明肿瘤球分散成的单细胞悬液。
本发明的有益效果是，本发明单细胞分散微流控芯片，在流体剪切力分散模块层中设计了较大尺寸的收缩扩张管道进行大细胞团块到小细胞团块的分散，微结构阵列分散模块层中设计了孔隙不等的微结构阵列进行小细胞团块到单细胞的分散。相对于以往微流控芯片内的单纯依靠微结构或流体剪切力单细胞分散的操作，其可以在进行较大尺寸细胞样品单细胞分散时达到高通量和高效率的特点。该芯片的制备方法及操作方法简单易操作，在单细胞分散方面具有操作简单快捷、样品与能量低消耗等特点，能够广泛应用于多种生物样品的单细胞分散、操作与分析应用。本芯片对流体流速的精度要求不高、操作简单，可将较大的细胞团块或细胞球分散得到的细胞活力好且单一细胞含量高的细胞悬液。本芯片可用于科研中肿瘤球或干细胞团的分散，也可用于临床肿瘤组织穿刺活检，因此具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明的单细胞分散微流控芯片的整体结构示意图；(A)为流体剪切力分散模块层结构示意图，(B)为微结构阵列分散模块层结构示意图，图中黑色箭头代表着流体流动方向。
图2是本发明的单细胞分散芯片的横截面示意图；
图3是本发明流体剪切力分散模块层结构俯视图；
图4是本发明流体剪切力分散模块层结构俯视图虚线部分的局部放大图；
图5是本发明微结构阵列分散模块层结构俯视图，其中(A)为整体示意图，(B)为(A)中虚线方框放大图，
图6是本发明的单细胞分散微流控芯片的一组操作示意图，(A)为流体剪切力分散模块层和微结构阵列分散模块层分别吸入2mL细胞培养液对芯片内的管道进行润洗和包被示意图，(B)为流体剪切力分散模块层1mL吸入肿瘤球悬液初步进行肿瘤球的单细胞分散的示意图，(C)吸入3mL细胞培养液对芯片内的剩余的肿瘤球进行冲洗和二次分散的示意图，(D)将所吸的所有液体全部通过微结构阵列分散模块层排出到一个新的细胞培养皿中就可以得到肿瘤球分散成的单细胞悬液的示意图，图中黑色箭头代表着流体流动方向；
图7是本发明的单细胞分散微流控芯片进行神经胶质瘤球分散，其中(A)为使用胰酶和芯片分散前后肿瘤球和细胞的典型白光图，(B)为分别使用胰酶和芯片分散后单细胞占比统计图；
图8是本发明的单细胞分散微流控芯片进行神经胶质瘤球分散后细胞活力统计图；
图9是本发明的单细胞分散微流控芯片进行神经胶质瘤球分散后重新接种后的细胞培养7d的白光图。
图1、2中，1.流体剪切力分散模块层，2.隔离粘附层，3.微结构阵列分散模块层，4.微管道，5.收缩扩张微管道，6.收缩扩张管道单元，7.微结构阵列，8.复杂微结构。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明一种单细胞分散微流控芯片，包括流体剪切力分散模块层1和微结构阵列分散模块层3，流体剪切力分散模块层1和微结构阵列分散模块层3的结构如图1所示，如图2所示，为本发明单细胞分散微流控芯片的横截面示意图，流体剪切力分散模块层1和微结构阵列分散模块层3之间设有隔离粘附层2，流体剪切力分散模块层1的管道高度B1为125～500μm，微结构阵列分散模块层3的管道高度B2为25～50μm之间，隔离粘附层2的厚度为2mm～2cm，流体剪切力分散模块层1与隔离粘附层2的长度相等，微结构阵列分散模块层3的长度小于隔离粘附层2的长度，微结构阵列分散模块层3与隔离粘附层2的长度差B3为2 000μm。
其中，流体剪切力分散模块层1包括至少一组微管道4，每组微管道4包括收缩扩张微管道5，收缩扩张微管道5包括至少3组重复的收缩扩张管道单元6，收缩扩展管道单元6包括间隔排列的宽通道6-1和窄通道6-2，宽通道6-1和窄通道6-2的尺寸自流体剪切力分散模块层1的入口方向到出口方向依次减小，如图3及图4所示，为宽通道6-1和窄通道6-2的结构示意图，宽通道6-1与窄通道6-2的尺寸关系如下：
Ln＝ln (1)
Dn＝Ln (2)
ln＝(3～5)dn (3)
Ln＝2Ln+1 (4)
ln＝2ln+1 (5)
Dn＝2Dn+1 (6)
dn＝2dn+1 (7)
其中，n为自然数，Ln为第n个宽通道6-1管道长度，Ln+1为第n+1个宽通道6-1管道长度，ln为第n个宽通道6-1管道宽度，ln+1为第n+1个宽通道6-1管道宽度，Dn为第n个窄通道6-2管道长度，Dn+1为第n+1个窄通道6-2管道长度，dn为第n个窄通道6-2管道宽度，dn+1为第n+1个窄通道6-2管道宽度。
如图5所示，为本发明微结构阵列分散模块层结构俯视图，其中(A)为整体示意图，(B)为(A)中虚线方框放大图，微结构阵列分散模块层3包括至少一组微结构阵列7，每组微结构阵列7由5～10列多排复杂微结构8构成，相邻列之间的距离为70～100μm，复杂微结构8两端为三角形，中间为长方形，其中，每列中相邻复杂微结构8之间的距离P相等，相邻列中相邻复杂微结构8之间的距离P的数值从自微结构阵列分散模块层3的入口方向到出口方向依次减小，P的范围为25～75μm，相邻的微结构阵列7相距1000μm。
从功能的角度，该微流控芯片的基本功能单元是由流体剪切力分散模块和微结构阵列分散模块共同组成，其中流体剪切力分散模块主要的功能是将较大尺寸(100～2000μm)的组织块或组织球进行单细胞分散，微结构阵列分散模块的功能是将小尺寸(100μm)以下的组织块或组织球进行单细胞分散。
本发明中三层结构的材料均为聚二甲基硅氧烷(PDMS，polydimethylsiloxane)聚合物，通过将不同比例的PDMS聚合物进行不可逆封接，保证芯片中微管道和微结构的一致性和独立性。
本发明一种单细胞分散微流控芯片的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1，制备流体剪切力分散模块层1：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，同时，使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan，TMCS)蒸汽处理流体剪切力分散模块层模具5min～10min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的流体剪切力分散模块层模具上，抽真空脱气并置于80℃～100℃烘箱中加热固化0.5h～1h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，并打孔制备筛选槽，清洗干净备用；
