KR101138472B1 - 바이오 칩의 미세환경 내에서 세포를 공배양하는 방법 - Google Patents

바이오 칩의 미세환경 내에서 세포를 공배양하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이오 칩 내에 조성된 미세환경 하에서 세포 부착 표면 위의 공간 치수(dimension) 또는 높이 조절을 통하여 간편하고 효과적으로 서로 다른 타입의 세포를 공배양하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 세포 부착 표면에 대한 별도의 조작 또는 처리를 수반하지 않으면서, 간단하고 효율적으로 서로 다른 세포를 공배양할 수 있다.
공배양, 바이오 칩, 미세환경, PDMS, 상피세포

Description

바이오 칩의 미세환경 내에서 세포를 공배양하는 방법{Method for Co-culturing Cells in Microenvironment of Biochip}
본 발명은 바이오 칩의 미세환경 내에서 세포를 공배양하는(co-culturing) 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 바이오 칩 내에 조성된 미세환경 하에서 세포 부착 표면 위의 공간 치수(dimension) 또는 높이 조절을 통하여 간편하고 효과적으로 서로 다른 타입의 세포를 공배양하는 방법에 관한 것이다.
세포 관련 연구들의 궁극적 목적은 생체 내(in vivo)에서 일어나는 세포의 모든 작용들을 시험관 내(in vitro)에서 조절하는 것이다. 매크로 사이즈(Macro size)의 기관(organ)으로부터 마이크로 사이즈(micro size)의 세포까지 생체 내 환경을 살펴보면, 생체 내에서는 모든 기초 작용들이 분자 단위에서 이루어지는 것을 알 수 있다. 따라서, 시험관 내 세포 연구의 경우, 미세환경(microenvironment)에서의 세포 조절이 핵심적이라 할 수 있다.
인체를 구성하는 세포는 대부분 상피세포(epithelial cell)이다. 상피 세포의 기본적인 배양 메커니즘은 부착 (attaching/adhering) 및 성장/증식 (growth/proliferation)으로 이루어진다. 이러한 메커니즘의 모든 단계들이 순서에 따라 원활하게 이루어질 때, 세포의 변형 없이 제어할 수 있다.
이와 관련하여, 마이크로 디바이스(micro-device) 내의 미세환경은 전형적으로는 마이크로미터 범위의 크기(scale) 레벨(즉, 약 1000㎛ 미만), 보다 전형적으로는 수십 내지 수백 마이크로미터, 특히 전형적으로는 약 10 내지 300㎛ 범위에서 특성 등이 정하여지므로 세포 수준의 생물학적 응용에 적합하다.
그러나, 세포(특히, 상피 세포)를 마이크로 디바이스에서 적용하는 과정에서는 여러 환경들을 고려하여야 한다. 이와 관련하여, 마이크로 디바이스에서 세포를 안정적으로 배양하기 위하여 많은 연구들이 진행되어 왔다.
미세환경 하에서 세포에 적용되는 상호작용(interaction)은 다양하다. 대표적으로 셀간 상호작용(cell-cell interaction), 셀-표면 상호작용(cell-surface interaction), 세포-가용성 인자 상호작용(cell-soluble factor interaction) 등을 들 수 있다. 이러한 상호작용을 조절하기 위하여 다양한 미세가공법(micro-fabrication method)을 이용하여 미세환경 하에서 세포의 여러 상호작용을 조절하는 방안들이 알려져 있다. 알려진 바와 같이, 미세가공법은 마이크로미터 사이즈의 디바이스 또는 시스템을 제작하는데 사용되는 기술의 총칭이다.
이러한 미세가공 기술은 마이크로 전자공학 분야에서 유래된 것으로, 전형적으로 미세가공된 디바이스는 실리콘 웨이퍼를 비롯하여, 글래스, 플라스틱, 기타 다른 타입의 기판 물질 상에서 제작된다. 미세가공기술은, 예를 들면, 포토리소그래피, 에칭, 박막 증착(thin film deposition), 열 산화 및 세정(cleaning)과 같은 단계에 의하여 수행된다. 미세가공된 디바이스는 배양액 내의 세포 미세환경을 조 절하고 고속처리용 측정을 축소화하는데 활용될 수 있다.
최근에는 포토리소그래피(photolithography) 기술의 한계를 극복하는 소위 "소프트 리소그래피(soft lithography)" 기술이 미세가공법의 하나로 각광받고 있다. 이러한 soft lithography 기술의 대표적인 예로서, PDMS(polydimethylsiloxane)와 같은 탄성체 몰드를 이용하여 표면을 개질하고 패터닝하는 기술을 들 수 있다. PDMS 몰드를 제작하는 기술은 일종의 플라스틱 가공기술로서, 캐스팅(casting), 인젝션(injection), 핫-엠보싱(hot-embossing) 등의 다양한 방법으로 원하는 몰딩 구조를 얻을 수 있다. 예를 들면, 실리콘 웨이퍼, 글래스 등의 기판 상에 감광물질(예를 들면, SU-8)이라는 감광성의 물질을 코팅하고 포토마스크를 이용해서 패터닝하면 결과적으로 마스터(master)가 만들어진다. 이를 주형으로 하여 PDMS를 캐스팅하고 소결시키면, 스탬프 기능을 하는 PDMS 몰드를 완성할 수 있다.
또한, 완성된 PDMS 표면을 플라즈마 처리하면 그 표면이 산화되어 친수성으로 표면 특성이 변화됨과 동시에 글래스 또는 다른 PDMS 재질과 접합시킬 수 있기 때문에 미세유체 채널(micro-fluidic channel)의 제작 등에도 널리 사용되고 있다. 다른 소프트 리소그래피 기술로서 미세유체 패터닝(microfluidic patterning), 멤브레인 기반의 패터닝(MEMPAT), 물리적 패터닝 등의 방법도 알려져 있다.
현재까지 마이크로 디바이스를 이용하여 진단용으로 활용하는 기술이 많이 개발되고 있다. 마이크로 디바이스를 기초로 하여 세포연구에 활용하는 기술 분야로는 세포 배양(cell culturing)을 통한 바이오 반응기(bioreactor), 미세유체 세포 배양 어레이(microfluidic cell culture array), 세포 약물 치료(cell drug treatment), 세포 선택(cell selection), 세포용해(cell lysis), 세포 분리(cell separation), 세포 분석(cell analysis) 등이 있다.
세포 배양은 세포 생물학, 조직 엔지니어링, 바이오 메디컬 엔지니어링, 의약품 개발을 위한 약물 동태학 등에서는 핵심 단계이다. 시험관 내 세포 배양은 다양한 세포를 다량으로 배양하는 것을 가능하게 한다. 비록 시험관 내 세포 배양 기술이 통상의 실험실 내에서 널리 사용되고 있기는 하나, 실험실 내에서 성장된 세포가 생체 내에서 성장된 세포와 동일한지는 여전히 확신할 수 없는 바, 이는 전자가 생물학적 시스템 환경과는 상이한 환경을 수반하기 때문이다. 실제, 살아있는 유기체는 다층, 멤브레인, 단백질 채널 등으로 구성되는 2차원 또는 3차원의 마이크로 스케일의 시스템의 복잡하고 유기적인 구조를 갖고 있다.
앞서 기술한 바와 같이, 세포는 다른 세포 등과의 상호작용을 하면서 성장한다. 그러나, 시험관 내 세포 배양 환경 하에서는 상호 작용할 다른 세포들이 존재하지 않기 때문에, 생체 내에서와 동일한 환경 내에서 배양시킨 것으로 단정할 수는 없다. 예를 들면, 암세포의 경우, 체내에서는 정상 세포의 환경에서 존재하기 때문에 시험관 내에서도 암세포 단독 배양이 아닌, 암세포와 정상세포를 공배양하여 생체 내에서와 유사한 환경을 만들어주는 것이 바람직할 것이다.
이처럼, 미세환경 하에서, 특히 칩의 미세환경에서도 서로 다른 세포를 공배양하여 생체 내에서와 유사한 환경을 조성할 필요성이 존재한다고 할 수 있다. 그러나, 지금까지 알려진 미세환경 내의 세포 공배양 시스템 또는 방법은 여전히 기 술적 한계를 갖고 있다.
이에 대한 원인으로, 미세환경 하에서의 세포 배양은 공간적 한계를 갖고 있다는 점을 들 수 있다. 미세 공간 내에서 세포는 그 이상의 공간에서와 달리, 안정성을 갖는데 상대적으로 오랜 시간이 걸린다. 이와 관련하여, 미세환경 내에서 세포 거동은 확산(diffusion)에 의존하는 것으로 밝혀진 바 있다. 따라서, 장기간에 걸친 세포 배양 시 세포의 분비성 인자(secreted factors)가 축적되면서 확산에 한계를 갖는 마이크로 디바이스에서 세포의 모든 기작은 한계를 가질 수밖에 없게 된다. 특히, 바이오 칩의 미세환경 내에서 서로 다른 타입의 세포를 각각 정해진 세포 배양 영역에 선택적으로 부착하도록 제어하여 공배양하는 것은 용이한 작업이 아니다.
이와 관련하여, 제1 타입의 세포가 세포외 기질(extracellar matrix) 단백질로 코팅된 영역(세포 부착 촉진 영역)에만 부착하도록 유도하고, 그 다음 전기 포텐셜의 인가에 의하여 나머지 영역을 전기적으로 활성화시켜 제2 타입 세포가 부착되도록 하는 기술이 제시된 바 있다(Proc . Natl . Acad . Sci . (USA) 2001, 98, 5992).
상기 문헌을 포함한 종래 기술의 대부분은 공배양되는 세포의 부착 표면(즉, 하면)에 패턴화된 배양이 가능하도록 별도의 특성을 부여한 것으로서, 절차가 번거로울 뿐만 아니라, 바이오 칩의 미세환경에 용이하게 적용하는데 한계가 있다.
이에 본 발명자들은 종래에 알려진 기술의 경우, 바이오 칩의 미세환경 내에서 서로 다른 세포를 공배양하는데 기술적 곤란성이 존재함을 인지하였고, 지속적으로 연구한 결과, 미세환경 내에서 세포 부착 영역 위에 존재하는 공간의 3차원적 치수(dimension) 또는 높이가 세포의 부착(배양) 특성에 중대한 영향을 미치는 점을 발견하였으며, 본 발명은 이에 기초한다.
따라서, 본 발명은 바이오 칩의 미세환경 내에서 간단하고 효율적으로 서로 다른 세포를 공배양하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 구체예에 따르면,
바이오 칩 내 미세환경의 세포 배양 영역에서 서로 다른 타입의 세포를 공배양하는 방법으로서,
a) 상기 세포 배양 영역 중 제1 영역에 제1 타입의 세포를 선택적으로 부착하는 단계; 및
b) 상기 세포 배양 영역 중 제2 영역에 제2 타입의 세포를 선택적으로 부착하는 단계;
를 포함하고,
상기 제1 영역 및 제2 영역은, 상기 단계 a) 및 b) 각각에 있어서, 상기 세포 배양 영역 위의 공간에 제공되는 3차원의 미세패턴(micro-pattern)에 의하여 서로 구별되며. 그리고
상기 단계 a) 중에는 제1 타입의 세포가 부착되는데 충분한 높이의 공간이 제1 영역 위에 형성되는 한편, 상기 단계 b) 중에는 제2 타입의 세포가 부착되는데 충분한 높이의 공간이 제2 영역 위에 형성되는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
단계 a) 및 b)에 있어서, 제1 영역 및 제2 영역 각각 위에 제공되는 3차원의 미세패턴은 바람직하게는 서로 상반된(inversed) 입체 형상 또는 기하학 특성(geometry)을 가지는데, 이때 3차원의 미세패턴은 볼록부와 오목부로 구성되는 패턴일 수 있다.
예를 들면, 단계 a)에서는, 하측 방향 기준으로, 제1 영역 위에 오목부가 형성되도록 하여 제1 영역에만 제1 타입의 세포가 효과적으로 부착되는데 충분한 높이를 확보할 수 있는 한편, 단계 b)에서는, 하측 방향 기준으로, 제1 영역 위에 볼록부가 형성되도록 하고 제2 영역 위에 오목부가 형성되도록 하여 제2 영역에만 제2 타입의 세포가 효과적으로 부착되는데 충분한 높이를 갖도록 할 수 있다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 제1 및 제2 타입의 세포(상피 세포)의 부착에 적합한 높이는 바람직하게는 적어도 약 100㎛, 보다 바람직하게는 약 100 내지 500㎛, 특히 바람직하게는 약 250 내지 300㎛ 범위일 수 있다.
또한, 단계 a) 및 단계 b)의 부착 시간은 배양되는 세포의 특성을 고려하여 결정될 수 있는데, 전형적으로 약 12시간 이내, 보다 전형적으로 약 3 내지 12 시간 범위에서 수행되면 충분하다. 특히, 단계 b)의 경우에는, 이미 부착된 제1 타입 세포의 부착 특성에 악영향을 주지 않도록 약 3 내지 5 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 바이오 칩 내 미세환경은 당업계에서 통상적으로 사용되는 재질을 특별한 제한 없이 사용하여 구성할 수 있는 바, 이때 글래스, 반도체 웨이퍼, 고분자 등의 다양한 재질이 가능하다. 전형적으로는, 글래스 재질, 고분자 재질 또는 이들의 조합(예를 들면, 상면 및 하면 중 하나가 글래스 재질의 표면이고 나머지가 고분자 재질의 표면인 경우)으로 구성할 수 있으며, 특히 고분자 재질의 표면이 제공되는 것이 바람직하다.
상기 고분자 재질로서 탄성 고분자(elastomer), 보다 바람직하게는 생체 적합성(biocompatibility)을 갖는 연성의 실리콘 탄성체, 특히 바람직하게는 폴리디메틸실록산(PDMS)을 사용할 수 있다.
또한, 세포가 보다 용이하게 부착되도록, 예를 들면 ATPES(3-aminopropyl-triethoxysilane)과 같은 화학물질을 이용하여 표면처리하는 방법, 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen)과 같은 ECM(extracellular matrix) 물질을 코팅하는 방법, 플라즈마 처리를 통하여 표면에 전하를 부여하는 방법 등을 통하여 미세환경을 이루는 재질(예를 들면, 글래스 또는 고분자)의 표면을 친수화할 수 있다. 바람직하게는 O2 플라즈마를 이용한 표면 처리 방법이 이용될 수 있다.
본 발명의 제2 면에 따르면,
a) 볼록부 및 오목부로 이루어지는 3차원의 미세패턴 표면을 갖는 제1 상부 고 분자 층 상에 제1 타입의 세포를 주입하는 단계;
b) 상기 제1 타입의 세포가 주입된 제1 상부 고분자 층 위에 일정 간격을 두고 하부 고분자 층을 제공하고, 이를 반전시켜 상기 제1 상부 고분자 층 표면의 오목부에 대응하는 상기 하부 고분자 층 표면의 제1 세포 배양 영역에 제1 타입의 세포를 선택적으로 부착하는 단계;
c) 볼록부 및 오목부로 이루어지며 상기 제1 상부 고분자 층과 상반된(inversed) 3차원의 미세패턴 표면을 갖는 제2 상부 고분자 층 상에 제2 타입의 세포를 주입하는 단계; 및
d) 상기 제2 타입의 세포가 주입된 제2 상부 고분자 층 위에 일정 간격을 두고 상기 제1 타입의 세포가 부착된 하부 고분자 층을 제공하고, 이를 반전시켜 상기 제2 상부 고분자 층 표면의 오목부에 대응하는 상기 하부 고분자 층 표면의 제2 세포 배양 영역에 제2 타입의 세포를 선택적으로 부착하는 단계;
를 포함하고,
상기 단계 b) 중에는 상기 제1 세포 배양 영역 위에 제1 타입의 세포가 부착되는데 충분한 높이의 공간이 형성되는 한편, 상기 단계 d) 중에는 상기 제2 세포 배양 영역 위에 제2 타입의 세포가 부착되는데 충분한 높이의 공간이 형성되는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
상기 구체예에 있어서, 고분자 층(즉, 제1 및 제2 상부 고분자 층, 및 하부 고분자 층)의 이면(하면)에는 기판(substrate)을 부착하는 것이 바람직하다. 이때, 예를 들면 글래스, 투명 플라스틱 등과 같이 투명성 재질의 기판을 사용하는 것이 바람직한데, 이는 배양 과정 중 부착되는 세포를 관찰할 필요성이 있기 때문이다.
상기 제1 및 제2 상부 고분자 표면에 형성된 3차원의 미세패턴은, 바람직하게는 포토리소그래피법을 이용한 성형 또는 몰딩 공정을 통하여 형성할 수 있다. 구체적으로,
기판 상에 포토레지스트층을 형성하는 단계;
상기 포토레지스트층을 패터닝하는 단계; 및
상기 패터닝된 포토레지스트층을 주형(template)으로 사용하여 고분자 표면에 상기 3차원의 미세패턴이 형성되도록 성형 또는 몰딩하는 단계;
를 포함하는 방법을 이용할 수 있다.
한편, 하부 고분자 층의 경우, 바람직하게는 평면(flat) 형상으로 구성할 수 있는 바, 다만 그 주연부에 스페이서 역할을 하는 돌출 영역을 형성하여, 하부 탄성 고분자 층과 제1 및 제2 상부 고분자 층이 일정 간격을 두고 배치되도록 할 수 있다. 일 예로서, 기판 상에 포토레지스트층을 형성한 다음, 주연부만을 제거하도록 패턴화하고, 이를 주형으로 사용하여 고분자를 성형 또는 몰딩할 수 있다.
본 발명에 있어서, 공배양되는 세포는 모든 부착형 세포, 보다 전형적으로는 부착형 상피 세포에 속하는 다양한 종류가 특별한 제한 없이 적용될 수 있다. 또한, 공배양 가능한 세포, 특히 상피 세포의 조합 역시 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면 항암제 특성을 확인하기 위한 암세포/정상세포의 조합 등이 고려될 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 공배양 방법은 바이오 칩의 미세환경 내 세포 배양 영역 위의 3차원적 치수(dimension) 또는 높이를 조절함으로써, 특히 단일 세포 배양 챔버를 사용하여 서로 다른 타입의 세포를 간편하고 효과적으로 공배양할 수 있는 장점을 갖는다. 더욱이, 종래 기술과는 달리 세포가 부착되는 표면(하면)의 특성을 변화시키는 대신에, 상측 공간의 높이 조절에 따른 세포의 거동 특성을 이용하기 때문에 간편성 면에서 한층 우수하다. 따라서, 향후 광범위한 상용화가 기대된다.
본 발명은 첨부된 도면을 참고로 하여 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아님을 이해해야 한다.
본 발명자들이 미세환경 하에서 세포의 거동(behavior)에 영향을 주는 요소들을 선정하고, 각각의 요소들이 세포의 거동에 미치는 영향을 체계적으로 평가한 바에 따르면, 바이오 칩의 미세환경 내 세포 배양에 있어서는 3차원적 치수(dimension), 즉 세포 배양 영역의 높이에 의하여 중대한 영향을 받게 된다. 따라서, 미세환경 내 세포 배양 영역 위의 높이 조절에 의하여 세포 거동을 용이하게 조절할 수 있고, 원하는 패턴에 따라 서로 다른 세포를 공배양할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라, 바이오 칩의 미세환경 내에서 서로 다른 2가지 타입의 세포를 공배양하기 위한 세포 부착 방법을 순차적으로 도시하는 단면 순서도이다.
도 2(a) 및 도 2(b)는 본 발명의 일 구체예에서 사용할 수 있는 제1 상부 고분자 층/기판 구조물 및 제2 상부 고분자 층/기판 구조물의 외관을 각각 부분적으로 도시하는 사시도이다.
상기 도시된 구체예에서, 먼저 개별 기판(14, 24, 34) 상에 하부 고분자층(13), 제1 상부 고분자 층(23) 및 제2 상부 고분자층(33)을 각각 형성한 3가지 고분자 층/기판 구조물(1, 2, 3)을 별도로 제작한다. 상기 고분자로서 탄성 고분자, 보다 바람직하게는 생체 적합성(biocompatibility)을 갖는 연성의 실리콘 탄성체 등이며, 특히 바람직하게는 폴리디메틸실록산(PDMS)을 사용할 수 있다.
상기 고분자 층/기판 구조물은 포토리소그래피법, 이온 밀링, e-beam 리소그래피법 등과 같은 통상의 실리콘 가공 기술에 의하여 제작될 수 있다. 본 발명이 특정 가공 기술로 한정되는 것은 아니지만, 도시된 바와 같이 포토리소그래피법을 이용하는 것이 바람직하다.
하부 고분자층(13)/기판(14) 구조물의 경우, 도 1(a)에 도시된 바와 같이, 먼저 주형용 기판(11)에 포토레지스트 층(12)을 형성한다. 상기 포토레지스트(12)는 감광성 물질로서, 바람직하게는 해상도 및 생체 적합성(biocompatibility)이 좋은 SU-8(에폭시계 네거티브 포토레지스트의 일종)을 사용할 수 있으나, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 주형용 기판은 글래스, 투명 플라스틱, 실리콘 웨이퍼 등, 다양한 재료로부터 선택하여 사용할 수 있다. 이때, 포토레지스트 층(12)은 통상의 고분자 코팅법, 예를 들면 스핀 코팅법에 의하여 주형용 기 판(11) 상에 도포될 수 있다. 도포된 포토레지스트 층(12)은 이후 선택적 제거 과정을 통하여 전체적으로 평면(flat) 형상을 가지면서 주연부 만이 제거된 포토레지스트 층(12')을 형성한다.
상기 포토레지스트 층(12')/주형용 기판(11) 구조물을 주형(template)으로 사용한 몰드 내로, 예를 들면 경화제를 함유한 액상 고분자를 부어 경화시킴으로써 고분자 층(13)을 형성할 수 있다. 상기 형성된 고분자 층(13)을 분리한 다음, 기판(14)에 부착하여 하부 고분자 층(13)/기판(14) 구조물(1)을 제작할 수 있다.
이때, 상기 고분자는 바람직하게는 실리콘계 탄성 고분자인 PDMS이며, 이의 제조를 위하여 사용되는 성분의 비, 즉 고분자(PDMS) : 경화제의 중량 비는 당업계에서 통상적으로 사용되는 범위, 예를 들면 약 10:1 내지 약 11:1 범위일 수 있다. 대표적으로는 Dow Corning사에 의하여 시판 중인 2액형의 Sylgard 184 키트(Sylgard A:Sylgard B=10:1)가 바람직하게 사용될 수 있다.
또한, 기판(14)은 주형용 기판과는 달리, 후속 단계에서 관찰이 용이하도록 투명성 재질, 바람직하게는 글래스 재질로 구성하는 것이 바람직하다.
상술한 바와 같이, 포토레지스트의 주연부가 제거된 주형 구조물을 사용하는 이유는 대응하는 성형된(몰딩된) 구조물(즉, 하부 고분자층(13)/기판(14) 구조물)의 주연부에 돌출 영역을 형성함으로써 추후 상부 고분자 층의 표면과 일정 간격을 유지하기 위한 일종의 스페이서(15)를 구비하기 위한 것이다.
그 다음, 주형을 분리하여 하부 고분자층(13)/기판(14) 구조물(1)을 얻는다. 선택적으로, 후속 공정에서 세포와의 부착성을 향상시킬 목적으로 상기 하부 고분 자 층(13)을 친수화 처리할 수 있는 바, 이를 위하여 ATPES(3-aminopropyl-triethoxysilane)과 같은 화학물질을 이용하여 표면 처리하는 방법, 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen)과 같은 ECM(extracellular matrix) 물질을 코팅하는 방법, 플라즈마 처리를 통하여 표면에 전하를 부여하는 방법 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 O2 플라즈마를 이용한 표면 처리 방법이 이용 가능하다.
제1 상부 고분자 층(23)/기판(24) 구조물(2) 및 제2 상부 고분자 층(33)/기판(34) 구조물(3)은 상술한 절차와 유사한 방식으로 제작될 수 있다.
제1 상부 고분자 층(23)/기판(24) 구조물(2)의 경우, 도 1(b)에 도시된 바와 같이, 먼저 주형용 기판(21) 상에 포토레지스트 층(22)을 형성하고, 노출-현상-제거 처리를 통하여 입체적으로 미세패턴화된 포토레지스트 층(22')을 형성한다. 그 다음, 포토레지스트 층(22')/주형용 기판(21) 구조물을 주형으로 하여 제1 고분자 층(23)을 성형(또는 몰딩)하고 분리한 다음, 기판(24)을 부착한다.
이와 같은 방식을 통하여 볼록부(26)와 오목부(25)로 이루어지는 3차원적 미세패턴 표면을 갖는 제1 상부 고분자 층(23)/기판(24) 구조물(2)을 제작한다.
본 명세서에서 "볼록부" 및 "오목부"는 도 1에서와 같은 수직 단면 상에서의 상대적 개념으로서, 예를 들면 상대적으로 돌출된 영역을 "볼록부"라고 할 때, 볼록부와 볼록부 사이에 존재하는 영역을 편의상 "오목부"로 언급할 수 있다. 역으로, 상대적으로 함몰된 영역을 "오목부"라고 할 때, 오목부와 오목부 사이에 존재하는 영역을 편의상 "볼록부"로 언급할 수 있다.
제2 상부 고분자 층(33)/기판(34) 구조물(3)의 경우에도, 도 1(c)에 도시된 바와 같이, 먼저 주형용 기판(31) 상에 형성된 포토레지스트 층(32)에 노출-현상-제거 처리를 통하여 패턴화된 포토레지스트 층(32')을 형성한다. 그 다음, 포토레지스트 층(32')/주형용 기판(31) 구조물을 주형으로 하여 제2 고분자 층(33)을 성형(또는 몰딩)하고 분리한 다음, 기판(34)을 부착한다. 그 결과, 볼록부(36)와 오목부(35)로 이루어지는 3차원적 미세패턴 표면을 갖는 제2 상부 고분자 층(33)/기판(34) 구조물(3)을 제작할 수 있다.
이때, 제1 상부 고분자 층(23) 및 제2 상부 고분자 층(33) 각각의 표면이 서로 상반된(inversed) 기하학적 특성(geometry)의 입체 패턴을 갖도록 설계한다.
상기와 같이 제작된 3개의 고분자 층/기판 구조물(1, 2, 3)을 이용하여, 서로 다른 타입의 세포를 상기 하부 고분자 층(13) 상에 원하는 패턴에 따라 부착할 수 있다.
먼저, 도 1(d)에 도시된 바와 같이, 제1 상부 고분자 층(23)/기판(24) 구조물(2)에 제1 타입 세포(41)를 주입한다.
그 다음, 도 (1e)에 도시된 바와 같이, 구조물(1)의 하부 고분자 층(13)이 제1 상부 고분자 층(23)을 마주보도록(즉, 반전시켜) 위치시킨다. 이때, 하부 고분자 층(13)의 주연부에 형성된 돌출 영역 또는 스페이서(15)에 의하여 하부 고분자 층(13)의 표면과 제1 상부 고분자 층(23)의 표면(즉, 미세패턴의 볼록부 상면) 사이에 일정 간격이 유지된다. 상기 간격은 바람직하게는 스페이서(돌출 영역)의 치수를 변경함으로써 조절할 수 있는데, 바람직하게는 약 10 내지 80㎛, 보다 바람직하게는 약 30 내지 60㎛ 범위이다.
도 1(f)에 도시된 태양에 따르면, 구조물(2) 위에 구조물(1)이 위치하는 전체 구조를 반전시킴에 따라, 상기 제1 상부 고분자 층(23)의 표면에 형성된 오목부(25)에 대응하는 하부 고분자 층(13)의 표면 상에 제1 세포 배양 영역(51)이 정하여지며, 상기 제1 세포 배양 영역(51)의 표면에 제1 타입 세포(41)가 착상(seeding)되어 선택적으로 부착된다. 이때, 제1 세포 배양 영역(51) 위의 공간에는 제1 타입의 세포(41)가 충분한 정도로 부착될 수 있는 높이가 확보되는 것이 중요하다. 구체적으로, 하부 고분자 층(13)의 표면으로부터 상기 제1 상부 고분자 층(23)의 표면에 형성된 3차원의 입체패턴 중 오목부(25)의 면까지의 거리(H)는 바람직하게는 적어도 약 100 ㎛, 보다 바람직하게는 약 100 내지 500㎛, 특히 바람직하게는 약 250 내지 300㎛ 범위이다. 만약, 제1 세포 배양 영역 위에 충분한 높이가 형성되지 않을 경우, 제1 타입의 세포(41)가 후속 단계에서 탈착되어 원하는 패턴에 따라 공배양하기 곤란하다.
이와 관련하여, 상기 제1 세포 배양 영역(51)의 형상 및 사이즈는 제1 상부 고분자 층(23)의 표면에 3차원의 미세패턴을 형성하는 과정 중 오목부(25)의 형상 및 사이즈를 조절함으로써 정할 수 있다.
상술한 제1 타입 세포의 선택적 부착 단계는 바람직하게는 약 12시간 이내, 보다 바람직하게는 약 3 내지 12 시간 동안 수행될 수 있다.
도 1(g)에 따르면, 제1 상부 고분자 층(23)/기판(24) 구조물(2)을 분리하고, 하부 고분자 층(13)의 표면에 유체 흐름을 가하여 세정(cleaning) 작업을 수행한다. 이때, 세정용 유체로서 예를 들면 완충용액(PBS), 배지 등을 사용할 수 있다. 상술한 세정 단계를 거치면, 제1 타입 세포(41)는 실질적으로 하부 고분자 층(13)의 표면 중 제1 세포 배양 영역(51)에 선택적으로 부착된 상태로 존재하게 된다.
한편, 도 1(h)에 도시된 바와 같이, 제2 상부 고분자 층(33)/기판(34) 구조물(3)에 제2 타입의 세포(42)를 주입한다. 그 다음, 도 1(i)에서와 같이, 앞서 설명한 제1 타입의 세포를 부착하는 경우와 동일한 절차에 따라 먼저 구조물(3) 위에 하부 고분자 층(13)/기판(14) 구조물(1)을 반전시켜 위치시킨다. 이때, 하부 고분자 층(13)의 표면 중 제1 세포 배양 영역(51)에는 제1 타입의 세포가 선택적으로 부착되어 있다.
도시된 구체예에 있어서, 하부 고분자 층(13)의 표면 위에 위치하는 제2 상부 고분자 층(33)은 제1 상부 고분자 층(23)과 상반된(즉, 양각 및 음각이 서로 바뀐) 3차원적 미세패턴이 형성된 표면을 갖는다.
도 1(j)에 도시된 바와 같이, 구조물(3) 위에 구조물(1)이 위치하는 구조를 반전시키면, 제2 상부 고분자 층(33)의 표면에 형성된 오목부(35)에 대응하는 하부 고분자 층(13)의 표면 상에 제2 세포 배양 영역(52)이 정하여진다. 상기 제2 세포 배양 영역(52) 위의 공간은, 도 1(f)에 도시된 제1 타입의 세포 부착 과정에서 제1 상부 고분자 층(23) 표면의 미세패턴 중 볼록부(26)에 대응하는 곳이다. 이처럼, 하부 고분자 층(13)의 표면에 형성된 제1 세포 배양 영역(51) 및 제2 세포 배양 영역(52)은 각각 위에 존재하는 공간의 높이에 의하여 서로 구별될 수 있는 것이다. 상기 구체예에 있어서, 제2 타입의 세포(42)는 제2 세포 배양 영역(52)의 표면 상에 착상(seeding)되어 선택적으로 부착된다.
제1 및 제2 타입의 세포 부착 단계 각각에 있어서, 해당 세포 배양 영역 위의 공간 높이는 실질적으로 동등하도록 설정되어 있으나, 제1 및 제2 상부 고분자 층(23, 33) 각각의 표면에 3차원의 미세패턴을 형성하는 과정에서 돌출부 및 오목부의 수치(dimension)를 변화시킴으로써 제1 및 제2 타입의 세포(41, 42) 각각의 부착 단계에서 제공되는 공간 높이를 허용 범위 내에서 변경할 수도 있다. 이러한 경우에 있어서도, 제1 세포 배양 영역(51) 상에 이미 부착된 제1 타입의 세포(41)가 제2 상부 고분자 층(33)에 형성된 볼록부(36)에 의하여 물리적으로 손상되지 않도록 일정한 공간을 확보하는 것이 바람직하다.
