KR102371825B1 - 미세유체칩으로부터 선택적으로 세포를 분리하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미세유체칩으로부터 세포를 선택적으로 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법으로 한 종류 이상의 세포를 공배양한 다음 원하는 세포만 선택적으로 분리하여 생물학적 분석에 이용할 수 있다.

Description

미세유체칩으로부터 선택적으로 세포를 분리하는 방법{Selective isolation of cells from microfluidic chips}
본 발명은 미세유체칩으로부터 선택적으로 세포를 분리하는 방법에 대한 것이다.
미세유체칩을 이용한 세포배양 기술의 경우 학계와 산업계에서 뛰어난 성과를 보이고 있다. 기술이 진보함에 따라 더욱 복잡한 세포 배양 방법들이 개발되었고, 한 종류의 세포가 아닌 여러 종류의 세포를 하나의 어레이에서 배양하는 기술이 최근에 많이 이용되고 있다. 여러 종류의 세포들을 미세유체칩 내에서 배양하기 때문에 미세유체칩에서 배양된 세포의 특성을 분석하는 방법은 이미징이나 세포 배양액을 기반으로 진행되었다. 하지만 명확하고 자세한 세포의 특성 평가를 위해서는 세포 자체에 대한 분석이 필수적이고, 세포를 추출하여 유전체 분석이 진행되어야 한다. 이 전의 단순한 세포 배양 모델에서는 세포를 추출하는 과정이 복잡하지 않았지만, 최근 개발된 복잡한 세포 배양 모델에서는 다른 종류의 세포들이 섞이는 과정 없이 개별적으로 세포를 분리해낼 수 있는 방법이 요구된다.
여러가지 세포가 섞여있는 경우 이를 분리해낼 수 있는 방법으로는 유세포분석 (fluorescence-activated cell sorting, FACS)가 있다. 그러나 FACS의 경우 각기 다른 세포를 구분하기 위한 항체와 FACS 분석기기를 필요하다. 하지만 FACS기기의 경우 고가이다. 또한 미세유체칩의 경우 소량의 세포들을 배양하기 때문에 FACS 장비를 사용하기에 적절하지 못하다. 따라서 공동의 공간에서 자란 세포들을 순차적으로 분리해서 세포를 추출할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.
기존의 방식의 경우, 미세유체칩에서 세포를 다시 추출해내는 방법은 매우 한정적이었다. 예를 들면, 1) 세포 전체를 용해하는 버퍼를 넣어서 세포 용해액을 추출하는 방법과, 2) 결착된 미세유체칩을 다시 분리하여 그 안에서 세포를 추출해내는 방법이 있다. 1)번 방법의 경우 미세유체칩 내의 공간이 콜라젠과 같은 다공성 구조로 이루어져있기 때문에 세포 용해액이 다공성 구조를 통해 전달되어 서로 다른 종류의 세포를 배양하는 경우 세포 용해액들이 서로 섞이는 문제점이 발생한다. 따라서 하나의 미세유체칩에서 여러가지 세포를 공동배양할 때에는 세포를 구분할 수 없는 단점이 있다. 2)번 방법의 경우 미세유체칩을 다시 분리하는 과정에서 분리에 실패할 확률이 높고 또한 분리하는 과정에서 세포의 손실이 발생하여 효율이 굉장히 낮다.
이에 본 발명자들은 미세유체칩에서 세포를 선택적으로 분리하는 기술에 대해 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.
US 9,121,847
본 발명의 목적은 미세유체칩으로부터 선택적으로 세포를 분리하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 다음을 포함하는 미세유체칩으로부터 선택적으로 세포를 분리하는 방법을 제공한다:
i) 제1 미디엄(medium) 채널; 제1 하이드로젤 채널; 제1 하이드로젤 분해효소 채널;　제2 하이드로젤 채널; 및 제2 하이드로젤 분해효소 채널이 일련의 순서로 배치된 미세유체칩을 준비하는 단계;
ii) 상기 제1 하이드로젤 채널 및 제2 하이드로젤 채널 각각에 세포가 포함된 하이드로젤을 주입하는 단계;
iii) 상기 세포와 하이드로젤이 주입된 미세유체칩을 인큐베이션하여 세포를 공배양하는 단계;
iv) 상기 미디엄 채널에 5℃ 이하의 미디엄을 주입하고, 상기 모든 하이드로젤 분해효소 채널에 분해효소 활성화온도의 하이드로젤 분해효소를 주입하는 단계;
v) 미디엄과 하이드로젤 분해효소가 주입된 미세유체칩을, 하이드로젤 분해효소 활성화 온도에서 인큐베이션하는 단계; 및
vi) 상기 제1 및 제2 하이드로젤 채널에서 선택적으로 세포를 추출하는 단계.
