CN105842435B - 细胞功能的微分析 - Google Patents

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Abstract

倒置微孔(102)提供了一种用于筛选生物粒子(128)的快速和有效的微分析系统(100)和方法，特别是基于单个细胞的细胞功能分析。使用倒置开放微孔系统(102)可以在同一微孔内鉴定可联合产生所需功能效应的粒子，细胞和生物分子，也允许对分泌抗体的治疗活性进行功能筛选，并具有重获细胞和液体、选择性地扩增细胞如抗体分泌细胞的潜能。

Description

细胞功能的微分析
本申请是申请日为2011年12月5日，申请号为201180066877.5，发明名称为“细胞功能的微分析”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年12月3日提交的，名称为“细胞功能的微分析”的美国临时申请号为61/419,377的权益，其用于所有目的的全部内容通过引用方式并入到本文中。
背景技术
需要高通量、有效分析包括单个活细胞在内的生物粒子的系统，以能够快速和有价值地鉴定包括细胞、分子等在内的粒子，所述粒子具备所需功能，如产生或诱导所需的生物结果。新药研发、诊断、候选分子的筛选等需要这种系统。在优选系统中，所述粒子可保留其活性，所述分析过程对其无明显损伤。
评估单个粒子的现有系统通常使用介电泳(DEP)来操纵粒子。将电场强加于粒子如细胞上，以在诱导反应期间使该粒子悬浮并维持粒子的位置，并且，分析可损伤其活性，并破坏粒子行驶正常功能的能力。例如，在长时间使用的情况下，这种损伤可以导致溶解和/或细胞死亡。粒子与基板、电极或室壁的黏附可能也需要所述细胞的溶解以在分析后将该细胞从系统中移除或者以捕获细胞产物。
提供一种用于有效且高效地捕获、鉴定以及并且分析单个粒子的生物功能的快速、高通量的系统是非常有用的，其中该系统对所述粒子无明显损伤。
发明内容
本文公开了倒置开放微孔系统、装置及使用方法，可以对粒子特别是包括单个细胞在内的单个粒子进行快速、有效地筛选和分选。这种筛选包括对可指示粒子或试剂是否可用于治疗用途的粒子的特定粒子特征以及功能特性的分析。例如，所述的粒子特征可以包括：配体如癌细胞靶抗原的特异性结合和/或亲和力的存在及相对量；细胞与细胞间的结合反应及相互作用，如细胞溶解，毒性，生物标志物产生，电穿孔等；诱导的细胞响应和/或反应，如由其他细胞，药物，化合物，蛋白，抗体，分子，酶，核酸分子，细胞分泌物等所诱导的；细胞产物如分解酶，抗体，生物标记等的诱导产生。这些特征的分析以及随后的粒子重获支持功能性细胞分选的方法，该方法导致具有已被证实的功能和效用如治疗效用的细胞或其副产物(如分泌的分子)的分离。
在一个实施方式中，所述单个细胞分析可以包括基本属于一个反应方案的多个试验或者连续地，如其结果是一个试验为接下来的特定试验提供信息的多个试验。比如，已知与特定疾病相关的细胞，比如，从患所述疾病的个人获得的细胞，可在该系统中进行分析，以确定特定生物标志物如抗原，表达蛋白或疾病特征的存在。在鉴定所述单个细胞是否显示所述生物标志物的初步分析之后，该同一个被鉴定的细胞可用于再次分析其对于候选治疗药物，化合物，或者预期在表现所筛选的生物标志的细胞内有效诱导所需响应的其它细胞治疗的响应。
在该倒置开放微孔中的分析可在单个粒子(包括单个细胞)上完成，且具有快速、有效的时序，而无需将该粒子或该粒子的产物从复杂混合物中分离。筛选方法包括筛选功能特性的单个细胞，并选择基本存活的原始细胞，以进行后续的分析，永生化和/或被认为具有有用特性的克隆扩增。细胞成分如DNA,RNA,蛋白质等，也可以从该原始细胞中分离出来。
在开发过程的早期，该方法能够鉴定所需的粒子反应和粒子相互作用。对于细胞功能的早期理解，使得在对材料的成功潜能有了更好理解的基础上，最终开发出有用的生物材料成为可能，并可减少开发过程更早期的潜在候选者的数目。对于同一个粒子如对于单个细胞可实施多重、快速分析的方法，并获得探索过程中更快速的进展。
本文所述的倒置开放微孔系统有助于将单个细胞精确传递到微孔或者被微孔排除，并且精确操控微通道中和特定微孔中的细胞和其它粒子，传递试剂、缓冲液、标记物等，包括用于细胞-细胞相互作用的其它细胞。可以对单个细胞的多个特征进行评估，同时保留其在开放微孔中的活性以进行可选的后续试验、永生化、扩增等。在很短的时间框架内可以重获粒子(包括重获原始的单个细胞)，使用最少的反应试剂并且重获基本存活和有用的情况中的细胞和产物。特别是，一个或多个粒子(包括活细胞)在开放微孔的流体/空气界面的沉积，允许可有效监视并且快速筛选的精确的粒子与粒子相互作用鉴定候选粒子如细胞，便于在微孔中进行后续的分析和/或克隆扩增。
出人意料地，当使用适当的几何约束和流体条件时，填充具有对空气开放的下部末端108的倒置开放微孔102的流体在不从下部开放末端泄漏的情况下被保留。此外，在流体洗涤期间，所沉积的粒子128出人意料地被保留在弯月面122，而将其它粒子放置在靠近所述第一个的位置和分析程序。所述开放微孔用作“微型离心机”，该微型离心机可将试剂传递至所沉积的粒子以在没有损失的情况下对所沉积粒子进行快速分析、洗涤以及后续分析。比如，在分析之后以及当从微孔重获时，微孔中的细胞可以保持较好的活性。比如，可从微孔重获到基板如微量滴定板上，以进行如永生化和/或扩增。在一个实施例中，可以在微孔中孵育并且扩增所选单个细胞。
本发明提供了实现倒置微孔系统的方法和结构，所述倒置微孔系统包括上部末端对微通道开放的微孔。在一个实施例中，可在下部末端将所述微孔封闭，优选使用透明材料如玻璃或透明聚合物使允许看到所述微孔中的内容物。在另一个实施例中，所述微孔在下部末端对装置外的大气(atmosphere)(如空气或其它气体)开放。
例如，可以通过沉降，由细胞密度，流体速度，加载时间和可选择地介电泳力控制将一个或多个粒子传递到微孔。介电泳力可由与适当的交流电压相连并布置在微通道中的电极生成，该微通道定位于对该微通道开放且流体相通的微孔的上面。本文还提供了比如由嵌入到开放微孔内的电极所控制的有效的粒子聚集和相互作用以产生能操纵粒子如单个细胞到微孔内的所需位置的介电泳力的方法。该方法提供了使用最小量的试剂并允许高通量地重获分析后的活性粒子(包括细胞和细胞产物)的高通量分析系统。
本发明还提供了精密控制和分选粒子(包括细胞和非细胞粒子)的方法和结构，以将粒子有效地传递到所述倒置开放微孔系统的微孔。具体的实施例包括将电极和电极对配置在微通道中，使粒子能够在对生物材料如细胞的活性具有较小或没有伤害的情况下移动；将电极和电极对配置在微通道中并且接近微孔，允许所需粒子到微孔的所控制的访问并且有效封闭微孔和驱离不需要的粒子的结构；和电极和电极对在微孔中的模式，用于检测和可选择地控制粒子进入和经过微孔时粒子的位置，比如，沉积在流体弯月面上。
所述倒置开放微孔系统包括一个(图1)或多个(图3)微孔，其中每个微孔与一个或与多个微通道流体连通，以将流体和粒子传递到所述一个或多个微孔。所述微通道通常配置在所述微孔的上方，所述微孔在微孔的上部末端106对流体微通道开放，在下部末端108对装置外的大气(如空气或其它气体)开放，可以控制大气特性(如气体组分、湿度、温度和不存在污染物)。所述微孔具有延伸在所述微孔102的上部末端106和下部末端108之间的一个垂直轴110(如中心垂直轴)。
在一个实施例中，所述微孔102的垂直壁112至少一部分由介电材料114形成。所述垂直壁还可以至少一部分由与介电材料集成的一个或多个电极形成，例如，在与孔的垂直轴垂直的层状结构中，层压板形成所述微孔，比如，如图2所示。
注入微通道104中的流体在毛细管作用下填充微孔102，同时表面张力将所述流体保持在所述开放微孔中，在空气-流体界面的微孔下部开放末端108处形成弯月面122。所述微通道表面和微孔表面可以涂以具有相反亲水性或疏水性的材料。比如，所述微孔可以具有亲水性涂层，靠近微孔开放末端的微通道表面具有疏水性涂层，反之亦然。
通常，粒子在微通道中的移动以及粒子在特定微孔中的放置由有限稀释，沉降，电磁力，重力以及这些的组合来完成。在一个实施例中，对所述倒置开放微孔系统中粒子的可控性操控包括对适当布置在微孔中的一个或多个电极阵列以及适当放置在微通道中的那些电极进行供电。电极配置的实例如图2和图9-图13所示。
本文所公开的方法包括筛选单个细胞或小的细胞组的方法，所述单个细胞或小的细胞组包括具体粒子的精确聚合物。通常提供单个细胞的分析以鉴定能够例如对于增加的生物材料产生具体的响应的细胞，其中所述生物材料可以是不同的细胞、细胞的一部分、蛋白质、核酸分子、药物、抗体、酶等。精确聚合物的产生允许细胞的精确排列，该精确排列可以一起诱导所需的响应并且/或者仅仅是一起用于对其具体的特征、能力或功能进行分析。该系统使得比如多个粒子在聚合物中的排列，直接接触或靠近以进行功能性接触的细胞的排列成为可能。精确聚合物中的这种细胞排列使得快速且高效地检测粒子与粒子的相互作用成为可能。