步骤2，制备微结构阵列分散模块层3：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，同时，使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan，TMCS)蒸汽处理微结构阵列分散模块层模具5min～10min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的微结构阵列分散模块层模具上，抽真空脱气并置于80℃～100℃烘箱中加热固化0.5h～1h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，并打孔制备筛选槽，清洗干净备用；
步骤3，制备隔离粘附层2：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，同时，使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan，TMCS)蒸汽处理隔离粘附层模具5min～10min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的隔离粘附层模具上，抽真空脱气并置于80℃～100℃烘箱中加热固化2h～3h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，清洗干净备用；
步骤4，将步骤1得到的流体剪切力分散模块层1和步骤3得到的隔离粘附层2粘接键合：
将隔离粘附层2表面使用匀胶机(中科院-微电子KW-4A型台式旋钮匀胶机)涂抹一层按质量比20:1混合的PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号：SYLGARD 184)，并将其置于80℃～100℃烘箱中加热键合10～20min，然后将流体剪切力分散模块层1小心的贴合到隔离粘附层2上并将其置于80℃～100℃烘箱中，加热键合5h～10h；
步骤5，将步骤2得到的微结构阵列分散模块层3和步骤4得到的贴合流体剪切力分散模块层1的隔离粘附层2粘接键合：
将隔离粘附层2中未贴合流体剪切力分散模块层1的表面使用匀胶机(中科院-微电子KW-4A型台式旋钮匀胶机)，涂抹一层按质量比20:1混合的PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD 184)，并将其置于80℃～100℃烘箱中，加热键合10～20min，然后将微结构阵列分散模块层1小心的贴合到隔离粘附层2相应位置上，并将其置于80℃～100℃烘箱中，加热键合100h～200h，沿着微流控芯片三层结构侧面贴合处用胶水进行涂抹封闭微流控芯片待用。
步骤5中微流控芯片的侧面的封闭还可以通过将PDMS基质和固化剂按照质量比10:1混合后涂抹到微流控芯片三层结构侧面贴合处，置于80℃～100℃烘箱中，加热键合100h～200h使其牢固键合。
本发明一种单细胞分散微流控芯片的操作方法，如图6所示，具体操作包括如下步骤：
步骤1，微流控芯片使用前先使用紫外灯照射2h以增加PDMS表面的亲水性，然后灌入医用酒精进行消毒，最后灌入表面活性剂F127阻止分散过程中细胞黏附到PDMS表面从而降低分散效率。
步骤2，借助一定的器械如注射器、移液枪，在流体剪切力分散模块层1和微结构阵列分散模块层3分别吸入不含血清的细胞培养液进行芯片内的管道进行润洗。
步骤3，借助一定的器械如注射器、移液枪，将含有肿瘤球的细胞培养液通过流体剪切力分散模块层1的入口吸入，当流体通过不同尺寸的收缩扩展管道时产生的流体剪切力将肿瘤球分散为较小的细胞团块。
步骤4，借助一定的器械如注射器、移液枪吸入不含血清的细胞培养液，不含血清的细胞培养液可以将芯片内的剩余的肿瘤球或细胞团块进行冲洗和二次分散，同时可以冲洗芯片可以提高芯片的使用寿命。
步骤5，借助一定的器械如注射器、移液枪，将步骤1～4所吸的所有液体全部通过微结构阵列分散模块层2排出到一个新的细胞培养皿，即可以得到肿瘤球分散成的单细胞悬液。
上述细胞培养液可为DMEM培养液或1640细胞培养液。
注：可根据实际分散情况和使用工具适当增加步骤3～5，以提高单细胞分散效率。
实施例1
本发明的申请人实验室设计的微流控芯片，如图2所示，流体剪切力分散模块层1的微通道高度B1＝200μm，微结构阵列分散模块层3的微通道高度B2＝40μm，微结构阵列分散模块层3与隔离粘附层2的长度差B3＝2000μm，隔离粘附层2的厚度＝2mm。
本实施例中包括一组微管道4，宽窄相间的收缩扩展管道单元6共包括3组，L1为2500μm，L2为1250μm，L3为625μm，D1为2500μm，D2为1250μm，D3为625μm，l1为2500μm，l2为1250μm，l3为625μm，d1为500μm，d2为250μm，d3为125μm；三组窄通道6-2的通道宽度分别为500、250和125μm，每组收缩扩张管道结构单元6的重复数分别为4、8和8个。
本实施例中微结构阵列分散模块层3主要包括了4组微结构阵列7，每组微结构阵列7由10列5排复杂微结构8构成，相邻列之间的距离为100μm，这种结构可以在中低流速时通过挤压进行较小细胞团块的分散，每列中复杂微结构8由两端的等边三角形和中间的正方形构成，边长为100μm。从左至右第1组微结构阵列7每列中相邻复杂微结构8之间的间距P1＝75μm，第2组微结构阵列7每列中相邻复杂微结构8之间的间距P2＝60μm，第3组微结构阵列7每列中相邻复杂微结构8之间的间距P3＝50μm，第1组微结构阵列7每列中相邻复杂微结构8之间的间距P4＝25μm，相邻的微结构阵列7相距1 000μm。