상기 i) 단계에서, 상기 미세유체칩은
상기 제1 미디엄(medium) 채널; 제1 하이드로젤 채널; 제1 하이드로젤 분해효소 채널;　제2 하이드로젤 채널; 및 제2 하이드로젤 분해효소 채널이 각각 저장소와 연결되고, 그리고 수두차(water pressure)가 발생하도록 상기 제1 미디엄 채널의 저장소의 수면 높이는 상기 제1 및 제2 하이드로젤 분해효소 채널의 저장소의 수면 높이보다 더 높을 수 있다(도 1).
미세유체칩 내에서의 유체의 흐름은 수두차(waterhead pressure)에 의해 발생한다. 이 때 수두차는 제1 미디엄 채널과 하이드로젤 분해효소채널의 저장소에 담겨 있는 유체의 부피 차이로 발생한다. 즉, 저장소의 밑넓이가 동일하니 부피가 큰 용액이 든 저장소의 수면의 높이가 더 높고, 따라서 수두가 높아서 수압이 크므로 수두차가 발생하게 된다.
상기 제1 미디엄(medium) 채널; 제1 하이드로젤 채널; 제1 하이드로젤 분해효소 채널;　제2 하이드로젤 채널; 및 제2 하이드로젤 분해효소 채널이 일련의 순서로 배치되는 것이란, 제 1 미디엄 채널의 일 측면부는 제 1 하이드로젤 채널의 일 측면부와 인접하고, 제 1 하이드로젤 채널의 다른 일 측면부는 제1 하이드로젤 분해효소 채널의 일 측면부와 인접하며, 제1 하이드로젤 분해효소 채널의 다른 일 측면부는 제2 하이드로젤 채널의 일 측면부와 인접하고, 제2 하이드로젤 채널의 다른 일 측면부는 제2 하이드로젤 분해효소 채널의 일 측면부와 인접하는 것을 의미한다(도 1).
상기 ii) 제1 하이드로젤 채널 및 제2 하이드로젤 채널 각각에 세포가 포함된 하이드로젤을 주입하는 단계에서, 상기 세포의 종류는 서로 동일하거나 또는 서로 다를 수 있다.
또한 상기 세포는 질병(예를 들면, 암) 세포일 수 있다.
상기 하이드로젤 채널의 하이드로젤은 다공성 구조로 이루어져 있어서 각각의 채널 사이의 물질 교환이 가능하다.
상기 물질 교환은, 물질의 상호 전달 및/또는 교환을 포함한다.
상기 하이드로젤은, 콜라겐(Collagen),　알지네이트(Alginate), 피브린(Fibrin), 히알루론산(Hyaluronic Acid), 아가로즈(Agarose), PHEMA(Polyhydroxyethylmethacrylate),　PVA(Polyvinyl alcohol),　PEG(Poly(ethylene glycol)), PEO(Poly(ethylene oxide)),　PEGDA(Polyethylene (glycol) diacrylate), 젤라틴(Gelatin), 매트리젤(Matrigel),　PLLA(poly(L-lactic acid)),　카복시메틸셀룰로오스(Carboxymethylcellulose),　덱스트란(Dextran), 키토산(Chitosan) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나. 반드시 이로 한정되는 것은 아니며, 이 기술분야에서 사용 가능한 하이드젤이라면 어느 것이나 사용 가능하다.
상기 하이드로젤 분해효소에 주입되는 하이드로젤 분해효소는 이 기술분야에 알려진 하이드로젤 분해효소라면 어느 것이나 이용할 수 있다. 예를 들면, 콜라게네이즈(collagenase), MMP, 히알루로니데이즈(hyaluronidase), 플라스민(Plasmin) 등이 있다.
상기 iv) 제1미디엄 채널에 5℃ 이하의 미디엄을 주입하고, 상기 모든 효소 채널에 30-40℃의 하이드로젤 분해효소를 주입하는 단계에서, 상기 미디엄 채널에서는 상기 미디엄 채널과 상기 제1 하이드로젤 분해효소 채널 사이의 수두차(waterhead pressure)에 의해 제1 미디엄 채널에서 제1 하이드로젤 분해효소 채널 방향으로 유동이 발생해서 제1 하이드로젤 분해효소 채널에서 제1 하이드로젤 채널 방향으로 하이드로젤 분해효소가 확산(diffusion)되는 것을 방해함으로써, 제1　하이드로젤　채널에 도달하는 하이드로젤 분해효소의 농도가 제2 하이드로젤 채널에 도달하는 하이드로젤 분해효소의 농도보다 낮을 수 있다.
상기 v) 미디엄과 하이드로젤 분해효소가 주입된 미세유체칩을 하이드로젤 효소 배양 최적 온도에서 인큐베이션하는 단계는, 상기 제1 하이드로젤 채널과 제2 하이드로젤 채널의 하이드로젤 분해효소 반응을 조절하는 단계로, 제1　하이드로젤 채널 보다 제2 하이드로젤 채널에 도달하는 하이드로젤 분해효소의 농도가 높고, 제1 하이드로젤 채널보다 제2 하이드로젤 채널의 온도가 높아서, 제1 하이드로젤 채널보다 제2 하이드로젤 채널에서 하이드로젤 분해 반응이 빨리 일어날 수 있다.
상기 iv) 단계에서, 상기 미디엄 채널에 주입되는 5℃ 이하의 미디엄은, 바람직하게는 0-4℃ 이하의 미디엄일 수 있다. 그리고 상기 하이드로젤 분해효소 채널에 주입되는 하이드로젤 분해효소 활성화온도는 바람직하게는 30-40℃ 일 수 있다.
상기 v) 단계는, 상기 하이드로젤 분해효소 활성화 온도는 30 내지 40℃일 수 있다. 바람직하게는 37℃일 수 있다.
상기 vi) 제1 및 제2 하이드로젤 채널에서 선택적으로 세포를 추출하는 단계에서, 상기 제1 하이드로젤 채널보다 제2 하이드로젤 채널에서 하이드로젤 분해효소 반응이 빨리 일어나서 제2 하이드로젤 채널의 하이드로젤이 먼저 용해됨으로써 제2 하이드로젤로부터 세포를 선택적으로 먼저 분리할 수 있다.
상기 i) 단계의 미세유체칩을 준비하는 단계에서, 상기 미세유체칩은, 상기 제1 미디엄(medium) 채널; 제1 하이드로젤 채널; 제1 하이드로젤 분해효소 채널;　제2 하이드로젤 채널; 및 제2 하이드로젤 분해효소 채널에, 제3 하이드로젤 채널 및 제2 미디엄 채널을 일련의 순서로 더 추가하여 배치된 미세유체칩일 수 있다.
상기 제1 미디엄(medium) 채널; 제1 하이드로젤 채널; 제1 하이드로젤 분해효소 채널;　제2 하이드로젤 채널; 및 제2 하이드로젤 분해효소 채널; 제3 하이드로젤 채널 및 제2 미디엄 채널이 각각 저장소와 연결된다. 그리고 수두차(water pressure)가 발생하도록 상기 제1 미디엄 채널과 제2 미디엄 채널의 저장소의 수면 높이는 상기 제1, 제2 및 제3 하이드로젤 분해효소 채널의 저상소의 수면 높이보다 높을 수 있다(도 2).
상기 미디엄 채널과 효소 채널의 위치는 서로 바꿀 수 있다.
다른 구체예에서 본 발명은, 다음 단계를 포함하는 미세유체칩으로부터 선택적으로 세포를 분리하는 방법을 제공한다:
i) 제1 미디엄(medium) 채널; 제1 하이드로젤 채널; 제1 하이드로젤 분해효소 채널;　제2 하이드로젤 채널; 및 제2 하이드로젤 분해효소 채널; 제3하이드로젤 채널; 및 제2미디엄 채널이 일련의 순서로 배치된 미세유체칩을 준비하는 단계;
ii) 상기 제1 하이드로젤 채널, 제2 하이드로젤 채널 및 제3 하이드로젤 채널 각각에 세포가 포함된 하이드로젤을 주입하는 단계;
iii) 상기 세포와 하이드로젤이 주입된 미세유체칩을 인큐베이션하여 세포를 공배양하는 단계;
iv) 상기 미디엄 채널에 5℃ 이하의 미디엄을 주입하고, 상기 모든 효소 채널에 30-40℃의 하이드로젤 분해효소를 주입하는 단계;
v) 미디엄과 하이드로젤 분해효소가 주입된 미세유체칩을, 하이드로젤 효소 배양 최적 온도에서 인큐베이션하는 단계; 및
vi) 상기 제1, 제2 및 제3 하이드로젤 채널에서 선택적으로 세포를 추출하는 단계.
상기 vi) 상기 제1, 제2 및 제3 하이드로젤 채널에서 선택적으로 세포를 추출하는 단계에시, 제2 하이드로젤 채널에서 먼저 선택적으로 세포를 추출할 수 있다.
상기 각 단계에 대한 구체적인 설명은 앞서와 같으므로 생략한다.
본 발명은 미세유체집에서 순차적으로 하이드로젤 기질을 용해하는 기술에 대한 것이다.
본 발명에서 "미세유체칩"이란, 마이크로미터 지름의 미세한 관 안에서 유체 흐름을 조종해 시료를 처리하는 플랫폼을 말한다.
본 발명에서 "대류"란, 외부의 힘(수두차)에 의해 유체 유동이 강제적으로 생길때 발생하는 대류를 말한다.
본 발명에서 "확산"이란, 분자들이 스스로 움직여 퍼져가는 현상을 말한다.
하이드로젤로 대표적인 것은 세포외 기질(extracellular matrix)을 예로 들 수 있다. 다공성 하이드로젤은 물질 전달이 가능하기 때문에 양측에 다른 수두차(waterhead pressure)가 존재할 시, 수두가 높은 곳에서 낮은 곳으로 다공성 하이드로젤 기질을 통하여 유동이 발생하게 된다. 이 때의 유량은 수두차가 0이 될 때까지 발생하며, 다공성 하이드로젤 기질의 유량저항과 수두차이 크기에 따라 다르다(대류, convection).
또한, 하이드로젤 분해효소는 버퍼 용액에 녹여진 상태로 존재하게 되는데, 이 때 하이드로젤 기질을 원할하게 용해시키기 위해서는 특정 온도와 특정 농도 조건을 충족시킬 수 있어야 한다. 하이드로젤 분해효소는 확산 현상에 의해 농도가 높은 곳에서 낮은 곳으로 이동하게 되고, 다공성 하이드로젤 기질을 통해 확산되다 양측의 농도가 같아질 시 멈추게 된다 (확산, diffusion). 하지만 물질 전달의 경우 수두차에 의해 발생하는 대류 현상으로 인한 물질 전달 속도가 확산 속도보다 빠르기 때문에 대류와 확산 방향을 반대로 구성한다면, 어느 정도 확산으로 인한 물질 전달을 막을 수 있다. 따라서 이 기술을 이용해 미세유체칩 내의 특정 채널의 하이드로젤 기질에 효소 반응에 필요한 농도보다 효소의 농도가 낮게 유지되도록 조절할 수 있다(도 2).
하이드로젤 분해효소는 앞서 언급했듯이 특정 온도가 충족되어야 제대로 작동을 하게 되는데, 이 활성화온도는 30 내지 40℃ 범위 내이고, 대부분은 체온인 37℃이다. 따라서 하이드로젤 에 맞닿은 곳에 위치한 하이드로젤 분해효소의 온도가 낮을 경우 효소 반응 속도가 더디다.
유체가 차있는 공간에서 열 전달은 두 가지 경로를 통해 이루어지는데, 유체의 이동에 따라 유체가 섞이며 열이 전달되는 대류 열전달과, 유체를 매질로 하여 열이 전달되는 전도 열전달이 있다. 효소 반응 속도에 관한 법칙과 열 전달에 대한 법칙을 이용하면, 특정 채널 부위에만 빠르거나 느리게 열을 가할 수 있어 효소 반응 온도를 조절할 수 있고, 이를 통해 효소 반응 속도를 조절해 순차적으로 하이드로젤을 용해시킬 수 있다.
본 발명은 기계공학적 지식을 활용해, 특정 채널 부위의 다공성 하이드로젤 기질에 하이드로젤 분해효소의 농도가 반응에 필요한 농도보다 낮게 유지되도록 실험을 설계하였고, 하이드로젤 분해효소의 반응 속도를 조절하는데 성공하였다. 이를 통해 복수 개의 다공성 하이드로젤 채널이 포함되어 있는 미세유체 채널에서 선택적으로 세포를 추출해내는데 성공하였다(도 3). 본 발명의 일 실시예에서는 제2 하이드로젤 채널에서 제일 먼저 효소반응이 일어나도록 설계하였는데, 앞서 언급한 원리를 이용하여 제1 및/또는 제3 하이드로젤에서 먼저 효소 반응이 일어나도록 설계를 변경할 수 있다.
본 발명의 방법을 따르면, 미세유체칩에서 복수 개의 세포를 공배양하여 원하는 세포만 선택적으로 분리할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 미세유체칩을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체칩을 이용하여 세포를 분리하는 방법을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 3차원 미세유체칩을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예와 비교예에 따라 미세유체칩에서 세포를 분리한 결과를 보여주는 사진이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
실시예 1. 3차원 미세유체칩 제작
미세유체칩은 2 가지 유형 이상의 세포를 공동 배양하도록 설계되었다.　미세유체는 4 개의 유닛을 가지며, 각 유닛은 2개의 미디엄 채널(도 2의 a, g), 3개의 하이드로젤 채널(도 2의 b, d 및 f), 및 2개의 하이드로젤 분해효소 채널(도 2의 c, e)로 구성되었다(도 2 및 도 4).　각 미디엄 채널에는 미디엄을 공급하기위한 2 개의 저장소(reservoir)가　있으며　하이드로젤 채널에　의해 분리되어 있다.　제1 미디어 채널, 제1 하이드로젤 채널, 제1 하이드로젤 분해효소 채널, 제2 하이드로젤 채널, 제2 하이드로젤 분해효소 채널, 제 3 하이드로젤 채널 및 제2 미디엄 채널을 일련의 순서로 배치하였다.
미세유체칩은 이전에 보고된 방법을 이용하여 제작하였다(Y. Shin et al., "Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels," Nat. Protoc., vol. 7, no. 7, pp. 1247-1259, 2012.).　간단히 말하면, 두께가 180-200 μm 인 SU-8 포토 레지스트를 먼저 포토 리소그래피 기술을 이용해 실리콘 웨이퍼 상에 패턴화하였다.　폴리디메틸실록산 혼합물 (PDMS, SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트, 다우 코닝)을 1:10의 중량비로 경화제와 PDMS 예비 중합체를 혼합하여 제조하였다.　PDMS 혼합물을 패턴화된 웨이퍼에 부었다.　이어서, PDMS 혼합물을 진공 챔버에서 15분 동안 탈기시켜 기포를 제거하였다.　PDMS 혼합물을 80℃ 건조 오븐에서 4 시간 동안 구웠다.　경화된 PDMS 몰드를 생검 펀치 및 무딘 바늘로 분리, 트리밍 및 펀칭하였다.　PDMS 몰드를 120℃에서 30 분 동안 고압멸균하였다.　멸균된 PDMS 몰드(상부)　및 마이크로 커버글래스(하부)를 산소 플라즈마 처리 (FEMTO science) 후에 접합시켰다.　접합된 마이크로칩　을 80℃의 오븐에서 24 시간 이상 건조시켜 소수성을 회복하였다.
실시예 2. 세포 공배양
2-1. 2차원 세포 배양
정상 인간의 성상세포(astrocytes) (Astrocyte, Cell systems)는 혈청, CultureBoost ?? (Cell systems) 및 Astrocytes Growth Medium BulletKit (AGM, Lonza)이 포함된 Complete Classic Medium에서 배양되었고, 제조업체의 표준 프로토콜에 따라 보존되었다.
이종이식 마우스의 암세포는 이전에 보고된 방법과 같은 방법으로 도너(donor)로부터 분리하였다(H. W. Lee et al., “Patient-derived xenografts from non-small cell lung cancer brain metastases are valuable translational platforms for the development of personalized targeted therapy,” Clin. Cancer Res., vol. 21, no. 5, pp. 1172-1182, 2015.). 분리된 종양 세포를　2 % B27 보충제 (50X, Gibco), 1 % N2 보충제 (100X, Gibco), 1 % L- 글루타민 (Gibco), 200ng / ml의 표피세포성장인자(EGF, R&D systems), 200 ng/ml의 기본 섬유아세포 성장인자 (bFGF, R&D systems), 30ng/ml 의 recombinant human neuregulin-1 beta1/heregulin-beta1 (rhNRG-1-b1/HRG-b1(EGF domain), R&D systems), 200ng/ml 의rhIGF-1(R&D systems)를 포함하는 Neurobasal Media (NBA, Gibco)　미디아(media)로 현탁액 배양용 세포 배양 플라스크에서 배양하였다. 종양 세포 구체를 <600um의 직경으로 성장시키고, 암 구체를 배양 배지로 수집하고 포스페이트 완충 식염수 (PBS, 1X, Gibco)로 세척하였다.　수집 된 세포 펠렛을 Accutase (Gibco)로 분리하여 단일 세포로 만들고 PBS로 중화시켰다.
2-2. 3D 미세유체칩에서의 공배양
랫 테일 콜라겐 1 형 용액 (BD), 10X PBS, 증류수 (DW) 및 수산화소듐 (NaOH, 0.1N)을 혼합하여 콜라겐 용액을 제조하였다.　콜라겐 젤 혼합물의 최종 농도 및 pH는 각각 2.0 mg/ ml 및 pH 7.0-7.4로 조정되었다.　콜라겐에 세포를 내장시키기 위해, 1.0　×　107　cells/ ml (최종 세포 밀도보다 10 배 높음) 밀도를 가지는 20 μl의 각 세포의 배양액 용액과 2.22 mg /ml의 콜라겐 용액 180 μl를　잘 혼합 하였다.
콜라겐 용액 및 콜라겐-세포 혼합물을 하이드로젤 채널에 주입하고 겔화되는 동안 건조되는 것을 막기 위해 고습도(~80%)에서 37℃에서 30 분 동안 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.　
2-3. 미세유체칩에서의 세포 추출
미세유체칩에서 세포를 공동배양 한 후, 하이드로젤 채널에서 종양세포를 분리하기 위해, 하이드로젤 채널을 채운 콜라겐 스캐폴드는 콜라게네이즈 D형(로슈)에 의해 분해되었다. 콜라게네이즈 용액은 PBS 중 1.0 mg/ml로 제조하였다.　(b)　60ul의 37℃로 예열된 콜라게네이즈 용액을 하이드로젤 분해효소 채널에 채우고, 120ul의 4℃ PBS는 제 1 및 제 2 미디엄 채널에 채워서 수두차(water pressure)를 발생시킴으로써, 미디엄 채널에서 하이드로젤 채널 방향으로 연속 유체 흐름을 만들었다(도 2B, 도 3A). 이 흐름은 효소 반응이 일어날 수 있는 조건 보다 낮은 온도와 낮은 효소 농도를 제1 하이드로젤 채널(및 제3 하이드로젤 채널)에 제공하여 콜라게네이즈가 콜라겐을 분해하는 것을 막는다.　 미세유체칩을 37℃에서　30　분 동안　CO2 배양기에서 배양하였다.　 제2 하이드로젤 채널에서 용해된 콜라겐 젤 및 세포를 코니컬 튜브에서 파이펫으로 수집하였다(도 2C, 도 3B). 세포 펠렛을 빼 내기 위해, 콜라겐 젤과 세포의 혼합물을 1000rpm에서 3 ~ 5 분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 제외한 상등액을 제거한 후, 4℃로 1 회　세척하고　다시 원심분리하였다. TRIzolTM을 사용하여 세척된 세포 펠릿에서 DNA 및 RNA를 추출하였다(도 2D).
