KR20170089020A - 세포간 상호 작용 기반 단일 세포 분석 장치 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 일 실시예에 따른 단일 세포 분석 장치는 기판, 배지를 위한 공간인 제1 세포를 배양시킬 수 있는 막과 기판 사이의 간격 및 제2 세포를 단일 세포 단위로 고립시킬 수 있는 기공을 갖는 다공성 막을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 단일 세포 분석 방법은 다공성 막의 바닥 면의 배지 내에서 제1 세포를 배양하는 단계; 배지 내의 다공성 막 상에 제2 세포를 포함하는 시료를 도포하는 단계; 교반 및 중력과 같은 외력으로, 제2 세포를 다공성 막에 존재하는 기공 내에 단일 세포 단위로 고립시키는 단계; 제1 세포와 단일 세포 수준의 제2 세포 간의 상호작용 상황을 생성하는 단계; 및 제1 세포 또는 제2 세포의 세포 현상을 분석하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 단일 세포 분석 방법은 다공성 막의 바닥 면의 배지 내에서 제1 세포를 배양하는 단계; 배지 내의 다공성 막 상에 제2 세포를 포함하는 시료를 도포하는 단계; 교반 및 중력과 같은 외력으로, 제2 세포를 다공성 막에 존재하는 기공 내에 단일 세포 단위로 고립시키는 단계; 제1 세포와 단일 세포 수준의 제2 세포 간의 상호작용 상황을 생성하는 단계; 및 제1 세포 또는 제2 세포의 세포 현상을 분석하는 단계;를 포함한다.
Description
본 발명은 단일 세포 및 이웃하는 다중 세포 간의 상호 작용을 기반으로 하는 단일 세포 수준의 분석 장치 및 방법에 관한 것이다.
세포 마이크로환경에서 세포는 사이토카인(cytokine) 신호 및/또는 세포 표현형(phenotypes) 에 영향을 미치는 직접 접촉을 통해 세포의 환경 및 그 자체와 메시지를 주고 받는다. 이 현상의 중요성 때문에, 세포 간 상호 작용을 위한 시험관 플랫폼은 2-D 또는 3-D 플랫폼의 형태로 적극적으로 개발되어 세포 집단 간의 상호 작용을 모방했다. 그러나 많은 수의 세포에서 평균 결과 만 얻을 수 있다. 이것은 단일 세포 분리 및 그 분석의 보완적인 체외 플랫폼의 개발을 동기 부여한다.
단일 세포 분리 기술은 유체역학의 유체 제어, 유전체 영동 및 표면 미세 패턴화 등을 사용하는 마이크로 웰 어레이, 트랩을 사용하여 개발되었다. 이 단일 세포 분리 기술을 사용하여, 이종 세포의 표현형 분석, 측분비 인자, 분비 및 DNA 복구능의 분석과 같은 유전적 배경이 다른 다양한 응용 분야에서 이러한 단일 세포 격리 기술을 사용했다.
특히, 세포 간 상호 작용의 시공간적 제어가 가능할 뿐 아니라, 단일 세포 수준에서의 상호 작용을 위한 특별한 상황을 만들 수 있기 때문에, 단일 세포 페어링(pairing) 기술이 강조되었다. 이 응용 분야는 세포 이동, 줄기 세포의 증식 패턴 및 림프구와의 상호 작용을 통한 CD8T 세포의 불균일 동역학(heterogeneous dynamics)을 포함한다. 대규모 집단에서 확률적 세포 행동을 해결하는 데 단일 세포 수준의 해결책을 제공 할 수 있어 세포 역학을 이해하고 기존의 벌크 시스템과 달리 세포 간 신호 전달 메커니즘에 대한 더 나은 통계 데이터를 얻을 수 있다. 기존에 보고 된 단일 셀 페어링 방법에는 단일 셀 및 단일 셀 상호 작용에만 중점을 두는 한계가 있었다. in-vitro 단일 세포, 단일 세포 상호 작용 칩 및 in-vivo 세포 마이크로환경 간에는 미세한 차이가 있다. 예를 들어, 종양 세포는 다수 기질 세포로 둘러싸인 마이크로환경에 위치하고 서로 상호 작용한다.