本发明一种单细胞分散微流控芯片的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1，制备流体剪切力分散模块层1：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，同时，使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan，TMCS)蒸汽处理流体剪切力分散模块层模具5min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的流体剪切力分散模块层模具上，抽真空脱气并置于80℃烘箱中加热固化1h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，并打孔制备筛选槽，清洗干净备用；
步骤2，制备微结构阵列分散模块层3：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，同时，使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan，TMCS)蒸汽处理微结构阵列分散模块层模具5min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的微结构阵列分散模块层模具上，抽真空脱气并置于80℃烘箱中加热固化1h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，并打孔制备筛选槽，清洗干净备用；
步骤3，制备隔离粘附层2：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，同时，使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan，TMCS)蒸汽处理隔离粘附层模具5min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的隔离粘附层模具上，抽真空脱气并置于80℃烘箱中加热固化3h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，清洗干净备用；
步骤4，将步骤1得到的流体剪切力分散模块层1和步骤3得到的隔离粘附层2粘接键合：
将隔离粘附层2表面使用匀胶机(中科院-微电子KW-4A型台式旋钮匀胶机),涂抹一层按质量比20:1混合的PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，并将其置于80℃烘箱中，加热键合20min，然后将流体剪切力分散模块层1贴合到隔离粘附层2上并将其置于100℃烘箱中，加热键合7h；
步骤5，将步骤2得到的微结构阵列分散模块层3和步骤4得到的贴合流体剪切力分散模块层1的隔离粘附层2粘接键合：
将隔离粘附层2中未贴合流体剪切力分散模块层1的表面使用匀胶机(中科院-微电子KW-4A型台式旋钮匀胶)，涂抹一层按质量比20:1混合的PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD 184)，并将其置于90℃烘箱中，加热键合13min，然后将微结构阵列分散模块层1贴合到隔离粘附层2相应位置上，并将其置于80℃烘箱中，加热键合200h，沿着微流控芯片三层结构侧面贴合处用胶水进行涂抹封闭微流控芯片待用。
所采用的肿瘤球由人神经胶质瘤细胞(U251)制备，U251细胞从中科院上海研究所获得。采用DMEM/F12中加入B27(1×)、重组人表皮生长因子(20ng/mL)、碱性成纤维细胞生长因子(20ng/mL)、白血病抑制因子(10ng/mL)进行人神经胶质肿瘤培养。为了验证分散后的单细胞的活力采用FDA/PI双染法。FDA/PI双染法具体步骤如下：首先去除细胞培养液后用PBS进行漂洗，然后使用FDA/PI(5μg/mL用PBS稀释)标记溶液加入细胞样品中孵育10min。最后再用PBS润洗5min。通过荧光显微镜进行细胞计数然后计算细胞活力。
一种单细胞分散微流控芯片的操作方法如图6所示，该装置采用最大量程为5mL的移液枪。首先流体剪切力分散模块层1和微结构阵列分散模块层3分别吸入细胞培养液(本例使用的细胞培养液为DMEM/F12)2mL对芯片内的管道进行润洗和包被，如图(A)所示；其次，流体剪切力分散模块层1吸入含肿瘤球的细胞培养液1mL初步进行肿瘤球的单细胞分散，如图(B)所示；然后，吸入细胞培养液3mL对芯片内的剩余的肿瘤球进行冲洗和二次分散，如图(C)所示，最后将所吸的所有液体全部通过微结构阵列分散模块层3排出到一个新的细胞培养皿中就可以得到肿瘤球分散成的单细胞悬液，如图(D)所示。
如图7所示为单细胞分散微流控芯片进行神经胶质瘤球的单细胞分散，其中(A)为使用胰酶和芯片分散前后肿瘤球和细胞的典型白光图，图中标尺为50μm。(B)为分别使用胰酶和芯片分散后单细胞占比统计图。从图中可以看出使用分散芯片进行分散后单细胞占比和使用胰酶进行分散后单细胞占比差距不大。
如图8是本发明的单细胞分散微流控芯片进行神经胶质瘤球分散后细胞活力统计图。为了检测单细胞分散微流控芯片操作对细胞活力的影响，本实验使用FDA/PI对分散后的细胞进行双染检测细胞活力。FDA/PI双染法具体步骤如下：首先去除细胞培养液后用PBS进行漂洗，然后使用FDA/PI(5μg/mL用PBS稀释)标记溶液加入细胞样品中孵育10min。最后再用PBS润洗5min。通过荧光显微镜进行细胞计数然后计算细胞活力。从图7中可以看出使用分散芯片进行分散和使用胰酶进行分散后活力与使用胰酶进行分散的细胞活力差距不大。
图9是本发明的单细胞分散芯片进行神经胶质瘤球分散后重新接种后的细胞培养7d的白光图。为了更进一步的探讨分离后细胞的活性，将经过不同处理的单细胞悬液回收后以5 000个cell/mL的密度进行重新接种6孔板进行培养，使用的细胞培养液为DMEM/F12高糖细胞培养液(含10％的Gibco胎牛血清)，图中标尺为50μm。从图中可以看出使用分散芯片进行分散后单细胞占比和使用胰酶进行分散后活力与使用胰酶进行分散的细胞活力差距不大。
实施例2
本发明的申请人实验室设计的微流控芯片，如图2所示，流体剪切力分散模块层1的微通道高度B1＝125μm，微结构阵列分散模块层3的微通道高度B2＝25μm，隔离粘附层2的厚度＝5mm，微结构阵列分散模块层3与隔离粘附层2的长度差B3＝2 000μm。