제2 타입의 세포(42) 부착 단계는 제1 타입의 세포(41) 부착 단계에서와 유사하게, 바람직하게는 약 12 시간 이내, 보다 바람직하게는 약 3 내지 12 시간에 걸쳐 수행될 수 있다. 다만, 약 3 내지 5 시간에 걸쳐 수행하는 것이 특히 바람직한데, 그 이유는 제2 타입의 세포 부착 시간이 지나치게 긴 경우에는 제1 세포 배양 영역(51)에 이미 부착된 제1 타입의 세포(41)가 그 위에 존재하는 공간의 낮은 높이에 의하여 영향을 받을 수 있음을 고려한 것이다.
그 다음, 제2 상부 고분자 층(33)/기판(34) 구조물(2)을 분리하고, 도 1(g)와 관련하여 설명된 방법과 동일하게 세정(cleaning) 작업을 수행한다. 상기 세정 단계를 통하여, 제2 세포 배양 영역(52) 이외에 존재하는 제2 타입의 세포(42)가 제거된다. 따라서, 도 1(k)에 도시된 바와 같이, 하부 고분자 층(13)의 제1 세포 배양 영역(51) 및 제2 세포 배양 영역(52)에는 대응하는 제1 타입 세포(41) 및 제2 타입 세포(42)가 각각 선택적으로 부착된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 제1 세포 배양 영역(51)이 상기 제2 세포 배양 영역(52)에 의하여 둘러싸인 패턴에 따라 공배양하는 것이 바람직하며, 이때 상기 제1 세포 배양 영역의 형상으로 원형, 사각형 등의 다양한 패턴이 가능하다.
또한, 상기 제1 및 제2 세포 배양 영역(51, 52) 상에 부착되는 세포의 밀도는 전형적으로 약 1×104 내지 1×106 cells/㎟ 범위일 수 있다.
상술한 공정에 따라 서로 다른 타입의 세포를 특정 패턴에 따라 부착시키면, 당업계에 알려진 통상의 방법에 따라 후속 성장/증식 단계를 수행할 수 있다.
본 발명에 따라 제공되는 방법은 세포 배양 영역의 표면(즉, 하면) 특성을 변경하는 대신에 상측 공간의 3차원적 치수 또는 높이를 변경하여 공배양할 수 있기 때문에 보다 편리하고 다양한 후속 응용 과정을 수행할 수 있다. 이러한 응용 과정의 예로서 항암제 스크리닝, 환경오염 측정 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
바이오 칩의 미세환경 하에서 세포의 배양 특성에 영향을 미치는 요소 선정
상피 세포를 대상으로 하는 바이오 칩의 미세환경에 있어서 배양에 영향을 미치는 환경 요인으로서 세포 착상 밀도(cell seeding density), 칩의 미세환경 높이 및 배지 교환 시간(media change time)을 선정하였고, factorial 프로그램을 이용하여, 3가지 요소 중 2가지를 고정하고 나머지를 변경하면서 어떠한 요소가 바이오 칩의 미세환경 내에서 세포의 표면 부착에 중요한 영향을 미치는지 평가하였다.
본 실시예에 따른 미세환경 내 세포 배양은 하기와 같이 제작된 바이오 칩을 사용하여 수행되었다.
각각 80㎛ 및 500㎛의 두께에 상당하는 량의 SU-8 2025(Micro-chem, USA)를 슬라이드 글래스(slide glass; 1mm) 상에 스핀 코터(shinumst, KOREA)로 도포한 다음, 핫 플레이트(hot plate; Luchi, JAPAN)을 이용하여 65℃에서 3분 동안, 그리고 95℃에서 7 분 동안 소프트 베이킹(soft baking)하였다. 그 후, MASK ALIGNER(shinumst, KOREA) 및 필름 마스크를 이용하여 22초간 노광하였다.
노광 공정 후, 핫 플레이트를 이용하여 95℃에서 25분 동안 후 베이킹(post-baking)하였으며, 상온이 될 때까지 온도를 낮추었다. 상기와 같이 후 베이킹된 글래스를 PGMEA에 45분 동안 현상(developing)한 다음, 이소프로판올로 세척하여 패턴화된 SU-8/글래스 구조물을 제작하였다(높이: 각각 80㎛ 및 500㎛).
패턴화된 SU-8 층/글래스 구조물 상에 경화제를 함유하는 PDMS(Sylgard 184, Dow Corning, MI, USA) 혼합물(PDMS:경화제 중량비가 10:1)을 붓고, 약 1시간 동안 80℃에서 베이킹하여 경화시켰다. 이때, SU-8 패턴은 약 1.0cm의 폭을 가지면서 길이 방향으로 연장되는 돌출 영역이 소정 높이(각각 80㎛ 및 500㎛)를 갖도록 구성되었다. 그 결과, 약 1.0cm의 폭을 가지면서 길이 방향으로 연장되며, 상기 SU-8 패턴 높이에 상당하는 마이크로 채널(channel)이 형성된 3차원적 PDMS 층(상판)이 형성되었다. 세포의 주입을 위하여 상기 PDMS 층의 양 단부에 구멍을 뚫어 두었다.
이와 별도로, PDMS 혼합물을 슬라이드 글래스(두께: 1mm) 상에 평면 상으로 스핀 코팅하여 PDMS 층(두께: 700㎛)/슬라이드 글래스 구조물(하판)을 제작하였다.
상기 하판의 PDMS 층과 상기 패턴화된 PDMS 층(상판)을 서로 마주보도록 배치시켰다. 그 다음, 상기 상판의 양 단부에 뚫린 구멍을 통하여 세포를 주입시켜 하판 상에 세포를 부착하였다.
이때, 사용된 세포는 유선 상피 세포(Human Epithelial Mammary Cells; HMEC)로서 정상 유방 세포주(normal human breast cell line; Lonza, Wakersville, MD, USA)를 사용하였고, RPMI-1640 (PAA, Austria) 배지를 사용하였다. 또한, 세포가 용이하게 부착하도록 O2 플라즈마(Femto Science Cograde, 60W, Korea)를 사용하여 세포 부착 표면이 전하를 띄게 하였으며, 동일한 시간에 착상(seeding)하였다.
하기 표 1에 기재된 바와 같이, 각각의 요소들이 가장 낮은 영향을 미치는 레벨(low level) 및 가장 큰 영향을 미치는 레벨(high level)을 선정하였으며, half factorial 프로그램을 이용하여 3회 반복실험을 수행하였다.
[표 1]
요소 낮은 레벨 높은 레벨
세포 착상 밀도(cells/㎟) 100 1,500
칩의 높이(㎛) 80 500
배지 교환 시간(1일 기준) 24시간 마다(1회) 6시간 마다(4회)
상피 세포의 특징에 따라 2가지 세포 거동인 부착(adhesion) 및 성장(growth)의 정도를 확인하였다.
먼저, 세포 부착 정도를 측정하기 위하여, 18시간에 걸쳐 세포가 표면에 충분히 부착될 수 있도록 하였다. 그 다음, 칩 내부에 유체(배지)를 흘려주어 일정 수준 이하의 부착 강도로 존재하는 세포를 제거하였으며 남아 있는 세포의 수를 계산하였다. 일단, 3가지 요소 중에서 배지 교환 시간에 의한 영향은 배제한 상태에서 실험을 수행하였고, 칩의 높이 및 세포 착상 밀도를 변화시키면서 세포의 부착 정도를 평균 백분율(부착된 세포의 수/착상된 세포의 수×100)로 구하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 그래프에서 -1 및 1은 각각 선정된 요소의 최소값 및 최대값을 가리킨다.
상기 도면에 따르면, 칩의 높이를 최소로 설정한 경우(80㎛)에는 세포 착상 밀도에 관계없이 세포의 부착율은 약 0인 반면, 칩의 높이를 증가시킬수록 세포의 부착율이 증가하는 경향을 나타낸다. 이처럼, 세포 부착율은 세포 착상 밀도에는 특별한 영향을 받지 않으나, 칩의 높이에 의하여는 큰 영향을 받는 것으로 확인되 었다.
한편, 3가지 요소가 세포의 성장에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 표 1에 기재된 범위에서 정해진 세포 착상 밀도로 칩 내에 세포(HMEC)를 주입한 다음, 설정된 배지 교환 시간에 따라 칩 내의 배지를 교환하였다. 24시간 후 세포 수를 세어 각 요소 변경에 따른 세포 성장율(cell growth rate)을 측정하여 도 4에 나타내었다. 이때, 세포 성장율은 부착된 세포 수에 대한 증가된 세포 수의 비율(즉, 세포 증식 후의 세포 수를 부착된 세포 수로 나눈 값)으로 정의된다. 이때, 세포 성장율이 '1'인 경우는 전혀 성장하지 않은 것을 의미하며, '2'인 경우에는 2배로 성장된 것을 의미한다.
도 4에 있어서, 그래프(1)은 세포 착상 밀도와 칩의 높이에 의한 세포 성장율의 변화를 나타낸다. 세포 성장율은 세포 착상 밀도 및 칩의 높이에 영향을 받아, 칩의 높이가 큰 경우에는 세포 착상 밀도가 높을수록 세포 성장율이 높음을 알 수 있다. 반면, 칩의 높이가 낮은 경우에는 세포 착상 밀도가 높음에도 불구하고 세포 성장율이 저하됨을 보여준다. 즉, 칩의 높이가 낮으면, 앞의 실험 결과에서 확인된 바와 같이, 세포 부착 정도가 저하되어 세포 성장율에도 중대한 영향을 미친 것으로 판단되었다.
그래프(2)는 배지 교환 시기 및 세포 착상 밀도가 세포 성장율에 미치는 영향을 나타낸다. 이와 관련하여, 세포 착상 밀도가 높으면, 배지 교환 시기를 짧게 하는 것(즉, 흐름을 높게 하는 것)이 세포 성장율에 유리함을 알 수 있다. 반면, 세포 착상 밀도가 낮은 경우에는, 배지 교환 시기를 길게 하는 것(즉, 흐름을 낮게 하는 것)이 세포 성장율을 높이는 것으로 확인되었다.
이러한 결과는 세포 착상 밀도가 높을수록 배지 내의 영양분 및 배설물의 고립이 빠르게 진행되기 때문에 자주 배지 교환하는 것이 세포 성장율을 높일 수 있음을 의미한다. 반면, 세포 착상 밀도가 낮은 경우에는 영양분 및 배설물의 고립보다 먼저 배지 교환에 의하여 부착된 세포가 손상되는 현상이 두드러지기 때문인 것으로 설명할 수 있다.
그래프(3)은 칩의 높이와 배지 교환 시간이 세포 성장율에 미치는 영향을 나타낸다. 상기 그래프에 따르면, 배지 교환 시간은 칩의 높이가 큰 경우에만 영향을 주는 반면, 칩의 높이가 낮은 경우에는 실질적인 영향을 주지 않았다. 또한, 칩의 높이가 큰 경우, 배지 교환 시간을 짧게 하는 것이 세포 성장에 그다지 유리하지 않는 것으로 확인되었다.
상술한 실험 결과로부터, 세포 성장율은 3가지 요소 중 칩의 높이에 의하여 가장 큰 영향을 받는 것으로 판단되었으며, 세포 착상 밀도는 세포 성장에 영향을 미치기는 하나, 세포 부착에는 중대한 영향을 미치지 않는 것으로 결론 내릴 수 있다.
실시예 2
칩의 높이 변화에 따른 세포 부착 및 성장 평가 실험
실시예 1로부터 도출된 결과에 기초하여, 도 5에 도시된 개념에 따라 하기와 같이 실시하였다.
슬라이드 글래스(두께: 1mm) 상에 SU-8 2025(Micro-chem, USA)을 스핀 코터 (shinumst, KOREA)로 1500 rpm에서 30초 동안 도포하였다. 이때, 상기 도포량은 50㎛의 두께에 상당한다. 슬라이드 글래스 상에 도포된 SU-8을 핫 플레이트(Luchi, JAPAN)를 이용하여 65℃에서 3분 동안, 그리고 95℃에서 7분 동안 소프트 베이킹하였다. 그 다음, MASK ALIGNER(shinumst, KOREA) 및 필름 마스크를 이용하여 22초 동안 노광하였다.
노광 공정 후, 그 위에 다시 SU-8 2100(Micro-chem, USA)을 캐스팅(casting) 방식에 의하여 420㎛ 두께에 상당하는 량으로 도포하였다. 상기 도포된 SU-8을 핫 플레이트(Luchi, JAPAN)를 이용하여 65℃에서 30분 동안, 그리고 95℃에서 420분 동안 소프트 베이킹하였으며, MASK ALIGNER(shinumst, KOREA) 및 필름 마스크를 이용하여 원하는 부위를 60초 동안 노광하였다.
노광 공정 후, 핫 플레이트를 이용하여 95℃에서 25분 동안 후 베이킹(post-baking)하였으며, 상온이 될 때까지 온도를 낮추었다. 후 베이킹까지 완료된 글래 스를 PGMEA에 45분 동안 현상한 다음, 이소프로판올로 세척하여 미세패턴이 형성된 SU-8층/글래스 구조물을 얻었다.
상기 패턴화된 SU-8 층/글래스 구조물을 주형으로 사용하여, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 (미세)패턴화된 PDMS 층(상판)을 성형하였다.
실시예 1에서 확인된 바와 같이 80㎛의 칩 높이에서는 세포가 제대로 부착되지 않음을 고려하여, 패턴화된 PDMS 층(하판)을 제작하였다. 상기 하판용 PDMS 층은 실시예 1에서와 동일한 방식으로 제작되었는데, 다만 제작 과정에서 SU-8 패턴은 약 1.5cm의 직경 및 500㎛의 높이를 갖는 실린더가 돌출되도록 구성되었으며, 따라서 약 1.5cm의 직경을 가지면서 상기 SU-8 패턴 높이에 상당하는(500㎛) PDMS 재질의 마이크로 웰(well)이 형성된 것이었다.
상기 하판용 PDMS 층의 마이크로 웰 내에 세포를 착상하여 12 시간에 걸쳐 부착하였다. 그 다음, 본 실시예에서 제작된 패턴화된 PDMS 층을 상판으로 하여 덮은 다음, 시간 경과에 따른 세포의 거동을 관찰하였다. 하판의 마이크로 웰 내의 일부 영역에서는 80㎛의 공간 높이가 형성되는 한편, 다른 영역에서는 500㎛의 공간 높이가 형성되었다.
이때, O2 플라즈마(Femto Science Cograde, 60W, Korea)를 사용하여 세포가 부착되는 PDMS 고분자 표면이 친수성을 나타내도록 한 다음, 1×103 cells/㎟의 농도로 세포를 착상시켰다. 시간 경과에 따른 변화를 현미경(Motic사의 제품명 AE31; 배율: ×100)으로 찍어 도 6에 나타내었다.
상기 도면에 따르면, 2가지 높이의 미세환경 하에서 세포의 거동은 시간 경과에 따라 다른 양상을 보였다. 500㎛ 높이의 공간에서는 세포가 시간이 경과함에 따라 증식하는 것이 관찰되었다. 그러나, 80㎛ 높이의 공간에서는 초기에 견고하게 부착되었던 세포들도 시간이 경과함에 따라 손상되어 탈착되는 것을 확인하였다. 또한, 2가지 상이한 높이에 있어서, 시간 경과에 따라 관찰된 세포의 수를 측정한 그래프를 도 7에 도시하였다.
상기 도면에 나타낸 바와 같이, 현미경 사진에서와 같이, 80㎛ 높이에서는 1일 경과한 후에도 세포는 증식하지 않았고, 오히려 감소하였다. 세포가 원활히 증식하는 500㎛ 높이의 칩에서와 비교하면, 칩의 미세환경 내에서는 높이에 의한 영향이 중요함을 확인할 수 있다.