본 발명은 단일 세포 및 이웃하는 다중 세포 간의 상호 작용을 기반으로 하는 단일 세포 수준의 분석 장치 및 방법 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 단일 세포 분석 장치는 기판, 제1 세포를 배양시킬 수 있는 막과 기판 사이의 간격, 및 제2 세포를 단일 세포 단위로 고립시킬 수 있는 기공을 갖는 다공성 막을 포함한다.
다공성 막과 기판 사이의 간격은 1 ㎛ 내지 100 ㎛일 수 있다.
다공성 막은 고분자 재질 또는 무기 재질에서 선택될 수 있다.
다공성 막은 고분자 막에 소프트 리소그래피법을 통해 기공을 형성한 것일 수 있다.
다공성 막은 감광성 고분자 재질일 수 있다.
다공성 막은 감광성 고분자 막에 리소그래피법을 통해 기공을 형성한 것일 수 있다.
기공의 직경은 1 ㎛ 내지 100 ㎛일 수 있다.
다공성 막은 102 내지 106 개/cm2의 기공을 가질 수 있다.
다공성 막은 기공을 갖고, 기공간의 간격이 1 ㎛ 내지 10mm일 수 있다.
본 발명의 일 실시 예에 따른 단일 세포 분석 방법은 다공성 막의 바닥 면의 배지 내에서 제1 세포를 배양하는 단계; 배지 내의 다공성 막 상에 제2 세포를 포함하는 시료를 도포하는 단계; 교반 및 중력과 같은 외력으로 제2 세포를 다공성 막에 존재하는 기공 내에 단일 세포 단위로 고립시키는 단계; 제1 세포와 단일 세포 수준의 제2 세포 간의 상호작용 상황을 생성하는 단계; 및 제1 세포 또는 제2 세포의 세포 현상을 분석하는 단계를 포함한다.
제1 세포는 섬유아세포이고, 제2 세포는 종양 세포일 수 있다.
다공성 막과 기판 사이의 간격은 1 ㎛ 내지 100 ㎛일 수 있다.
제1 세포의 농도는 1 x 105 내지 1 x 107 세포수/mL일 수 있다.
시료 내의 제2 세포의 농도는 (다공성 막의 기공수 x 1)세포수/mL 내지 (다공성 막의 기공수 x 10,000)세포수/mL 또는 1 x 102 내지 1 x 1010 세포수 /mL 일 수 있다.
교반 및 중력과 같은 외력을 가할 때, 동시에 교반을 행할 수 있다. 또한 1분 내지 1시간 동안 0rpm 내지 500rpm으로 교반을 행할 수 있다.
기공의 직경은 1 ㎛ 내지 100 ㎛일 수 있다.
다공성 막은 102 내지 106 개/cm2 의 기공을 가질 수 있다.
다공성 막은 기공을 갖고, 기공간의 간격이 1㎛ 내지 10mm일 수 있다.
제1 세포와 제2 세포간 1시간 내지 7일 동안 접촉 및 측분비 통신을 통해 상호작용을 일으킬 수 있다.
제1 세포 또는 제2 세포의 세포활동을 분석하는 단계는 제 1 세포 또는 제 2 세포의 세포활동을 모니터링하는 단계를 포함할 수 있다.
제1 세포 또는 제2 세포의 세포활동을 분석하는 단계는 제1 세포를 획득 및 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
제1 세포 또는 제2 세포의 세포활동을 분석하는 단계는 제 2 세포를 포획하여 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
단일 세포와 벌크 세포간의 상호작용에 따른 단일 세포 단위의 세포 현상 모니터링 및 분석을 용이하게 할 수 있다. 단일 세포 단위에서의 시각적 분석뿐만 아니라 유전자 분석이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시 예에 따른 단일 세포 분석 장치의 개략적인 도면이다.
도 2는 기공이 형성된 다공성 막의 확대 사진이다.
도 3은 제1 세포를 다공성 막의 바닥면에 배양할 때의 단일 세포 분석 장치의 개략적인 도면이다.
도 4는 제2 세포를 다공성 막의 기공 내에 고립시킬 때의 단일 세포 분석 장치의 개략적인 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시 예에 따른 단일 세포 분석 장치의 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시 예에 따른 단일 세포 분석 방법의 순서도이다.
도 7은 기공에 고립된 종양 세포의 확대 사진이다.
도 8은 고립된 단일 종양세포와의 상호작용에 의해 자가포식현상을 일으키는 다공성 막의 바닥면 상의 섬유아세포를 스크리닝한 확대 사진이다.
도 9는 본 발명의 모니터링 성능을 설명하기 위한 그래프로서, 섬유아세포의 자가포식 현상이 나타나는 경우 단일 세포가 존재하는 기공은 빈 기공과 큰 차이가 발생한다.
도 10은 단일 종양 세포를 사용하여 기공으로부터 단일 종양 세포를 고립시키고 게놈 분석 결과 사진이다.
도 2는 기공이 형성된 다공성 막의 확대 사진이다.
도 3은 제1 세포를 다공성 막의 바닥면에 배양할 때의 단일 세포 분석 장치의 개략적인 도면이다.
도 4는 제2 세포를 다공성 막의 기공 내에 고립시킬 때의 단일 세포 분석 장치의 개략적인 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시 예에 따른 단일 세포 분석 장치의 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시 예에 따른 단일 세포 분석 방법의 순서도이다.
도 7은 기공에 고립된 종양 세포의 확대 사진이다.
도 8은 고립된 단일 종양세포와의 상호작용에 의해 자가포식현상을 일으키는 다공성 막의 바닥면 상의 섬유아세포를 스크리닝한 확대 사진이다.
도 9는 본 발명의 모니터링 성능을 설명하기 위한 그래프로서, 섬유아세포의 자가포식 현상이 나타나는 경우 단일 세포가 존재하는 기공은 빈 기공과 큰 차이가 발생한다.
도 10은 단일 종양 세포를 사용하여 기공으로부터 단일 종양 세포를 고립시키고 게놈 분석 결과 사진이다.
여기서 사용되는 전문 용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.
다르게 정의하지는 않았지만, 여기에 사용되는 기술용어 및 과학용어를 포함하는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 보통 사용되는 사전에 정의된 용어들은 관련기술문헌과 현재 개시된 내용에 부합하는 의미를 가지는 것으로 추가 해석되고, 정의되지 않는 한 이상적이거나 매우 공식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명의 구현 예를 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
도 1은 본 발명의 일 실시 예에 따른 단일 세포 분석 장치를 개략적으로 나타낸다. 도 1의 단일 세포 분석 장치는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다. 따라서 단일 세포 분석 장치를 다양하게 변형할 수 있다.
도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명의 일 실시 예에 따른 단일 세포 분석 장치는 기판, 배지를 위한 공간인 막과 기판 사이의 간격 및 제2 세포를 단일 세포 단위로 고립시킬 수 있는 기공(31)을 갖는 다공성 막을 포함한다.
기공(31)에 단일 세포로 고립된 제2 세포(200)는 배지에서 배양된 제1 세포(100)와 상호작용을 일으킨 후, 다공성 막(30)과 함께 제1 세포(100)로부터 분리되어, 단일 세포 단위로 분석될 수 있다. 결국, 단일 세포와 벌크 세포간의 상호작용에 따른 단일 세포 단위의 분석을 용이하게 할 수 있다. 또한, 단일 세포 단위에서의 시각적 분석뿐만 아니라 유전자 분석이 가능하다.
다공성 막(30)과 기판 사이의 간격은 1 ㎛ 내지 100 ㎛가 될 수 있다. 다공성 막(30)과 기판 사이의 간격이 너무 좁으면, 제1 세포(100)가 다공성 막의 바닥면에서 배양되기 어려운 문제가 발생할 수 있다. 다공성 막(30)과 기판 사이의 간격이 너무 넓으면, 제2 세포(200)가 기공(31) 내에 고립되지 않고, 다공성 막(30)과 기판 사이의 간격으로 통과되는 문제가 발생할 수 있다. 더욱 구체적으로 다공성 막(30)과 기판사이의 간격은 1 내지 100㎛가 될 수 있다.
다공성 막(30)은 고분자 재질을 사용할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 폴리메틸(메트)아크릴레이트(PMMA), 폴리디메틸실옥세인 (PDMS), 폴리카보네이트(PC), 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리프로필렌(PP) 등이 있다. 다공성 막(30)으로서, 고분자 재질을 사용할 경우, 다공성 막(30)에 기공(31)을 형성할 때, 소프트 리소그래피 법을 사용할 수 있다. 다공성 막(30)으로서, 감광성 고분자 재질을 사용할 경우, 다공성 막(30)에 기공(31)을 형성할 때, 리소그래피 법을 사용할 수 있다. 소프트 리소그래피 법을 이용하여 다공성 막(30)에 기공(31)을 형성하는 과정의 일 예를 간단하게 설명하면 다음과 같다. 실리콘 기판 웨이퍼 상에 광레지스트를 도포한다. 광리소그래피를 이용하여 패턴을 형성한다. 사전-경화된 PDMS를 추가하고 경화한다. PDMS 마스터를 분리하고, CHF3로 RIE 처리한다. PDMS 마스터와 유리 사이의 간격에 사전-경화 된 PDMS 주입한다. 기공(31)이 형성된 PDMS 막을 방출한다. 기공(31)이 형성된 다공성 막(30)의 확대 사진을 도 2에서 나타내었다.
기판으로서는 슬라이드 글라스(Slide glass), 폴리다이메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS)을 사용할 수 있다. 기판에 소프트 식각 (soft lithography) 방법을 이용하여, 공간을 확보한다. 상술한 방법은 단일 세포 분석 장치를 제조하기 위한 일 예에 불과하며, 필요에 따라 달라질 수 있다.
다공성 막(30)에 형성된 기공(31)의 직경은 1 ㎛ 내지 100 ㎛가 될 수 있다. 기공(31)의 직경이 너무 작으면, 제2 세포(200)가 기공(31) 내에 고립되기 어려운 문제가 발생할 수 있다. 기공(31)의 직경이 너무 넓으면, 제2 세포(200)가 단일 세포 단위로 고립되지 않는 문제가 발생할 수 있다.
다공성 막(30)에는 102 내지 106 개/cm2의 기공(31)이 형성될 수 있다. 기공(31)이 너무 적으면, 분석을 위한 제2 세포(200)의 양이 너무 적어지는 문제가 발생할 수 있다. 기공(31)이 너무 많으면, 제2 세포(200)이 커지게 되어, 분석 장치에 문제가 발생할 수 있다.
다공성 막(30)에 형성된 기공(31)은 기공(31)간의 간격이 1㎛ 내지 10mm가 되도록 형성될 수 있다. 기공(31)간의 간격이 너무 좁으면, 배지 내에 배양된 인근 제1 세포(100)간의 상호작용이 발생하여, 제1 세포(100), 제2 세포(200)의 상호작용에 의한 세포현상을 분석하기에 어려움이 있을 수 있다. 기공(31)간의 간격이 너무 넓으면, 제2 세포(200) 분석을 위한 분석 장치가 방대해 지는 문제가 발생할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 단일 세포 분석 장치는 저장소, 다공성 막, 다공석 막과 기판 사이의 간격을 더 포함할 수 있다.
도 3에서는 제1 세포(100)를 막(20)의 바닥면에서 배양할 때의 개략적인 모습을 도시하였다.
도 4에서는 제2 세포(200)를 다공성 막(30)의 기공(31) 내에 고립시킬 때의 개략적인 모습을 도시하였다. 교반 및 중력과 같은 외력을 부여하여, 제2 세포(200)을 기공(31) 내에 단일 세포 단위로 고립시킬 수 있도록 한다.
도 5에서는 본 발명의 일 실시예에 따른 단일 세포 분석 장치의 사진을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일 세포 분석 방법의 순서도를 개략적으로 나타낸다. 도 6의 단일 세포 분석 방법의 순서도는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다. 따라서 단일 세포 분석 방법을 다양하게 변형할 수 있다.
도 6에 도시한 바와 같이, 단일 세포 분석 방법은 기판과 다공성 막 사이에 형성된 다공성 막의 바닥면(20)에서 제1 세포(100)를 배양하는 단계(S10); 배지(20) 내의 다공성 막(30) 상에 제2 세포(200)를 포함하는 시료를 도포하는 단계(S20); 교반 및 중력과 같은 외력으로, 제2 세포(200)를 다공성 막(30)에 존재하는 기공(31)내에 단일 세포 단위로 고립시키는 단계(S30); 제1 세포(100)와 단일 세포 수준의 제2 세포(200) 간의 상호작용 상황을 생성하는 단계(S40); 제1 세포 또는 제2 세포의 세포활동을 분석하는 단계 (S50)를 포함한다.
먼저, 단계(S10)에서는 다공성 막의 바닥면에서 제1 세포(100)를 배양한다. 기판과 다공성 막의 간격은 1 ㎛ 내지 100 ㎛가 될 수 있다. 다공성 막(30)과 기판 사이의 간격이 너무 좁으면, 제1 세포(100)가 배지에서 배양되기 어려운 문제가 발생할 수 있다. 다공성 막(30)과 기판 사이의 간격이 너무 넓으면, 제2 세포(200)가 기공(31) 내에 고립되지 않고, 배지로 통과되는 문제가 발생할 수 있다.
제1 세포(100)를 다공성 막의 바닥면에서 배양할 때, 제1 세포(100)를 포함하는 배지는 몇 시간 동안 다공성 막의 바닥면에 놓는다. 그리고 상기 다공성 막은 기판과 결합되어 상기 다공성 막과 기판 사이의 간격으로 영양물을 공급할 수 있다.
제1 세포(100)의 농도는 1 x 105 세포수/mL 내지 1 x 107 세포수/mL 가 될 수 있다.
도 3에서는 제1 세포(100)를 다공성 막의 바닥면(20)에서 배양할 때의 개략적인 모습을 도시하였다. 제1 세포(100)를 포함하는 배지는 몇 시간 동안 다공성 막의 바닥면에 놓는다. 그리고, 다공성 막은 기판과 결합된다.
제1 세포(100)는 제2 세포(200)와의 상호작용을 유도하기 위한 세포라면 제한 없이 사용될 수 있다. 구체적으로는 섬유아세포가 될 수 있다.
단계(S20)에서는 교반 및 중력과 같은 외력으로 다공성 막(30) 상의 제2 세포(200)를 포함하는 시료를 도포한다. 시료는 제2 세포(200)외에도 배지를 포함하며, 이 때, 시료 내의 제2 세포(200)의 농도는 (다공성 막의 기공수 x 1) 세포수/mL 내지 (다공성 막의 기공수 x 10,000) 세포수/mL가 될 수 있다. 또는 1 x 102 세포수/mL 내지 1 x 1010 세포수/mL가 될 수 있다. 제2 세포(200)의 농도가 너무 낮으면, 제2 세포(200)가 고립되지 않은 빈 기공(31)이 많아지게 되어 분석의 효율이 저하될 수 있다. 제 2 세포(200)의 농도가 너무 높으면, 기공(31)에 단일 세포 단위로 고립되기 어려운 문제가 발생할 수 있다.
제2 세포(200)는 제1 세포(100)와의 상호작용을 유도하여, 상호작용 이후 세포 활동의 변화를 분석하기 위한 세포라면 제한 없이 사용될 수 있다. 구체적으로는 종양 세포가 될 수 있다.
단계(S30)에서는 교반 및 중력과 같은 외력으로, 제2 세포(200)를 다공성 막(30)에 존재하는 기공(31) 내에 단일 세포 단위로 고립시킨다.
도 4에서는 제2 세포(200)를 다공성 막(30)의 기공(31) 내에 고립시킬 때의 개략적인 모습을 도시하였다. 교반 및 중력과 같은 외력을 부여하여, 제2 세포(200)을 기공(31) 내에 단일 세포 단위로 고립시킬 수 있도록 한다.
교반 및 중력과 같은 외력을 부여하면, 저장소 내의 제2 세포(200)를 포함하는 시료가 다공성 막(30)에 형성된 기공(31)으로 취입된다. 갇히지 않은 제2 세포(200)는 씻겨 나가고, 갇힌 제2 세포(200)만이 단일 세포 상태로 기공(31)에 고립된다. 이 때 교반속도는 0 내지 200rpm이 될 수 있다. 교반은 예컨데 쉐이커(Shaker) 위에 단일 세포 분석 장치를 올려놓는 방식으로 수행될 수 있다. 교반은 1분 내지 1시간 동안 10rpm 내지 500rpm으로 행할 수 있다. 교반 속도가 너무 느리면, 제2 세포가 분산되기 어렵다. 교반 속도가 너무 빠르면, 제2 세포(200)가 가장자리 부분에 모이는 경향이 발생한다.
교반력을 가하는 경우, 다른 수의 제2 세포 투입이 동시에 수행될 수 있다. 투입되는 제2 세포의 수는 총 기공의 1배수 내지 1000배수까지 다양할 수 있다. 제2 세포의 투입 개수가 너무 적으면, 단일 세포의 갇히는 효율이 낮아 질 수 있다. 제2 세포의 투입 개수가 너무 많으면, 다중 세포가 갇히는 비율이 증가한다. 따라서, 특정부분에만 세포가 단일 세포 수준으로 고립되는 문제가 발생할 수 있다.
제2 세포(200)를 고립시키는 기공(31)의 직경은 1 ㎛ 내지 100 ㎛가 될 수 있다. 기공(31)의 직경이 너무 작으면, 제2 세포(200)가 기공(31) 내에 고립되기 어려운 문제가 발생할 수 있다. 기공(31)의 직경이 너무 넓으면, 제2 세포(200)가 단일 세포 단위로 고립되지 않는 문제가 발생할 수 있다.
다공성 막(30)에는 102 내지 106 개/cm2의 기공(31)이 형성될 수 있다. 기공(31)이 너무 적으면, 분석을 위한 제2 세포(200)의 양이 너무 적어지는 문제가 발생할 수 있다. 기공(31)이 너무 많으면, 제2 세포(200)가 고립되지 않은 빈 기공(31)이 많아지게 되어 분석의 효율이 저하될 수 있다.
제2 세포(200)를 고립시키는 기공(31)은 기공(31)간의 간격이 1㎛ 내지 10mm가 되도록 형성될 수 있다. 기공(31)간의 간격이 너무 좁으면, 다공성 막의 바닥면에 배양된 인근 제 1 세포(100) 간의 상호작용이 발생하여 제 1 세포 (100), 제 2세포 (200) 상호작용에 의한 세포현상을 분석하기에 어려움이 있을 수 있다. 기공(31)간의 간격이 너무 넓으면, 제2 세포(200) 분석을 위한 분석 장치가 방대해 지는 문제가 발생할 수 있다.
단계(S40)에서는 제1 세포(100)와 제2 세포(200)간의 접촉 또는 측분비 인자를 통해 상호작용을 일으킨다. 이 때 상호작용은 1시간 내지 7일 동안 일으킬 수 있다. 상호작용으로서는 예컨데 종양 세포와 섬유아세포의 직접 접촉에 의한 상호작용 또는 간접적인 측분비 인자에 의한 상호작용이 있다.
분석하는 방법으로는 제1 세포(100) 또는 제2 세포의 상호 작용에 의해 변화된 세포 활동을 스크리닝하거나, 상호작용을 마친 제2 세포(200)를 포획하여 분석하는 방법이 있을 수 있다. 상호작용을 마친 제2 세포(200)는 고립된 상태로 다공성 막(30)의 기공(31)내에 존재하므로, 큰 어려움 없이, 단일 세포 단위의 제2 세포(200)를 제1 세포(100)로부터 분리하여 분석할 수 있다.
구체적으로는 미리 제1 세포(100)에 투여된 녹색 마커를 통해 제1 세포(100)와 제2 세포(200)간의 상호작용을 분석할 수 있다. 또한, 단일 세포 채집기(Single cell picker, Kuiqpick)를 이용하여 단일 세포 단위의 제2 세포(200)를 수득하여, 수득된 제2 세포(200)를 단일 세포 유전자 분석 장치(Biomark HD)를 통해 유전자 분석을 행할 수 있다.
따라서, 시각적 분석뿐만 아니라 단일 세포 단위의 유전자 분석이 가능하다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
폴리다이메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS)을 사용하여, 30 ㎛의 기공(5,000개)을 가지는 다공성 막을 준비하였다. 5㎛의 두께를 갖는 폴리다이메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS)이 코팅된 기판을 기판으로서 준비하였다. 기판은 배지의 공간으로서 사용되었다.
도 7은 기공에 고립된 종양 세포의 확대 사진이다. 다공성 막 상에 종양 세포를 포함하는 시료를 10,000개 도포하고, 100rpm에서 5분동안 교반하여 종양 세포를 단일 세포 단위로 기공에 고립시켰다.
하기 표 1에는 다공성 막 상에 도입된 종양 세포의 개수에 대하여 기공에 고립된 종양 세포의 개수 비를 수득 효율로 정리하여 나타내었다.
도 8은 고립된 단일 종양세포와의 상호작용에 의해 자가포식현상을 일으키는 다공성 막의 바닥면 상의 섬유아세포를 스크리닝한 확대 사진이다.
종양 세포와 섬유아세포를 6시간 동안 상호작용시켜 섬유아세포의 세포변화가 일어나는지 관찰하였다. 기공에 고립된 제2 세포와 제1 세포간의 상호작용이 있음을 확인할 수 있다.
도 9는 본 발명의 모니터링 성능을 설명하기 위한 그래프로서, 섬유아세포의 자가포식 현상이 나타나는 경우 단일 세포가 존재하는 기공은 빈 기공과 큰 차이가 발생한다.
하기 표 2에는 빈 기공과 단일 종양 세포가 존재하는 기공을 비교하여 섬유아세포의 자가포식 활성의 비율을 비교하였다.
도 10은 단일 종양 세포를 사용하여 기공으로부터 단일 종양 세포를 고립시키고 게놈 분석 결과 사진이다. 고립된 단일 세포에서 추출된 단백질을 유전자 분석에 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2
교반 속도를 0rpm으로 조정하였다. 나머지 실험과정은 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
실시예 3
교반 속도를 200rpm으로 조정하였다. 나머지 실험과정은 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
실시예 4
제2 세포의 두입 개수를 5,000 개로 조절하였다. 나머지 실험과정은 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
실시예 5
제2 세포의 두입 개수를 20,000 개로 조절하였다. 나머지 실험과정은 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
| 제2 세포 투입 수 | 교반 속도(rpm) | 교반 시간(min) | 수득 효율(%) | |
| 실시예 1 | 10,000 | 100 | 5 | ~ 50 |
| 실시예 2 | 10,000 | 0 | 5 | ~ 40 |
| 실시예 3 | 10,000 | 200 | 10 | ~ 35 |
| 실시예 4 | 5,000 | 100 | 5 | ~ 40 |
| 실시예 5 | 20,000 | 100 | 5 | ~ 35 |
표 1에 나타나듯이, 다양한 조건, 예를 들어, 제2 세포의 투입 개수, 교반 속도, 교반 시간의 조정에 의해 세포를 단일 세포 단위로 기공에 고립시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
20 : 배지
30 : 다공성 막 31 : 기공
100 : 제1 세포
200 : 제2 세포
30 : 다공성 막 31 : 기공
100 : 제1 세포
200 : 제2 세포
Claims (22)
- 기판,
배지를 위한 공간인 상기 기판과 다공성 막 간의 간격 및
제2 세포를 단일 세포 단위로 고립시킬 수 있는 기공을 갖는 다공성 막을 포함하는 단일 세포 분석 장치. - 제1항에 있어서,
상기 다공성 막과 상기 기판 사이의 간격은 1 ㎛ 내지 100 ㎛ 인 단일 세포 분석 장치. - 제1항에 있어서,
상기 다공성 막은 고분자 재질 또는 무기 재질에서 선택되는 단일 세포 분석 장치. - 제3항에 있어서,
상기 다공성 막은 감광성 고분자 재질인 단일 세포 분석 장치. - 제3항에 있어서,
상기 다공성 막은 고분자 막에 소프트 리소그래피법을 통해 기공을 형성한 것인 단일 세포 분석 장치. - 제4항에 있어서,
상기 다공성 막은 감광성 고분자 막에 리소그래피법을 통해 기공을 형성한 것인 단일 세포 분석 장치. - 제1항에 있어서,
상기 기공의 직경은 1㎛ 내지 100㎛인 단일 세포 분석 장치. - 제1항에 있어서,
상기 다공성 막은 102 내지 106 개/cm2의 기공을 갖는 단일 세포 분석 장치. - 제1항에 있어서,
상기 다공성 막은 기공을 갖고, 기공간의 간격이 1㎛ 내지 10mm인 단일 세포 분석 장치. - 다공성 막의 바닥 면의 배지 내에서 제1 세포를 배양하는 단계;
상기 배지 내의 다공성 막 상에 제2 세포를 포함하는 시료를 도포하는 단계;
교반 및 중력과 같은 외력으로, 상기 제2 세포를 상기 다공성 막에 존재하는 기공 내에 단일 세포 단위로 고립시키는 단계; 및
상기 제1 세포와 단일 세포 수준의 제2 세포 간의 상호작용 상황을 생성하는 단계; 및
제1 세포 또는 제2 세포의 세포 현상을 분석하는 단계;
를 포함하는 단일 세포 분석 방법. - 제10항에 있어서,
상기 제1 세포는 섬유아세포고, 상기 제2 세포는 종양 세포인 단일 세포 분석 방법. - 제10항에 있어서,
상기 배지의 두께는 1㎛ 내지 100㎛인 단일 세포 분석 방법. - 제10항에 있어서,
상기 시료 내의 상기 제1 세포의 농도는 1 x 105 내지 1 x 107 세포수/mL인 단일 세포 분석 방법. - 제10항에 있어서,
상기 제2 세포를 도포할 때, 동시에 교반을 행하는 단일 세포 분석 방법. - 제10항에 있어서,
시료 내의 제2 세포의 농도는 (다공성 막의 기공수 x 1)세포수/mL 내지 (다공성 막의 기공수 x 10,000)세포수/mL 또는 1 x 102 내지 1 x 1010 세포수 /mL 인 단일 세포 분석 방법. - 제14항에 있어서,
1분 내지 1시간 동안 10rpm 내지 500rpm으로 교반을 행하는 단일 세포 분석 방법. - 제10항에 있어서,
상기 기공의 직경은 1 ㎛ 내지 100 ㎛ 인 단일 세포 분석 방법. - 제10항에 있어서,
상기 다공성 막은 102 내지 106 개/cm2의 기공을 갖는 단일 세포 분석 방법. - 제10항에 있어서,
상기 다공성 막은 기공을 갖고, 기공간의 간격이 1 ㎛ 내지 10mm인 단일 세포 분석 방법. - 제10항에 있어서,
상기 제1 세포와 상기 제2 세포 간, 1시간 내지 7일 동안 접촉 또는 측분비 인자를 통해 상호작용을 일으키는 단일 세포 분석 방법. - 제10항에 있어서,
상기 제1 세포 또는 제2 세포의 세포활동을 분석하는 단계는 상기 제 1 세포 또는 제 2 세포의 세포활동을 스크리닝하는 단계를 포함하는 단일 세포 분석 방법. - 제10항에 있어서,
상기 제1 세포 또는 제2 세포의 세포활동을 분석하는 단계는 상기 제 2 세포를 포획하여 분석하는 단계를 포함하는 단일 세포 분석 방법.
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