本实施例中包括两组微管道4，宽窄相间的收缩扩展管道单元6共包括4组，L1为2500μm，L2为1250μm，L3为625μm，L4为312μm，D1为2500μm，D2为1250μm，D3为625μm，D4为312μm，l1为2500μm，l2为1250μm，l3为625μm，l4为312μm，d1为625μm，d2为312μm，d3为156μm，d4为78μm；四组窄通道6-2的通道宽度分别为625、312、156和78μm，每组收缩扩张管道结构单元6的重复数分别为4、8、8和8个。
本实施例中微结构阵列分散模块层3主要包括了2组微结构阵列7，每组微结构阵列7由8列10排复杂微结构8构成，这种结构可以在中低流速时通过挤压进行较小细胞团块的分散，列之间的距离为85μm。每列中复杂微结构由两端的等边三角形和中间的正方形构成，边长为100μm。从左至右第1组微结构阵列7每列中相邻复杂微结构8之间的间距P1＝65μm，第2组微结构阵列7每列中相邻复杂微结构8之间的间距P2＝50μm，相邻的微结构阵列7相距1 000μm。
本发明的一种单细胞分散微流控芯片的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1，制备流体剪切力分散模块层1：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，同时，使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan，TMCS)蒸汽处理流体剪切力分散模块层1模具7min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的流体剪切力分散模块层模具上，抽真空脱气并置于85℃烘箱中加热固化40min，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，并打孔制备筛选槽，清洗干净备用；
步骤2，制备微结构阵列分散模块层3：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，同时，使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan，TMCS)蒸汽处理微结构阵列分散层模具10min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的微结构阵列分散层模具上，抽真空脱气并置于100℃烘箱中加热固化0.5h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，并打孔制备筛选槽，清洗干净备用；
步骤3，制备隔离粘附层2：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，同时，使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan，TMCS)蒸汽处理隔离粘附层模具7min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的隔离粘附层模具上，抽真空脱气并置于100℃烘箱中加热固化2.5h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，清洗干净备用；
步骤4，将步骤1得到的流体剪切力分散模块层1和步骤3得到的隔离粘附层2粘接键合：
将隔离粘附层2表面使用匀胶机(中科院-微电子KW-4A型台式旋钮匀胶机),涂抹一层按质量比20:1混合的PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，并将其置于100℃烘箱中，加热键合10min，然后将流体剪切力分散模块层1贴合到隔离粘附层2上并将其置于85℃烘箱中，加热键合10h；
步骤5，将步骤2得到的微结构阵列分散模块层和步骤4得到的贴合流体剪切力分散模块层的隔离粘附层粘接键合：
将隔离粘附层2中未贴合流体剪切力分散模块层1的表面使用匀胶机(中科院-微电子KW-4A型台式旋钮匀胶机)，涂抹一层按质量比20:1混合的PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD 184)，并将其置于80℃烘箱中，加热键合20min，然后将微结构阵列分散模块层3小心的贴合到隔离粘附层2相应位置上，并将其置于95℃烘箱中，加热键合102h，用PDMS基质和固化剂按照质量比10:1混合后涂抹到微流控芯片三层结构侧面贴合处，置于80℃烘箱中，加热键合100h使其牢固键合，键合后放置待用。
实施例3
本发明的申请人实验室设计的微流控芯片，如图2所示，流体剪切力分散模块层1的微通道高度B1＝500μm，微结构阵列分散模块层3的微通道高度B2＝50μm，隔离粘附层2的厚度＝10mm，微结构阵列分散模块层3与隔离粘附层2的长度差B3＝2 000μm。
本实施例中包括三组微管道4，宽窄相间的收缩扩展管道单元6共包括5组，L1为3000μm，L2为1500μm，L3为750μm，L4为375μm，L5为187μm，D1为3000μm，D2为1500μm，D3为750μm，D4为375μm，D5为187μm，l1为3000μm，l2为1500μm，l3为750μm，l4为375μm，l5为187μm，d1为1000μm，d2为500μm，d3为250μm，d4为125μm，d5为62μm；五组窄通道6-2的通道宽度分别为1000、500、250、125和62μm。每组收缩扩张管道结构单元6的重复数分别为4、8、8、10和10个。
本实施例微结构阵列分散模块层3主要包括了3组微结构阵列7，每组微结构阵列7由8列12排复杂微结构8构成，这种结构可以在中低流速时通过挤压进行较小细胞团块的分散，列之间的距离为90μm，每列中复杂微结,8由两端的等边三角形和中间的正方形构成，边长为100μm。从左至右第1组微结构阵列7每列中相邻复杂微结构8之间的间距P1＝50μm，第2组微结构阵列7每列中相邻复杂微结构8之间的间距P2＝40μm，第3组微结构阵列7每列中相邻复杂微结构8之间的间距P3＝25μm，相邻的微结构阵列7相距1 000μm。