비교예
실시예 1에서 제작한 미세유체칩의 미디엄 채널 및 하이드로젤 분해효소 채널에 모두 37℃의 콜라게네이즈만 주입하여 세포를 분리하였다(도 5의 대조군). 그 결과, 도 5의 대조군을 보면 세포 추출 전 상황과 비교하여 하이드로젤 채널에서 세포 분리가 제대로 이루어지 않고 세포들이 섞여 있다. 반면에 본 발명의 방법을 이용하면, 도 5의 실험군에 나타난 것과 같이, 가운데 채널과 그 주변 채널에서 이미 콜라게네이즈 용액이 세포와 함께 추출되고, 주변 채널에는 기포만 남아 있는 것을 볼 수 있다. 즉, 세포 분리가 잘 이루어졌음을 알 수 있다.
본 발명은 하이드로젤을 선택적으로 용해하여 하이드로젤에 내장되어 있는 세포를 선택적으로 분리하는 방법에 대한 것이다. 하이드로젤은 다공성 기질로서 물질 전달이 가능하기 때문에 하이드로젤 분해효소를 특정 하이드로젤 부분에만 처리하는 것이 굉장히 어렵다. 또한, 하이드로젤 용해가 진행됨에 따라 물질 전달률도 높아진다. 따라서 별다른 처리 없이 하이드로젤 분해효소를 처리하면 모든 다공성 하이드로젤 기질에 용해제가 확산되기 때문에 하이드로젤 기질에 포함되어 있는 세포들이 섞여버려서 특정 부분의 하이드로젤 기질만 용해하는 것이 불가능하다.
본 발명은 이러한 종래기술의 장벽을 뛰어 넘은 기술로, 유체의 흐름과 온도를 조절하여 특정 하이드로젤 채널에서만 하이드로젤 분해효소의 반응이 먼저 일어나도록 하여 선택적으로 세포를 분리할 수 있다.
본 발명의 세포 분리 방법을 이용하면 질병과 관련된 조직내의 복수 개의 세포를 동시에 배양하여 원하는 세포만 선택적으로 분리하여 분석할 수 있다.

Claims (12)

  1. i) 제1 미디엄(medium) 채널; 제1 하이드로젤 채널; 제1 하이드로젤 분해효소 채널;　제2 하이드로젤 채널; 및 제2 하이드로젤 분해효소 채널이 일련의 순서로 배치된 미세유체칩을 준비하는 단계;
    ii) 상기 제1 하이드로젤 채널 및 제2 하이드로젤 채널 각각에 세포가 포함된 하이드로젤을 주입하는 단계;
    iii) 상기 세포와 하이드로젤이 주입된 미세유체칩을 인큐베이션하여 세포를 공배양하는 단계;
    iv) 상기 제1 미디엄 채널에 5 ℃ 이하의 미디엄을 주입하고, 상기 모든 하이드로젤 분해효소 채널에 분해효소 활성화온도의 하이드로젤 분해효소를 주입하는 단계;
    v) 미디엄과 하이드로젤 분해효소가 주입된 미세유체칩을 하이드로젤 분해효소 활성화 온도에서 인큐베이션하는 단계; 및
    vi) 상기 제1 및 제2 하이드로젤 채널에서 선택적으로 세포를 추출하는 단계;
    를 포함하며,
    상기 i) 단계에서, 상기 미세유체칩은
    상기 제1 미디엄(medium) 채널; 제1 하이드로젤 채널; 제1 하이드로젤 분해효소 채널;　제2 하이드로젤 채널; 및 제2 하이드로젤 분해효소 채널이 각각 저장소와 연결되고, 그리고 수두차(waterhead pressure)가 발생하도록 상기 제1 미디엄 채널의 저장소의 수면 높이는 상기 제1 및 제2 하이드로젤 분해효소 채널의 저장소의 수면 높이보다 더 높은 것인, 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 ii) 단계에서,
    상기 세포의 종류는 서로 동일하거나 또는 서로 다른 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로젤은 다공성 구조로 이루어져 있어서 각각의 채널 사이의 물질 교환이 가능한 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로젤은, 콜라겐(Collagen),　알지네이트(Alginate), 피브린(Fibrin), 히알루론산(Hyaluronic Acid), 아가로즈(Agarose), PHEMA(Polyhydroxyethylmethacrylate),　PVA(Polyvinyl alcohol),　PEG(Poly(ethylene glycol)), PEO(Poly(ethylene oxide)),　PEGDA(Polyethylene (glycol) diacrylate), 젤라틴(Gelatin), 매트리젤(Matrigel),　PLLA(poly(L-lactic acid)),　카복시메틸셀룰로오스(Carboxymethylcellulose),　덱스트란(Dextran), 키토산(Chitosan) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 iv) 단계에서,