附图说明
图1是倒置开放微孔系统的示意图，显示了在有流体在微通道中流动，有粒子通过重力从微通道传递至微孔的情况下，沉积在开放微孔的弯月面上的细胞。
图2是显示倒置开放微孔系统中的3电极配置的横截面图。
图3是显示包括与提供流体到微通道中的流体系统相连的多个微孔的倒置开放微孔系统和用以支持对所述倒置开放微孔的内容物进行光学检测的成像系统的示意图。
图4是显示将微孔内容物重获到微量滴定板上的示意图。
图5是显示将微孔内容物从一个包括多个开放微孔的系统重获到一个重获基板上的示意图。
图6显示用倒置荧光显微镜所观察的倒置开放微孔的所述弯月面的照片，照片显示：(A)在沉降期间，当没有施加电场以聚集细胞时，随机布置在弯月面上的K562细胞，以及(B)沉降期间，被电磁力操控到微孔的中心垂直轴并作为细胞聚合物被沉积在弯月面的中心附近的K562细胞。
图7包括显示生物标志物荧光信号强度下降的图表和一系列照片，所述生物标志物荧光信号强度用于衡量在将个体的单个细胞暴露于激活的T淋巴细胞20分钟以诱导单个细胞溶解后，钙黄绿素在活性靶细胞中的摄取。
图8为显示介电泳定位并转移到V形微量滴定板扩增5天(A＝0天；B＝3天；C＝5天)后，从开放微孔重获的单个K562细胞的克隆扩增的一系列照片(A,B,C)。(D)图显示6天时间内相对细胞数目的增加。
图9为显示电极在微通道中和微孔中的代表性排列的俯视图的示意图，所述电极排列用于控制粒子在微通道中和倒置开放微孔系统的微孔中的介电电泳移动。
图10是经过线A-A’的图9的示意图的剖视图，显示电极在所述微通道中的排列。
图11是经过线B-B’的图9的示意图的剖视图，显示电极在所述微通道中的排列。
图12显示透过倒置开放微孔系统的顶部显示的、中心在微孔位置处的电极阵列，该阵列显示了用于在最小电势(Δ)处捕获通道中粒子的微通道中的电极排列。当流体流在通道中不流动时，这种排列为最合适。
图13显示透过倒置开放微孔系统的顶部显示的、中心在微孔上游的电极阵列，该阵列显示了用于操控粒子(●)向最小电势(Δ)移动的微通道中的电极排列，其中，所述最小电势是由电极所施加的特定力所建立的。
图14是一个实施例的剖视图，显示微通道中的可替换的电极排列，包括沿微通道的顶部配置的电极。
图15显示根据一些实施例的透过倒置开放微孔系统的顶部显示的、中心在微孔上游的电极阵列，并且该阵列显示了用于操控沿F-F’的粒子(●)的微通道中的电极排列。
图16显示根据一些实施例的透过倒置开放微孔系统的顶部显示的、中心在微孔上游的电极阵列，并且该阵列显示了用于操控沿F-F’的粒子(●)的微通道中的电极排列。
优选实施方式的具体描述
A.定义
以下术语和短语旨在具有下面示出的定义：
本文使用的微孔，是指微米尺寸规格(小于1000微米)的孔，包括高度，横截面积，例如所述微孔为管状情况的直径；和体积。
本文使用的微通道，是指提供流体到所述微孔的通道，具有微米尺寸规格(小于1000微米)的横截面积。
本文使用的粒子，包括可以在所公开的倒置开放微孔系统的微孔中进行传递、操控、反应或者分析的任何粒子。所述粒子可以是细胞或细胞的一部分、微生物、生物分子(如蛋白、多核苷酸、抗体、酶)或底物(如可以涂有反应物质(如被包裹成球形的抗原等)的聚合粒子)。
本文使用的弯月面，是指由于表面张力在所述倒置开放微孔的下部末端形成的空气/流体界面。
本文使用的电极，是一种导电材料，例如，金属，如金、铜、镍-金等。优选电极由高纯度金形成。
本文使用的介电材料，是一种电绝缘基板。在所述倒置开放微孔系统中使用的优选介电材料包括聚酰亚胺，如和
本文使用的介电泳，是当粒子受到非均匀电场时施加到粒子上的力。
“A”是指至少一个。
“多数”是指两个或更多个。
“微”是指具有小于1000微米的至少一个尺寸规格。
“包括(Comprises)”或“包括(comprising)”是指包括至少所列举的元素或步骤，并且对于附加元素或步骤的包含是开放的。
B.缩略语
下列缩略语按如下所示使用：
DEP是指介电泳
ASC是指抗体分泌细胞
CTL是指细胞毒性淋巴细胞
NK是指自然杀伤细胞
LCL是指类成淋巴细胞系
ADCC是指抗体依赖的细胞毒性
CMC是指补体介导的细胞毒性
PCB是指印刷电路板
C.倒置开放微孔系统和装置
所述倒置开放微孔系统包括装置(100)，所述装置(100)包括一个(图1)或多个(图3)微孔，其中每个微孔(102)与一个或与多个微通道(104)流体连通，用于将流体和粒子传递到微孔。所述微通道通常配置在所述微孔的上方，所述微孔在上部末端(106)对流体微通道开放，在下部末端(108)对装置外的大气(如空气或其它气体)开放。该微孔具有延伸在微孔的上部末端和下部末端之间的垂直轴(110)，如中心轴。注入微通道中的流体通过毛细管作用填充微孔，同时表面张力将所述流体保持在所述开放微孔中，在空气/流体界面处形成弯月面(122)。
在本申请中，微孔下部开放末端的装置外的大气被示为“空气”。应当理解的是，所述大气可以被控制为(如在一个室内)包含气体而不是空气，例如富含二氧化碳，氮气或其它所需气体的房间，用于维持所述粒子并且/或者使得分析能在微孔中进行。该室可以包括这样一种系统，该系统控制气体成分、湿度、温度、压力和/或其它物理参数并且/或者维持环境在无菌状态。
在一个实施例中，通过将该装置的基板114放置在微量滴定板上来创建封闭室，该微量滴定板的孔与所述倒置开放微孔对齐。这种对齐在所述开放微孔与所述微量滴定板的表面之间保留了空隙，以便将开放微孔的内容物与微量滴定板的内容物如流体内容物分隔开。例如，微量滴定孔可以包含一种液体介质，如用于细胞重获和细胞培养的生理介质，以便当开放微孔的内容物释放时可以接受它。微量滴定孔可以包括一种不同的介质，如水或其它液体，例如，以增加该封闭室的湿度，由于微量滴定孔中液体的蒸发而造成增加该封闭室的大气湿度可以饱和所述室内的蒸汽压，并在该室内阻止从所述倒置开放微孔的液体蒸发。在一个实施例中，所述封闭室的大气被完全饱和，如湿度达到或大约100％，以阻止弯月面的蒸发。为了防止凝结在所述基板表面，可维持基板114的温度高于包括在室中的湿空气的温度。
所述倒置开放微孔系统可用于实现控制一个或多个粒子如一个或多个活性细胞到微孔的传递，以引起微孔中已被传送的粒子与被传送到微孔的一个或多个另外的粒子的相互作用，并且/或者允许进行生物功能的高通量分析，例如，通过在微孔中诱导具体的反应，分析所述反应的结果，同时对所选粒子和/或所选粒子的生物产物进行鉴定和选择性重获。
随着包括在通道中的提供洗涤的流体的改变以及所述开放微孔中的试剂改变，而布置在所述弯月面上的粒子没有取代或缺失时，该系统可以用作“微型离心机”。在一个特定的实施例中，包括在微孔中的流体适用于粒子的介电泳操控。一旦粒子被布置在微孔中，如在弯月面上，所述流体介电泳介质可从微孔被洗涤，并用适于试验的介质或适于被布置的粒子生长和扩增的介质代替。
所述倒置微孔系统可以为粒子功能(包括多种粒子的相作用)、功能筛选和粒子(如活细胞)分选，提供有效且高效的实时监视。在特定的实施例中，所述系统可以提供抗体分泌细胞的高通量功能分析及高亲和力抗体的快速鉴定和选择，所需细胞毒性淋巴细胞和自然杀伤细胞的溶解活性分析和选择，如通过ADCC或CMC试验。所述系统允许快速分析由单个细胞分泌的分子(如单克隆抗体)的亲和力和特异性，以及重获被鉴定的抗体分泌细胞和/或所分泌的抗体，并且还允许被鉴定细胞在微孔中的扩增。
为提供最佳功能，可优化装置的结构属性，包括相对几何形状、涂层、压力、材料，以及打算放入微孔的流体、粒子和试剂的质量，以进行特定的分析。例如，可将用于微孔内壁的涂层与用于邻近微孔的微通道内壁的涂层设计为具有相反的疏水/亲水特性，以将不需要的材料从所述孔驱离并且/或者调解所需粒子的进入。
微孔的直径和/或长度被设计为允许在微孔下部末端的流体与外界环境如空气的界面处形成弯月面，并且以在较少或几乎没有流体从微孔中渗漏的情况下允许沉积在弯月面上的粒子(a particle)或多个粒子(particles)被保留，以及允许流体与试剂在微孔中进行交换，同时保留布置在弯月面上的粒子。微通道的宽度，高度和长度被设计为可创建一个液压阻力，使得在特定流体流的情况下，在微通道产生一个压力，压力大小控制在允许流体填充微孔同时阻止流体从微孔底部泄漏的范围之内。本文对所述倒置开放微孔系统的这些和其他特征及用途进行了描述和举例论证。
1.微孔
例如，如图1所示，所述倒置开放微孔装置100包括尺寸在微米范围内的微孔102。所述开放微孔的形状可以是管状，如有一个圆形的横截面轴。还可以使用其它形状的微孔，如圆锥形、长方形或其它几何形状。在一个实施例中，所述微孔为从一个狭窄的下端延伸出一个扩展宽度的上端的结构。