本发明一种单细胞分散微流控芯片的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1，制备流体剪切力分散模块层1：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，同时，使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan，TMCS)蒸汽处理流体剪切力分散层模具10min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的流体剪切力分散层模具上，抽真空脱气并置于95℃烘箱中加热固化0.5h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，并打孔制备筛选槽，清洗干净备用；
步骤2，制备微结构阵列分散模块层3：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，同时，使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan，TMCS)蒸汽处理微结构阵列分散层模具8min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的微结构阵列分散层模具上，抽真空脱气并置于95℃烘箱中加热固化45min，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，并打孔制备筛选槽，清洗干净备用；
步骤3，制备隔离粘附层2：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，同时，使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan，TMCS)蒸汽处理隔离粘附层模具9min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的隔离粘附层模具上，抽真空脱气并置于85℃烘箱中加热固化2h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，清洗干净备用；
步骤4，将步骤1得到的流体剪切力分散模块层1和步骤3得到的隔离粘附层2粘接键合：
将隔离粘附层2表面使用匀胶机(中科院-微电子KW-4A型台式旋钮匀胶机)，涂抹一层按质量比20:1混合的PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，并将其置于95℃烘箱中，加热键合13min，然后将流体剪切力分散模块层1小心的贴合到隔离粘附层2上并将其置于90℃烘箱中，加热键合5h；
步骤5，将步骤2得到的微结构阵列分散模块层3和步骤4得到的贴合流体剪切力分散模块层1的隔离粘附层2粘接键合：
将隔离粘附层2中未贴合流体剪切力分散模块层1的表面使用匀胶机(中科院-微电子KW-4A型台式旋钮匀胶机)，涂抹一层按质量比20:1混合的PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD 184)，并将其置于100℃烘箱中，加热键合20min，然后将微结构阵列分散模块层小心的贴合到隔离粘附层相应位置上，并将其置于100℃烘箱中，加热键合100h，用PDMS基质和固化剂按照质量比10:1混合后涂抹到微控芯片三层结构侧面贴合处，置于100℃烘箱中，加热键合200h使其牢固键合，键合后放置待用。
实施例4
本发明的申请人实验室设计的微流控芯片，如图2所示，流体剪切力分散模块层1的微通道高度B1＝400μm，微结构阵列分散模块层3的微通道高度B2＝35μm，隔离粘附层2的厚度＝2cm，微结构阵列分散模块层3与隔离粘附层2的长度差B3＝2 000μm。
本实施例中包括三组微管道4，该宽窄相间的收缩扩展管道单元6共包括4组，L1为3000μm，L2为1500μm，L3为750μm，L4为375μm，D1为3000μm，D2为1500μm，D3为750μm，D4为375μm，l1为3000μm，l2为1500μm，l3为750μm，l4为375μm，d1为1000μm，d2为500μm，d3为250μm，d4为125μm；四组窄通道6-2的通道宽度分别为1000、500、250和125μm。每组收缩扩张管道结构单元6的重复数分别为4、6、8和10个。
本实施例微结构阵列分散模块层3主要包括了1组微结构阵列7，每组微结构阵列7由8列15排复杂微结构8构成，这种结构可以在中低流速时通过挤压进行较小细胞团块的分散，列之间的距离为100μm。每列中复杂微结构8由两端的等边三角形和中间的正方形构成，边长为100μm。从左至右第1组微结构阵列7每列中相邻复杂微结构8之间的间距P1＝75μm，第2组微结构阵列7每列中相邻复杂微结构8之间的间距P2＝50μm，第3组微结构阵列7每列中相邻复杂微结构8之间的间距P3＝25μm，第1组微结构阵列7每列中相邻复杂微结构8之间的间距P4＝12μm，相邻的微结构阵列7相距1000μm。
本发明一种单细胞分散微流控芯片的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1，制备流体剪切力分散模块层1：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，同时，使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan，TMCS)蒸汽处理流体剪切力分散层模具9min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的流体剪切力分散层模具上，抽真空脱气并置于100℃烘箱中加热固化45min，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，并打孔制备筛选槽，清洗干净备用；
步骤2，制备微结构阵列分散模块层3：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，同时，使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan，TMCS)蒸汽处理微结构阵列分散模块层模具7min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的微结构阵列分散模块层模具上，抽真空脱气并置于90℃烘箱中加热固化0.5h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，并打孔制备筛选槽，清洗干净备用；