    상기 미디엄 채널에서는 상기 미디엄 채널과 상기 제1 하이드로젤 분해효소 채널 사이의 수두차(water pressure)에 의해 제1 미디엄 채널에서 제1 하이드로젤 분해효소 채널 방향으로 유동이 발생해 제1 하이드로젤 분해효소 채널에서 제1 하이드로젤 채널 방향으로 하이드로젤 분해효소가 확산(diffusion)되는 것을 방해함으로써, 제1　하이드로젤　채널에 도달하는 하이드로젤 분해효소의 농도가 제2 하이드로젤 채널에 도달하는 하이드로젤 분해효소의 농도보다 낮은 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 v) 단계는,
    상기 제1 하이드로젤 채널과 제2 하이드로젤 채널의 하이드로젤 분해효소 반응을 조절하는 단계로,
    제1　하이드로젤　채널 보다 제2 하이드로젤 채널에 도달하는 하이드로젤 분해효소의 농도가 높고, 제1 하이드로젤 채널보다 제2 하이드로젤 채널의 온도가 높아서 하이드로젤 분해 반응이 빨리 일어나는 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 v) 단계에서, 상기 활성화 온도는 30 내지 40℃인, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 vi) 단계에서,
    상기 제1 하이드로젤 채널보다 제2 하이드로젤 채널에서 하이드로젤 분해효소 반응이 빨리 일어나서 제2 하이드로젤 채널의 하이드로젤이 먼저 용해됨으로써 제2 하이드로젤로부터 세포를 먼저 분리하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 i) 단계의 미세유체칩을 준비하는 단계에서, 상기 미세유체칩은
    상기 제1 미디엄(medium) 채널; 제1 하이드로젤 채널; 제1 하이드로젤 분해효소 채널;　제2 하이드로젤 채널; 및 제2 하이드로젤 분해효소 채널에, 제3 하이드로젤 채널 및 제2 미디엄 채널을 일련의 순서로 더 추가하여 배치된 미세유체칩인, 방법.
  11. i) 제1 미디엄(medium) 채널; 제1 하이드로젤 채널; 제1 하이드로젤 분해효소 채널;　제2 하이드로젤 채널; 및 제2 하이드로젤 분해효소 채널; 제3하이드로젤 채널; 및 제2미디엄 채널이 일련의 순서로 배치된 미세유체칩을 준비하는 단계;
    ii) 상기 제1 하이드로젤 채널, 제2 하이드로젤 채널 및 제3 하이드로젤 채널 각각에 세포가 포함된 하이드로젤을 주입하는 단계;
    iii) 상기 세포와 하이드로젤이 주입된 미세유체칩을 인큐베이션하여 세포를 공배양하는 단계;
    iv) 상기 모든 미디엄 채널에 5℃ 이하의 미디엄을 주입하고, 상기 모든 효소 채널에 30-40℃의 하이드로젤 분해효소를 주입하는 단계;
    v) 미디엄과 하이드로젤 분해효소가 주입된 미세유체칩을 하이드로젤 효소 배양 최적 온도에서 인큐베이션하는 단계; 및
    vi) 상기 제1, 제2 및 제3 하이드로젤 채널에서 선택적으로 세포를 추출하는 단계;
    를 포함하며,
    상기 제1 미디엄 채널의 저장소의 수면 높이는 상기 제1 및 제2 하이드로젤 분해효소 채널의 저장소의 수면 높이보다 높아 수두차(waterhead pressure)가 발생하는, 미세유체칩으로부터 선택적으로 세포를 분리하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 vi) 단계에서, 상기 제2 하이드로젤 채널에서 먼저 세포를 추출하는 것인, 방법.
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