图1显示了包括开放微孔102的装置100的横截面视图。该装置100包括界定了在开放微孔102的上部开放末端106和下部开放末端108之间横向延伸的微孔102垂直壁112的基板114。
基板114可以为可塑造的塑料，如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚碳酸酯，聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，环-烯烃聚合物等。
基板114可以具有如从大约10μm到大约500μm的厚度，首末项包括在内，如其厚度可能为12.5μm,25μm或50μm。在一些实施例中，特别是包括电极的这些实施例，基板114至少一部分由介电材料如聚酰亚胺,等材料形成。
2.电极
如图2所示，所述倒置微孔系统可包括藕接到电源上的一个或多个电极，所述电源施加电压到电极上。在各种不同的实施例中，电极可设置在微孔和微通道中以控制施加到粒子上的电力，例如以将微通道中的粒子推或拉向和/或进或出微孔，或者有助粒子从进入开放微孔到微孔下部末端或这些中的任何部分的转运。
虽然图2中的微孔显示有三个电极116,118,120，但是所述装置100可选择性地包括更多或更少的电极。在一个实施例中，所述微孔被至少一个环形电极116所环绕。在另外一个实施例中，一对面向电极116，116A包围微孔。在一个实施例中，一对面向电极被布置在开放微孔的上部末端106附近，以调控粒子128进入微孔并且/或者调控粒子沿着垂直轴110如中心垂直轴进行定位。
电极还可被设置在微通道中，从而影响粒子的转运。例如，图10-图11显示了在微通道155,156,153,154中和微孔116,118中可能的电极排列。图12-图13显示了沿着微通道成对配置的电极153-164的示范性阵列，可有助粒子向微孔102转运，或者从微孔102转出。
所述电极由导电材料形成，例如该导电材料可以为导电薄板或导电板的形式。在一些实施例中，所述导电材料包括生物相容性的金属，如金、碳或铝。在所展示的实施例中，电极116,118,120和153-164被嵌入基板114中，以便相邻的电极例如在与微孔垂直轴110垂直的层压结构中由基板114的部分彼此隔开(见图2)。
3.微通道
例如，如图1、图2和图3所示，在倒置开放微孔系统100,101中，所述微孔102与微通道104连通，以用于运输可以包括一个或多个粒子128的流体130。所述微通道104可与一个或多个微孔102相连，如，与装置100,101中的一行或多行微孔102相连。
在靠近顶盖124的地方，所述微通道可由聚合物如聚酰亚胺形成，优选由透明材料如玻璃或合适的塑料，如PMMA，聚碳酸酯，PEN,PET，环-烯烃聚合物形成。然后，可例如使用生物相容性的粘合剂将所形成的微通道黏附在一个或多个微孔的顶端。
微孔的上部末端106对微通道104开放。比如，可以通过在微通道104的两个末端创建一个压力差，从而导致流体130流过微通道104。比如，微通道104可以与泵如蠕动泵相连，或者与压缩空气源等相连。可以通过调整微通道104两端的压力差来控制微通道中流体130的流速，由此控制一个或多个粒子128通过一个或多个微孔102的速度。
4.多微孔或微孔阵列
如图3所示，装置101可以包括有序排列的多个微孔102。如，装置101可以包括微孔阵列或微孔矩阵，如以与一个或多个微通道104相通的微孔行和微孔列的形式。装置101可用于在多个微孔102上同时执行多重平行操作。虽然下面的讨论涉及单个微孔102，但是所描述的实施例适用于多微孔102中的每个，如可以作为微孔102的阵列或矩阵配置在装置101中，并且，可以包括不同结构的微孔102和微通道104。为方便起见，可以设计微孔的结构，如以适应传统系统如96孔微量滴定板或1536孔微瓶组件(micro-vial assembly)等的转换。这种设计也可以为了特定的目的，如高通量。
5.制作倒置微孔装置
在一个示例中，为形成倒置微孔装置，微孔102可以制作成贯穿基板114的通孔，所述基板114嵌有电极116,118,120。所述通孔可以使用如机械的或激光技术，通过传统的钻孔方法形成。倒置微孔系统的典型制作如以下实例所述。
在一些实施例中，微孔102有一个圆形(circular)或半球形(rounded)横截面，然而，微孔102可以具有其它横截面形状，如六边形、矩形、正方形、锥形等形状。微孔102的直径通常小于1000微米并且可以例如根据将沉积在微孔中的细胞或其它粒子的直径以及根据保留足够的表面张力以形成和维持弯月面122所需要的几何关系而变化。微孔的直径可以例如从大约70μm到大约150μm，或者，例如从大约50μm到大约100μm。微孔的深度(高度)最好等于或大于直径，并且可以为例如从大约50μm到300μm，例如从大约70μm到大约200μm。所述直径与深度(高度)的比值可以为例如大约1：1、1：1.25、1：1.5或1：2。
在一个实施例中，构建了其中微通道长度为27mm，宽度为350μm，高度为150μm的装置。所述微孔的直径为100μm，高度约75μm。没有使用疏水性或亲水性的涂层。当通道的顶侧由透明的聚碳酸酯构成时，微通道中和装置底侧的聚酰亚胺表面具有适度的亲水性行为，而被机械钻孔的微孔的内侧部分的粗糙度增加，从而提高了微孔内侧部分的亲水性行为。这种表面性质的差异(其中微孔的内侧部分比微通道及底表面具有更高的亲水性)结合适当的微通道和微孔尺寸是出乎意料地足以使来自微通道的流体适当填充微孔，而不会从开放微孔的底部产生任何泄漏。
6.亲水性/疏水性表面
为了有助一个或多个粒子128在每个微孔102中的引进和滞留，可以将装置100,101配置为某些表面是疏水性的同时其它表面是亲水性的。在一些实施例中，可以通过将涂层施加到表面上来将表面制成疏水性的或亲水性的。比如，在利用含水流体的实施例中，微通道143的底表面和微孔112的垂直壁可以是亲水性的，而下部表面142可以是疏水性的。作为另一个例子，在利用油脂流体的实施例中，微通道143的底表面和微孔112的垂直壁可以是疏水性的，而下部表面142可以为亲水性的。在接触角为20-70度范围的情况下，Kapton和Polyimide呈现一种不连续的亲水行为。通过施加等离子体表面处理，如氧等离子体，Kapton和Polyimide表面变得更加具有亲水性。可用于Polyimide或Kapton表面的疏水涂层包括FEP、FC-732或41-90。
将流体130，如生理缓冲液或培养基，注入微通道104，该微通道位于一个或多个微孔102的上方，并且与一个或多个微孔102的上部开放末端流体相通。微孔102的孔的微尺寸以及其下部开放末端108的疏水性行为，与微通道104以及微孔102上部末端的亲水性形成对比，使得流体填充具有开放底部的微孔，而不会从下部开放末端108泄露。当使用具有封闭底部的微孔时，为有助填充微孔，可在加入生理介质之前，首先加入一种润湿剂，如乙醇或乙醇与水的混合物。毛细管作用和表面张力可以将流体130保持在微孔中，并在流体-空气界面处形成一个弯月面122，如图1所示。在一个实施例中，所述流体可以包含一种润湿剂以辅助填充微通道和/或微孔。示例性的润湿剂包括如乙醇，吐温-20和SDS。在注入细胞悬液之前，先用生理介质如磷酸盐缓冲液(PBS)对微通道进行适当冲洗，以去除润湿剂的残留。
7.可控的粒子传递和聚集
7.1控制性传递
包含粒子如细胞的流体，可以以设计好的浓度和流速传递到微通道104，以允许有限数量的微粒如单个粒子分布到每个微孔102中。电极可用于运送微通道104中的粒子，以允许或拒绝粒子128从微通道104进入微孔102，操控微孔中的一个或多个粒子128，使粒子聚集或保持在微孔中的所需位置，诱导沉积在微孔中的粒子或多个粒子发生结构或功能性的变化，并且/或者感测并且/或者测量微孔中粒子的存在、移动或改变，或者感测并且/或者测量由微孔中的粒子所产生的分子的存在。
如图9-图11所描述的实施例，利用通道中的流体流动将所关注的粒子从入口运送到特定的微孔，同时，还可以配制介电泳力以使粒子可以跳过微孔，并沿着所述微通道到达另一个微孔。如图12和图13所描述的实施例，显示了电极阵列，该实施例不需要流体流动以将微通道中的粒子向微孔运送，但是使用介电泳力以达到上述目的。
7.2在不存在流体流动的情况下，粒子向微通道的运送
当要求精确定位每个粒子时，需要微通道中的精确运送以将粒子精确传递到特定的微孔。一种控制精确传递的方法基于电参数变化的序列，这可以不依赖流体流动或类似技术而提供非常精确的结果。
当将具有复杂介电常数的粒子暴露于空间变化的电场中时，可以根据Clausius-Mossotti因子的值，由负介电泳推动该粒子。在该情况下，所述粒子将朝向最小的电场移动，而被最大值电场所驱离。