步骤3，制备隔离粘附层2：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，同时，使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan，TMCS)蒸汽处理隔离粘附层模具10min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的隔离粘附层模具上，抽真空脱气并置于90℃烘箱中加热固化3h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，清洗干净备用；
步骤4，将步骤1得到的流体剪切力分散模块层1和步骤3得到的隔离粘附层2粘接键合：
将隔离粘附层2表面使用匀胶机(中科院-微电子KW-4A型台式旋钮匀胶机),涂抹一层按质量比20:1混合的PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD184)，并将其置于90℃烘箱中，加热键合13min，然后将流体剪切力分散模块层1小心的贴合到隔离粘附层2上并将其置于80℃烘箱中，加热键合9h；
步骤5，将步骤2得到的微结构阵列分散模块层3和步骤4得到的贴合流体剪切力分散模块层1的隔离粘附层2粘接键合：
将隔离粘附层2中未贴合流体剪切力分散模块层1的表面使用匀胶机(中科院-微电子KW-4A型台式旋钮匀胶机)，涂抹一层按质量比20:1混合的PDMS基质和固化剂(采购自美国道康宁公司，编号:SYLGARD 184)，并将其置于85℃烘箱中，加热键合15min，然后将微结构阵列分散模块层3小心的贴合到隔离粘附层2相应位置上，并将其置于90℃烘箱中，加热键合150h，用PDMS基质和固化剂按照质量比10:1混合后涂抹到微流控芯片三层结构侧面贴合处，置于85℃烘箱中，加热键合120h使其牢固键合，键合后放置待用。

Claims (7)

1.一种单细胞分散微流控芯片，其特征在于，包括流体剪切力分散模块层（1）和微结构阵列分散模块层（3），所述流体剪切力分散模块层（1）和微结构阵列分散模块层（3）之间设有隔离粘附层（2）；
所述流体剪切力分散模块层（1）包括至少一组微管道（4），每组微管道（4）包括收缩扩张微管道（5），收缩扩张微管道（5）包括至少3组重复的收缩扩张管道单元（6）；微结构阵列分散模块层（3）包括至少一组的微结构阵列（7），每组微结构阵列（7）由5~10列多排复杂微结构（8）构成，相邻的微结构阵列（7）之间的距离为1000μm；
所述收缩扩展管道单元（6）包括间隔排列的宽通道（6-1）和窄通道（6-2），宽通道（6-1）和窄通道（6-2）的尺寸自流体剪切力分散模块层（1）的入口方向到出口方向依次减小，宽通道（6-1）与窄通道（6-2）的尺寸关系如下：
Ln= ln                                                                  （1）
Dn= Ln（2）
ln=（3~5） dn（3）
Ln= 2Ln+1 （4）
ln=2 ln+1（5）
Dn=2Dn+1 （6）
dn=2dn+1（7）
其中，n为自然数，Ln为第n个宽通道（6-1）管道长度，Ln+1为第n+1个宽通道（6-1）管道长度，ln为第n个宽通道（6-1）管道宽度，ln+1为第n+1个宽通道（6-1）管道宽度，Dn为第n个窄通道（6-2）管道长度，Dn+1为第n+1个窄通道（6-2）管道长度，dn为第n个窄通道（6-2）管道宽度，dn+1为第n+1个窄通道（6-2）管道宽度；
所述相邻列复杂微结构（8）之间的距离为70~100μm，所述复杂微结构（8）的两端分别为三角形，两个三角形之间为长方形结构，其中，每列中相邻复杂微结构（8）之间的距离P相等，相邻列中相邻复杂微结构（8）之间的距离P的数值从自微结构阵列分散模块层（3）的入口方向到出口方向依次减小，P的范围为25~75μm。
2.根据权利要求1所述的一种单细胞分散微流控芯片，其特征在于，所述流体剪切力分散模块层（1）、隔离粘附层（2）和微结构阵列分散模块层（3）的材质均为PDMS 聚合物。
3.根据权利要求1所述的一种单细胞分散微流控芯片，其特征在于，所述流体剪切力分散模块层（1）的管道高度B1为125~500μm，所述微结构阵列分散模块层（3）的管道高度B2为25~50μm，流体剪切力分散模块层（1）与隔离粘附层（2）的长度相等，微结构阵列分散模块层（3）的长度小于隔离粘附层（2）的长度，微结构阵列分散模块层（3）与隔离粘附层（2）的长度差B3为2 000μm。
4.一种权利要求1~3任一项所述的一种单细胞分散微流控芯片的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1，制备流体剪切力分散模块层（1）：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂，同时使用三甲基氯硅烷蒸汽处理流体剪切力分散模块层模具5min～10min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的流体剪切力分散模块层模具上，抽真空脱气并置于80℃～100℃烘箱中加热固化0.5h～1h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，并打孔制备筛选槽，清洗干净备用；
步骤2，制备微结构阵列分散模块层（3）：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂，同时使用三甲基氯硅烷蒸汽处理微结构阵列分散模块层模具5min～10min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的微结构阵列分散模块层模具上，抽真空脱气并置于80℃～100℃烘箱中加热固化0.5h～1h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，并打孔制备筛选槽，清洗干净备用；
步骤3，制备隔离粘附层（2）：
