CN111500524A - 一种组织单细胞的捕获方法 - Google Patents

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范卫华
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Abstract

本发明提供了一种组织切片单细胞的捕获方法，所述方法包括：将组织切片置于单细胞捕获装置中，对单细胞捕获装置施加高压气体，组织切片受到物理力的作用进行单细胞获取。本发明以微流控芯片为基底层，将组织切片置于基底层上，并在组织切片上覆盖在外力作用下可以快速发生形变的保护层，采用瞬时高压气体处理覆盖于组织切片上的保护层，依靠物理力作用实现了组织单细胞的自动捕获。

Description

一种组织单细胞的捕获方法
技术领域
本发明属于单细胞分离技术领域，涉及一种组织切片单细胞的捕获方法。
背景技术
单细胞分析是通过高灵敏性和高特异性的方法检测单个细胞内痕量代谢物的技术。对于组织而言，同一块组织中的不同细胞往往具有相似的基因和生长环境。然而，近年来研究人员发现，同一块组织的不同细胞对相同信号的应激反应可能显著不同，导致细胞内的代谢物可能存在明显的差异。这种单细胞水平的变化与生长、分化、异质性、应激反应、衰老、凋亡、癌变等多种生物学现象相关。因此，研究组织中的单细胞对于在细胞水平了解多种生物学现象具有重要意义。
应用于组织的单细胞分析技术，首先需要从组织中获取单细胞，目前常用的方法包括酶解法和毛细管探针取样法。酶解法是通过各种蛋白酶和胶原酶等酶类对组织进行酶解，再进行单细胞捕获，但是，酶解方法中用到的蛋白酶和胶原酶等酶类对细胞表面的一些蛋白有一定的消化作用，因而使分离的单细胞并不能很好地反映生理状态下细胞的活性，且效率较低。毛细管探针取样法主要通过将极细的毛细管探针插入单个细胞内来吸取细胞溶液，过程复杂、成本高昂、效率低下，且对细胞具有不可逆的破坏作用。
因此，有必要提供一种新的组织单细胞的捕获方法，以克服现有方法的缺陷。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种组织单细胞的捕获方法，所述方法以微流控芯片为基底层，采用瞬时高压气体处理覆盖于组织切片上的保护层，依靠物理力作用实现了组织单细胞的自动捕获。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种组织单细胞的捕获方法，所述方法包括：将组织切片置于单细胞捕获装置中，对单细胞捕获装置施加高压气体，组织切片受到物理力的作用进行单细胞获取。
本发明中，以3D打印的微流控芯片为基底层，将组织切片置于基底层上，并在组织切片上覆盖在外力作用下可以快速发生形变的保护层，通过向保护层施加高压气体，保护层的瞬时形变使组织切片受到外力作用实现单细胞分离，分离的单细胞自动落入微流控芯片的微孔阵列中，捕获效率达99％以上。
优选地，所述单细胞捕获装置包括基底层和保护层，所述保护层位于基底层的上部，所述基底层和保护层之间具有空隙。
本发明中，单细胞捕获装置中的基底层和保护层之间的空隙用于放置组织切片，进行组织中的单细胞分离。
优选地，所述基底层包括微流控芯片。
优选地，所述微流控芯片上设置有微孔阵列。
优选地，所述微孔的孔径为10～25μm，例如可以是10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm或25μm。
本发明中，微流控芯片上的微孔的孔径与细胞的粒径相当，在保护层向组织切片施加向下的物理力的条件下，微孔阵列对组织切片施加向上的物理力，在保护层和微流控芯片的挤压下，组织切片中的单细胞自动落入微流控芯片的微孔阵列中。
优选地，所述微孔的孔深为40～100μm，例如可以是40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm或100μm。
优选地，所述保护层为有机聚合物层。
优选地，所述保护层为聚二甲基硅氧烷层。
优选地，所述保护层的杨氏模量为101～750KPa，例如可以是101KPa、150KPa、200KPa、250KPa、300KPa、350KPa、400KPa、450KPa、500KPa、550KPa、600KPa、650KPa、700KPa或750KPa。
优选地，所述保护层的厚度为40～100μm，例如可以是40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm。
本发明中，采用杨氏模量为101～750KPa、厚度为40～100μm的有机聚合物层作为保护层，可以向组织切片提供适当的压力，既可以实现组织切片中单细胞的分离，又不会使组织切片断裂。
优选地，所述高压气体垂直施加于所述单细胞捕获装置的保护层上。
优选地，所述高压气体的压强为0.5～2.0MPa，例如可以是0.5MPa、1MPa、1.5MPa或2MPa。
优选地，所述高压气体的施加持续时间为1～5ms，例如可以是1ms、2ms、3ms、4ms或5ms。
本发明中，向保护层上垂直施加瞬时高压气体，使得保护层发生瞬时形变，在短时间内完成了组织切片的单细胞分离，单细胞自动落入微孔中。
优选地，所述组织切片的厚度为5～15μm，例如可以是5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm或15μm。
第二方面，本发明提供了一种组织单细胞的捕获装置，所述装置包括基底层和保护层，所述保护层位于基底层的上部，所述基底层和保护层之间具有空隙。
优选地，所述基底层包括微流控芯片。
优选地，所述微流控芯片上设置有微孔阵列。
优选地，所述微孔的孔径为10～25μm，例如可以是10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm或25μm。
优选地，所述微孔的孔深为40～100μm，例如可以是40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm或100μm。
优选地，所述保护层为有机聚合物层。
优选地，所述保护层为聚二甲基硅氧烷层。
优选地，所述保护层的杨氏模量为101～750KPa，例如可以是101KPa、150KPa、200KPa、250KPa、300KPa、350KPa、400KPa、450KPa、500KPa、550KPa、600KPa、650KPa、700KPa或750KPa。
优选地，所述保护层的厚度为40～100μm，例如可以是40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明以3D打印的微流控芯片为基底层，将组织切片置于基底层上，并在组织切片上覆盖在外力作用下可以快速发生形变的保护层，通过向保护层施加高压气体，保护层的瞬时形变使组织切片受到外力作用实现单细胞分离，分离的单细胞自动落入微流控芯片的微孔阵列中；
(2)本发明的方法基于物理原理，不需要酶或毛细管探针的作用，不会对细胞活性造成影响，捕获的单细胞接近于生理状态，方法经济、简洁、高效。
附图说明
图1为组织单细胞捕获流程图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
将组织切片置于单细胞捕获装置的微流控芯片基底层上，基底层上排列有孔径为20μm、孔深为50μm的微孔阵列，在组织切片上覆盖聚二甲基硅氧烷保护层，保护层的杨氏模量为500KPa、厚度为50μm；
向单细胞捕获装置的保护层垂直施加瞬时高压气体，高压气体的压强为1MPa，施加持续3ms，组织切片在保护层和基底层的挤压下实现单细胞分离，分离的单细胞自动落入微孔中。
实施例2
将组织切片置于单细胞捕获装置的微流控芯片基底层上，基底层上排列有孔径为10μm、孔深为40μm的微孔阵列，在组织切片上覆盖聚二甲基硅氧烷保护层，保护层的杨氏模量为750KPa、厚度为40μm；
向单细胞捕获装置的保护层垂直施加瞬时高压气体，高压气体的压强为2MPa，施加持续1ms，组织切片在保护层和基底层的挤压下实现单细胞分离，分离的单细胞自动落入微孔中。
实施例3
将组织切片置于单细胞捕获装置的微流控芯片基底层上，基底层上排列有孔径为25μm、孔深为100μm的微孔阵列，在组织切片上覆盖聚二甲基硅氧烷保护层，保护层的杨氏模量为101KPa、厚度为100μm；
向单细胞捕获装置的保护层垂直施加瞬时高压气体，高压气体的压强为0.5MPa，施加持续5ms，组织切片在保护层和基底层的挤压下实现单细胞分离，分离的单细胞自动落入微孔中。
对比例1
与实施例1相比，微孔阵列的微孔孔径为50μm，其他条件与实施例1相同。
由于微流控芯片上的微孔的孔径显著大于细胞的粒径，保护层和微流控芯片层虽然对组织切片施加了压力，但是无法实现组织切片的单细胞分离，落入微孔中的细胞为若干细胞构成的细胞群。
对比例2
与实施例1相比，微孔阵列的微孔孔径为1μm，其他条件与实施例1相同。
由于微流控芯片上的微孔的孔径显著小于细胞的粒径，在保护层和微流控芯片层的挤压下，组织切片上的单细胞发生形变并破碎，无法完成单细胞的自动捕获。
对比例3
与实施例1相比，高压气体的压强为5MPa，其他条件与实施例1相同。
由于高压气体的压强过大，保护层发生明显形变，造成组织切片断裂。
对比例4
与实施例1相比，高压气体的压强为0.1MPa，其他条件与实施例1相同。
由于高压气体的压强过小，保护层基本未发生形变，无法完成组织切片的单细胞分离。
对比例5
与实施例1相比，高压气体的施加持续时间为10ms，其他条件与实施例1相同。
由于高压气体的施加持续时间过长，保护层发生持续形变，造成组织切片断裂。
对比例6
与实施例1相比，高压气体的施加持续时间为0.1ms，其他条件与实施例1相同。
由于高压气体的施加持续时间过短，保护层基本未发生形变，无法完成组织切片的单细胞分离。
综上所述，本发明以3D打印的微流控芯片为基底层，将组织切片置于基底层上，并在组织切片上覆盖在外力作用下可以快速发生形变的保护层，通过向保护层施加高压气体，保护层的瞬时形变使组织切片受到外力作用实现单细胞分离，分离的单细胞自动落入微流控芯片的微孔阵列中；本发明的方法基于物理原理，不需要酶或毛细管探针的作用，不会对细胞活性造成影响，捕获的单细胞接近于生理状态，方法经济、简洁、高效。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种组织切片单细胞的捕获方法，其特征在于，所述方法包括：将组织切片置于单细胞捕获装置中，对单细胞捕获装置施加高压气体，组织切片受到物理力的作用进行单细胞获取。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单细胞捕获装置包括基底层和保护层，所述保护层位于基底层的上部，所述基底层和保护层之间具有空隙。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基底层包括微流控芯片；
优选地，所述微流控芯片上设置有微孔阵列；
优选地，所述微孔的孔径为10～25μm；
优选地，所述微孔的孔深为40～100μm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述保护层为有机聚合物层；
优选地，所述保护层为聚二甲基硅氧烷层；
优选地，所述保护层的杨氏模量为101～750KPa；
优选地，所述保护层的厚度为40～100μm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述高压气体垂直施加于所述单细胞捕获装置的保护层上；
优选地，所述高压气体的压强为0.5～2.0MPa；
优选地，所述高压气体的施加持续时间为1～5ms。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述组织切片的厚度为5～15μm。
7.一种组织单细胞的捕获装置，其特征在于，所述装置包括基底层和保护层，所述保护层位于基底层的上部，所述基底层和保护层之间具有空隙。
8.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，所述基底层包括微流控芯片；
优选地，所述微流控芯片上设置有微孔阵列；
优选地，所述微孔的孔径为10～25μm；
优选地，所述微孔的孔深为40～100μm。
9.根据权利要求7或8所述的装置，其特征在于，所述保护层为有机聚合物层；
优选地，所述保护层为聚二甲基硅氧烷层。
10.根据权利要求7-9任一项所述的装置，其特征在于，所述保护层的杨氏模量为101～750KPa；
优选地，所述保护层的厚度为40～100μm。
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