比如，如图10、图11、图12和图13所示，电极155和156被布置在电极153,154,157,158,159,160,161和162的上方。特别是，电极155被布置在电极153,157,159,和161的上方，同时电极156被布置在电极154,158,160和162的上方。这些电极可以用于创建电场强度模式，以引起粒子(●)128在微通道104中按所需的方向移动。
在一个实例中，电极153,157,161和156中的每一个在指定的电势处连接到正弦电压源。面向的电极搭档154,158,162和155中的每一个连接到与其面对的搭档具有幅度相同而移位180度的相位差的正弦电压源。电极159和160连接到接地端(G1)。
在该方案中，因为电极159和160具有相同的电势，且它们的厚度创建了一个可以诱导很强最小电场的凹槽，所以微通道104中的电场在电极159和160之间的间距达到了最小值(Δ)170。微通道104中的电场在彼此面对的电极对153-154,157-158,161-162被具有180度相位差的电压极化的情况下达到最大。在该情况中，粒子(●)128被捕获在电极159,160之间的最小值(Δ)170被电场达到最大值强度的地方所包围的位置。
俘获粒子的位置可以改变和移动，比如，如图13所示，俘获粒子的位置分两个阶段向左移动。在第一阶段，位于现有静止位置左侧的电极157,158的电压被设置为地电位(G2)。这创建了与位于电极159和160之间的电场强度相同的最小值(Δ)电场。在第二阶段，电极159被极化为电极161，电极160被极化为电极162。这种极化在电极159和160之间创建了很强的电场。这个电场将推动被捕获于那个即将落入最接近最小值(Δ)电场处的粒子，并将该粒子向其左侧移动一个位置。
因此，以此种方式获得的粒子移位不需要流体流。
在另一个实施例中，如图14所示，电极155和156被沿微通道顶侧布置的唯一电极190所取代。也可以通过用金属材料或带有铟氧化物(ITO)涂层的透明材料在顶部关闭微通道来实现电极190，所述透明材料如玻璃或透明塑料。这种导电涂层提供了一种电连接，同时保留了透明顶盖，不妨碍从顶侧进行光学检测或照明。
在这个实例中，电极190连接到地电位，同时电极153,157和161中的每一个电极在指定的电势处连接到正弦电压电源。面向的电极搭档154,158,162中的每一个连接到与其面对的搭档具有幅度相同而移位180度的相位差的正弦电压源。电极159和160连接到与电极153,157和161具有幅度相同而移位90度或270度的相位差的正弦电压源。
在该方案中，因为电极159和160具有相同的电势，且它们的厚度创建了一个可以诱导很强最小电场的凹槽，所以微通道104中的电场在电极159和160之间的间距达到了最小值(Δ)170。微通道104中的电场在彼此面对的电极对153-154,157-158,161-162被具有180度相位差的电压极化的情况下达到最大。在该情况中，粒子(●)128被捕获在电极159,160之间的最小值(Δ)170被电场达到最大值强度的地方所包围的位置。
在这种电极配置的情况下，俘获粒子的位置可以改变和移动，比如，分两个阶段向左移动。在第一阶段，位于现有静止位置左侧的电极157,158的电压被设置为与电极153,157和161具有幅度相同而移位90度或270度的相位差的正弦电压源。这创建了与位于电极159和160之间的电场强度相同的最小值(Δ)电场。在第二阶段，电极159被极化为电极161，电极160被极化为电极162。这种极化在电极159和160之间创建了很强的电场。这个电场将推动被捕获于那个即将落入最接近最小值(Δ)电场处的粒子，并将该粒子向其左侧移动一个位置。
图12显示了一个在没有流体流动的情况下，可用于精确传递微孔102中粒子的结构。图12中没有显示出电极对155,156，但是如图9和图10所示，该电极对位于其他电极对的上面，具体地，电极155处于电极163,116,153的上面位置，同时电极156位于电极164,116A,154的上面位置。
如果电极116和116A分别被156和155的电压极化，同时电极153和154具有相同的地电压，则粒子可被负介电泳捕获在位于153和154之间的位置(Δ)。然后，当连接到接地电极116和116A同时153和154被极化为156和155时，可以将粒子推向微孔所在位置的116和116A之间的最小值(Δ)170电场处。
由于电极116,116A围绕微孔102并连接到地电位，电极155和156的存在在微孔102下面的通道中产生电场。经过前面的分析，现在所述粒子将被推向该微孔。
假如必须精确地控制所述粒子在微孔中的沉降位置，那么可通过将电极连接到电压源上而极化电极118，该电压源的幅度基本上小于用于控制电极155和156的幅度，且其相位相对于电极155和156的相位旋转90度或270度。这种极化可在微孔中创建介电泳力，该介电泳力将粒子推向微孔的中央。
如果必须避免微孔中粒子的传递，则在没有流体流动的情况下，推荐一种不同的电极极化。特别地，假定粒子在与地面连接的电极153,154之间被捕获，则可通过连接到接地电极116,163,164，同时电极116A被极化为电极155、电极153被极化为电极156、电极154被极化为155，来避免粒子传递。这些极化可创建临时的粒子移位，使得粒子从153和154之间的位置移位到接近电极116的位置(不是116和116A之间的位置)，并最终到达稳定的传递位点，该传递位点在最小值电场所在处的电极163和164之间。
在另一个实施例中，图12所报道的结构可用于在没有流体流的情况下，精确地传递微孔102中的粒子。如图16所示，布置在微通道顶侧的电极190取代了电极对155,156，并与地面相连。
如果电极116和116A分别连接到具有幅度相同而相位为0度和180度的正弦电压源，同时电极153和154连接到具有90度或270度相位移的相同的正弦电压，则粒子可以被负介电泳捕获在153和154之间的位置(Δ)。然后，当将电极116和116A连接到相位移为90度或270度的正弦电压同时将153和154分别连接到具有幅度相同而相位为0度和180度的正弦电压时，粒子将被推向微孔所在处的116和116A之间的最小值(Δ)170电场处。
由于电极116,116A围绕微孔102并连接到相同电压，电极190的存在可以在微孔102下面的通道中诱导电场。经过前面的分析，现在所述粒子将被推向该微孔。
假如必须精确地控制所述粒子在微孔中的沉降位置，那么可通过将电极118连接到电压源而极化电极118，该电压源的幅度基本上小于用于控制电极116和116A的幅度，且其相位相对于电极116和116A的相位旋转90度或270度。这种极化可在微孔中创建介电泳力，该介电泳力可将粒子推向微孔的中央。
如果必须避免微孔中粒子的传递，则在没有流体流动的情况下，推荐一种不同的电极极化。特别地，假定粒子在与连接到具有90度或270度相位移的相同的正弦电压的电极153,154之间被捕获，则可通过将电极116,163,164连接到地面、同时将电极153,116A和154分别连接到具有0度、90度或180度相位移的相同的正弦电压来避免粒子传递。始终保持电极190与地面连接。这些极化可创建临时的粒子移位，使得粒子从153和154之间的位置移位到接近电极116的位置(不是116和116A之间的位置)。最终，通过将电极116连接到与电极153相同的、具有270度相位移的正弦电压，使得所述粒子到达稳定的传递位点，该传递位点在最小值电场所在处的电极163和164之间。
本文所提出的这些带电压的结构，对于粒子的移位和传递不依赖于流体流的存在。然而，流体流动有利于提供一个适当的冷却结构。这些结构可用于使单个细胞沿着微通道移动，并驱使它们进入开放微孔，或者通过适当地施加一系列极化信号阻止它们进入开放微孔。
7.3在流体流存在的情况下，粒子在微通道和开放微孔中的传送
图9-图11图解了与微通道104流体相通的微孔102结构，所述微通道的顶部被覆盖了微通道中所包含液体的表面124所封闭。在通道流体中流动的粒子如细胞或珠子(beads)受到电磁力的影响，从而导致粒子128被拉向微孔102或被从微孔102推出。当可传送粒子的通道中有一股很明显的流体流时，特别适合用该结构来进行操作。例如，参见Faenza等，2011(五月),“使用电激活微通道调控k562白血病细胞的分离和模式化”("Controlledisolation and patterning of k562leukemia cells using electrically activatedmicrochannels"),In:International Conference on Microtechnologies in Medicineand Biology.
电极被固定于所述微孔和微通道的结构中以控制粒子移动。如，图9显示了一种被成某种形状的电极116包绕的微孔102，这样以来，在图9中呈现了一个朝向从右到左的流动方向的开口。
这些附图所呈现的用于调控粒子移动的特定的实施例包括那些布置在微孔102中的电极116,118，和那些布置在微通道104中的电极153,154。图10显示了与微通道104流体相通的微孔102，每一个具有一个由层状结构所形成的垂直壁112，所述层状结构包含一个介电基板114和电极。微通道电极153-164配置在微通道中，同时电极对153-154和155-156布置在微孔上部开放末端108的微通道与微孔102的接合点附近。微孔电极116和118分别配置在微孔的上部末端和下部末端附近。
在有流体流动的微通道104中，如果介电电泳与周围流体130的复介电常数不同时，则在该微通道中移动的粒子(●)128会受到介电电泳力的影响。所关注的粒子，如细胞，微珠或脂质体，其特征在于，可以被负介电泳驱动以促使这些粒子向最小值(Δ)170电场移动。这些粒子的相对密度也高于周围的缓冲液的相对密度。由于这个原因，它们可在重力的作用下沉降。
图10和图11显示，在微通道104中流通的粒子在到达微孔以及电极116之前可遇到电极153,154,155,156。根据介电泳原理，在粒子移向最小值(Δ)170电场的地方和从很强电场移出的地方，各种配置的应用电压可使得粒子128被电场捕获或驱逐。
在一个实施例中，电极116被设置为地面。电极155和156被一个外部电源极化为电压发生器。电极155的电压相位相对于电极156的电压相位旋转180度。施加到电极155和156上的电压具有相同的幅度。所述电压可随着正弦信号或方波而改变。由于这个原因，在两个电极155和156之间存在相对大的电场。
电极153和154的极化将根据捕获或驱逐粒子的任务不同而变化。更具体地说，在一个被称为“捕获”的配置中，电极153和154可与地面连接。可替选地，可以使用正弦电压或方波来极化电极153和154。当它们被极化时，电极153的相位将与电极156的相位相同，同时电极154将具有电极155的相位。该第二个配置被称为“驱逐”。所述电极的相对位置参见图11。
如图9-图11所示的电极配置，当微通道104中流动的所需粒子128被捕获于微孔102中时，将电极153和154设置为地面电位。电极155和156被一个外部电源极化为电压发生器。电极155的电压相位相对于电极156的电压相位旋转180度。施加到电极155和156上的电压具有相同的幅度。所述电压可随着正弦信号或方波而改变。由于这个原因，在两个电极155和156之间存在相对大的电场。
在这种情况下，由于电场在放置在电极153和154之间的位置170中达到较强的最小值，将出现一种“捕获”的情形。通道中的保留区域受较强电场的支配，将粒子推向所述最小值(Δ)电场区域。电极153和154以及所有其它电极的厚度大约为5到30微米。这将在电场达到最小值的地方以及所述粒子与其周围电极具有几乎相同的尺寸的地方创建一个区域(Δ)170。
区域(Δ)170与微孔102的开口对齐。捕获于最小值区域(Δ)170的粒子，被在微通道中流动的流体沿水平路径推向微孔的开口。将区域(Δ)170与微孔102开口之间的距离设置为一个制造技术上可行的、尽可能小的数值。如果使用标准印刷电路板技术，比较典型的距离约为20到100微米。由于电极116围绕着微孔102并与地面相连，电极155和156的存在将在微孔102下方的通道中产生电场。经过此前的分析，现在所述粒子将被推向微孔。
假如必须精确地控制粒子在微孔中的沉降位置，那么可通过将电极118连接到电压源而极化电极118，该电压源的幅度基本上小于用于控制电极155和156的幅度，且其相位相对于电极155和156的相位旋转90度或270度。这种极化可在微孔中创建介电泳力，该介电泳力将粒子推向微孔的中央。
如果粒子在微通道104中流动并且并不打算进入微孔，那么可通过在“驱逐”配置中极化电极153和154，从而获得期望的效应。在该情况中，将最小值电场置于微通道104的中间。在这个位置，粒子暴露于流体流，并且，如果微孔102与电极153和154的间距较小，则粒子不会被微孔102捕获。
在另一个实施例中，可通过首先在电极153和154之间捕获粒子，进而对“加载”或“驱逐”配置进行程序设计来控制粒子的移动，所述程序设计可通过合理设置电极153,154和116的极化，同时保持电极155时时地连接在一个正弦电压、电极156相移位180度连接在与电极155相同的正弦电压上来实现。为了首先捕获粒子，将电极153和154接地，并且电极116移位90度连接到与电极155相同的正弦电压。通过设置从电极153和154到微孔的流体流，可以找到足够低的流量值，使得能够用一种不足以阻止粒子往前移动、并且与在一边的电极116和另一边的电极155和156之间所建立的电场相反的拖拽力来捕获电极153和154之间的最小值电场中的粒子。如果需要将粒子传递到微孔，则将电极116连接到地面，所述拖拽力将使粒子移向微孔，然后进入微孔。相反，如果粒子必须移向并绕过微孔，那么将电极153和116连接在与电极156相同的正弦信号上，同时将电极154连接在与电极155相同的正弦电压上。在该配置中，粒子首先向上移动，然后移向电极156下方的电极116的部分，也是最小值电场所在的地方。通过这种方式，微孔被规避，粒子不传递。现在假设沿着所述通道还有第二个微孔,且具有与图9所示相同的构造，那么可将一组新的电极153和154设置为接地，并将第一个微孔的电极116恢复到初始电压。通过这种方式，最小值电场将布置在第二个微孔的电极对153,154之间，粒子将布置在这些电极之间。该方案可以在沿同一微通道布置的几个孔中重复实施。
7.4微通道中粒子的检测
当此类配置中的图9-图14所示的电极操控微通道104中的粒子以使粒子传递到目标微孔时，电极可以产生使粒子沿着图15-图16所示的轴线F-F’排列的效果。此外，所述粒子可以被垂直地推向微通道的底侧。假定微通道中存在一个连续的层状流体并且具有将粒子沿F-F’方向进行牵引的效果，那么所述粒子沿预定轴线以及在精确的垂向位置的精确定位，使得它们适于被光学检测或阻抗测量检测。比如，Duqi等，2011(五月),“使用DEP力和光学检测自动分离程序化数目的细胞进入微孔”(“Automated isolation of aprogrammable number of cells into microwells using DEP forces and opticaldetection”),关于医学和生物学中的微技术的国际会议(International Conference onMicrotechnologies in Medicine and Biology)已证明了通过介电泳以实现细胞聚焦，从而改善光学检测以及提高微孔中细胞传递的好处。
在一个实施例中，如图15所示，将包括四个电极170,171,172,173的结构合理地布置在操控电极153,154的下游。将电极设计为允许粒子沿F-F’方向移动并经过电极170-171和电极172-173之间的空隙。电极171,173与一个由交流电压所表示的激励信号188相连，同时电极170,172与一个读出电路186相连，所述读出电路186可以放大输出电流180和182，并提供一个与信号180,182之间的差异或比值相称的终端输出信号184。这可以通过使用已知的电路方案来完成。上游电极153,154,155,156的存在具有使细胞沿轴线排列的效果，在该轴线上，由单个细胞的通道在输出信号184上所产生的信号-噪声比最大。
在另一个实施例中，如图16所示，在由电极153,154,155,156对单个细胞进行适当地布置和排列后，借由包括三个电极174,175,176组成的结构执行单个细胞的检测。电极175与一个由交流电压所表示的激励信号188相连，同时电极174,176与一个读出电路186相连，所述读出电路186可以放大输出电流180和182，并提供一个与信号180,182之间的差异或比值相称的终端输出信号184。上游电极153,154,155,156的存在具有使细胞沿轴线排列的效果，在该轴线上，由单个细胞的通道在输出信号184上所产生的信号-噪声比最大。
在一个实施例中，在由电极153,154,155,156对单个细胞进行适当地布置和排列后，在无论是荧光或正常光照条件下，通过光学检测对单个细胞进行检测，所述光学检测通过将一个光学激励和检测系统置于微孔阵列的顶侧或底侧，并调整该光学系统沿轴线F-F’对齐。
在具体实施例中，一旦根据前述方法中的一种检测到粒子，由电极116,153,154,155,156,116,118和微孔102所表示的并由图9-图11所报道的结构将被复制，并布置在所述检测区域或电极的下游。这些电极的控制取决于由光测量或电测量所获得的感测信号184，所述光测量或电测量以检测时可将单个细胞选择性地拉进或推出靶微孔的方式进行。这种实施例使得单个细胞或预定数量的细胞在微孔中的精确定位成为可能。
7.5粒子在微孔中的聚集
当粒子128进入微孔102时，重力可导致该粒子128通过微孔102向所述弯月面122降落。为保证粒子128基本保持在微孔102的中央，可对微孔电极116,118,120供电以将粒子128推到微孔102直径的中心位置。例如，可以控制施加在电极116,118,120上的电压，以在微孔102的垂直对称轴或其附近生成一个基本上为零或基本上垂直的电场。这导致粒子128被推向微孔102的中央，导致粒子128沿中央轴线降落微孔的长度，并沉积在弯月面122的中央或其附近。重力或电磁力或这些的组合可以有助粒子的降落。
在一些实施例中，当微孔电极116,118,120为环形电极时，所述微孔可包括成对电极，如面向电极，以达到粒子操控及在微孔中移动的目的。另外，微孔可以包含附加电极，包括如用于特定分析或反应的电极，如用于感测粒子、细胞产物和细胞变化的感测电极和/或测量电极。例如，感测电极和/或测量电极可以用于测量阻抗、光信号、极性等电信号的变化。
即使在中止电磁力(如施加到电极的电压)后，沉积在弯月面122的粒子128仍可保持稳定地布置在弯月面122上。已公开的申请号为2009/0288963的美国专利描述了施加电压到电极以用介电泳操控粒子的示范性的方法，其全部内容通过引用并入到本文中。
当粒子128已经进入微孔102时，可以对布置在微孔102和微通道104接合点附近的微通道的底侧的电极153和154供电，以防止在微通道中流动的其它粒子进入微孔。例如，可以控制施加到电极153和154的电压的相位以驱离流体中的其它粒子，特别是关闭微孔102。这可以发生在粒子跌穿电极116后，比如，当电极118和120被用于使粒子集中在微孔中心时，即使在所施加的电磁力不存在时，依然允许粒子通过重力降落微孔的长度并基本保持在中心位置。
在一些实施例中，允许两个或更多个的粒子128进入微孔102并布置，以便促使粒子接触或靠近彼此。例如，在第一个粒子128布置在弯月面122后，可以撤掉施加到电极153和154的电压，同时开放微孔102以接收来自微通道104的一个或多个其它粒子。如上面所讨论的，当一个或多个其它粒子从微通道104进入微孔102时，该其它粒子128可以通过施加电压到电极118,120上而集中在微孔102中心。该其它粒子128沿微孔的垂直对称轴降落，直到该其它粒子布置到与弯月面122上的粒子128接触或接近为止。在可选择实施例中，在基本上相同的时间，将所有粒子引入微孔，并对电极116,118,120供电以将粒子聚集在微孔的中央作为一个细胞聚合物群，同时在弯月面形成一簇沉积细胞。
8.显微镜观察沉积细胞
由于微孔102的开放性质，可以例如使用显微镜，相机或其它光学装置观察到粒子128在微孔102下部末端108的流体-空气界面处的弯月面122上的停泊。可以从微孔102的上部末端106观察该粒子128，如透过微通道104和一个由一种透明材料如玻璃或塑料制造的顶盖，也可以从微孔的下部末端108观察，比如，在视野无阻碍的地方。
9.在弯月面的稳定停留
出人意料地，当电场被停用时，粒子包括活细胞能稳定地停留在弯月面，同时，流体在微通道中连续流动，从而进入微孔。出人意料地发现，假定微孔大小合适，那么在电场不存在的情况下，流体洗涤或改变培养基均不能移动弯月面上的细胞。这种稳定的停留允许除去有害的液体，如DEP操作所需的缓冲液和试剂，并允许更新更适合于微孔中所沉积的生物性粒子的维持和活力并且/或者更适合于特定分析方法的新鲜缓冲液和培养基。
如果在微孔的底部水平由流体速度的水平部分所引起的剪切应力相对较低或没有，则可获得弯月面上的稳定停留。通过改变封闭微孔的直径与深度的相对比值，流体速度的水平部分也改变，这在Han et al.,2010,“Integration of single oocyte trapping,in vitro fertilization and embryo culture in a microwell-structuredmicrofluidic device,”Lab on a Chip,vol.10,no.21,pp.2848-2854.有解释。在底部一侧以空气和流体之间的弯月面为特色的倒置开放微孔中，也能观察到相似的性能。
在一个实施例中，微孔的尺寸为能确保微孔的深度等于或大于直径。例如，对于一个直径75微米的微孔，可以考虑100微米或以上的深度。对于微通道中2.5mm/秒的平均流体速度，这种微孔尺寸能够保持水平流体速度小于1微米/秒。
在所述倒置开放微孔系统，可以持续供应微通道中流动的缓冲液或培养基中的营养物质以及移除细胞所产生的分解代谢物，并有助于维持配置在微孔的所述细胞或其它粒子的活力。此外，在微孔的下部开放末端暴露于所述装置外的大气使得气体交换成为可能，这有助于维持开放微孔中所包含粒子或多个粒子的健康和活力。
出人意外地，在所述倒置开放微孔系统中，包括小体积，稳定停留，有效的缓冲液和培养基的交换，有效的气体交换，以及使用最小的电磁力操纵和聚集细胞到期望的位点的能力的特征的组合，使得不仅能够有效利用该系统来评估单个细胞的特征，还可以用来保持、重新使用和重获原始细胞以进行克隆扩增。
10、微孔内容物的重获
在一个实施例中，可以例如通过破坏弯月面的表面张力来重获微孔内容物。例如，破坏弯月面的表面张力可以通过将如来自泵132或压缩空气源等的压力脉冲施加到微通道104来实现，所述压力脉冲的压力范围为0.5bars到3bars，脉冲持续时间范围为1毫秒到100毫秒。比如，微孔内容物可以作为包含如微孔流体中的单个粒子，细胞，或粒子或细胞簇的液滴，释放到位于微孔102下方的合适的容器126中(图4,5)，所述合适的容器如储存器，微量滴定板，收集瓶系统，捕捉表面等。在一个实施例中，所述容器126可以包括用于从微孔102重获的流体中分离一个或多个粒子的过滤器或膜。
在一个实施例中，微孔中包绕粒子128的流体，在从微孔重获前，可以通过蒸发来浓缩。例如，用空气或合适气体替换微通道中的流体可以导致微孔中的体积减少，因在开放于空气或气体的微孔的下部末端108将会发生蒸发。对微通道中的所述空气/气体施加压力可引起微孔中的浓缩流体的释放，并释放到所述一个或多个容器中。
在一个实施例中，在微孔下部末端的空气/流体界面处或其附近，所述微孔包含半透膜，所述膜可保留一个或多个粒子。在该实施例中，可从每个微孔102重获流体到一个或多个容器126中。
在装置101包含多个微孔的情况中，多孔的内容物可转移到一组匹配的，平行的多个容器中，如到微量滴定板的多孔中。
在将细胞从微孔转移期间，当施用所述压力脉冲时，可以在微通道中捕获其它细胞或粒子，并且该其它细胞或粒子可以与微孔中的一个或多个细胞一起被转移。为了制止这个问题，在使用前，可以在微通道中增加牛血清白蛋白(BSA)涂层或其它抗静摩擦涂层，如有机钝化层，如氟化脂肪酸自组装单层膜(SAM)或alkylhalosilane。
实例
可以通过参考以下实例更充分地理解本发明。所述实例意在描述本发明的特定的示例性的实施例，并不用来限制本发明的范围。
实例1
所制作的微通道或微孔的几何分析
1.1制作
通过从多层柔性印刷电路板(PCB)的基板上钻通孔，创建包含多个开放微孔的装置。改变微孔的尺寸，以分析特定几何形状的微孔的有效性。在本研究中，所钻的孔直径从70μm到150μm不等，PCB的厚度在75μm到350μm之间，每个装置包括6×6或8×8的矩阵孔。为将开放微孔阵列与标准微量滴定板直接接口，并容易地实施细胞重获和转移至微量滴定孔中，按如下表1所示准备优选器具。
在所述多个微孔102的顶部一侧，用聚酰亚胺制作厚度从30μm到200μm不等、宽度从200μm到1mm不等的微通道104，并将其配置在微孔上部末端106的上方。通道盖124通过将具有750μm厚度的透明聚碳酸酯黏附在微通道的顶部而形成。
表1微孔阵列特征
微孔数目 排x列 孔-孔和通道-通道间距
24 6x4 18mm
96 12x8 9mm
384 24x16 4.5mm
1536 48x32 2.25mm
微通道壁用聚酰亚胺制作，并结合到顶盖上，所述结合使用一种在70℃下2小时至过夜以适当固化的粘合剂，以确保该粘合剂的生物相容性，或者使用一种在室温下被层压然后用1mM BSA包裹的粘合剂，以确保生物相容性。
在可选的实施例中，在将厚度为55μm的光敏聚合物膜(Ordyl SY550,ElgaEurope)贴在包含被钻过的微孔的底层柔性PCB之前，将其贴在玻璃顶盖上以创建微通道。在所述顶盖中形成孔，以提供输入和输出的流体连接或嵌入储液室。所述孔直径约0.45mm。
在一次研究中，使用如图5所示连接的蠕动泵(Watson Marlow 101U/R)和与另一个微通道的入口(KDS-210,KD Scientific,Holliston,MA)连接的注射泵，将流体或包含细胞和粒子的流体注入每个微通道。流体流动从1微升/小时到20微升/分钟不等，取决于通道的截面和在粒子上要执行的具体操作。作用在微孔的毛细作用力可阻止从微孔下部末端的流体泄漏。在某些情况下，可以在所述装置的底面加一层疏水涂层(FC-732)以增加流体泄漏的阻力。其结果是，该流体系统使得微通道中的流体意外地填充微孔而没有从下部末端泄漏。1.2分析由重力沉积的细胞
将活的K562细胞(永生化的人类粒细胞性白血病细胞)以1.6×10e6个细胞/毫升的浓度悬浮于生理溶液(NaCl 0.9％w/v或PBS)，并用蠕动泵将其注入倒置微孔装置的微孔中。微通道的宽度为600μm，高度为55μm，每一个微孔直径为70μm。
设置输入泵以进行循环操作，其中每个循环包括两个阶段。在阶段1期间，以每分钟9微升的速度激活流体，同时在阶段2期间，将所述泵撤掉1分钟30秒。在阶段1期间，细胞沿随机轨迹在通道中流动。在阶段2的起始，细胞以随机定位的方式固定在通道中。在阶段2期间，允许一定数目的细胞通过沉降进入每一个微孔。
使用倒置显微镜来检查每个孔中的内容物，并且检测作为沉降结果的细胞在微孔中的可能存在。结果显示，可以通过调整细胞浓度来控制细胞进入微孔的分布。在此处描述的条件下，我们获得了表2所报道的分布。
表2细胞在微孔中的加载效率(总共41个采样)
加载的细胞数目 频率
0 51％
1 42％
2+ 7％
加载阶段的结果显示，单个细胞或多个细胞可沉积在微孔，到达下部开放末端的空气流体界面，并且可在那里捕获并且存活，而不破坏弯月面的表面张力。在那些微孔中，细胞下降到微孔期间，施加到细胞上的除了重力没有其它力，细胞沉积到流体弯月面的位置是随机的(见图6A)。
1.3分析由聚集排列和重力所沉积的细胞
如图2所示，使用两个或更多个的电极，可以生成作用于微孔中粒子的介电泳力，并在粒子沉降期间，操控所述粒子沿所述孔的垂直轴从微孔上部开放末端106的微通道104入口处，下降至下部开放末端108。在相邻电极116,118,120的每一对中，第一电极与正弦信号相连，同时第二电极与地面或具有180度的相位旋转的相同的正弦信号相连。
构建倒置微孔系统并将该倒置微孔系统用于本研究，所述倒置微孔系统具有如图2所示的系统特征。所述微孔102的直径在100μm到120μm之间，环形电极116,118,120中的每对电极之间的垂直空隙为50μm。
将K562细胞悬浮于PBS和甘油(300mM)之比为1:9的混合液中，电极116和120连接到具有包括80KHz和100KHz之间的一个典型频率的相同正弦电压。所施加电压的幅度为3.4V到15V不等。电极118接地。由于在保持电场激活时将四个细胞加载到微孔，每个细胞被迫沿所述微孔的中心轴排列。一旦到达微孔下部末端的空气/流体弯月面，每个细胞被置于中心且与先前加载的一个或多个细胞接触。这种聚合起因于垂直重力和所述介电泳力的水平部分的结合。
在荧光条件下，使用倒置显微镜140对所述开放微孔进行观察。当所述孔中的电极被适当极化时，一个或多个细胞被聚集到所述微孔的中心轴。在沿所述中心轴下降期间，如此排列的细胞各自沉积在微孔弯月面122的中心，在所述空气-流体界面处形成一聚合物并导致细胞与细胞接触。
K562细胞用荧光染料标记并使用倒置显微镜观察。如图6所示，虽然不施加电场时细胞通过重力随机沉积在微孔的弯月面(6A)，但是由垂直重力和介电泳力联合沉积的相同细胞可形成沉积在弯月面中心部分的粒子聚合物(6B)。1.4分析由聚集排列和重力沉积的微珠
将直径为10-25μm的聚苯乙烯微珠以22.5mM的浓度悬浮于去离子水或甘油中，并通过重力传递到具有约80μm直径的微孔中。电极116和118连接到具有100KHz频率的相同的正弦电压。电极接地。对2个珠子聚合物的聚集进行分析，表3报道了其结果，结果显示了珠与珠的平均距离和根据信号幅度所建立的珠-珠接触的相对数目。
表3
电压幅度(V) 平均距离(μm) 珠-珠接触比率
2 7.2 33％
4 2.2 90％
1.5芯片上标记被捕获于弯月面的细胞
分析微通道中流体的改变对所述开放微孔远末端弯月面上所捕获的细胞周围流体的影响，以确定所述倒置开放微孔系统提供单个细胞离心功能的能力。在K562细胞上实行钙黄绿素染色方案。
通过有限稀释和沉降将K562细胞传递至倒置开放微孔。在将细胞传递至所述弯月面之后，用微通道中流动的PBS冲洗所述微通道5分钟。包含钙黄绿素(1mM in NaCl 0.9％w.v)的缓冲液，以每分钟9微升的恒流速率在微通道中持续流动40分钟，所述钙黄绿素为示踪分子，当被细胞摄入时可变为荧光。图4显示微孔中单个细胞上所监控的荧光强度的动态情况。
细胞染色是有效的，显示了钙黄绿素从所述微通道到所述微孔和所述稳定保留细胞的扩散。如通过钙黄绿素摄取所显示的，所述细胞在洗涤后出人意料地保留在了弯月面上，并且为存活状态。通过监视钙黄绿素在单个细胞的摄取，可以观察到不同的摄取特性。通常，在30-40分钟后可达到最大摄取。荧光强度如表4所示。
表4
实例2
2.1 K562细胞在传递和DEP聚集后的重获
使用所述倒置开放微孔系统分析单个细胞功能可以重获已确定具有所需性能的细胞。比如，在多个微孔(如微孔阵列)中的每一个微孔捕获单个细胞和/或粒子后，可以通过一种或多种生物测定分析细胞功能。当一个特定的细胞被认为具有一种或多种所需的特性或功能时，每个微孔的内容物可被重获并转移到基板如微量滴定板上。
开发如图5所示特征的装置，使能够从所述倒置开放中重获细胞。为释放微孔中的内容物，以可控方式将一种加压过滤气体如氮气或空气注入微通道104。比如，通过连接一个常闭电阀172的输入端，施以约1bar的压力脉冲。
与所述电阀172的控制输入端连接的电子系统生成具有约5毫秒的持续时间的电压或电流脉冲。关于脉冲的生成，所述压缩气体经由与微通道输入和输出端连接的管道进入所述微通道104，其结果是，流体小滴138从每一个微孔102中被驱逐出，并滴到以一些实验中的捕捉表面或另一些实验中的微量滴定板为代表的容器126上，其中，所述板置于所述微孔阵列的下方并适当对齐。存在于微孔中的一个或多个粒子和/或细胞以流体小滴138的形式转移到所述捕捉表面。
在细胞从微孔转移期间，当施加压力脉冲时，可以在微通道中捕获其它细胞或粒子，并将该其它细胞或粒子与微孔中的一个或多个细胞一起转移。为了制止这个问题，在使用前，在微通道中注入牛血清白蛋白(BSA)涂层30分钟，以形成蛋白自组装单层膜。在细胞重获前，用PBS冲洗微通道20分钟。所有的细胞已从微通道中移除，以便仅仅将微孔所含细胞转移至所述重获容器中。2.2重获细胞的活力和生长
所述倒置微孔系统的功能之一是评定单个细胞(a single cell)或多个细胞(cells)的功能，并从微孔中重获或在微孔中扩增已确定为具有所需功能特性的活细胞。例如，在激活或失活电场和DEP下以及不同的时间长度的细胞活力，可通过监视重获的单个细胞或小细胞簇的生长和扩增来评定，如，每天计数细胞数。也可以通过显微镜观察细胞来监视细胞的生长。
将单个K562细胞重悬于生理介质，通过沉降将细胞传递至微孔，并沉积在多个微孔的所述空气/流体弯月面上。20分钟后，如上面所述，通过给通道中的流体传递一个压力脉冲来转移单个细胞，从而导致含所述细胞的小滴从所述微孔中转移到具有V-型孔并装有补充胎牛血清的RPMI生长培养基的96孔微量滴定板中。孵育几个小时后，所述单个细胞沉淀在V-型孔中，并用倒置显微镜观察。
在37℃，5％CO2下孵育所述细胞，并培养几天。每天观察细胞培养情况，确认来自重获的各单个细胞的克隆细胞群的生长。3-5天后显示细胞的生长和扩增，已经从所述单个沉积细胞生成出单克隆细胞系。所述单个细胞或小的细胞聚合物的生长如一系列定时照片所示，并如图8的图表所报道。本研究显示，细胞在倒置微孔的弯月面上的沉积以及所述细胞的重获是可能的，且能够重获活细胞。
实例3细胞-细胞相互作用分析
3.1针对靶LCL细胞的CTL细胞的活性
通过T淋巴细胞诱导靶肿瘤细胞的细胞溶解，显示了所述倒置微孔系统中功能活细胞间的相互作用。将靶细胞LCL细胞用钙黄绿素标记，并传递到微孔。针对所述靶细胞的T淋巴细胞(CTL)被激活，并传递到相同的微孔中。通过荧光显微镜监控所述靶细胞的荧光，并确定作为衡量细胞溶解的钙黄绿素荧光特性。
与负对照相比，被激活的CTL细胞诱导所述靶细胞荧光的持续下降。如图7所示，20分钟内，在所述倒置开放微孔系统中观察的活性目标细胞的荧光减弱和消失，显示了由所述CTL诱导的所述目标细胞的有效溶解(一种特定的细胞与细胞之间诱导的相互作用的有效分析)，并在几分钟内检测其功能性结果。
表5报道了在直径为70μm的倒置开放微孔中传递的一些LCL靶上所检测的荧光强度。作为对照，我们单独传递了LCL细胞。在两个条件下检测所述CTL-LCL的相互作用：没有人乳头瘤病毒(HPV)感染靶LCL，以及有HPV感染。在所述第一种情况下，预期没有溶解，而在所述第二种情况下，预期所述CTL细胞可识别所述靶并溶解所述LCL细胞。该表中所报道的结果显示，当所述LCL被HPV感染时(cases e-h)，CTL-LCL结合体(couples)的荧光强度在30分钟内有很强的下降。与此相反，在仅仅一种情况(d)下，可获得a-特异性(a-specific)溶解，代表了在即使没有HPV感染的情况下，由所述CTL细胞识别靶细胞的情况。在所有其它非感染的情况(a-c)下，仅观察到荧光信号的生理性下降。
表5
案例 细胞类型 时间(分钟) 强度(相对的)
a LCL(对照) 30 57.9％
b CTL-LCL(没有HPV) 20 59.8％
c CTL-LCL(没有HPV) 20 88.6％
d CTL-LCL(没有HPV) 20 23.8％
e CTL-LCL 1 30 2.3％
f CTL-LCL 2 20 6.2％
g CTL-LCL 3 15 0.0％
h CTL-LCL 4 15 4.5％
实例4控制粒子在有活跃流体流动的微孔中的传递
为验证如附图所示倒置开放微孔结构的功能进行实验。制造具有圆形直径为100μm，介电层厚度为50μm和25μm的微孔的装置。每个电极的厚度为9μm。电极153和154之间的空隙8为50μm。所述微通道高度为150μm，宽度为350μm。
将直径为10μm的聚苯乙烯微珠重悬于甘油(22.5mM)中。甘油密度高于水，用于降低沉降速度，并因此限制了微珠黏附在所述微通道的底部表面。将K562细胞重悬于PBS、甘油(300mM)比为1:9的混合液中。这种缓冲液具有生理渗透压，而导电率减低至约0.1S/m。
在两个不同的实验中，微珠和细胞被引进微通道，并且控制电极116,153,154,155,156,118被极化，以便促使(捕获)或阻止(驱逐)粒子进入微孔。除了接地电极之外，所有的信号为具有100kHz频率和相同振幅的正弦信号。表6报道了相移方案。控制电极的功能通过对于根据粒子速度和外加电压所传递的每种粒子和细胞传递至微孔的粒子数目进行统计分析来确定。
表6
当捕获配置被激活时，由于较高的信号振幅和较低的流体速度，传递至所述微孔的粒子数目增加。具体结果如表7和表8所报道的，其中所报道的每个数值考虑了至少50个样本。
当驱逐配置被激活时，我们发现，对于峰到峰电压幅度大于2V和任意粒子的速度在15-150μm/s范围内的情况，该结构正常工作(即无粒子传递)。
通常不采用低于15μm/s的流速，因为它们会导致粒子黏附到微通道的底表面。如在流过通道的细胞上所进行的钙黄绿素释放试验所显示的，所述驱逐配置提供了比所述捕获配置更高的对细胞的刺激。作为结果，当使用细胞进行工作时，优选峰到峰电压幅度低于10V，以限制对细胞的刺激并维持细胞活力。
表7
表8
实例5控制所述倒置开放微孔的外部环境以减少蒸发和增强细胞活力
通过设立其中所述微孔外的湿度为饱和的系统，并测量由于蒸发所导致的所述拖拽力的持续下降，可显示控制所述倒置开放微孔周围环境的积极效果。
用于控制所述蒸发的装备包括384孔的微量滴定板，其中每个孔中装有100uL储存温度为4℃到10℃之间的流体，如水，RPMI，PBS或任何适合细胞培养的缓冲液。以微量滴定板的每个孔与倒置开放微孔对齐的方式，将所述倒置开放微孔阵列114依靠在所述微量滴定板上，从而创建一个包含预先存于微量滴定板的流体的封闭室，所述流体可以在封闭室中蒸发，从而增加湿度。通常，所述倒置开放微孔的弯月面与所述池之间的垂直距离从0.5mm到5mm不等。几分钟后，所述室中的蒸汽压达到饱和值，从而阻止任何从微量滴定板和倒置开放微孔的进一步蒸发。
为显示控制微孔下湿度对于减少微孔中蒸发的积极效果，使用一种以具有图2所示电极配置的微孔为特色的装置101。电极116和120接地，同时电极118连接到具有100kHz频率和可变幅度的正弦信号。
将温度保持在30℃到37℃之间的K562细胞悬浮液注入微通道，并停止流体流动以将单个细胞配置在微孔入口上方的微通道中。在蒸发存在的情况下，所述细胞受到方向向下且由空气-流体界面处的蒸发所产生的流体流动的拖拽力FD。另外，细胞以FB-FG-FD＝FDEPy的方式受到重力FG，浮力FB和介电泳力的垂直部分FDEPy。
由于相对高值的介电泳力，所述细胞依然被捕获于微通道的入口处，作用于该细胞的所述力使其处于平衡状态。当介电泳力减小时，细胞的垂直位置降低，并到达电场力和介电泳力更高的区域。在电场的幅度达到一个最低临界值之前，一直能观察到这种行为。如果所述幅度进一步减小，则所述细胞将落入微孔，因为介电泳力没有强大到足以抵消作用于细胞的其它力。
比较有湿度控制或没有湿度控制的情况下被空气包围的倒置开放微孔的细胞的垂直位置。高度的参考值为顶部电极116的顶侧。高度的正值与保持在微孔外的微通道中的剩余粒子对应，同时负值与进入微孔的粒子对应。如表9所报道的，当控制湿度时，细胞高度总是较高。这表明，倒置开放微孔下方的用于控制湿度的装备的存在可有效移除由于蒸发所带来的附加拖拽力FD。
表9
为了维持对于捕获于空气-流体界面处的弯月面上的细胞来说适当的生理环境，需要控制蒸发。事实上，蒸发的存在将引起盐类和所述培养基所含其它营养素的局部浓度增加，以及随之发生的渗透压的增加。在实施蒸发控制之后，我们使用标准的钙黄绿素释放试验测量了细胞活力，如Neri et al.,2001,Clin.Diagn.Lab.Immunol.,vol.8,no.6,pp.1131-1135“Calcein-Acetyoxymethyl Cytotoxicity Assay:Standardization of aMethod Allowing Additional Analyses on Recovered Effector Cells andSupernatants”.所报道，所述试验中，细胞被1μM的钙黄绿素染色，并且每小时的信号丢失大约为8％，这相当于众所周知的生理丢失。
本说明书包括已公开参考文献和专利文件的大量引文，其中每一个均通过引用方式将其全部内容并入到本文中。
尽管已举例说明了本发明，并在前述的说明书和附图中描述了优选实施例，可以理解的是，在不脱离如下面的权利要求所体现的本发明的范围和精神的前提下，可以对优选实施例做出任何变化和更改。

Claims (10)

1.一种用于对粒子功能进行微分析的倒置微孔系统，其包括：
a)微通道，其具有第一末端和第二末端，其中所述微通道被配置成允许流体以流体流方向流动，所述流体流方向被限定为从第一末端到第二末端，并且其中所述微通道被限定在第一垂直壁和第二垂直壁之间，所述第一垂直壁配置在所述微通道的第一侧壁上，所述第二垂直壁配置在所述微通道的第二侧壁上，所述第一垂直壁包含第一基板部分，并且所述第二垂直壁包含第二基板部分；
b)微孔，其具有开放的上部末端和开放或关闭的下部末端，所述上部末端对所述微通道开放，所述微通道便于流体输送至所述微孔，所述微孔包含在上部末端和下部末端之间延伸的第三垂直壁，所述第三垂直壁包含第三基板部分；以及
c)受控的电极阵列，所述电极阵列包括第一电极(153)，第二电极(154)，第三电极(155)和第四电极(156)，其中第一电极(153)和第三电极(155)中的每一个的至少一部分包埋在第一基板部分中，并且第二电极(154)和第四电极(156)中的每一个的至少一部分包埋在第二基板部分中；
其中第三和第四电极设置成邻近所述微通道的上表面，并且其中第一和第二电极分别设置在第三和第四电极的下方，使得第一基板部分设置在第一和第三电极之间并且第二基板部分设置在第二和第四电极之间，并且进一步地，其中第三电极(155)位于第一电极(153)上方，第四电极(156)位于第二电极(154)上方，并且分别地，所述第一电极(153)面向所述第二电极(154)，所述第三电极(155)面向所述第四电极(156)；
所述电极阵列还包括至少部分地包埋在第三基板部分中并且至少部分地在微孔周围延伸的第五电极(116)和至少部分地包埋在第三基板部分中并且至少部分地在微孔周围延伸的第六电极(116a)，其中第三电极设置在第五电极上方，并且第四电极设置在第六电极上方。
2.根据权利要求1所述的倒置微孔系统，其还包括检测结构，所述检测结构包括第一检测电极(170)，第二检测电极(171)，第三检测电极(172)和第四检测电极(173)，其中第一和第二检测电极彼此相对并且位于与液体流方向平行的轴线的对边，使得第一空隙设置在第一和第二检测电极之间，其中第三和第四检测电极彼此相对并且位于与液体流方向平行的轴线的对边，使得第二空隙设置在第三和第四检测电极之间，并且其中第一、第二、第三和第四检测电极与所述微通道的底部表面接触。
3.根据权利要求1所述的倒置微孔系统，其还包括检测结构，所述检测结构包括设置于第一位置的第一检测电极(174)，设置于第二位置的第二检测电极(175)，以及设置于第三位置的第三检测电极(176)，所述第二位置关于液体流方向位于第一位置的下游，所述第三位置关于液体流方向位于第二位置的下游，其中第一、第二和第三检测电极各自部分地与平行于液体流方向的轴线重叠，并且其中第一、第二和第三检测电极与所述微通道的底部表面接触。
4.根据权利要求1所述的倒置微孔系统，其中所述微孔的下部末端对微孔外部的大气开放。
5.一种用于对粒子功能进行微分析的方法，其包括：
a)提供根据权利要求1-4任一项所述的倒置微孔系统，所述系统包括在上部末端对至少一个微通道开放的一个或多个微孔，其中沿着所述至少一个微通道布置电极；
b)将至少一个粒子加入所述至少一个微通道；
c)其中电场强度模式引起所述粒子以期望的方向在所述至少一个微通道中移动。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述倒置微孔系统为权利要求1中要求保护的系统，并且所述方法包括：
a)分别用第三电极(155)和第四电极(156)的电压极化第五电极(116)和第六电极(116a)，而第一电极(153)和第二电极(154)具有相同的地电压，并且在所述第一电极(153)和第二电极(154)之间的位置(Δ)捕获所述至少一个粒子。
7.根据权利要求6所述的方法，其在步骤a)后还包括：
b)将所述第五电极(116)和第六电极(116a)连接到地，并且将第一电极(153)和第二电极(154)极化为第四电极(156)和第三电极(155)，将所述至少一个粒子推向一个或多个微孔所在处的、所述第五电极(116)和第六电极(116a)之间的电场的最小值处。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述倒置微孔系统为权利要求2中请求保护的系统，其中上游第一、第二、第三和第四电极使所述粒子沿着轴线排列，其中由所述至少一个粒子的通过产生的终端输出信号(184)的信噪比是最大的，并且所述方法包括：
a)将所述第二检测电极(171)和第四检测电极(173)与由交流电压表示的激励信号(188)连接；
b)将所述第一检测电极(170)和第三检测电极(172)与读出电路(186)连接，所述读出电路(186)放大第一输出电流(180)和第二输出电流(182)，并且提供与第一输出电流(180)和第二输出电流(182)之间的差值或比值成比例的所述终端输出信号(184)。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述倒置微孔系统为权利要求3中要求保护的系统，其中上游第一、第二、第三和第四电极使所述粒子沿着轴线排成一行，其中由所述至少一个粒子的通过产生的终端输出信号(184)的信噪比是最大的，并且所述方法包括：
a)将第二检测电极(175)连接至由交流电压表示的激励信号(188)，而第一检测电极(174)和第三检测电极(176)连接至读出电路(186)，所述读出电路放大第一输出电流(180)和第二输出电流(182)，并提供与第一输出电流(180)和第二输出电流(182)之间的差值或比值成比例的所述终端输出信号(184)。
10.根据权利要求5-9任一项所述的方法，其中，所述至少一个粒子在由第一、第二、第三和第四电极适当布置和排列后通过光学检测进行检测。
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