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂，同时使用三甲基氯硅烷蒸汽处理隔离粘附层模具5min～10min，将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的隔离粘附层模具上，抽真空脱气并置于80℃～100℃烘箱中加热固化2h～3h，将固化后的PDMS从模具上剥离，并按照需要进行裁剪，清洗干净备用；
步骤4，将步骤1得到的流体剪切力分散模块层（1）和步骤3得到的隔离粘附层（2）粘接键合：
将隔离粘附层（2）表面使用匀胶机涂抹一层PDMS基质和固化剂的混合物，并将隔离粘附层（2）置于80℃～100℃烘箱中加热键合10～20min，然后将流体剪切力分散模块层（1）贴合到隔离粘附层（2）上并将其置于80℃～100℃烘箱中加热键合5h～10h；
步骤5，将步骤2得到的微结构阵列分散模块层（3）和步骤4得到的贴合流体剪切力分散模块层（1）的隔离粘附层（2）粘接键合：
将隔离粘附层（2）中未贴合流体剪切力分散模块层（1）的表面使用匀胶机涂抹一层PDMS基质和固化剂的混合物，并将其置于80℃～100℃烘箱中，加热键合10～20min，然后将微结构阵列分散模块层（3）贴合到隔离粘附层（2）相应位置上，并将其置于80℃～100℃烘箱中，加热键合100h～200h，沿着微流控芯片三层结构侧面贴合处用胶水进行涂抹封闭微流控芯片待用。
5.根据权利要求4所述的一种单细胞分散微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤5 中微流控芯片的侧面的封闭通过将PDMS基质和固化剂按照质量比10:1混合后涂抹到微流控芯片三层结构侧面贴合处，置于于80℃～100℃烘箱中，加热键合100h～200h使其牢固键合。
6.根据权利要求4所述的一种单细胞分散微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤4和步骤5中PDMS基质和固化剂的混合物中PDMS基质和固化剂的质量比均为20:1。
7.一种权利要求1~3任一项所述的一种单细胞分散微流控芯片的操作方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1，微控流控芯片使用前先使用紫外灯照射2h，然后灌入医用酒精进行消毒，最后灌入表面活性剂F127；
步骤2，在流体剪切力分散模块层（1）和微结构阵列分散模块层（3）中分别吸入不含血清的细胞培养液；
步骤3，将含有肿瘤球的细胞培养液通过流体剪切力分散模块层（1）的入口吸入；
步骤4，将不含血清的细胞培养液冲洗流体剪切力分散模块层（1）；
步骤5，将步骤1~4所吸的所有液体全部通过微结构阵列分散模块层（3）排出到一个新的细胞培养皿，即可以得到本发明肿瘤球分散成的单细胞悬液。
CN201911338048.2A 2019-12-23 2019-12-23 一种单细胞分散微流控芯片及制备和操作方法 Active CN110982667B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911338048.2A CN110982667B (zh) 2019-12-23 2019-12-23 一种单细胞分散微流控芯片及制备和操作方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911338048.2A CN110982667B (zh) 2019-12-23 2019-12-23 一种单细胞分散微流控芯片及制备和操作方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110982667A CN110982667A (zh) 2020-04-10
CN110982667B true CN110982667B (zh) 2023-08-22

Family

ID=70075593

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911338048.2A Active CN110982667B (zh) 2019-12-23 2019-12-23 一种单细胞分散微流控芯片及制备和操作方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110982667B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111500524A (zh) * 2020-04-26 2020-08-07 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种组织单细胞的捕获方法
CN114410443A (zh) * 2020-10-28 2022-04-29 苏州壹达生物科技有限公司 一种冲散细胞团块的装置和方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011027832A1 (ja) * 2009-09-04 2011-03-10 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 有核赤血球濃縮回収用チップ及び有核赤血球濃縮回収方法
CN106552682A (zh) * 2011-03-22 2017-04-05 西维克公司 微流体装置以及制造方法和用途
CN107881106A (zh) * 2017-10-29 2018-04-06 西北工业大学 一种阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片及其制备方法和应用
CN110305788A (zh) * 2019-05-31 2019-10-08 西安医学院 细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化芯片及其制备和操作方法