48시간이 경과한 후, 부착 표면 상의 세포 상태를 확인하기 위하여 live-dead 염색 키트(Nikon 사의 제품명 NIS-Element)를 이용하였고, 이에 대한 사진 촬영을 하였다. 그 결과를 도 8a(높이: 80㎛) 및 도 8b(높이: 500㎛)에 나타내었다. 이때, 녹색은 살아있는 세포, 그리고 적색은 죽어있는 세포를 나타낸다.
상기 도면에 도시된 바와 같이, 80㎛ 높이에서는 대부분의 세포가 탈착되어 표면 상에 부착된 세포가 거의 존재하지 않거나, 죽어있는 세포가 공존되어 부착되어 있는 것을 확인할 수 있다. 반면, 500㎛ 높이에서는 죽어있는 세포가 거의 존재하지 않았으며, 살아있는 세포가 충분히 부착, 배양되는 것을 확인할 수 있다.
실시예 3
칩 높이 조절에 따른 세포의 공배양
도 1에 도시된 공정에 따라 서로 다른 세포의 공배양을 수행하였다. 공배양에 사용된 세포는 AGS (ATCC, USA, MO) 및 U373MG (ATCC, USA, MO)로서 AGS는 F-12K (PAA, Austria) 배지에서, 그리고 U373MG (PAA, Austria) 세포는 DMEM (PAA, Austria) 배지에서 배양되었다. 이때, 사용된 모든 배지에는 FBS 10% (PAA, Austria) 및 Penicillin-streptomycin 1% (GIBCO, NY, UAS)가 첨가되었다. 또한, 모든 세포는 37℃, 5% CO2 조건으로 조절된 인큐베이터 내에서 배양되었다.
이외에도, 공배양에 사용된 서로 다른 타입의 세포들은 세포염색의 전처리 과정을 거쳐 구분하였다. 세포염색은 cell tracker (Invitrogen, USA)를 이용하여 세포가 미세환경, 즉 바이오 칩에 주입되기 전에 각각 적색 및 녹색으로 염색되었다. 염색 과정을 거친 후, 세포를 주입하였으며, 염색 시약은 세포가 분화되는 과정에서도 계속 전이되어 유지하도록 하였다.
도 1을 참고하여, 본 실시예에 따라 공배양하는 방법은 하기와 같다.
- 하부 고분자 층/기판 구조물(1)의 제작
50㎛ 두께에 상당하는 량의 SU-8 2025(Micro-chem, USA)을 슬라이드 글래스 (두께: 1mm) 상에 스핀코터(shinumst, KOREA)로 1500 rpm에서 30초 동안 도포하였다. 상기 슬라이드 글래스 상에 도포된 SU-8을 핫 플레이트(Luchi, JAPAN)로 65℃에서 5분 동안, 그리고 95℃에서 20분 동안 소프트 베이킹하였다. 그 다음, MASK ALIGNER(shinumst, KOREA) 및 필름 마스크를 이용하여 20초 동안 노광하였다.
상기 노광 공정 후, 핫 플레이트를 이용하여 95℃에서 7분 동안 후 베이킹하였으며, 상온이 될 때까지 온도를 낮추었다. 상기 후 베이킹 공정이 완료된 글래스를 PGMEA 내에서 5분 동안 현상시킨 다음, 이소프로판올로 세척하였다. 이와 같은 방법으로 50㎛ 두께를 가지면서 주연부가 제거된 SU-8 층(12')/주형용 기판(11) 구조물을 제작하였다.
몰드 내에서 상기 제작된 SU-8 층(12')/주형용 기판(11) 구조물을 주형으로 하여 그 위에 PDMS(Sylgard 184A, Dow corning, MI, USA) 및 경화제 DC-184B를 10:1의 중량비로 혼합하여 붓고, 80℃로 유지되는 진공 오븐(EYELA, Japan) 내에서 30분 동안 경화시켰다. 상기 경화된 PDMS 성형물을 슬라이드 글래스(두께: 1mm)에 부착하여 하부 고분자 층(13)/기판(14) 구조물(1)을 얻었다.
- 제1 상부 고분자 층/기판 구조물(2) 및 제2 상부 고분자 층/기판 구조물(3)의 제작
250㎛ 두께에 상당하는 량의 SU-8 2100(Micro-chem, USA)을 슬라이드 글래스(두께: 1mm) 상에 스핀코터(shinumst, KOREA)로 1000 rpm에서 30초 동안 도포하 였다. 핫 플레이트(Luchi, JAPAN)을 이용하여 상기 슬라이드 글래스 상에 도포된 SU-8을 65℃에서 30분 동안, 그리고 95℃에서 200분 동안 소프트 베이킹하였다. 그 다음, MASK ALIGNER(shinumst, KOREA) 및 필름 마스크를 이용하여 45초 동안 노광하였다.
상기 노광 공정 후, 핫 플레이트를 이용하여 95℃에서 25분 동안 후 베이킹하였으며, 상온이 될 때까지 온도를 낮추었다. 후 베이킹 공정까지 완료된 글래스를 PGMEA(propylene glycol mono ether acetate) 내에서 20분 동안 현상한 후, 이소프로판올로 세척하였다. 이와 같은 방법으로 250㎛ 두께를 가지면서 볼록부와 오목부로 이루어지는 3차원적 미세패턴을 갖는 SU-8 층(22')/주형용 기판(21) 구조물을 제작하였다.
몰드 내에서 상기 제작된 SU-8 층(22')/주형용 기판(21) 구조물을 주형으로 사용하여, 그 위에 PDMS(Sylgard 184A, Dow corning, MI, USA) 및 경화제 DC-184B를 10:1의 중량 비로 혼합하여 붓고, 80℃로 유지되는 진공 오븐(EYELA, Japan) 내에서 30분 동안 경화시켰다. 상기 경화된 PDMS 성형물을 슬라이드 글래스(두께: 1mm)에 부착하여 제1 상부 고분자 층(23)/기판(24) 구조물(2)을 얻었다. 이때, 형성된 3차원의 미세패턴의 직경은 300㎛, 두께는 250㎛이었으며, 패턴 간의 간격(볼록부와 볼록부의 간격)은 300㎛이었다.
제2 상부 고분자 층(33)/기판(34) 구조물(3)의 경우, 3차원의 미세패턴이 상반된(즉, 양각 및 음각이 반대인) 것을 제외하고는 제1 상부 고분자 층(23)/기판(24) 구조물(2)의 제작 방법과 동일한 방법으로 제작되었다.
- 제1 타입의 세포(AGS)의 선택적 부착
상기와 같이 제작된 제1 상부 고분자 층(23)/기판(24) 구조물(2)에 5×106 cell/ml의 AGS 세포(41) 45㎕를 주입하였다. 그 다음, 구조물(1)의 PDMS 표면이 구조물(2)의 PDMS 표면과 마주보도록 위치시킨 다음, 전체 구조물을 반전시켜 구조물(1)의 표면에 AGS가 부착되도록 하였다. 이때, 구조물(2)의 미세패턴 중 오목부에 해당하는 영역(25)으로부터 하부 고분자 층(13)의 표면까지의 거리(H)는 약 300㎛이었으며, 볼록부에 해당하는 영역(26)으로부터 하부 고분자 층(13)의 표면까지의 거리는 약 50㎛이었다. 37℃및 5%의 CO2 조건 하에서 4 시간 동안 유지한 후, 상기 구조물(2)를 제거하고 배지로 세정하였다.
하부 고분자 층(13)의 제1 세포 배양 영역(51)에 배양된 세포가 부착된 패턴의 현미경 사진(Nikon사의 제품명 EZ-C1; 배율 ×50)을 도 9에 나타내었다. 도시된 바와 같이, 제1 타입의 세포(AGS)는 원형으로 형성된 제1 세포 배양 영역에서 선택적으로 부착되어 있음을 알 수 있다.
- 제2 타입의 세포(U373MG)의 선택적 부착
상기 제작된 제2 상부 고분자 층(33)/기판(34) 구조물(3)에 5×106 cell/ml 의 U373MG(42) 90㎕를 주입하였다. 그 다음, 구조물(1)의 PDMS 표면이 구조물(3)의 PDMS 표면과 마주보도록 위치시킨 다음, 전체 구조물을 반전시켜 구조물(1)의 표면에 U373MG가 부착되도록 하였다. 이때, 구조물(3)의 미세패턴 중 오목부에 해당하는 영역(35)으로부터 하부 고분자 층(13)의 표면까지의 거리(H)는 약 300㎛이었으며, 볼록부에 해당하는 영역(36)으로부터 하부 고분자 층(13)의 표면까지의 거리는 약 50㎛이었다. 37℃ 및 5%의 CO2 조건 하에서 4 시간 동안 유지한 후, 상기 구조물(3)을 제거하고 배지로 세정하였다.
상술한 공정에 따라, 2가지 타입의 세포를 부착하여 공배양시킨 결과를 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
상기 도면은 제2 타입의 세포(U373MG)가 주입된 후 7시간이 경과한 후의 사진이다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, 제1 타입의 세포(ASG) 및 제2 타입의 세포(U373MG) 각각이 제1 세포 배양 영역(51) 및 제2 세포 배양 영역(52)에 선택적으로 부착되어 있음을 알 수 있다.
이처럼, 본 발명에 따라 바이오 칩의 미세환경 내에서 세포 부착 영역의 공간 높이를 조절할 경우, 종래기술과는 달리 칩 표면(하면)에 대한 별도의 처리 과정 없이도 서로 다른 타입의 세포를 원하는 패턴에 따라 간편하고 효과적으로 부착하여 공배양할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로, 본 발명의 구체적인 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라, 바이오 칩의 미세환경 내에서 서로 다른 2가지 타입의 세포를 부착하는 방법을 순차적으로 도시하는 단면 순서도이고;
도 2(a) 및 도 2(b)는 도 1에 도시된 구체예에 있어서 제1 상부 고분자 층/기판 구조물 및 제2 상부 고분자 층/기판 구조물을 각각 부분적으로 도시하는 사시도이고;
도 3은 실시예 1에 따라 칩의 높이 및 세포 착상 밀도를 변화시키면서 세포의 부착 정도를 평균 백분율로 구한 결과를 나타내는 그래프이고;
도 4는 실시예 1에 따라 바이오 칩의 높이, 세포 부착 밀도 및 배지 교환 시간의 변경 각각의 요소가 세포 성장율에 미치는 영향을 나타내는 그래프이고;
도 5는 실시예 2에 따라 상이한 높이가 동시에 제공된 바이오 칩의 개략적인 개념도이고;
도 6은 실시예 2에 따라 상이한 칩 높이(각각 80㎛ 및 500㎛)에서 시간 경과에 따른 변화를 현미경으로 확대한 사진이고;
도 7은 실시예 2에 따라 상이한 칩 높이(각각 80㎛ 및 500㎛)에서 시간 경과에 따라 관찰된 세포의 수를 측정한 그래프이고;
도 8(a) 및 도 8(b)는 실시예 2에 따라 상이한 칩 높이(각각 80㎛ 및 500㎛)에서 바이오 칩의 표면에 존재하는 세포에 대한 live-dead 염색 결과를 나타낸 현미경 사진이고;
도 9는 실시예 3에 따라 하부 고분자 층의 표면의 제1 세포 배양 영역에서 세포가 부착된 패턴에 대한 현미경 사진이고; 그리고
도 10은 실시예 3에 따라 2가지 타입의 세포를 부착하여 공배양시킨 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
<도면 부호에 관한 설명>
1: 하부 고분자 층/기판 구조물
2: 제1 상부 고분자 층/기판 구조물
3. 제2 상부 고분자 층/기판 구조물
11: 21, 31: 주형용 기판
12, 22, 32: 포토레지스트 층
12' 주연부가 제거된 포토레지스트 층
22', 32' 입체적으로 미세패턴화된 포토레지스트 층
13: 하부 고분자 층
23: 제1 상부 고분자 층
33: 제2 상부 고분자 층
14, 24, 34: 기판
15: 돌출 영역(스페이서)
25, 35: 오목부
26, 36: 볼록부
41: 제1 타입의 세포
42: 제2 타입의 세포
51: 제1 세포 배양 영역
52: 제2 세포 배양 영역

Claims (10)

  1. 바이오 칩 내 미세환경의 세포 배양 영역에서 서로 다른 타입의 세포를 공배양하는 방법으로서,
    a) 볼록부 및 오목부로 이루어지는 3차원의 제 1 미세패턴에 제 1타입의 세포를 주입한 후, 상기 제 1 미세패턴 상에 상기 세포 배양 영역을 제공하고 이를 반전시켜 상기 오목부에 대응되는 상기 세포 배양 영역 중 제1 영역에 제1 타입의 세포를 선택적으로 부착하는 단계 ;
    b) 볼록부 및 오목부로 이루어지며 상기 제 1 미세패턴과 상반된(inversed) 3차원의 제 2 미세패턴에 제2 타입의 세포를 주입한 후, 상기 미세패턴 상에 상기 세포 배양 영역을 제공하고 이를 반전시켜 상기 오목부에 대응되는 상기 세포 배양 영역의 제2 영역에 제2 타입의 세포를 선택적으로 부착하는 단계를 포함하고,
    상기 단계 a) 중에는 제1 타입의 세포가 부착되는 소정 높이의 공간이 제1 영역 위에 형성되는 한편, 상기 단계 b) 중에는 제2 타입의 세포가 부착되는 소정 높이의 공간이 제2 영역 위에 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 a) 중 상기 제1 타입의 세포가 제1 영역에 부착되는 소정 높이, 그리고 상기 단계 b) 중 상기 제2 타입의 세포가 제2 영역에 부착되는 소정 높이는, 각각 적어도 100㎛인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 미세환경은 글래스 재질의 표면, 고분자 재질의 표면 또는 이들의 조합으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 고분자는 폴리디메틸실록산(PDMS)인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포는 상피세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. a) 볼록부 및 오목부로 이루어지는 3차원의 미세패턴 표면을 갖는 제1 상부 고분자 층 상에 제1 타입의 세포를 주입하는 단계;
    b) 상기 제1 타입의 세포가 주입된 제1 상부 고분자 층 위에 일정 간격을 두고 하부 고분자 층을 제공하고, 이를 반전시켜 상기 제1 상부 고분자 층 표면의 오목부에 대응하는 상기 하부 고분자 층 표면의 제1 세포 배양 영역에 제1 타입의 세포를 선택적으로 부착하는 단계;
    c) 볼록부 및 오목부로 이루어지며 상기 제1 상부 고분자 층과 상반된(inversed) 3차원의 미세패턴 표면을 갖는 제2 상부 고분자 층 상에 제2 타입의 세포를 주입하는 단계; 및
    d) 상기 제2 타입의 세포가 주입된 제2 상부 고분자 층 위에 일정 간격을 두고 상기 제1 타입의 세포가 부착된 하부 고분자 층을 제공하고, 이를 반전시켜 상기 제2 상부 고분자 층 표면의 오목부에 대응하는 상기 하부 고분자 층 표면의 제2 세포 배양 영역에 제2 타입의 세포를 선택적으로 부착하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 단계 b) 중에는 상기 제1 세포 배양 영역 위에 제1 타입의 세포가 부착되는 소정 높이의 공간이 형성되는 한편, 상기 단계 d) 중에는 상기 제2 세포 배양 영역 위에 제2 타입의 세포가 부착되는 소정 높이의 공간이 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    (i) 상기 단계 b) 중 제1 타입의 세포가 제1 세포 배양 영역에 부착되는 소정 높이, 그리고 (ii) 상기 단계 d) 중 제2 타입의 세포가 제2 세포 배양 영역에 부착되는 소정 높이는, 각각 적어도 100㎛인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 하부 고분자 층의 표면은 평면(flat) 형상을 갖고, 그 주연부에 스페이 서로서 돌출 영역이 형성된 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    (i) 상기 단계 b) 중 상기 제1 상부 고분자 층과 상기 하부 고분자 층의 간격, 그리고 (ii) 상기 단계 d) 중 상기 제2 상부 고분자 층과 상기 하부 고분자 층의 간격은, 각각 10 내지 80㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
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