CN110437992A (zh) * 2019-08-14 2019-11-12 重庆大学 一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片及其使用方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160272934A1 (en) * 2010-10-08 2016-09-22 Cellanyx Diagnostics, Llc Systems, devices and methods for microfluidic culturing, manipulation and analysis of tissues and cells

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011027832A1 (ja) * 2009-09-04 2011-03-10 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 有核赤血球濃縮回収用チップ及び有核赤血球濃縮回収方法
CN106552682A (zh) * 2011-03-22 2017-04-05 西维克公司 微流体装置以及制造方法和用途
CN107881106A (zh) * 2017-10-29 2018-04-06 西北工业大学 一种阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片及其制备方法和应用
CN110305788A (zh) * 2019-05-31 2019-10-08 西安医学院 细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化芯片及其制备和操作方法
CN110437992A (zh) * 2019-08-14 2019-11-12 重庆大学 一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片及其使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Pang, L etal.Single-Cell-Derived Tumor-Sphere Formation and Drug-Resistance Assay Using an Integrated Microfluidics.ANALYTICAL CHEMISTRY.2019,第91卷(第13期),第8318-8325页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110982667A (zh) 2020-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN117264765A (zh) 细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化芯片及其制备和操作方法
Gomez Biological applications of microfluidics
CN107904161B (zh) 一种可视化即时检测病原体核酸的微流控芯片及其制备方法和检测方法
CN101948741B (zh) 一种用于核酸测序的微流体基因芯片
CN105170206B (zh) 一种多指标检测的微流控芯片
CN110982667B (zh) 一种单细胞分散微流控芯片及制备和操作方法
US20130244270A1 (en) Microfluidic device for cell motility screening and chemotaxis testing
CN105713834B (zh) 一种微流控芯片及其制备方法和应用
CN114062679B (zh) 一种基于液滴微流控的单细胞分泌物高通量检测方法和系统
Park et al. Pumpless, selective docking of yeast cells inside a microfluidic channel induced by receding meniscus
WO2012094956A1 (en) Microfluidic device and its use for positioning of cells or organisms
CN110437992B (zh) 一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片及其使用方法
CN102277294A (zh) 一种用于数字核酸扩增的高密度阵列芯片装置及应用
WO2021088936A1 (zh) 一种分离捕获单细胞的微流控芯片及其制备方法和应用
ZHUANG et al. Recent developments in microfluidic chip for in vitro cell-based research
CN210765350U (zh) 一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片
CN209741124U (zh) 一种用于数字核酸分子微量化的阵列芯片装置
CN113564045A (zh) 一种微流控芯片及其在肿瘤干细胞分选、富集中的应用
CN107881106B (zh) 一种阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片及其制备方法和应用
CN102212458A (zh) 基于可变间距微柱阵列的细胞分选结构及其制作方法
Vickers et al. Separation of two phenotypically similar cell types via a single common marker in microfluidic channels
CN108384713B (zh) 一种细胞迁移用微流控芯片及其制备方法
CN102796659A (zh) 一种多孔单细胞观测板及其应用
CN108148752B (zh) 一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法
CN111389474B (zh) 一种用于样本分散的微流控芯片及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant