TWI808934B - 經工程化以表現促發炎多肽之腫瘤浸潤細胞 - Google Patents

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Abstract

本發明提供製備經工程化以表現促發炎多肽之腫瘤浸潤細胞之方法。該促發炎多肽係由該腫瘤浸潤細胞表現，以逆轉由免疫效應細胞之數量及活化狀態相對於抑制細胞之數量及活化狀態間之失衡引起之腫瘤內及腫瘤周圍之一般免疫抑制狀態。經由TIC之表現遞送該促發炎多肽明顯不同於全身投與，可減少在遠離欲治療腫瘤之部位因發炎增加所致之副作用。

Description

經工程化以表現促發炎多肽之腫瘤浸潤細胞
本發明係關於經基因工程化之細胞群，及特定言之係關於可靶向腫瘤並將促發炎劑遞送至該腫瘤之位點之經基因工程化之細胞。
T細胞已開發作為治療劑許多年(參見，例如，Sharpe等人，Disease Models & Mechanisms 8, 337-350 (2015)；Maus等人，Annul. Rev. Immunol. 32, 289-225 (2014), Wu等人，Cancer J. 18, 160-175 (2012))。此外，T細胞之抗原特異性已經基因操作以重定向對抗由腫瘤表現之靶抗原。特定言之，T細胞已經工程化以表現經修飾之TCR (所謂之TCR治療劑)或具有針對靶抗原之增強之特異性之蛋白質-融合-衍生之嵌合抗原受體(CAR)。CAR組合類抗體識別及T細胞活化功能(Maher, ISRN Oncol.2012 278093)。其等包括衍生自抗體、配體或受體之抗原結合區(Eshhar等人，PNAS 90, 720-724 (1993))；將CAR固定至T細胞之跨膜域(Bridgeman等人，J. Immunol. 184 6938-6949 (2010))；及於誘導轉導T細胞之持久、運輸及效應功能之一或更多個細胞內傳訊域(Finney等人，J. Immunol. 161, 2791-2797 (1998)；Krause等人，J. Exp. Med. 188, 619-626 (1998))。靶向域(通常為單鏈FV片段)係經由可撓性間隔區連接至細胞內傳訊域(通常CD3ζ或FCRγ受體之跨膜及膜內域(endodomain))。 認為腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)係天然生成之T細胞回應腫瘤之結果。TIL(其等可分離自腫瘤組織)具有浸潤及靶向特定類型腫瘤之固有能力。經分離之TIL可經活體外培養、活化及擴增。一經再注射至病患體內，TIL已於臨床試驗中(特定言之於黑色素瘤之治療中)顯示治療活性(Rosenberg等人，Adv Exp Med Biol. 1988; 233:459–467；Besser等人，Clin Cancer Res. 2010;16(9):2646–2655；Kvistborg等人，J Immunother. 2011; 34(9):677；Dudley, J Cancer. 2011;2:360–362))。人類中之陽性反應速率已接近50%，及人類病患之約13%中持久及完全恢復。此等反應速率強調技術之前景，及改善之空間。
提供經基因工程化以提供不同於嵌合抗原受體(CAR)之促發炎蛋白之增加之表現之經分離之腫瘤浸潤細胞(TIC)。視需要，該TIC係經基因工程化以表現編碼增加該促發炎蛋白之表現之轉錄活化物之外源性核酸或以表現編碼該促發炎蛋白之外源性核酸。視需要，該TIC亦包括編碼CAR之核酸。視需要，該TIC係衍生自分離自實體腫瘤生檢之細胞。視需要，該TIC係衍生自分離自外周血液或淋巴組織之細胞。視需要，該TIC係白血球。視需要，該TIC係T細胞、B細胞、巨噬細胞或NK細胞。視需要，該TIC表現選自CD3、CD4、CD8、T-bet、GATA-3、CD25、Foxp3及ROR-γT之群之至少一種標記物。視需要，該細胞表現選自CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD38、CD40、CD72及CD79a,b之群之至少一種標記物。視需要，該細胞表現選自CD56、CD16、F480、siglec3及γ受體之群之至少一種標記物。視需要，該外源性核酸編碼細胞介素。視需要，該細胞介素係選自由IL-2、IL-7、IL-15、IFN (1或2型)、CSF、GM-CSF、IL-21及TNF-α組成之群。視需要，該外源性核酸編碼可為單鏈抗體之抗體。視需要，該抗體特異性識別(例如，特異性抑制)檢核點抑制蛋白。視需要，該抗體係選自抗-CTLA-4、抗-PD-1及抗-PD-L1之群。視需要，該外源性核酸編碼趨化介素。視需要，該趨化介素係選自RANTES、IP-10、CXCL9及CXCL10之群。視需要，該外源性核酸編碼微生物抗原。視需要，該微生物抗原係選自SEA、SEA/E-120及細菌鞭毛蛋白之群。視需要，該促發炎蛋白係表現為融合蛋白。視需要，該外源性核酸係以操作方式連接至可誘導啟動子。視需要，該可誘導啟動子係四環黴素-可誘導啟動子。視需要，該TIC進一步包含編碼基質降解酶之核酸。視需要，該基質降解酶係選自肝素酶、膠原酶、基質金屬蛋白酶及胞漿素原活化物之群。視需要，該基質降解酶係MMP9或尿激酶。 亦提供製備腫瘤浸潤細胞之方法，該方法包括：自病患獲得樣本；自該樣本分離腫瘤浸潤細胞；及用編碼不同於嵌合抗原受體(CAR)之促發炎多肽之外源性核酸或誘導該促發炎多肽表現之轉錄因子轉形該等腫瘤浸潤細胞。視需要，該樣本包含腫瘤生檢或細針抽吸物(FNA)。該FNA可來自該腫瘤中或來自該腫瘤周圍(例如，來自腫瘤引流淋巴結)。視需要，該樣本包含外周血液或淋巴組織生檢。視需要，自該樣本分離腫瘤浸潤細胞之步驟包括使該樣本(例如，部分或大體上完全)分離成單一細胞。視需要，該TIC係腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。視需要，該TIC係細胞毒性T細胞、輔助性T細胞及/或B細胞。視需要，分離該等腫瘤浸潤細胞包括使該等細胞與特異性結合至細胞類型特異性細胞表面標記物之藥劑接觸。該細胞表面標記物可為所需細胞類型(諸如T細胞、NK細胞或巨噬細胞)所特有。例如，該藥劑可為抗-CD4及/或抗-CD8抗體。或者，該細胞表面標記物可為非所需細胞類型所特有，藉此提供陰性選擇。視需要，該藥劑係結合至固體擔體。視需要，分離腫瘤浸潤細胞包括進行FACS或MACS。視需要，分離該等腫瘤浸潤細胞包括將該等細胞引入微流控裝置內並將一或更多個細胞放置於位於該微流控裝置內之複數個隔離室之各者內。視需要，該微流控裝置係奈流控裝置。視需要，該微流控或奈流控裝置包含至少一個經調整以支援細胞生長及/或維持之內表面。視需要，該經調整之表面係本文描述之表面。例如，該經調整之表面可包含共價連接之聚合物。視需要，該等聚合物可包含聚乙二醇(PEG)、一或更多種多醣或一或更多種肽或蛋白質。視需要，該經調整之表面可包含不同類型之共價連接之聚合物(例如，包含PEG之聚合物及包含肽或蛋白質之聚合物)之組合。視需要，將一或更多個細胞放置於隔離室內包括使用電動力以將該等細胞移動至複數個隔離室內。視需要，該電動力係介電泳力。視需要，將該等細胞引入微流控裝置內並將一或更多個細胞放置於複數個隔離室之各者內之步驟係於轉形該等腫瘤浸潤細胞之步驟後進行。視需要，轉形該等腫瘤浸潤細胞包括用病毒載體轉形該等細胞。視需要，該病毒載體係慢病毒載體。視需要，轉形該等腫瘤浸潤細胞包括將CRISPR-Cas9、TALEN或鋅指蛋白引入該等細胞內。視需要，該方法亦包括於該微流控裝置之該等隔離室內培養轉形細胞。視需要，該等轉形細胞係單獨培養於各別隔離室中以藉此產生轉形細胞之純系群。視需要，該方法亦包括在雷帕黴素(rapamycin)之存在下培養該等轉形細胞。視需要，該方法亦包括向病患投與轉形細胞。視需要，該轉形細胞係獲得樣本之相同病患。 亦提供治療患有癌症之病患之方法，該方法包括向該病患投與如上文描述之經基因工程化之腫瘤浸潤細胞之有效方案。視需要，該癌症係黑色素瘤、乳癌、泌尿生殖癌、神經系統癌、腸癌或肺癌。視需要，該方法亦包括向該病患投與可誘導外源性核酸之表現之藥劑。視需要，該外源性核酸包含四環黴素-可誘導啟動子及向該病患投與之藥劑係四環黴素。視需要，向該病患投與至少103 個經基因工程化之腫瘤浸潤細胞。視需要，向該病患投與103 -105 個經基因工程化之腫瘤浸潤細胞。視需要，向該病患投與之經基因工程化之腫瘤浸潤細胞包含經基因工程化之腫瘤浸潤細胞群之混合物，各群選殖衍生自單一經基因工程化之腫瘤浸潤細胞。 亦提供包含經基因工程化之腫瘤浸潤細胞群之混合物之組合物。各群可選殖衍生自單一類型之本文描述之經基因工程化之腫瘤浸潤細胞。視需要，該組合物大體上不含除來自本文描述之經基因工程化之腫瘤浸潤細胞之純系群中之一者之細胞外之細胞。視需要，該混合物中至少95%之細胞係來自本文描述之經基因工程化之腫瘤浸潤細胞之純系群中之一者。視需要，該組合物包含至少103 個細胞、至少104 個細胞、至少105 個細胞或至少106 個細胞。視需要，該組合物進一步包含醫藥上可接受之載劑。
本申請案係依35 U.S.C. 119(e)主張在2015年12月31日申請之美國臨時申請案第62/274,059號之權利之非臨時申請案，第62/274,059號之內容以全文引用之方式併入本文中。 定義 若多肽引起發炎之全身或局部增加，則其係促發炎多肽。發炎之增加可表徵為(例如)：具有效應功能之免疫細胞相較於具有調節功能之免疫細胞之活化狀態或數量之比率增加；一或更多種促發炎細胞介素及/或趨化介素(除投與之多肽外)之濃度增加；一或更多種抗發炎細胞介素之濃度減小；抗體之濃度增加；組織胺之釋放；及/或體溫升高。促發炎細胞介素之實例包括IL-1、TNF α、IL-6、IL- 8及IFNγ。促發炎趨化介素之實例包括CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11及CXCL10。抗發炎細胞介素之實例包括IL4、IL10、IL13、IL35、IL-16、IFN-α、TGF-β、IL1ra及G-CSF。 腫瘤浸潤細胞可以經分離之形式提供。此意謂該等腫瘤浸潤細胞係作為細胞之活體外群提供，其已經處理以移除某些生物分子及/或通常與活體內腫瘤浸潤細胞相關聯之細胞類型。此處理可包括細胞外蛋白之部分消化、細胞分離、分級分離、細胞培養、細胞擴增及/或細胞富集。細胞擴增可包括靶向擴增，諸如當免疫細胞經擴增以回應於抗原刺激(例如，與腫瘤細胞相關聯之抗原刺激)時發生。細胞富集可包括所需免疫細胞類型之基於標記物之富集(例如，使用細胞表面標記物)。視需要，腫瘤浸潤細胞係活體外群中總細胞之至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。 單株抗體或腫瘤浸潤細胞與其靶抗原之特異性結合意謂至少106、107、108、109或1010 M-1之親和力。特異性結合係在量級上具有較高可偵測性且區別於與至少一個無關靶發生之非特異性結合。特異性結合可為特定官能基之間之鍵形成或特定空間擬合(例如，鎖及鑰匙類型)之結果，然而非特異性結合通常係凡得瓦爾力之結果。然而，特異性結合不一定暗示單株抗體或腫瘤浸潤細胞結合一個且僅一個靶。 若腫瘤浸潤細胞以大於其結合至相同類型之正常組織(或正常組織內之非癌細胞)之親和力之親和力結合至腫瘤(或腫瘤內之癌細胞)及/或(在全身引入至病患內後)發現於該病患之至少一個腫瘤中之濃度比於該病患之非腫瘤組織中之濃度大，則腫瘤浸潤細胞具有「靶向」腫瘤之能力。 基本抗體結構單元係亞單元之四聚物。各四聚物包括兩個相同之多肽鏈對，各對具有一條「輕」 (約25 kDa)及一條「重」鏈(約50-70 kDa)。各鏈之胺基端部分包括具有約100至110或更多個主要負責抗原識別之胺基酸之可變區。此可變區係最初經表現連接至可裂解訊號肽。無該訊號肽之可變區有時被稱為成熟可變區。因此，例如，輕鏈成熟可變區意謂無該輕鏈訊號肽之輕鏈可變區。各鏈之羧基端部分定義主要負責效應功能之恆定區。 輕鏈分為κ或λ。重鏈分為γ、μ、α、δ或ξ，且將該抗體之同型分別定義為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區係藉由具有約12個或更多個胺基酸之「J」區連接，及該重鏈亦包括具有約10個或更多個胺基酸之「D」區。(通常參見，Fundamental Immunology (Paul, W.編，第2版，Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7) (出於所有目的將該案以全文引用之方式併入本文中)。 各輕鏈/重鏈對之成熟可變區形成抗體結合位點。因此，完整抗體具有兩個結合位點。除於雙官能或雙特異性抗體中以外，該等兩個結合位點相同。該等鏈均顯示藉由三個高度可變區(亦稱為互補決定區或CDR)連接之相對保守框架區(FR)之相同一般結構。來自各對之兩條鏈之CDR係藉由框架區對齊，使得能夠結合至特定抗原決定基。自N端至C端，輕鏈及重鏈兩者均包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。胺基酸至各域之分配係根據Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987及1991)或Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；Chothia等人，Nature 342:878-883 (1989)之定義。Kabat亦提供廣泛使用之編號規則(Kabat編號)，其中向不同重鏈之間或不同輕鏈之間之相應殘基分配相同編號。 術語「抗體」包括完整抗體及其結合片段。通常，片段與衍生其等之完整抗體競爭以特異性結合至靶。此等抗體片段可包括不同重鏈、不同輕鏈、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、Dab、奈米抗體及Fv。抗體片段可藉由重組DNA技術，或藉由完整免疫球蛋白之酶或化學分離產生。術語「抗體」亦包括雙特異性抗體。雙特異性或雙功能抗體係具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩種不同結合位點之人造雜合抗體(參見，例如，Songsivilai及Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990)；Kostelny等人，J. Immunol., 148:1547-53 (1992))。 嵌合抗體係其中非人類抗體(例如，小鼠)之輕鏈及重鏈之成熟可變區與人類輕鏈及重鏈恆定區組合之抗體。此等抗體大體上或完全保留小鼠抗體之結合特異性，及係約三分之二之人類序列。 鑲飾抗體(veneered antibody)係人類化抗體之一種類型，其保留CDR之一些及通常所有及非人類抗體之非人類可變區框架殘基之一些但以來自人類抗體序列之相應位置之殘基置換可有助於B細胞或T細胞抗原決定基之其他可變區框架殘基例如曝露殘基(Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991)。結果係其中該等CDR係完全或大體上來自非人類抗體且非人類抗體之可變區框架係藉由取代變得更類似人類之抗體。ABC2或ABC 101抗體之鑲飾形式係包括於本發明中。 人類化抗體係其中來自非人類「供體」抗體之CDR經移植至人類「受體」抗體序列內之經基因工程化之抗體(參見，例如，Queen，美國專利案第5,530,101號及5,585,089號；Winter，美國專利案第5,225,539號；Carter，美國專利案第6,407,213號；Adair，美國專利案第5,859,205、6,881,557號；Foote，美國專利案第6,881,557號)。該等受體抗體序列可為(例如)成熟人類抗體序列、此等序列之複合物、人類抗體序列之共通序列、或生殖區序列。因此，人類化抗體係具有完全或大體上來自供體抗體之一些或所有CDR及 (若存在)完全或大體上來自人類抗體序列之可變區框架序列及恆定區之抗體。同樣地，人類化重鏈具有完全或大體上來自供體抗體重鏈之至少一、二及通常所有三個CDR，及(若存在)大體上來自人類重鏈可變區框架及恆定區序列之人類重鏈可變區框架序列及重鏈恆定區。同樣地，人類化輕鏈具有完全或大體上來自供體抗體輕鏈之至少一、二及通常所有三個CDR，及(若存在)大體上來自人類輕鏈可變區框架及恆定區序列之輕鏈可變區框架序列及輕鏈恆定區。除奈米抗體及dAb外，人類化抗體包含人類化重鏈及人類化輕鏈。當相應殘基(如藉由Kabat定義)之至少85%、90%、95%或100%在各自CDR之間相同時，人類化抗體中之CDR係大體上來自非人類抗體中之相應CDR。當藉由Kabat定義之相應殘基之至少80%、85%、90%、95%或100%相同時，抗體鏈之可變區框架序列或抗體鏈之恆定區係大體上分別來自人類可變區框架序列或人類恆定區。 術語「抗原決定基」係指抗原上被抗體結合之位點。抗原決定基可自鄰近胺基酸或藉由一或更多個蛋白質之三級折疊並列之非鄰近胺基酸來形成。自鄰近胺基酸所形成之抗原決定基(亦稱為線性抗原決定基)係通常因曝露於變性溶劑而被保留，然而藉由三級折疊所形成之抗原決定基(亦稱為構形抗原決定基)係通常因經變性溶劑處理而有所損失。抗原決定基通常包括呈獨特空間構形之至少3個及更通常至少5或8至10個胺基酸。判定抗原決定基之空間構形之方法包括例如X射線結晶學及二維核磁共振。參見，例如，Epitope Mapping Protocols，Methods in Molecular Biology，第66卷，Glenn E. Morris編(1996)。 多肽係指胺基酸之任何聚合物(無關長度)，及因此包括(例如)天然蛋白質、工程化蛋白質(諸如scFV)、蛋白質片段(其等包括至少一個結構域或蛋白質折疊)及短肽(諸如來自微生物抗原之免疫原性肽)。 術語「病患」包括接受預防性或治療性治療之人類及其他哺乳類個體。因此，例如，病患可包括異種模型，其中人類癌細胞植入於嚙齒動物中以測試治療之作用。 「包含」一或更多種列舉元素之組合物或方法可包括非明確列舉之其他元素。例如，包含抗體之組合物可單獨含有抗體或與其他成分組合。 「約」係指數值，無論有無明確指示，其包括(例如)整數、分數及百分數。該術語約通常係指數值之範圍(例如，列舉範圍之+/-5-10%)，熟習此項技術者將認為等於所列舉之值(例如，具有相同之功能或結果)。當術語(諸如至少及約)在數值或範圍列表之前時，該等術語修飾該列表中提供之所有值或範圍。在一些實例中，該術語(約)可包括經取整為最近有效數之數值。 「大體上」意謂足以致力於預期目的。術語「大體上」因此容許來自絕對狀態或理想狀態、尺寸、量測、結果或類似物(諸如預期，但不明顯影響整體性能)之微小、微不足道之變化。當參考數值或可表示為數值之參數或特徵使用時，「大體上」意謂在百分之十內。 術語「微小物體」通常係指可根據本發明分離及/或操作之任何微觀物體。微小物體之非限制性實例包括：無生命之微小物體，諸如微粒；微珠(例如，聚苯乙烯珠，Luminex™珠或類似物)；磁珠；微桿；微絲；量子點及類似物；生物微小物體(諸如細胞)；生物細胞器；囊泡或複合體；合成囊泡；脂質體(例如，合成或衍生自膜製劑)；脂質奈米筏及類似物；或無生命微小物體及生物微小物體之組合(例如，結合至細胞之微珠；塗佈脂質體之微珠；塗佈脂質體之磁珠；或類似物)。珠可包括共價或非共價結合之部分/分子，諸如螢光標記、蛋白質、醣、抗原、小分子傳訊部分或可用於分析中之其他化學/生物種類。脂質奈米筏已描述(例如)於Ritchie等人，(2009) 「Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs,」 Methods Enzymol., 464:211-231中。 「細胞」可與術語「生物細胞」交換使用。生物細胞之非限制性實例包括真核細胞、植物細胞、動物細胞(諸如哺乳動物細胞、爬蟲動物細胞、禽類細胞、魚類細胞或類似物)、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、原生動物細胞或類似物、分離自組織(諸如肌肉、軟骨、脂肪、皮膚、肝、肺、神經組織及類似物)之細胞、免疫細胞(諸如T細胞、B細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞及類似物)、胚胎細胞(例如，合子)、卵母細胞、卵細胞、精細胞、融合瘤、培養細胞、來自細胞系之細胞、癌細胞、受感染細胞、轉染細胞及/或轉形細胞、報導細胞及類似物。哺乳動物細胞可(例如)來自人類、小鼠、大鼠、馬、山羊、綿羊、奶牛、靈長類動物或類似物。 若可複製群體中之所有活細胞係衍生自單一親代細胞之子細胞，則生物細胞之群體係「純系的」。在某些實施例中，純系群體中之所有該等子細胞係藉由不超過10次分裂衍生自單一親代細胞。在其他實施例中，純系群體中之所有該等子細胞係藉由不超過14次分裂衍生自單一親代細胞。在其他實施例中，純系群體中之所有該等子細胞係藉由不超過17次分裂衍生自單一親代細胞。在其他實施例中，純系群體中之所有該等子細胞係藉由不超過20次分裂衍生自單一親代細胞。術語「純系細胞」係指具有相同純系群體之細胞。 生物細胞之「群體」係指2個或更多個細胞(例如，約2至約20、約4至約40、約6至約60、約8至約80、約10至約100、約20約200、約40約400、約60約600、約80約800、約100約1000或大於1000個細胞)。 術語「維持(一個)細胞(多個細胞)」係指提供包含流體及氣體組分兩者及視需要表面之環境，其提供保持細胞存活率及/或擴增所需之條件。 流體介質之「組分」係存在於該介質中之任何化學或生化分子，其包括溶劑分子、離子、小分子、抗生素、核苷酸及核苷、核酸、胺基酸、肽、蛋白質、抗體、糖、醣、脂質、脂肪酸、膽固醇、代謝物或類似物。 當涉及流體介質使用時，「擴散」及「擴散作用」係指流體介質之組分沿濃度梯度下降之熱力學移動。 片語「介質之流動」意謂流體介質主要因除擴散作用外之其他機制而引起之批量移動。例如，介質之流動可涉及該流體介質因點間之壓力差而自一點移動至另一點。此流動可包括液體之連續、脈衝、週期性、隨機、間歇性或往復流動或其任何組合。當一種流體介質流入另一流體介質內時，該等介質之湍流及混合可產生。 片語「大體上無流動」係指流體介質經時平均之流動速率係小於材料(例如，受關注之分析物)之組分擴散擴散於流體介質內之速率。此材料之組分之擴散速率可取決於(例如)溫度、組分之大小及組分與流體介質間相互作用之強度。 涉及流體裝置(特定言之，微流控或奈流控裝置)使用時，「流體連接」意謂當裝置之不同區域大體上經流體(諸如流體介質)填充時，各區域中之流體係經連接以便於形成單一流體。此非意謂不同區域中之流體(或流體介質)在組成上必須相同。而是，流體裝置之不同流體連接區域中之流體可具有處於變化中之不同組成(例如，不同濃度之溶質(諸如蛋白質、醣、離子或其他分子))，因為溶質沿其等各自濃度梯度下降移動及/或流體流動通過該裝置。 [詳細說明] I. 綜述 本發明提供製備經工程化以表現促發炎多肽之腫瘤浸潤細胞(TIC)之方法。該促發炎多肽係自腫瘤浸潤細胞表現以逆轉由免疫效應細胞之數量及活化狀態相對於抑制細胞之數量及活化狀態間之失衡引起之腫瘤內及/或腫瘤周圍之一般免疫抑制狀態。經由來自TIC之表現遞送該促發炎多肽因明顯不同於全身投與而減少於遠離欲治療之腫瘤之部位因增加之發炎所致之副作用。該促發炎多肽可為促發炎趨化介素或細胞介素。此等多肽可於腫瘤內及/或周圍刺激免疫反應，並導致腫瘤浸潤細胞之繁殖。該促發炎多肽可為抗體，諸如檢核點抑制劑，例如，抗-PD-1或抗-CTLA-4。或者，該多肽可為以下之抗原：其刺激針對該抗原之免疫反應並藉此於腫瘤內及/或周圍產生更多促發炎環境。儘管無需為本發明之實務瞭解機制，但據信腫瘤浸潤細胞藉由經由刺激免疫系統之其他組分以殺死腫瘤細胞之細胞介素或趨化介素之釋放直接細胞毒性及/或間接對抗腫瘤。 II.    腫瘤之類型 腫瘤可為乳癌、泌尿生殖癌、神經系統癌、腸癌、肺癌、黑色素瘤或其他類型癌症。例示性乳癌係骨髓乳癌。泌尿生殖癌可為起源於泌尿道之癌症，諸如起源於腎(例如，腎細胞癌)、輸尿管、膀胱或尿道中。泌尿生殖癌可為男性生殖道之癌症(例如，睪丸癌、前列腺癌或精液囊泡、輸精管或陰莖之癌症)或女性生殖道之癌症(例如，卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、陰道癌或輸卵管之癌症)。神經系統癌可為神經胚細胞瘤或神經膠質母細胞瘤。腸癌可為結腸、直腸或胃癌。肺癌可為間皮瘤。 癌症通常由特定標記物表徵。此等標記物中之一或更多者可用於在腫瘤浸潤細胞之分離期間選擇癌細胞。 就乳癌而言，CD44、HLA-DR、Ki-67 (或MK167)、醛脫氫酶1 (ALDH1)及神經節苷脂GD2趨於存在於癌細胞中及/或於癌細胞中增多，而雌激素受體(ER)、黃體酮受體(PR)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)及CD24趨於不存在於癌細胞中或於癌細胞中減少；ER-/PR-/HER2-/HLA-DR+可用以識別骨髓乳癌細胞；及CD44hi/CD24lo/ALDH1hi或CD44hi/CD24lo/GD2hi可用以識別乳癌幹細胞。 就腎癌而言，C-反應蛋白、水孔蛋白-1 (AQP1)、親脂素(ADFP)、胰島素樣生長因子II mRNA結合蛋白3 (IGF2BP3或IMP3)、B7-H1 (或PD-L1)及Ki-67 (MK167)趨於存在於癌細胞中及/或於癌細胞中增加。 就膀胱癌而言，核有絲分裂器蛋白(NMP22)、膀胱腫瘤抗原(BTA)及血纖維蛋白/血纖維蛋白原降解產物趨於存在於癌細胞中及/或於癌細胞中增加，而脂肪細胞脂肪酸結合蛋白(A-FABP)、麩胱甘肽S-轉移酶mu (GST-　)、前列腺素脫氫酶(PGDH)及角蛋白13趨於不存在於正常細胞中或相對於正常細胞減少；在基因水平下，膀胱癌細胞中之p16腫瘤抑制基因或9p21基因座可經刪除。 就尿路上皮癌而言，補體因子H相關蛋白質(CFHrp)可於癌細胞中顯示增加之濃度及/或分泌；在細胞核水平下，端粒酶逆轉錄酶(TERT)趨於在癌細胞中顯示增加之mRNA表現。 就子宮內膜癌而言，癌症抗原15-3 (CA15-3)、癌症抗原125 (CA125)、癌症抗原19.9 (CA19.9)、癌症抗原72.4 (CA72.4)及癌胚抗原(CEA)趨於存在於癌細胞中及/或於癌細胞中增加。 就卵巢癌而言，腫瘤相關胰蛋白抑制劑(TATI)、癌症抗原125 (CA125)、密連蛋白5、人類附睪蛋白4 (HE4)、癌胚抗原(CEA)、VCAM-1及miR-181a傾向存在於癌細胞中及/或於癌細胞中增加；TATI、CA125及密連蛋白5已被組合用於診斷卵巢癌，如HE4及CA125，視需要結合CEA及VCAM-1；STAT1可用以區分回應於化學治療之卵巢癌與不回應於化學治療之卵巢癌。 就宮頸癌而言，人類乳突狀瘤病毒(HPV) (例如，類型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、6、11、42、43及44)、p16INK4a及胰島素樣生長因子II mRNA結合蛋白3 (IGF2BP3或IMP3)趨於存在於癌細胞中及/或於癌細胞中增加。 就前列腺癌而言，前列腺特異性抗原(PSA)、肌胺酸(代謝物)、前列腺癌基因3 (PCA3)及TMPRSS2:ERG融合產物趨於存在於癌細胞中及/或於癌細胞中增加，而前列腺酸磷酸酶、血纖維蛋白原α鏈前驅物、膠原蛋白α-1 (III)、膠原蛋白α-1 (I)、牛皮癬敏感性1候選基因2蛋白質、肝細胞癌相關蛋白TB6、組織蛋白H2BB、骨橋蛋白、聚合物Ig受體、Na/K-運輸ATP酶 γ、跨膜分泌組分及精液凝固蛋白1趨於不存在於正常細胞中或相對於正常細胞減少。 就神經胚細胞瘤而言，香草扁桃酸(VMA)、高香草酸(HVA)及鐵蛋白之增加之濃度及/或分泌係與癌細胞，及神經元特異性烯醇化酶(NSE)、乳酸鹽脫氫酶(LDH)相關聯，及神經節苷脂GD2趨於存在於癌細胞中及/或於癌細胞中增加；在基因水平下，染色體1p及11q部分中之刪除及17q之一部分之複製係與癌細胞相關聯。 就結腸直腸癌而言，癌胚抗原(CEA)、癌症抗原19-9 (CA19-9)、結腸癌特異性抗原3 (CCSA-3)、結腸癌特異性抗原4 (CCSA-4)及B-Raf突變V600E趨於存在於癌細胞中及/或於癌細胞中增加；在基因水平下，結腸直腸癌細胞顯示微衛星不穩定性及各種K-Ras突變。 就小細胞肺癌而言，神經節苷脂GD2趨於存在於癌細胞中及/或於癌細胞中增加；就非小細胞肺癌而言，B-Raf突變V600E趨於存在於癌細胞中；就間皮瘤而言，鈣視網膜蛋白、細胞角蛋白5/6及WT1趨於存在於癌細胞中及/或於癌細胞中增加，而癌胚抗原(CEA)、上皮細胞黏附分子(Ep-CAM)(例如，如由MOC-31或Ber-EP4抗體偵測)、Lewis Y血型(例如，如由BG-8抗體偵測)及由B72.3抗體偵測之腫瘤相關醣蛋白趨於不存在或減少；及相反地，就肺腺癌而言，CEA、Ep-CAM (例如，如由MOC-31或Ber-EP4抗體偵測)、Lewis Y血型(例如，如由BG-8抗體偵測)及由B72.3抗體偵測之腫瘤相關醣蛋白趨於存在於癌細胞中及/或於癌細胞中增加，而鈣視網膜蛋白、細胞角蛋白5/6及WT1趨於不存在或減少。 就黑色素瘤而言，人類內源性逆轉錄病毒(HERV-K)、神經節苷脂GD2、B-Raf突變V600E、Hsp90、G-蛋白傳訊調節子1(RGS1)、骨橋蛋白、人類表皮生長因子受體3 (HER3)、細胞核受體共活化子3 (NCOA3)及微型染色體維持複合體組分4及6 (分別為MCM4及MCM6)趨於存在於癌細胞中及/或於癌細胞中增加，而抑制劑或生長蛋白3及4 (分別為ING3及ING4)趨於不存在於正常細胞中或相對於正常細胞減少。 III.   腫瘤浸潤細胞 腫瘤浸潤細胞(TIC)係免疫系統之非癌細胞，其等可靶向至少一種類型的腫瘤(例如，本文描述之腫瘤)。在一些實施例中，該等TIC係分離自腫瘤(例如，本文描述之腫瘤)或係產生自原發性腫瘤細胞增殖之子代，其等大體上保留腫瘤靶向能力。在其他實施例中，該等TIC係分離自除腫瘤外之組織源(例如，外周血液，特定言之PBMC，或淋巴組織，特定言之骨髓或外周淋巴結)或係產生自分離自此等非腫瘤組織之原發性細胞之增殖之子代。無關分離出TIC之組織，其等具有靶向至少一種類型之腫瘤之能力。本發明之腫瘤浸潤細胞包括已經基因工程化以表現促發炎多肽之子代細胞。該等經基因工程化之TIC可具有增強之活性，諸如增強之腫瘤靶向及/或增強之效應功能。另外，該等經基因工程化之TIC可大體上保留該等TIC所衍生自之形態及/或基因標記物。就腫瘤浸潤淋巴細胞而言，腫瘤浸潤細胞在科學文獻中通常被稱為TIL。然而，非所有腫瘤浸潤細胞係所需淋巴細胞。因此，本文使用術語TIC更通常係指任何腫瘤浸潤免疫細胞。 TIC可為先天或適應免疫系統之一部分。TIC包括白血球(例如，嗜中性細胞、嗜酸性細胞、嗜鹼性細胞、淋巴細胞、單核細胞及巨噬細胞)及樹枝狀細胞。淋巴細胞包括T細胞、T記憶幹細胞(TSCM)、T效應記憶細胞(TEMC)、T細胞、B細胞、血漿細胞及自然殺手(NK)細胞。該等TIC可為一或更多種類型之輔助性T細胞，諸如Th1細胞、CD3+/CD4+/T-bet+細胞、Th2細胞、CD3+/CD4+/GATA-3+細胞、Treg細胞、CD3+/CD4+/CD25+/Foxp3+細胞、Th17細胞、CD3+/CD4+/ROR-γT+細胞或細胞毒性T細胞(例如，CD3+/CD8+ T細胞)。或者，該等TIC可為B細胞(例如，血漿B細胞、記憶B細胞、調節性B細胞、CD5+CD1d+細胞及CD24+CD38+細胞)或巨噬細胞。 最重要TIC中之一些具有針對腫瘤細胞之直接細胞毒性活性，其等包括細胞毒性淋巴細胞、自然殺手細胞及淋巴激素活化之殺手細胞。 細胞毒性T淋巴細胞(CTL)係通常具有CD3+、CD8+、CD4-表現型。其等通常溶解顯示與其等細胞表面上之類別I MHC分子相關聯之外來抗原之片段之細胞。CTL通常識別在經病毒或其他病原體感染後表現抗原之正常細胞；及已經轉形並表現突變蛋白或係過表現正常蛋白之腫瘤細胞。細胞毒性淋巴細胞已知通過顆粒酶(其係於天門冬胺酸殘基處裂解之絲胺酸蛋白酶)及穿孔蛋白(其於腫瘤細胞之血漿膜中形成孔)之作用調節腫瘤細胞之抗原特異性細胞溶解。非意欲受理論束縛，據信穿孔蛋白嵌入靶細胞之血漿膜內並形成容許顆粒酶進入靶細胞內之孔，因此該等顆粒酶藉由活化半胱天冬酶(capsase)促進細胞之細胞凋亡。 自然殺手細胞係免疫系統中有效且表現人類外周血液中單細胞核細胞之平均15%之淋巴細胞之子類。用以識別人類NK細胞之表面標記物係以低親和力結合至IgG抗體(諸如Fc-γ受體III或CD16抗原)之Fc片段之受體。NK細胞已經證實活體內於防禦腫瘤、腫瘤轉移及病毒感染中發揮重要作用，及調節正常及惡性造血作用。 淋巴激素活化之殺手(LAK)細胞係細胞之細胞毒性群，其等在細胞介素(例如，IL2)之存在下可溶解抗NK-細胞之腫瘤細胞系。 在一些方法中，TIC係獲得自單一病患中之單一腫瘤。在其他方法中，TIC係獲得自多個腫瘤。在此等方法中，該等腫瘤可來自相同器官(例如，所有乳癌)或相同細胞類型(所有癌)或相同器官及細胞類型兩者。在其中腫瘤浸潤細胞係獲得自多個腫瘤之一些方法中，該等腫瘤係來自相同病患，及在其他方法中，該等腫瘤係來自多個病患。若該等腫瘤浸潤細胞係獲得自多個病患，則當將該等細胞引入病患中時，該等病患係較佳經免疫匹配(例如，經HLA匹配)以避免或至少減少相容性問題。 腫瘤樣本可藉由獲得至少一個實體腫瘤樣本及分離至少一個單一細胞而經主動分離或藉由獲得先前已經分離或以分離形式生長之樣本而經被動分離。該分離可以許多方式進行。例如，腫瘤樣本可使用膠原酶加DNA水解酶(DNase)消化分離。腫瘤樣本亦可使用細胞分離儀器分離，諸如來自Miltenyi Biotec之gentleMACS™儀器。 在一些方法中，TIC係獲得自來自單一病患之非腫瘤組織之單一樣本。該非腫瘤組織樣本可包含外周血液(例如，PBMC)或淋巴組織(例如，骨髓或一或更多個外周淋巴結)。在其他方法中，TIC係獲得自多個非腫瘤組織樣本。在其中腫瘤浸潤細胞係獲得自多個非腫瘤組織樣本之一些方法中，該等樣本係來自相同病患，及在其他方法中，該等樣本係來自多個病患。若該等腫瘤浸潤細胞係獲得自多個樣本，則當將該等細胞引入病患中時，該等病患係較佳經免疫匹配(例如，經HLA匹配)以避免或至少減少相容性問題。 非腫瘤組織樣本(諸如外周血液或淋巴組織)可藉由獲得至少一個此樣本(例如，特定言之PBMC、骨髓或外周淋巴結)並分離至少一個單一細胞而經主動分離或藉由獲得先前已經分離或以分離形式生長之樣本而經被動分離。該分離可以許多方式進行。例如，該非腫瘤組織樣本可使用膠原酶加DNA水解酶消化分離。該非腫瘤組織樣本亦可使用組織處理儀器分離，諸如COBE光譜採集系統(例如，用於外周血液或骨髓)。 在一些方法中，病患係在收集腫瘤樣本以收穫TIC前經來自存在於該病患中之腫瘤之抗原免疫。此免疫可增加具有腫瘤靶向能力之TIC於腫瘤中之呈現。 IV.   選擇及擴增腫瘤浸潤細胞 腫瘤浸潤細胞可藉由數種技術(包括親和力分離、FACS、MAC、微流控及其組合)與經分離之腫瘤(或血液或淋巴組織)中之其他細胞分離。分離可導致不同純系起源及/或不同細胞類型之腫瘤浸潤細胞之混合群，或可分離個別細胞。腫瘤浸潤細胞可藉由選擇腫瘤浸潤細胞上之標記物或針對其他細胞上標記物進行選擇而與腫瘤(或血液或淋巴組織)中之其他細胞分離。腫瘤浸潤細胞之選擇可在將細胞裝載於微流控(或奈流控)裝置內前，在基因工程化該等細胞後進行，而該等細胞係於微流控(或奈流控)裝置中，或在兩個或更多個此時刻期間。用於分選及/或分離T細胞或B細胞之技術之指導意見係揭示於下列參考文獻中：Thiel等人，Clin. Immunol, 111(2): 155-161 (2004)；Newman等人，J. Immunol. Meth., 272: 177-187 (2003): Hoven等人，J. Immunol. Meth., 117(2): 275-284 (1989)；美國專利案5,213,960及5,326,696；Moody等人，Cytometry A, 73A: 1086-1092 (2008)；Gratama等人，Cytometry A, 58A: 79-86 (2004)；Davis等人，Nature Reviews Immunology, 11 : 551-558 (2011)；美國專利案8,053,235及8,309,312；Lee等人，Nature Medicine, 5(6): 677-685 (1999)；Altman等人，Science, 274: 94-96 (1996)；Leisner等人，PLosOne 3(2): el678 (2008)」；Pro5 MHC Pentamer Handbook」，(Prolmmune, Ltd., United Kingdom, 2012)。 供選擇之T細胞標記物包括CD4、CD8、CD25、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD69及CD3中之任何一者。NK細胞標記物包括CD56。B細胞標記物包括CD19、CD20、IgM、IgD、CD38、CD27、CD138、PNA及GL7。腫瘤細胞可針對一或更多個腫瘤特異性抗原(例如，上文指示之一或更多種腫瘤特異性抗原)選擇。 A.     將TIC裝載微流控裝置內中並使其在微流控裝置內移動 微流控(或奈流控)裝置可用以自該(等)經分離腫瘤樣本(或血液或淋巴組織)分離個別細胞並藉由其等與所需靶(例如，來自靶腫瘤(諸如分離出TIC之腫瘤)之癌細胞，或來自此等癌細胞之一或更多種免疫原性抗原)之結合表徵該等細胞。具有最所需性質之TIC可然後經活體外擴增。 經分離細胞樣本(視需要如上文討論經分級分離)可藉由使樣本之細胞流動通過裝置中之入口並使得該等細胞流動進入流動區內而裝載於微流控(或奈流控)裝置內。在一些實施例中，該流動區包括流動通道及裝載該經分離細胞樣本包括使該等細胞流動進入該流動通道內。 一旦將經分離細胞樣本裝載於微流控(或奈流控)裝置之流動區(或流動通道)內，則樣本中之腫瘤浸潤細胞可移動進入該裝置之隔離區內。例如，腫瘤浸潤細胞可自流動區(或流動通道)移動至一或更多個隔離區內，隔離區可位於與區(或流動通道)流體連接並開放之隔離室內。腫瘤浸潤細胞之移動可藉由各種方式完成，包括使用重力(諸如藉由傾斜微流控裝置)，其包括定位流體流動(諸如藉由壓或拉相鄰或接近隔離區放置之微流控裝置之可變形表面)、應用介電泳(DEP)力(諸如藉由光電鑷子(OET)形成之DEP力)或其任何組合。 在將經分離細胞樣本裝載於微流控(或奈流控裝置)中前，該經分離細胞樣本中之腫瘤浸潤細胞可用至少一種可偵測標記物(諸如上文揭示之標記物中之任何一者)標記。該標記物可有助於選擇TIC以自裝置之流動區(或流動通道)選擇性移動(例如，使用DEP力)至其隔離室或隔離區。 在一些實例中，無論是否裝載所有隔離區，僅一個腫瘤浸潤細胞移動至各隔離區內。在其他實例中，該等腫瘤浸潤細胞可經最初匯集至一或更多個隔離區內，及接著分離至個別隔離區(即，每個隔離區內一個腫瘤浸潤細胞)內。後者實務在針對所需抗原/靶結合篩選腫瘤浸潤細胞時容許更大通量。 B.     將癌細胞、癌細胞衍生之抗原或其他微顆粒裝載於微流控/奈流控裝置內 癌細胞可藉由使該等細胞或微顆粒流動通過裝置中之入口並流動進入流動區內而裝載於微流控(或奈流控)裝置內(例如，出於偵測TIC結合；偵測癌症抗原誘導之TIC增殖；及/或分析TIC依賴性癌細胞殺滅之目的)。TIC可在裝載癌細胞或微顆粒之前、之後或同時裝載於裝置上。因此，例如，當使用來自相同腫瘤之TIC及癌細胞之組合時，該等TIC及癌細胞可經裝載而無需使該等TIC及癌細胞彼此分級分離)。 在一些實施例中，將癌細胞裝載於微流控(或奈流控)裝置之流動區(或流動通道)內並維持在流動區(或流動通道)中直至自裝置輸出。在一些實施例中，該等癌細胞不進入隔離區中。在一些實施例中，除停駐於流動區(或流動通道)中外，該等癌細胞下沉至隔離室之連接區內。在此等實施例之任何一者中時，該等癌細胞可以至少約1 x 106 、5 x 106 、1 x 107 、2.5 x 107 、5 x 107 、7.5 x 107 或1 x 108 個細胞/ml之濃度裝載於流動區(或流動通道)內。 在其他實施例中，可將癌細胞移動至微流控(或奈流控)裝置中之至少一個隔離區內。與TIC一樣，癌細胞之移動可藉由各種方式完成，包括使用重力(諸如藉由傾斜裝置)，其包括定位流體流動(諸如藉由壓或拉相鄰或接近隔離區放置之裝置之可變形表面)、應用介電泳(DEP)力(諸如藉由光電鑷子(OET))或其任何組合。在一些實施例中，一或更多(例如，僅1、約2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多或自約1至20、1至10、1至5、1至3、1至2)個癌細胞可移動至微流控(或奈流控)裝置中之個別隔離區內，藉此獲得具有經分離之癌細胞或一組經分離之癌細胞之至少一個隔離區。因此，該等經分離之癌細胞可放置於相同隔離區中。或者，該等經分離之癌細胞/微顆粒及該等TIC可放置於不同隔離區中(諸如於相鄰隔離區中，相鄰隔離區可例如藉由容許蛋白質及其他巨分子或小分子擴散但防止TIC與癌細胞接觸之狹窄通路連接)。相鄰但連接之隔離區中具有癌細胞/微顆粒及TIC可為有利的，例如，當針對癌症抗原-結合劑(諸如抗體)之TIC依賴性產生進行分析，及/或針對此等抗原-結合劑對癌細胞之作用進行分析時。 不考慮癌細胞於微流控(或奈流控)裝置中之所需位置，該等癌細胞可在將該等癌細胞裝載於該裝置前用一或更多種可偵測標記物標記。若所需模式包括使至少一個癌細胞移動至至少一個隔離區中時，該(等)可偵測標記物可用以選擇至少一個癌細胞以供移動。或者或另外，可使用細胞大小、細胞形狀、細胞核大小或細胞核結構之形態評估以選擇至少一個癌細胞以供移動。癌細胞亦可藉由在缺乏細胞標記物之情況下，視需要組合形態評估進行選擇。 癌細胞可源自於獲得TIC之相同經分離細胞樣本或源自於另一源。該等癌細胞可於用於評估TIC功能(例如，癌細胞誘導之增殖，可結合至該等癌細胞之抗體之TIC產生，TIC誘導之癌細胞殺滅等)前經培養及/或選殖。培養及/或選殖該等癌細胞可於微流控(或奈流控)裝置內進行或在將該等癌細胞裝載於裝置內之前進行(例如，使用用於自腫瘤樣本選擇、培養及/或選殖癌細胞之習知技術)。無論，該等癌細胞可經選擇、培養及/或選殖至至少約1 x 106 、5 x 106 、1 x 107 、2.5 x 107 、5 x 107 、7.5 x 107 或1 x 108 個細胞/ml之濃度。 衍生自腫瘤之癌細胞之群可相對於組成該群之個別細胞之形態及基因特徵為相對異源的。例如，該群可含有癌症幹細胞(其等可緩慢分裂)及更多個分化癌細胞(其等可更快速分裂且可含有癌前突變之不同子類)。可使用癌細胞之基於標記物之選擇及/或選殖以提供細胞之更同源群。因此，可將複數個異源癌細胞裝載於微流控(或奈流控)裝置上。或者，個別癌細胞可在裝載於微流控(或奈流控)裝置上前經選擇及選殖。因此，可將癌細胞之大體上同源群裝載於裝置上並用以識別可結合至及/或以其他方式與該等癌細胞相互作用之TIC。大體上同源群可為衍生自提供該至少一個腫瘤樣本之病患之癌細胞系，或可為衍生自不同病患之癌細胞系。 作為癌細胞之替代物，具有癌細胞衍生之抗原或包括來自此等抗原之至少一個B細胞或T細胞抗原決定基之肽之微粒可用於本發明之方法中。該等癌細胞衍生之抗原可來自任何來源癌細胞，包括腫瘤衍生之癌細胞(無論是否來自治療中之病患或一些其他病患)或尤其既定癌細胞系。因此，有關癌細胞藉由使該等細胞或微顆粒流動通過裝置中之入口並流動進入流動區內而裝載於微流控(或奈流控)裝置內(例如，出於偵測TIC結合，偵測癌症抗原誘導之TIC增殖及/或分析TIC依賴性癌細胞殺滅之目的)之所有先前揭示內容係同樣適用於具有癌症衍生之抗原之微粒。 作為癌細胞之另一替代物，裝載癌細胞衍生之抗原或攜載來自此(等)抗原之至少一個B細胞或T細胞抗原決定基之肽之樹枝狀細胞(DC)可用於本發明之方法中。因此，有關癌細胞藉由使該等細胞或微顆粒流動通過裝置中之入口並流動進入流動區內而裝載於微流控(或奈流控)裝置內(例如，出於偵測TIC結合，偵測癌症抗原誘導之TIC增殖及/或分析TIC依賴性癌細胞殺滅之目的)之所有先前揭示內容係同樣適用於裝載經癌症細胞衍生之抗原之樹枝狀細胞。 C.     TIC之結合及處理之偵測 TIC (或分泌TIC之藥劑)與癌細胞之結合可以各種方式偵測。例如，可使用細胞凝聚(cell clumping)(諸如可出現於聚集類型分析中)以偵測TIC-癌細胞結合。或者，可使用TIC增殖以偵測腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)與靶癌細胞之細胞-細胞結合。就分泌TIC之抗體而言，二級抗體(諸如結合至標記(例如，螢光或發光標記)之抗-人類抗體)可經添加以標記具有結合至其等之一級抗體(即，分泌TIC之抗體)之癌細胞。如下文更詳細討論，微流控(或奈流控)裝置可包含容許信號(例如，TIC-癌細胞凝聚，TIC增殖或標記於癌細胞之表面處聚集)之可視化之成像裝置。例如，該成像裝置可週期性成像微流控裝置及可偵測此信號之任何經時增強。可獲得影像，例如，每幾秒鐘(例如，每5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60秒鐘或更長)或每幾分鐘(例如，每2、3、4、5、6、7、8、9、10分鐘或更長)。在一些實施例中，複數個影像可重疊於彼此之上，藉此產生「概述」影像，其具有在真實信號與背景信號之間平均出背景信號及產生更佳對比度之一般作用。信號之偵測可為手動進行的，諸如當人回顧影像時發生，或自動(例如，使用適當之影像分析軟體)進行。 一旦已偵測到癌細胞與腫瘤浸潤細胞間之結合，則腫瘤浸潤細胞可經識別及其等位置(例如，腫瘤浸潤細胞所處隔離區或隔離室)可被記下及/或記錄。視需要，一旦當已偵測到結合至癌細胞之腫瘤浸潤細胞，則流動區(或流動通道)可經排水。此排水可在結合至該等癌細胞之腫瘤浸潤細胞之識別之前或之後發生。不結合至該等癌細胞之腫瘤浸潤細胞可自微流控(或奈流控)裝置廢棄。 一般而言，偵測癌細胞與TIC之間之結合之相同或相似方法可在必要變更下用以偵測TIC與攜載癌症衍生之抗原之微粒或樹枝狀細胞之結合，及此等測試之結果同樣用以分選適用於後續步驟中之TIC。 作為可選步驟，可評估TIC結合至正常組織或細胞(即，非癌組織/細胞)之能力或與正常組織或細胞(即，非癌組織/細胞)相互作用之能力，及可廢棄顯示結合至正常組織之超過一個背景水平之TIC。該正常組織可為例如非癌細胞(來自提供TIC之病患或其他人)、結合至非癌細胞衍生之抗原之微顆粒或樹枝狀細胞(視需要裝載非癌細胞衍生之肽)。 識別為結合至癌細胞抗原之腫瘤浸潤細胞(無論經由癌細胞、結合至癌細胞衍生之抗原之微顆粒或裝載癌細胞衍生之抗原之樹枝狀細胞)可於微流控(或奈流控)裝置中培養及/或選殖。此培養可發生例如至少約12小時(例如，至少約18、24、30、36、42或48小時或至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天(例如，至少約12至48小時，或至少約2-3天、2-4天、2-5天、2-7天、2-10天、3-4天、3-5天、3-7天、3-10天、4-5天、4-7天、4-10天、5-7天或5-10天))及/或至以下細胞計數：至少2個細胞(例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或更多個細胞(例如，至少約2-8個細胞、2-10個細胞、2-12個細胞、2-15個細胞、2-12個細胞、4-8個細胞、4-10個細胞、4-12個細胞、4-15個細胞、4-20個細胞、5-8個細胞、5-10個細胞、5-12個細胞、5-15個細胞、5-20個細胞、8-10個細胞、8-12個細胞、8-15個細胞或8-20個細胞))。 在某些實施例中，識別為結合至癌細胞衍生之抗原之腫瘤浸潤細胞可自微流控(或奈流控)裝置輸出。例如，結合(例如，特異性結合)至癌細胞衍生之抗原之一或更多個腫瘤浸潤細胞可自裝置輸出以用於核酸定序(例如，轉錄組定序、基因體定序及/或特定基因或標記物(諸如T細胞受體(TCR)之定序)。就於晶片上或引入微流控裝置內之前經基因改變之腫瘤浸潤細胞而言，此核酸定序可證實核酸構築體之適當靶向及/或脫靶基因改變之缺乏。另外，結合(例如，特異性結合)至癌細胞抗原(及視需要，經成功工程化以提供促發炎蛋白之增加之表現)之腫瘤浸潤細胞可自微流控裝置輸出以準備引入病患體內之細胞。或者，結合(例如，特異性結合)至癌細胞抗原之腫瘤浸潤細胞可經輸出以用於晶片外基因操作。在一些實例中，各TIC或經選殖之TIC之群(或其溶離份)係經個別(例如，連續)輸出。 V.     微流控及奈流控裝置 A. 微流控及奈流控裝置術語 「微流控裝置」係包括一或更多個經組態以容納流體之離散微流控環路之裝置，各環路由流體互通之環路元件組成，該等環路元件包括(但不限於)區、通道、室及/或圍欄及至少兩個經組態以容許流體(及視需要，懸浮於流體中之微小物體)流入及/或流出微流控裝置之出入口。通常，微流控裝置中之微流控環路容納小於約1 mL，例如，小於約750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2 uL之流體之體積。在某些實施例中，該微流控環路容納約1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300 uL。 「奈流控裝置」係具有微流控環路之微流控裝置之一種類型，微流控環路包含至少一個經組態以容納小於約1 mL，例如小於約750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1 nL或更小之流體體積之環路元件。通常，奈流控裝置將包含複數個環路元件(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多個)。在某些實施例中，該等至少一個環路元件中一或更多個(例如所有)係經組態以容納約100 pL至1 nL、100 pL至2 nL、100 pL至5 nL、250 pL至2 nL、250 pL至5 nL、250 pL至10 nL、500 pL至5 nL、500 pL至10 nL、500 pL至15 nL、750 pL至10 nL、750 pL至15 nL、750 pL至20 nL、1至10 nL、1至15 nL、1至20 nL、1至25 nL或1至50 nL之流體體積。在其他實施例中，該等至少一個環路元件中之一或更多個(例如所有)係經組態以容納約100至200 nL、100至300 nL、100至400 nL、100至500 nL、200至300 nL、200至400 nL、200至500 nL、200至600 nL、200至700 nL、250至400 nL、250至500 nL、250至600 nL或250至750 nL之流體體積。 微流控(或奈流控)裝置可包含「掃及(swept)」區及「非掃及(unswept)」區。掃及區係由微流控環路之一或更多個流體互連環路元件組成，各環路元件在流體流動通過該微流控環路時經驗流體通量。掃及區之環路元件可包括例如區、通道及室。相比之下，非掃及區係由微流控環路之一或更多個流體互連環路元件組成，各環路元件在流體流動通過該微流控環路時大體上不經驗流體通量。非掃及區可以流體連接至掃及區，但是該等流體連接經結構化以可進行擴散但掃及區與非掃及區之間大體上無介質流動。微流控裝置可因此結構化以大體上分離非掃及區與掃及區之介質流，而使得掃及區與非掃及區之間大體上僅擴散流體連通。 生物微小物體(例如，生物細胞)產生特定生物材料(例如，蛋白質、代謝物、分泌物等)之能力可於此微流控(或奈流控)裝置中進行分析。例如，可將包含用於產生受關注之分析物(諸如細胞介素、抗體或其他分泌物)之欲分析生物微小物體(諸如T細胞、B細胞或NK細胞)之樣本材料裝載於該微流控裝置之掃及區內。可然後阻止流體流動通過掃及區，及掃及區中之該等生物微小物體之流體可配置於非掃及區中。取決於進行中之分析，被配置於非掃及區中之生物微小物體可隨機選擇或基於特定特徵進行選擇。殘餘之樣本材料可然後流出掃及區及分析材料流入掃及區內。因所選生物微小物體係在非掃及區中，所以所選生物微小物體係大體上不受殘餘樣本材料流出或分析材料流入之影響(即，其等仍隱藏於非掃及區中)。所選生物微小物體可容許產生受關注之分析物，其(若經分泌)可自非掃及區擴散至掃及區內，其中該受關注之分析物可與分析材料反應以產生局部可偵測反應，其等中之各者可與特定非掃及區相關聯。與經偵測之反應相關聯之任何非掃及區可經分析以判定非掃及區中之生物微小物體中之哪一者(如果有的話)係受關注之分析物之充足產生者。若該受關注之分析物緩慢擴散或仍結合至生物微小物體，則該分析可經修改以包括將分析材料配置於非掃及區中及/或藉由使用擴散至非掃及區內之分析材料。 B.     包括微流控裝置之系統 圖1A-1C繪示具有微流控裝置100之系統之實例，其可用於本文描述之方法中。如顯示，該微流控裝置100封閉包含複數個互連流體環路元件之微流控環路132。在圖1A-1C中繪示之實例中，該微流控環路132包括流動通道134，其與隔離室136、138、140流體連接。儘管繪示之實施例中顯示一個流動通道134及三個隔離室136、138、140，但應瞭解在替換實施例中可能分別有多於一個流動通道134，及多於或少於三個隔離室136、138、140。該微流控環路132亦可包括額外或不同之流體環路元件諸如流體室、貯槽及類似物。 微流控裝置100包含封閉該微流控環路132之外殼102，微流控環路132可含有一或更多種流體介質。儘管該裝置100可以不同方式物理結構化，在圖1A-1C中顯示之實施例中，外殼102包括支撐結構104 (例如，基座)、微流控環路結構112及蓋子122。該支撐結構104、微流控環路結構112及該蓋子122可彼此附接。例如，該微流控環路結構112可配置於該支撐結構104上，及該蓋子122可配置於該微流控環路結構112上。憑藉支撐結構104及蓋子122，該微流控環路結構112可界定該微流控環路132。該微流控環路132之內表面在圖中標識為106。 如圖1A及1B中繪示，支撐結構104可位於底部及蓋子122可位於裝置100之頂部。或者，該支撐結構104及蓋子122可位於其他方向上。例如，該支撐結構104可位於頂部及該蓋子122位於該裝置100之底部。無關組態，提供一或更多個流體出入(即，入口及出口)口124；各流體出入口124包含與微流控環路132連通之通路126，其等容許流體材料流入或流出外殼102。流體通路126可包括閥、門、通過孔或類似物。儘管繪示之實施例中顯示兩個流體出入口124，應瞭解裝置100之替代實施例可具有僅一個或超過兩個提供流體材料流入或流出微流控環路132之入口及出口之流體出入口124。 微流控環路結構112可界定或以其他方式容納微流控環路132之環路元件或位於外殼102內之環路之其他類型。在圖1A-1C中繪示之實施例中，該微流控環路結構112包含框架114及微流控環路材料116。 支撐結構104可包含基板或複數個互連基板。例如，該支撐結構104可包含一或更多個互連半導體基板、印刷電路板(PCB)或類似物及其組合(例如，安裝於PCB上之半導體基板)。框架114可部分或完全封閉微流控環路材料116。該框架114可為例如大體上圍繞微流控環路材料116之相對剛性結構。例如，該框架114可包含金屬材料。 微流控環路材料116可形成腔或類似物之圖案以界定微流控環路132之微流控環路元件及互連。微流控環路材料116可包含氣體可滲透之可撓性材料(例如，橡膠、塑膠、彈性體、矽酮、聚二甲基矽氧烷(「PDMS」)或類似物)。可組成微流控環路材料116之材料之其他實例包括模製玻璃、可蝕刻材料諸如矽(例如，可光圖案化矽)、光致抗蝕劑(例如，SU8)或類似物。在一些實施例中，此等材料—及因此微流控環路材料116—可為剛性的及/或大體上無法滲透氣體。無關所用之材料，將微流控環路材料116配置於支撐結構104上，於框架114內。 蓋子122可為框架114及/或微流控環路材料116之組成部分。或者，該蓋子122可為結構不同之元件(如圖1A及1B中繪示)。該蓋子122可包含與框架114及/或微流控環路材料116相同或不同之材料。同樣地，該支撐結構104可為與如繪示之框架114或微流控環路材料116分離之結構或框架114或微流控環路材料116之組成部分。同樣地，框架114及微流控環路材料116可為如圖1A-1C中顯示之分離結構或相同結構之組成部分。在一些實施例中，蓋子或蓋122係由剛性材料製成。該等剛性材料可為玻璃或類似物。在一些實施例中，該剛性材料可導電(例如，塗佈ITO之玻璃)及/或經修飾以支持細胞黏附、存活率及/或生長。該修飾可包括塗佈合成或天然聚合物。在一些實施例中，放置於圖1A-1C之各自隔離室136、138、140上之蓋子或蓋122之一部分或圖2、3及4中繪示之下文討論之實施例中之等效物係由可變形材料(包括(但不限於)PDMS)製成。因此蓋子或蓋122可為具有剛性及可變形部分兩者之複合結構。在一些實施例中，蓋子122及/或支撐結構104可透光。 蓋子122亦可包括至少一種氣體可滲透之材料，其包括(但不限於)PDMS。 C.     其他系統組件 圖1A亦繪示可結合微流控裝置100使用之控制/監測系統170之簡化方框圖，微流控裝置100及控制/監測系統170一起提供用於識別產生結合至癌細胞之抗體之B細胞之系統。如顯示(圖示)，該控制/監測系統170包括控制模組172及控制/監測設備180。該控制模組172可經組態以直接及/或通過控制/監測設備180控制及監測裝置100。 控制模組172包括控制器174及記憶體176。該控制器174可為例如數位處理器、電腦或類似物，及記憶體176可為例如用於儲存資料之非暫態數位記憶體及機器可執行指令(例如，軟體、固件、微碼或類似物)，如非暫態資料或信號。該控制器174可經組態以根據儲存於記憶體176中之此等機器可執行指令操作。或者或另外，該控制器174可包含固線式數位電路及/或類比電路。該控制模組172可因此經組態以進行(自動或者基於用戶導向輸入)適用於本文描述之方法中之任何過程、此過程之步驟、功能、行為或本文討論之類似物。 控制/監測設備180可包含用於控制或監測微流控裝置100之許多不同類型裝置中之任何一者及用微流控裝置100進行之過程。例如，該控制/監測設備180可包括用於向微流控裝置100提供電力之電源(未顯示)；用於向微流控裝置100提供流體介質或自微流控裝置100移除介質之流體介質源(未顯示)；動力模組，諸如，舉例而言，用於控制選擇及移動微流控環路132中微小物體(未顯示)之選擇器控制模組(下文描述)；影像捕獲機制，諸如，舉例而言，用於捕獲微流控環路132內部之影像(例如，微小物體之影像)之偵測器(下文描述)；刺激機制，諸如，舉例而言，圖1D中繪示之實施例之光源320，其用於將能量引入微流控環路132內以刺激反應；及類似物。 更特定言之，影像捕獲偵測器可包括一或更多個用於偵測流動區中之事件之影像捕獲裝置及/或機制，流動區包括(但不限於)圖1A-1C、2及3中顯示之實施例之流動通道134、圖4A-4C中顯示之實施例之流動通道434及圖1D-1E中顯示之實施例之流動區240及/或經分別繪示之微流控裝置100、300及400之隔離室，其等包括含於佔據各自流動區及/或隔離室之流體介質中之微小物體。例如，該偵測器可包含可偵測流體介質中微小物體(未顯示)之一或更多個輻射特徵(例如，由於螢光或發光所致)之光偵測器。此偵測器可經組態以偵測例如介質中之一或更多個微小物體(未顯示)係輻射電磁輻射物及/或近似波長、亮度、強度或該輻射物之類似物。該偵測器在光之可見光、紅外光或紫外光波長下可捕獲影像。合適之光偵測器之實例包括(但不限於)限制光電倍增管偵測器及雪崩光偵測器。 可包含偵測器之合適之成像裝置包括數位相機或光感測器，諸如電荷耦合裝置及互補金屬氧化物半導體(CMOS)成像器。影像可用此等裝置捕獲及分析(例如，藉由控制模組172及/或人類操作員)。 流動控制器可經組態以控制流體介質在經分別繪示之微流控裝置100、300及400之流動區/掃及區/通道中之流動。例如，該流動控制器可控制流動之方向及/或速度。流動控制器之此等流動控制元件之實例包括一或更多個泵或流體引動器。在一些實施例中，該流動控制器可包括額外元件，諸如用於感測例如流動區/掃及區/通道中之介質之流動速度及/或pH之一或更多個感測器。 控制模組172可經組態以接受來自選擇器控制模組、偵測器及/或流動控制器之信號並控制該選擇器控制模組、偵測器及/或流動控制器。 參考(特定言之)圖1D中顯示之實施例，光源320可將用於光照及/或螢光刺激之光引入微流控環路132內。或者或另外，該光源可將能量引入微流控環路132內以刺激反應，其等包括提供DEP組態微流控裝置選擇及移動微小物體所需之活化能。該光源可為可將光能投射至微流控環路132內之任何合適光源，諸如高壓汞燈、氙弧燈、二極體、雷射或類似物。該二極體可為LED。在一個實例中，LED可為寬譜「白」光LED (例如，Prizmatix之UHP-T-LED-White)。該光源可包括投影儀或用於產生結構化光之其他裝置，諸如數位微鏡裝置(DMD)、MSA (微陣列系統)或雷射)。 D.     用於選擇及移動包括生物細胞之微小物體之動力模組 如上文描述，控制/監測設備180可包含用於在微流控電路132中選擇及移動微小物體(未顯示)之動力模組。可利用各種動力機制。例如，可利用介電泳(DEP)機制以在微流控環路中選擇及移動微小物體(未顯示)。圖1A-1C之微流控裝置100之支撐結構104及/或蓋子122可包含DEP組態以在微流控環路132中對流體介質(未顯示)之微小物體(未顯示)選擇性誘導DEP力及藉此選擇、捕獲及/或移動個別微小物體。該控制/監測設備180可包括用於此等DEP組態之一或更多個控制模組。微小物體(包括元件)可於微流控環路內隨意移動或使用重力、磁力、流體流動及/或類似物自微流控環路輸出。 具有包含支撐結構104及蓋子122之DEP組態之微流控裝置之一個實例係圖1D及1E 中繪示之微流控裝置300。然而出於簡化之目的，圖1D及1E顯示微流控裝置300之流動區240之一部分之側面橫剖面圖及頂部橫剖面圖，應瞭解該微流控裝置300亦可包括一或更多個隔離室及一或更多個額外之流動區/通道，諸如彼等本文參考微流控裝置100及400描述者，及DEP組態可併入該微流控裝置300之此等區域之任何一者中。應進一步知曉上文或下文所述之微流控系統組件中之任何一者可併入微流控裝置300中及/或與微流控裝置300組合使用。例如，包括上文描述之控制/監測設備180與圖1A-1C之微流控裝置100之組合之控制模組172亦可與微流控裝置300一起使用，該微流控裝置300包括影像捕獲偵測器、流動控制器及選擇器控制模組中之一或更多個。 如圖1D中所見，微流控裝置300包括第一電極304、遠離第一電極304放置之第二電極310及覆蓋電極310之電極活化基板308。各自第一電極304及電極活化基板308界定流動區240之相對表面，其中流動區240中含有之介質202在電極304與電極活化基板308之間提供電阻流動路徑。亦顯示經組態以連接至第一電極304及第二電極310及在該等電極之間產生偏壓(其為在流動區240中產生DEP力所需)之電源312。該電源312可為例如交流電流(AC)電源。 在某些實施例中，圖1D及1E中繪示之微流控裝置300可具有經光學驅動之DEP組態，諸如光電鑷子(OET)組態。在此等實施例中，來自光源320之光322之變化圖案(其可由選擇器控制模組控制)可用以選擇性活化「DEP電極」在流動區240之內表面242上之靶向位置314上之變化圖案。下文中流動區240之內表面242上之靶向區314亦稱為「DEP電極區」。 在圖1E中繪示之實例中，定向於內表面242上之光圖案322'照明所示正方形圖案中之交叉影線(cross-hatched)DEP電極區314a。其他DEP電極區314未經照明且下文中稱為「暗」 DEP電極區314。通過DEP電極活化基板308之電阻抗(即，自內表面242上之各暗電極區314至第二電極310)係大於通過介質202之電阻抗(即，自第一電極304跨過流動區240中之介質202至內表面242上之暗DEP電極區314)。然而，照明DEP電極區314a會減少通過電極活化基板308之阻抗(即，自內表面242上之經照明DEP電極區314a至第二電極310)至小於動過介質202之阻抗(即，自第一電極304跨過流動區240中之介質202至內表面242上之經照明DEP電極區314a)。 隨著電源312啟動，前述在各自經照明DEP電極區314a與相鄰暗DEP電極區314之間於介質202中產生電場梯度，其進一步產生吸引或排斥流體介質202中之鄰近微小物體(未顯示)之局部DEP力。以此種方式，吸引或排斥介質202中之微小物體之DEP電極可藉由變化自光源320投射至微流控裝置300內之光圖案322來選擇性活化及去活化以操作(即，移動)流動區240內之微小物體。光源320可為例如結構化光源之雷射或其他類型，諸如投影儀。DEP力是否吸引或排斥鄰近微小物體可取決於諸如(但不限於)以下之參數：電源312之頻率及介質202及/或微小物體(未顯示)之介電性質。 圖1E中繪示之經照明DEP電極區314a之正方形圖案322'僅係一個實例。DEP電極區314之任何數量之圖案或組態可藉由自光源320投射至裝置300內之光322之相應圖案來選擇性照明，及經照明DEP電極區之圖案322'可藉由變化光圖案322來重複變化以操作流體介質202中之微小物體。 在一些實施例中，電極活化基板308可為光導電材料，及內表面242之剩餘部分可為無特徵的。例如，光導電材料可由非晶形矽製成，且可形成具有厚度約500 nm至約2 μm之厚度(例如，厚度大體上1微米)之層。在此等實施例中，DEP電極區314可根據光圖案322 (例如，圖1E中顯示之光圖案322’)產生於流動區240之內表面242上任何地方並呈任何圖案形式。經照明DEP電極區314a之數量及圖案因此係不固定的，但與經各自投射之光圖案322一致。實例係闡述於美國專利案第7,612,355號中，在美國專利案第7,612,355號中，使用未摻雜之非晶形矽材料作為可組成電極活化基板308之光導電材料之一個實例。 在其他實施例中，電極活化基板308可包含含有形成諸如半導體領域中已知的半導體積體電路之複數個摻雜層、電絕緣層及導電層之基板。例如，該電極活化基板308可包含光電晶體陣列。在此等實施例中，電路元件可在於流動區240之內表面242處之DEP電極區314與可經各自光圖案322選擇性活化之第二電極310之間形成電連接。當未經活化時，通過各電連接之電阻抗(即，自於內表面242上之相應DEP電極區314通過電連接至第二電極310)可大於通過介質202之阻抗(即，自第一電極304通過介質202至於內表面242上之相應DEP電極區314)。然而，當在光圖案322中經光活化時，通過經照明電連接之電阻抗(即，自各經照明DEP電極區314a通過電連接至第二電極310)可減小至小於通過介質202之電阻抗(即，自第一電極304通過介質202至相應經照明DEP電極區314a)之量，藉此活化如上文討論之相應DEP電極區314處之DEP電極。吸引或排斥介質202中之微小物體(未顯示)之DEP電極可因此於流動區240之內表面242處之許多不同DEP電極區314處藉由光圖案322選擇性活化及去活化。電極活化基板308之此等組態之實例包括美國專利案第7,956,339號之圖21及22中繪示之基於光電晶體之裝置300。 在其他實施例中，電極活化基板308可包含含有複數個可經光驅動之電極之基板。電極活化基板308之此等組態之實例包括美國專利申請公開案第2014/0124370號中繪示及描述之光驅動裝置200、400、500及600。在又其他實施例中，支撐結構104及/或蓋子122之DEP組態非依賴於微流控裝置之內表面處之DEP電極之光活化，但使用相對於包括至少一個電極之表面放置之選擇性可定址及可通電之電極，諸如美國專利案第號6,942,776中描述者。 在DEP組態裝置之一些實施例中，第一電極304可為外殼102之第一壁302 (或蓋子)之一部分，及電極活化基板308及第二電極310可為外殼102之第二壁306 (或基座)之一部分，通常如圖1D中繪示。如顯示，流動區240可在第一壁302與第二壁306之間。然而，前述僅係一個實例。在替代實施例中，第一電極304可為第二壁306之一部分及電極活化基板308及/或第二電極310中之一者或兩者可為第一壁302之一部分。此外，光源320可隨意放置在外殼102下。在某些實施例中，第一電極304可為銦錫氧化物(ITO)電極，然而亦可使用其他材料。 當與圖1D-1E之微流控裝置300之光學驅動DEP組態一起使用時，選擇器控制模組可因此藉由將一或更多個連續光圖案322投射至裝置300內以活化流動區240之內表面242之DEP電極區314處之相應一或更多個DEP電極，使其呈圍繞及「捕獲」微小物體之連續圖案來選擇流動區240之介質202中之該微小物體(未顯示)。該選擇器控制模組可然後藉由相對於裝置300移動光圖案322 (或裝置300 (及因此其中捕獲之微小物體)可相對於光源320及/或光圖案322移動)而將經捕獲之微小物體於流動區240內移動。就表徵微流控裝置300之電驅動DEP組態之實施例而言，該選擇器控制模組可藉由電活化流動區240之內表面242之DEP電極區314處之DEP電極之子類，使其形成圍繞及「捕獲」微小物體之圖案來選擇流動區240中之介質202中之該微小物體(未顯示)。該選擇器控制模組可然後藉由變化經電活化之DEP電極之子類而使經捕獲之微小物體在流動區240內移動。 E.     隔離室組態 裝置100之隔離室136、138及140之實例係顯示於圖1A至1C中。憑藉明確參考圖1C，各隔離室136、138、140包含界定隔離區144及連接區142之隔離結構146，連接區142將該隔離區144流體連接至流動通道134。該等連接區142各具有進入該流動通道134內之近端開口152，及進入該各自隔離區144內之遠端開口154。該等連接區142係經較佳組態使得在流動通道134中以最大速度(Vmax)流動之流體介質流(未顯示)之最大滲透深度非故意延伸至該隔離區144內。安置於各自隔離室136、138、140之隔離區144中之微小物體(未顯示)或其他材料(未顯示)可因此自流動通道134中之介質流(未顯示)分離且大體上不受流動通道134中之介質流(未顯示)影響。該流動通道134可因此係掃及區之實例，及隔離室136、138、140之隔離區可為非掃及區之實例。如上文指示，各自流動通道134及隔離室136、138、140係經組態以含有一或更多種流體介質(未顯示)。在圖1A至1C顯示之實施例中，流體出入口124係流體連接至該流動通道134及容許將流體介質(未顯示)引入或移除自微流控環路132。一旦該微流控環路132含有流體介質，則其中特定流體介質之流動可選擇性產生於該流動通道134中。例如，介質流可自一個充當入口之流體出入口124至另一充當出口之流體出入口124來產生。 在一些模式中，微流控隔離區可各形成微流控裝置中之終端。在一些態樣中，當流動區及微流控隔離區係大體上充滿流體介質時：(a)第二介質之組分可擴散於第一介質中或第一介質之組分可擴散於第二介質中；及(b)大體上無第一介質自流動區流動至隔離區內。 圖2繪示圖1A至1C之裝置100之隔離室136之實例之詳細視圖。隔離室138、140可經相似組態。亦顯示位於隔離室136中之微小物體222之實例。 如已知，微流控流動通道134中之流體介質202(由方向箭頭212指示)流動經過隔離室136之近端開口152可引起介質202 (由方向箭頭214指示)第二流動(secondary flow)至隔離室136內及/或第二流出隔離室136外。為自第二流動214隔離隔離室136之隔離區144中之微小物體222，當流動通道134中之流動212之速度處於最大(Vmax)時，自近端開口152至遠端開口154之連接區142之長度Lcon係較佳大於第二流動214進入連接區142內之最大滲透深度Dp。只要流動通道134中之流動212不超過最大速度Vmax，則該流動212及所得第二流動214係受限於各自流動通道134及連接區142，並保持在隔離室136之隔離區144之外。流動通道134中之流動212將因此不將微小物體222拉出隔離室136之隔離區144之外。 此外，流動212將不使可能位於流動通道134中之雜項顆粒(例如，微粒及/或奈米顆粒)移動至隔離室136之隔離區144內。具有大於最大滲透深度Dp之連接區142之長度Lcon可因此防止來自流動通道134或另一隔離室138、140之雜項顆粒污染隔離室136。 因為隔離室136、138、140之流動通道134及連接區142可受介質202在流動通道134中之流動212影響，所以流動通道134及連接區142可視作微流控環路132之掃及(或流動)區。另一方面，隔離室136、138、140之隔離區144可視作非掃及(或非流動)區。例如，流動通道134中之第一介質202之組分(未顯示)可與隔離區144中之第二介質204混合，此大體上僅藉由使第一介質202之組分自流動通道134擴散通過連接區142並進入隔離區144中之第二介質204內來實現。同樣地，隔離區144中之第二介質204 (未顯示)之組分可與流動通道134中之第一介質202混合，此大體上僅藉由使第二介質204之組分自隔離區144擴散通過連接區142並進入流動通道134中之第一介質202內來實現。應知曉該第一介質202可為與第二介質204相同或不同之介質。此外，該第一介質202及該第二介質204可開始時相同，然後變得不同，例如，通過藉由隔離區144中之一或更多個元件調節第二介質，或藉由變化流動通過流動通道134之介質。 由流動通道134中之流動212所引起之第二流動214之最大滲透深度Dp可取決於許多參數。此等參數之實例包括(但不限於)流動通道134之形狀(例如，該流動通道可將介質導入連接區142內，轉移介質使其遠離連接區142，或僅流動經過連接區142)；流動通道134於近端開口152處之寬度Wch (或橫截面積)；連接區142於近端開口152處之寬度Wcon (或橫截面積)；流動212於流動通道134中之最大速度Vmax；第一介質202及/或第二介質204之黏度，及類似物。 在一些實施例中，流動通道134及/或隔離室136、138、140之大小係參考流動通道134中之流動212如下定向：流動通道寬度Wch (或流動通道134之橫截面積)可大體上垂直於流動212；連接區142於近端開口152處之寬度Wcon (或橫截面積)可大體上平行於流動212；及連接區之長度Lcon可大體上垂直於流動212。前述僅為實例，及流動通道134及隔離室136、138、140之大小可參考彼此處於額外及/或其他方向上。 如圖2中繪示，連接區142之寬度Wcon自近端開口152至遠端開口154可為一致的。連接區142於遠端開口154處之寬度Wcon可因此位於對應於連接區142於近端開口152處之寬度Wcon之下文定義之範圍之任何一者中。或者，連接區142於遠端開口154之寬度Wcon可大於(例如，如圖3之實施例中顯示)或小於(例如，如圖4A至4C之實施例中顯示)連接區142於近端開口152處之寬度Wcon。 亦如圖2中繪示，隔離區144於遠端開口154處之寬度可與連接區142於近端開口152處之寬度Wcon大體上相同。隔離區144於遠端開口154處之寬度可因此位於對應於連接區142於近端開口152處之寬度Wcon之下文定義之範圍之任何一者中。或者，隔離區144於遠端開口154處之寬度可大於(例如，如圖3中顯示)或小於(未顯示)連接區142於近端開口152處之寬度Wcon。 在一些實施例中，流動212於流動通道134中之最大速度Vmax係與其中該流動通道134可維持而不引起該流動通道所在之各自微流控裝置(例如，裝置100)中之結構故障之最大速度大體上相同。一般而言，流動通道可維持之最大速度取決於各種因素， 該等因素包括微流控裝置之結構完整性及流動通道之橫截面積。就本文揭示及描述之例示性微流控裝置而言，具有約3,500至10,000平方微米之橫截面積之流動通道中之最大流動速度Vmax係約1.5至15　L/sec。或者，流動通道中之流動之最大速度Vmax可經設定以便於確保使隔離區與流動通道中之流動分離。特定言之，基於生長室之連接區之近端開口之寬度Wcon，Vmax可經設定以便於確保第二流動於連接區內之滲透Dp之深度小於Lcon。例如，就具有連接區(該連接區具有寬度Wcon為約40至50微米及Lcon為約50至100微米之近端開口)之生長室而言，Vmax可設定為或約為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5　L/sec。 在一些實施例中，連接區142之長度Lcon及隔離室136、138、140之隔離區144之相應長度之總和可足夠短以使隔離區144中含有之第二介質204之組分相當快速擴散至流動通道134中流動或另外含於其中之第一介質202中。例如，在一些實施例中， (1)連接區142之長度Lcon及(2)位於隔離室136、138、140之隔離區144中之生物微小物體與連接區之遠端開口154之間之距離之總和可為下列範圍中之一者：自約40微米至500微米、50微米至450微米、60微米至400微米、70微米至350微米、80微米至300微米、90微米至250微米、100微米至200微米或包括前述終點中之一者之任何範圍。分子(例如，受關注之分析物，諸如抗體)之擴散速率係取決於許多因素，其等包括(但不限於)溫度、介質之黏度及分子之擴散係數D0。例如，IgG抗體於水溶液中於約20℃下之D0係約4.4x10-7 cm2/sec，而細胞培養基之動黏度係約9x10-4 m2/sec。因此，細胞培養基中之抗體於約20℃下可具有約0.5微米/sec之擴散速率。因此，在一些實施例中，自位於隔離區144中之生物微小物體擴散至流動通道134內之時間週期可為約10分鐘或更少(例如，約9、8、7、6、5分鐘或更少)。用於擴散之時間週期可藉由變化影響擴散速率之參數來操作。例如，介質之溫度可增加(例如，增加至生理學溫度，諸如約37℃)或減小(例如，減小至約15℃、10℃或4℃)，藉此分別增加或減小擴散速率。或者或另外，介質中溶質之濃度可經增加或減小。 圖2中繪示之隔離室136之物理組態僅係一個實例，及隔離室之許多其他組態及變更係可能的。例如，該隔離區144被繪示為具有含有複數個微小物體222之大小，但該隔離區144可具有含有僅約一、二、三、四、五或類似相對較小數量之微小物體222之大小。因此，隔離區144之體積可為例如至少約3x103 、6x103 、9x103 、1x104 、2x104 、4x104 、8x104 、1x105 、2x105 、4x105 、8x105 、1x106 、2x106 、4x106 、6x106 立方微米或更大。 作為另一實例，隔離室136在圖2中顯示為自流動通道134大體上垂直延伸，及因此形成與流動通道134呈大體上約90°之角度。該隔離室136可以其他角度(諸如，例如，自約30°至約150°之任何角度)自流動通道134隨意延伸。 作為又另一實例，連接區142及隔離區144在圖2中繪示為具有大體上成直角組態，但連接區142及隔離區144中之一者或兩者可具有不同組態，其包括(但不限於)橢圓形、三角形、圓形、沙漏形及類似物。 如仍另一實例，連接區142及隔離區144在圖2中繪示為具有大體上均勻寬度。即，連接區142之寬度Wcon顯示為沿自近端開口152至遠端開口154之整個長度Lcon係均勻的。隔離區144之相應寬度係同樣均勻的；及連接區142之寬度Wcon及隔離區144之相應寬度顯示為相等的。然而，在替代實施例中，前述中之任何一者可為不同的。例如，連接區142之寬度Wcon可沿自近端開口152至遠端開口154之長度Lcon例如以梯形或以沙漏形之方式變化；隔離區144之寬度亦可沿長度Lcon例如以三角形或以燒瓶之方式變化；及連接區142之寬度Wcon可不同於隔離區144之寬度。 圖3繪示隔離室336之替代實施例，其證實前述變更之一些實例。儘管替代隔離室336係描述為微流控裝置100中之室136之替代者，但應知曉該隔離室336可替代本文揭示或描述之微流控裝置實施例之任何一者中之隔離室之任何一者。此外，給定微流控裝置中可能提供一個隔離室336或複數個隔離室336。 隔離室336包括連接區342及包含隔離區344之隔離結構346。該連接區342具有通向流動通道134之近端開口352及通向隔離區344之遠端開口354。在圖3繪示之實施例中，該連接區342擴展使得其寬度Wcon沿自近端開口352至遠端開口354之連接區之長度Lcon增加。然而，除具有不同形狀外，連接區342、隔離結構346及隔離區344之功能通常與圖2中顯示之隔離室136之上文描述之連接區142、隔離結構146及隔離區144之功能相同。 例如，流動通道134及隔離室336可經組態使得第二流動214之最大滲透深度Dp延伸至連接區342內，但未延伸至隔離區344內。連接區342之長度Lcon可因此大於最大滲透深度Dp，通常如上文參考圖2中顯示之連接區142進行討論。同樣地，如上文討論，隔離區344中之微小物體222將停留於隔離區344中，只要流動通道134中流動212之速度不超過最大流動速度Vmax。流動通道134及連接區342因此係掃及(或流動)區之實例，及隔離區344係非掃及(或非流動)區之實例。 圖4A-C描述含有微流控環路432及流動通道434之微流控裝置400之另一例示性實施例，其等係圖1A-1C之各自微流控裝置100、環路132及流動通道134之變更。該微流控裝置400亦具有複數個生長室436，其等係上文描述之生長室136、138、140及336之額外變更。特定言之，應知曉圖4A-C中顯示之裝置400之生長室436可取代裝置100及300中之上文描述之生長室136、138、140、336中之任何一者。同樣地，該微流控裝置400係該微流控裝置100之另一變體，及亦可具有與上文描述之微流控裝置300及本文描述之其他微流控系統組件中之任何一者相同或不同之DEP組態。 圖4A-C之微流控裝置400包含支撐結構(圖4A-C中不可見，但可與圖1A-1C中描述之裝置100之支撐結構104相同或大體上相似)、微流控環路結構412及蓋子(圖4A-C中不可見，但可與圖1A-1C中描述之裝置100之蓋子122相同或大體上相似)。微流控環路結構412包括框架414及微流控環路材料416，其等可與圖1A-1C中顯示之裝置100之框架114及微流控環路材料116相同或大體上相似。如圖4A中顯示，由微流控環路材料416界定之微流控環路432可包含多個生長室436流體連接之多個流動通道434 (顯示兩個但其實可能更多)。 各生長室436可包含隔離結構446、於隔離結構446內之隔離區444、及連接區442。自於流動通道434處之近端開口472至於隔離結構436處之遠端開口474，連接區442將流動通道434流體連接至隔離區444。通常根據圖2之上文討論，流動通道434中第一流體介質402之流動482可產生第一介質402自流動通道434進入及/或離開生長室436之各自連接區442之第二流動484。 如圖4B中繪示，各生長室436之連接區442通常包括介於連通流動通道434之近端開口472與連通隔離結構446之遠端開口474之間延伸之區。連接區442之長度Lcon可大於第二流動484之最大滲透深度Dp，在該情況下，第二流動484將延伸至連接區442內而不重定向至隔離區444 (如圖4A中顯示)。或者，如圖4C中繪示，連接區442可具有小於最大滲透深度Dp之長度Lcon，在該情況下，第二流動484將通過連接區442延伸並重定向至隔離區444。在此後者情況下，連接區442之長度Lc1及Lc2之總和係大於最大滲透深度Dp，使得第二流動484將不延伸至隔離區444內。無論連接區442之長度Lcon是否大於滲透深度Dp，或連接區442之長度Lc1及Lc2之總和是否大於滲透深度Dp，流動通道434中第一介質402之不超過最大速度Vmax之流動482將產生具有滲透深度Dp之第二流動，及生長室436之隔離區444中之微小物體(未顯示但可與圖2中顯示之微小物體222相同或通常相似)將不被流動通道434中第一介質402之流動482帶出隔離區444。流動通道434中之流動482亦將不會使雜項材料(未顯示)自流動通道434引入生長室436之隔離區444內。因此，擴散作用係使流動通道434中第一介質402之組分可自流動通道434移動至生長室436之隔離區444中之第二介質404內之僅一種使機制。同樣地，擴散作用係使生長室436之隔離區444中之第二介質404中之組分可自隔離區444移動至流動通道434中之第一介質402內之僅一種機制。第一介質402可為與第二介質404相同之介質，或第一介質402可為與第二介質404不同之介質。或者，第一介質402及第二介質404可一開始相同，然後變得不同，例如，通過藉由隔離區444中之一或更多個元件調節第二介質，或藉由變化流動通過流動通道434之 介質。 如圖4B中繪示，流動通道434中流動通道434之寬度Wch (即，在流體介質流動通過流動通道之方向(在圖4A中藉由箭頭482指示)之橫向上)可大體上垂直於近端開口472之寬度Wcon1及因此大體上平行於遠端開口474之寬度Wcon2。然而，近端開口472之寬度Wcon1及遠端開口474之寬度Wcon2無需大體上彼此垂直。例如，近端開口472之寬度Wcon1所定向之軸(未顯示)與遠端開口474之寬度Wcon2所定向之另一軸之間之角度可為非垂直的，及因此非呈90°。其他角度之實例包括在下列範圍之任何一者中之角度：自約30°至約90°、自約45°至約90°、自約60°至約90°或類似物。 在生長室136、138、140、336或436之各種實施例中，生長室之隔離區可具有經組態以支援培養物中不超過約1x103、5x102、4x102、3x102、2x102、1x102、50、25、15或10個細胞之體積。在其他實施例中，生長室之隔離區具有支援多達及包括約1x103、1x104或1x105個細胞之體積。 在隔離室136、138、140、336或436之各種實施例中，隔離室之隔離區可具有經組態以支援培養物中不超過約1x103、5x102、4x102、3x102、2x102、1x102、50、25、15或10 個細胞之體積。在其他實施例中，隔離室之隔離區具有支援多達及包括約1x103、1x104或1x105個細胞之體積。 在隔離室136、138、140、336或436之各種實施例中，流動通道134於近端開口152處之寬度Wch (隔離室136、138或14)；流動通道134於近端開口352處之寬度Wch (隔離室336)；或流動通道434於近端開口472處之寬度Wch (隔離室436)可為下列範圍中之任何一者：自約50-1000微米、50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米及100-120微米。前述僅為實例，及流動通道134或434之寬度Wch可在其他範圍(例如，由上文列舉之任一終點所界定之範圍)中。 在隔離室136、138、140、336或436之各種實施例中，流動通道134於近端開口152處之高度Hch (隔離室136、138或140)、流動通道134於近端開口352處之高度Hch (隔離室336)或流動通道434於近端開口472處之高度Hch (隔離室436)可為下列範圍中之任何一者：自約20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。前述僅為實例，且流動通道134或434之高度Hch可在其他範圍(例如，由上文列舉之任一終點所界定之範圍)中。 在隔離室136、138、140、336或436之各種實施例中，流動通道134於近端開口152處之橫截面積(隔離室136、138或140)、流動通道134於近端開口352處之橫截面積(隔離室336)或流動通道434於近端開口472處之橫截面積(隔離室436)可為下列範圍中之任何一者：自約500-50,000平方微米、500-40,000平方微米、500-30,000平方微米、500-25,000平方微米、500-20,000平方微米、500-15,000平方微米、500-10,000平方微米、500-7,500平方微米、500-5,000平方微米、1,000-25,000平方微米、1,000-20,000平方微米、1,000-15,000平方微米、1,000-10,000平方微米、1,000-7,500平方微米、1,000-5,000平方微米、2,000-20,000平方微米、2,000-15,000平方微米、2,000-10,000平方微米、2,000-7,500平方微米、2,000-6,000平方微米、3,000-20,000平方微米、3,000-15,000平方微米、3,000-10,000平方微米、3,000-7,500平方微米或3,000至6,000平方微米。前述僅為實例，且流動通道134於近端開口152處之橫截面積、流動通道134於近端開口352處之橫截面積或流動通道434於近端開口472處之橫截面積可在其他範圍(例如，由上文列舉之任一終點所界定之範圍)中。 在隔離室136、138、140、336或436之各種實施例中，連接區之長度Lcon可為下列範圍中之任何一者：自約1-200微米、5-150微米、10-100微米、15-80微米、20-60微米、20-500微米、40-400微米、60-300微米、80-200微米及100-150微米。前述僅為實例，且連接區142 (隔離室136、138或140)、連接區342 (隔離室336)或連接區442 (隔離室436)之長度Lcon可在與前述實例不同之範圍(例如，由上文列舉之任一終點所界定之範圍)內。 在隔離室136、138、140、336或436之各種實施例中，連接區142於近端開口152處之寬度Wcon (隔離室136、138或140)、連接區342於近端開口352處之寬度Wcon (隔離室336)或連接區442於近端開口472處之寬度Wcon (隔離室436)可為下列範圍中之任何一者：自約20-500微米、20-400微米、20-300微米、20-200微米、20-150微米、20-100微米、20-80微米、20-60微米、30-400微米、30-300微米、30-200微米、30-150微米、30-100微米、30-80微米、30-60微米、40-300微米、40-200微米、40-150微米、40-100微米、40-80微米、40-60微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、50-80微米、60-200微米、60-150微米、60-100微米、60-80微米、70-150微米、70-100微米及80-100微米。前述僅為實例，及連接區142於近端開口152處之寬度Wcon；連接區342於近端開口352處之寬度Wcon；或連接區442於近端開口472處之寬度Wcon可與前述實例不同(例如，由上文列舉之任一終點所界定之範圍)。 在隔離室136、138、140、336或436之各種實施例中，連接區142於近端開口152處之寬度Wcon (隔離室136、138或140)、連接區342於近端開口352處之寬度Wcon (隔離室336)或連接區442於近端開口472處之寬度Wcon (隔離室436)可為下列範圍中之任何一者：自約2-35微米、2-25微米、2-20微米、2-15微米、2-10微米、2-7微米、2-5微米、2-3微米、3-25微米、3-20微米、3-15微米、3-10微米、3-7微米、3-5微米、3-4微米、4-20微米、4-15微米、4-10微米、4-7微米、4-5微米、5-15微米、5-10微米、5-7微米、6-15微米、6-10微米、6-7微米、7-15微米、7-10微米、8-15微米及8-10微米。前述僅為實例，及連接區142於近端開口152處之寬度Wcon、連接區342於近端開口352處之寬度Wcon或連接區442於近端開口472處之寬度Wcon可與前述實例不同(例如，由上文列舉之任一終點所界定之範圍)。 在隔離室136、138、140、336或436之各種實施例中，連接區142之長度Lcon相對於連接區142於近端開口152處之寬度Wcon之比率(隔離室136、138或140)、連接區342之長度Lcon相對於連接區342於近端開口352處之寬度Wcon之比率(隔離室336)或連接區442之長度Lcon相對於連接區442於近端開口472處之寬度Wcon之比率(隔離室436)可大於或等於下列比率中之任何一者：約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或更大。前述僅為實例，及連接區142之長度Lcon相對於連接區142於近端開口152處之寬度Wcon之比率、連接區342之長度Lcon相對於連接區342於近端開口372處之寬度Wcon之比率；或連接區442之長度Lcon相對於連接區442於近端開口472處之寬度Wcon之比率可與前述實例不同。 在具有生長室136、138、140、336或436之微流控裝置之各種實施例中，Vmax可設定為約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5 uL/sec。 在具有生長室136、138、140、336或436之微流控裝置之各種實施例中，隔離區144 (隔離室136、138或140)、344 (隔離室336)或444 (隔離室436)之體積可為例如至少約3x103 、6x103 、9x103 、1x104 、2x104 、4x104 、8x104 、1x105 、2x105 、4x105 、8x105 、1x106 、2x106 、4x106 、6x106 立方微米或更大。 在一些實施例中，該微流控裝置具有隔離室136、138、140、336或436，其中可維持不超過約1x102 個生物細胞，且隔離室之體積可不超過約2x106 立方微米。 在一些實施例中，該微流控裝置具有隔離室136、138、140、336或436，其中可維持不超過約1x102 個生物細胞，且隔離室之體積可不超過約4x105 立方微米。 在又其他實施例中，該微流控裝置具有隔離室136、138、140、336或436，其中可維持不超過約50個生物細胞，且隔離室之體積可不超過約4x105 立方微米。 在各種實施例中，該微流控裝置具有如在本文討論之實施例之任何一者中組態之隔離室，其中該微流控裝置具有約100至約500個隔離室；約200至約1000個隔離室；約500至約1500個隔離室；約1000至約2000個隔離室或約1000至約3500個隔離室。 在一些其他實施例中，該微流控裝置具有如在本文討論之實施例之任何一者中組態之隔離室，其中該微流控裝置具有約1500至約3000個隔離室；約2000至約3500個隔離室；約2000至約4000個隔離室；約2500至約4000個隔離室或約3000至約4500個隔離室。 在一些實施例中，該微流控裝置具有如在本文討論之實施例之任何一者中組態之隔離室，其中該微流控裝置具有約3000至約4500個隔離室；約3500至約5000個隔離室；約4000至約5500個隔離室；約4500至約6000個隔離室或約5000至約6500個隔離室。 在其他實施例中，該微流控裝置具有如在本文討論之實施例之任何一者中組態之隔離室，其中該微流控裝置具有約6000至約7500個隔離室；約7000至約8500個隔離室；約8000至約9500個隔離室；約9000至約10,500個隔離室；約10,000至約11,500個隔離室；約11,000至約12,500個隔離室；約12,000至約13,500個隔離室；約13,000至約14,500個隔離室；約14,000至約15,500個隔離室；約15,000至約16,500個隔離室；約16,000至約17,500個隔離室；約17,000至約18,500個隔離室。 在各種實施例中，該微流控裝置具有如在本文討論之實施例之任何一者中組態之隔離室，其中該微流控裝置具有約18,000至約19,500個隔離室；約18,500至約20,000個隔離室；約19,000至約20,500個隔離室；約19,500至約21,000個隔離室或約20,000至約21,500個隔離室。 F.     隔離室之其他性質 儘管上文已將界定裝置100 (圖1A-1C)之各自隔離室136、138、140及形成裝置400 (圖4A-4C)之隔離室436之隔離結構446之微流控環路材料116 (圖1A-1C)及416 (圖4A-4C)之障壁繪示及討論為物理障壁，但應知曉該等障壁可隨意製造為「虛擬」障壁，其包含由光圖案322中之光活化之DEP力。 在一些其他實施例中，各自隔離室136、138、140、336及436可經遮罩以避開照明(例如，藉由引導光源320之偵測器及/或選擇器控制模組)，或可僅選擇性照明短暫的時間週期。隔離室中含有之元件及其他生物微小物體可因此在被移動至隔離室136、138、140、336及436內前防止進一步(即，可能有害的)照明。 G.     塗佈溶液及塗佈劑。 非意欲受理論限制，當微流控裝置之至少一個或更多個內表面已經調整或塗佈以便於呈現有機及/或親水性分子之層(其在微流控裝置與維持於其中之生物微小物體之間提供主要界面)時，生物微小物體(例如，生物細胞)於微流控裝置(例如，DEP組態及/或EW組態微流控裝置)內之維持可經促進(即，該生物微小物體於微流控裝置內顯示增加之存活率、更大之擴增及/或更大之可攜性)。在一些實施例中，微流控裝置之內表面之一或更多個(例如，DEP組態微流控裝置之電極活化基板之內表面、微流控裝置之蓋子及/或環路材料之表面)可經塗佈溶液及/或塗佈劑處理或修飾以產生有機及/或親水性分子之所需層。 該塗佈可於引入生物微小物體之前或之後施加，或可與該(等)生物微小物體同時引入。在一些實施例中，該(等)生物微小物體可引入微流控裝置之包括一或更多種塗佈劑之流體介質中。在其他實施例中，微流控裝置(例如，DEP組態微流控裝置)之內表面係於將生物微小物體引入微流控裝置內之前經包含塗佈劑之塗佈溶液處理或「底塗」。 在一些實施例中，微流控裝置之至少一個表面包括提供適用於生物微小物體之維持及/或擴增之有機及/或親水性分子之層之塗佈材料(例如，提供如下文描述經調節之表面)。在一些實施例中，微流控裝置之大體上所有內表面包括塗佈材料。經塗佈之內表面可包括流動區(例如，通道)、室或隔離圍欄或其組合之表面。在一些實施例中，複數個隔離圍欄中之各者具有至少一個經塗佈材料塗佈之內表面。在其他實施例中，複數個流動區或通道中之各者具有至少一個經塗佈材料塗佈之內表面。在一些實施例中，複數個隔離圍欄中之各者及複數個通道中之各者之至少一個內表面係經塗佈材料塗佈。 塗佈劑/溶液。可使用任何便利之塗佈劑/塗佈溶液，其包括(但不限於)：血清或血清因子、牛血清白蛋白(BSA)、聚合物、清潔劑、酶及其任何組合。 基於聚合物之塗佈材料。至少一個內表面可包括包含聚合物之塗佈材料。該聚合物可共價或非共價結合(或可非特異性黏合)至該至少一個表面。該聚合物可具有各種結構基元，諸如嵌段聚合物(及共聚物)、星形聚合物(星形共聚物)及移植或梳形聚合物(移植共聚物)中發現之結構基元，其等中之所有可適用於本文描述之方法。 聚合物可包括包括伸烷醚部分之聚合物。含有伸烷醚之聚合物之各種類型可適用於本文描述之微流控裝置中。含有伸烷醚之聚合物之一個非限制性例示性類別係兩親性非離子嵌段共聚物，其包括在聚合物鏈中呈不同比率及位置之聚環氧乙烷(PEO)及聚環氧丙烷(PPO)亞單元之嵌段。Pluronic®聚合物(BASF)係此類型之嵌段共聚物且此項技術中已知適用於接觸活細胞。該等聚合物之平均分子質量Mw可介於自約2000Da至約20KDa之範圍內變化。在一些實施例中，該PEO-PPO嵌段共聚物可具有大於約10 (例如，12-18)之親水性-親脂性平衡(HLB)。用於產生經塗佈之表面之特定Pluronic® 聚合物包括Pluronic® L44、L64、P85及F127 (包括F127NF)。含有伸烷醚之聚合物之另一類別係聚乙二醇(PEG Mw ＜100,000Da)或或者聚環氧乙烷(PEO, Mw＞100,000)。在一些實施例中，PEG可具有約1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da之Mw。 在其他實施例中，塗佈材料可包括含有羧酸部分之聚合物。羧酸亞單元可為含有烷基、烯基或芳族部分之亞單元。一個非限制性實例係聚乳酸(PLA)。在其他實施例中，塗佈材料可包括含有磷酸部分之聚合物，該磷酸部分位於聚合物主鏈之末端或懸掛自聚合物之主鏈。在又其他實施例中，塗佈材料可包括含有磺酸部分之聚合物。磺酸亞單元可為含有烷基、烯基或芳族部分之亞單元。一個非限制性實例係聚苯乙烯磺酸(PSSA)或聚茴香腦磺酸。在其他實施例中，塗佈材料可包括包含胺部分之聚合物。聚胺基聚合物可包括天然聚胺聚合物或合成聚胺聚合物。天然聚胺之實例包括精胺、亞精胺及腐肉鹼。 在其他實施例中，塗佈材料可包括含有醣部分之聚合物。在非限制性實例中，多醣(諸如黃原膠或聚葡萄糖)可適用於形成可減少或防止細胞黏附於微流控裝置中之材料。例如，具有約3kDa大小之聚葡萄糖聚合物可用以提供微流控裝置內表面之塗佈材料。 在其他實施例中，塗佈材料可包括含有核苷酸部分(即核酸，其可具有核糖核苷酸部分或脫氧核糖核苷酸部分)之聚合物，提供聚電解質表面。核酸可僅含有天然核苷酸部分或可含有非天然核苷酸部分，其包含核鹼基、核糖或磷酸部分類似物，諸如7-脫氮雜腺嘌呤、戊糖、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯部分，但不限於此。 在又其他實施例中，塗佈材料可包括含有胺基酸部分之聚合物。含有胺基酸部分之聚合物可包括含有天然胺基酸之聚合物或含有非天然胺基酸之聚合物，各可包括肽、多肽或蛋白質。在一個非限制性實例中，該蛋白質可為牛血清白蛋白(BSA)及/或血清(或多種不同血清之組合)，其包含白蛋白及/或一或更多種其他相似蛋白質作為塗佈劑。該血清可來自任何方便來源，包括(但不限於)胎牛血清、綿羊血清、山羊血清、馬血清及類似物。在某些實施例中，塗佈溶液中之BSA係以自約1 mg/mL至約100 mg/mL之範圍內存在，包括5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL、60 mg/mL、70 mg/mL、80 mg/mL、90 mg/mL或更大或該等範圍之間之任何地方。在某些實施例中，塗佈溶液中之血清可以自約20% (v/v)至約50% v/v之範圍內存在，包括25%、30%、35%、40%、45%或更大或該等範圍之間之任何地方。在一些實施例中，BSA可作為塗佈劑以5 mg/mL存在於塗佈溶液中，而在其他實施例中，BSA可作為塗佈劑以70 mg/mL存在於塗佈溶液中。在某些實施例中，血清係作為塗佈劑以30%存在於塗佈溶液中。在一些實施例中，可於塗佈材料內提供細胞外基質(ECM)蛋白用於使細胞黏附最佳化以助細胞生長。塗佈材料中可包括之細胞基質蛋白可包括(但不限於)膠原、彈性蛋白、含有RGD之肽(例如纖網蛋白)或層連結蛋白。在又其他實施例中，可於微流控裝置之塗佈材料內提供生長因子、細胞介素、激素或其他細胞傳訊種類。 在一些實施例中，塗佈材料可包括含有環氧烷部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸部分、醣部分、核苷酸部分或胺基酸部分中之多於一者之聚合物。在其他實施例中，經聚合物調節之表面可包括多於一種聚合物之混合物，各聚合物具有環氧烷部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸部分、醣部分、核苷酸部分及/或胺基酸部分，該等聚合物可獨立或同時併入塗佈材料內。 共價連接之塗佈材料。在一些實施例中，至少一個內表面包括共價連接之分子，其等提供適用於微流控裝置內之生物微小物體之維持/擴增之有機及/或親水性分子之層，為此等細胞提供經調節之表面。 共價連接之分子包括連接基團，其中如下文描述，該連接基團係共價連接至微流控裝置之一或更多個表面。該連接基團亦共價連接至經組態以提供適用於生物微小物體之維持/擴增之有機及/或親水性分子之層之部分。 在一些實施例中，經組態以提供適用於生物微小物體之維持/擴增之有機及/或親水性分子之層之共價連接之部分可包括烷基或氟烷基(其包括全氟烷基)部分；單醣或多醣(其等可包括但不限於聚葡萄糖)；醇(包括(但不限於)炔丙醇)；多元醇，包括(但不限於)聚乙烯醇；伸烷醚，包括(但不限於)聚乙二醇；聚電解質(包括(但不限於)聚丙烯酸或聚乙烯基膦酸)；胺基(其等包括其衍生物，諸如，但不限於烷基化胺、羥基烷基化胺基、胍及含有非芳族化氮環原子之雜環基，諸如，但不限於嗎啉基或哌嗪基)；羧酸，包括(但不限於)丙炔酸(其可提供羧酸鹽陰離子表面)；膦酸，包括(但不限於)乙炔基膦酸(其可提供膦酸鹽陰離子表面)；磺酸鹽陰離子；羧基甜菜鹼；磺基甜菜鹼；胺磺酸；或胺基酸。 在各種實施例中，經組態以於微流控裝置內提供適用於生物微小物體之維持/擴增之有機及/或親水性分子之層之共價連接之部分可包括非聚合物部分，諸如烷基部分；經取代之烷基部分，諸如氟烷基部分(包括(但不限於)全氟烷基部分)；胺基酸部分；醇部分；胺基部分；羧酸部分；膦酸 部分；磺酸部分；胺磺酸部分或醣部分。或者，該共價連接之部分可包括聚合部分，其等可為上文描述之部分中之任何一者。 在一些實施例中，該共價連接之烷基部分可包含形成直鏈(例如，具有至少10個碳原子，或至少14、16、18、20、22或更多個碳原子之直鏈)之碳原子且可為無分支之烷基部分。在一些實施例中，烷基可包括經取代之烷基(例如，烷基中之碳原子中之一些可經氟化或全氟化)。在一些實施例中，烷基可包括第一片段(其可包括全氟烷基)，其連接至第二片段(其可包括未經取代之烷基)，其中該等第一及第二片段可直接或間接(例如，藉助於醚鍵聯)連接。烷基之第一片段可位於連接基團之遠端，及烷基之第二片段可位於連接基團之近端。 在其他實施例中，該共價連接之部分可包括至少一個胺基酸，其可包括多於一種類型之胺基酸。因此，該共價連接之部分可包括肽或蛋白質。在一些實施例中，該共價連接之部分可包括可提供兩性離子表面以支援細胞生長、存活率、可攜性或其任何組合之胺基酸。 在其他實施例中，該共價連接之部分可包括至少一個環氧烷部分，且可包括任何如上文描述之環氧烷聚合物。含有伸烷醚之聚合物之一種有用類別係聚乙二醇(PEG Mw ＜100,000Da)或或者聚環氧乙烷(PEO, Mw＞100,000)。在一些實施例中，PEG可具有約1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da之Mw。 該共價連接之部分可包括一或更多種醣。該等共價連接之醣可為單醣、二醣或多醣。該等共價連接之醣可經修飾以引入反應性配對部分，其允許偶合或加工以結合至表面。例示性反應性配對部分可包括醛、炔烴或鹵素部分。多醣可以隨機方式進行修飾，其中醣單體中之各者可經修飾或多醣內之醣單體之僅一部分係經修飾以提供反應性配對部分，其可直接或間接偶合至表面。一個實例可包括聚葡萄糖多醣，其可經由無分支連接子間接偶合至表面。 該共價連接之部分可包括一或更多個胺基。該胺基可為經取代之胺部分、胍部分、含有氮之雜環部分或雜芳基部分。含有胺基之部分可具有允許微流控裝置及視需要隔離圍欄及/或流動區(例如，通道)內之環境之pH修飾之結構。 提供經調節之表面之塗佈材料可包含僅一種共價連接之部分或可包括超過一個不同種類之共價連接之部分。例如，經氟烷基(包括全氟烷基)調節之表面可具有複數個相同之共價連接之部分，例如，具有相同連接基團及共價結合至表面、相同整體長度及相同數量之組成該氟烷基部分之氟亞甲基單元。或者，該塗佈材料可具有超過一種結合至表面之共價連接之部分。例如，該塗佈材料可包括具有具有指定數量之亞甲基或氟亞甲基單元之共價連接之烷基或氟烷基部分之分子且可進一步包括另一組分子，該等分子具有共價結合至具有更大數量之亞甲基或氟亞甲基單元之烷基或氟烷基鏈之帶電荷部分，其等可提供經塗佈表面處呈較大部分之能力。在此實例中，具有不同、較少空間需求之末端及較少主鏈原子之第一組分子可有助於官能化整個基板表面及藉此防止與組成基板本身之矽/氧化矽、氧化鉿或氧化鋁之非所需之黏附或接觸。在另一實例中，該等共價連接之部分可提供以隨機方式在表面上呈現交流電荷之兩性離子表面。 H.     流體介質 參考關於有關具有流動通道及一或更多個隔離室之微流控裝置之前述討論，流體介質(例如，第一介質及/或第二介質)可為可將生物微小物體維持於大體上可行及/或可分析狀態之任何流體。該可分析狀態將取決於生物微小物體及所進行之分析。例如，若該生物微小物體係針對受關注之蛋白質之分泌進行分析之細胞，則該細胞將係大體上可分析的，只要該細胞係有活力的且可表現及分泌蛋白質。 VI.   基因工程化 腫瘤浸潤細胞可經工程化以表現至少一個促發炎多肽。該促發炎多肽可為例如細胞介素、趨化介素、微生物抗原、其抗體或融合蛋白。例示性細胞介素包括IL-2、IL-7、IL-15、IFN (類型1或2)、CSF (M-CSF、G-CSF、GM-CSF)及IL-21。例示性趨化介素包括RANTES、IP-10、CXCL9及CXCL10。較佳地，所有此等多肽具有人類起源。此等多肽中之任何一者之序列可尤其於Swiss-Prot資料庫及/或NCBI蛋白資料庫中發現。 該促發炎劑亦可為適用於誘導免疫反應之微生物抗原。該微生物抗原可包括至少一個B細胞抗原決定基或至少一個T細胞抗原決定基或兩者。抗原之一個較佳類型係超抗原，諸如SEA、SEA/E-120或鞭毛蛋白。超抗原係抗原之識別類別；由一些致病菌或病毒作為防禦機制產生；引起T細胞之非特異性活化及細胞介素釋放。習知疫苗(諸如流感、肺炎球菌、破傷風、白喉、百日咳、肺炎A或B、HPV、麻疹、腮腺炎及風疹、水痘及腦膜炎)中之抗原亦可表現自TIC以刺激腫瘤近端之免疫反應。 該促發炎多肽亦可為抗體。如在治療之其他形式中，該抗體係較佳嵌合、鑲飾、人類化、人類或類似物以減小抗體本身之免疫原性。嵌合、鑲飾、人類化或人類抗體之重鏈及輕鏈可變區可連接至人類恆定區之至少一部分。恆定區之選擇(部分)取決於是否需要抗體依賴性補體及/或細胞介導之細胞毒性。例如，人類同位素IgG1及IgG3具有補體介導之細胞毒性及人類同型IgG2及IgG4不具有。人類IgG1同型係較佳同型。 例示性抗體包括抑制抗體，其等特異性結合至CTLA-4、PD-1、PD-2、PD-L1、PD-L2、4-1BB或抗-CD40並抑制其功能。例示性抗體包括易普利姆瑪單抗(ipilimumab) (抗-CTLA-4)及派姆單抗(pembrolizumab)及尼魯單抗(nivolumab) (抗-PD-1)及此等抗體之結合片段(特定言之scFv)及雙特異性版本。例示性雙特異性抗體組合腫瘤特異性靶向域(例如，抗-HER2抗體或類似物)及促發炎域(例如，IL-2或抗-CD3抗體)。 抗體或其他天然異二聚蛋白可視需要表現為單鏈融合蛋白，其中兩種組分(在抗體之情況下為重鏈及輕鏈可變區)表現為融合在一起。 除經工程化以表現至少一個促發炎多肽以外，腫瘤浸潤細胞可經基因工程化以表現促進基質降解之酶。例示性酶包括乙醯肝素酶、膠原酶、基質金屬蛋白酶(例如，MMP9)及胞漿素原活化物(例如，尿激酶)。此等酶係較佳具有人類起源，其等之例示性序列係尤其提供於Swiss-Prot資料庫及/或NCBI蛋白資料庫中。此工程化可藉由引入編碼可操作連接至可於TIC中表現之啟動子之基質降解酶之構築體(及引入視需要其他調節物序列)，或藉由活化內源性基質降解酶之表現進行。 腫瘤浸潤細胞亦可經工程化以表現使細胞靶向腫瘤之受體。此靶向可例如藉由工程化T細胞以表現CAR (Brocker等人，J. Ex. Med 181, 1653-1659 (1995；Ramos等人，Expert Opin Biol. Ther. 11, 855-873 (2011)；Hombach等人，J. Immunol. 167, 6123-6131 92001)；Maher等人，Nat. Biotech 20, 70-75 (2002)；Finney等人，J. Immunol. 172, 104-113 (2004)進行。CAR係經工程化之受體，其等包括結合域(通常scFv、跨膜域及傳訊域(通常CD3ζ)。第二代CAR亦包括來自CD38、4-1BB或OX40之共刺激域以使T細胞活化最佳化。第三代CAR亦包括第三分子之傳訊域，諸如TNF-受體家族成員，其包括4-1BB或OX40。所有組分係較佳具有人類起源。該結合域特異性結合至表現於腫瘤細胞之表面上之抗原。 細胞之基因工程化可在微流控裝置上分離細胞之前或之後進行；及該等細胞可在基因工程化之前或之後增殖。因此，基因工程化可在細胞之純系或混合群上進行。例如，腫瘤浸潤細胞可與轉形劑接觸(例如，本文揭示之藥劑中之任何一者，諸如CRISPR/Cas9、TALEN、鋅指、逆轉錄病毒及其他病毒載體、轉座子等)，接著將該等細胞引入微流控(或奈流控)裝置中，然後於裝置上增殖，視需要在將個別腫瘤浸潤細胞分離至各別隔離室後進行。在此等實施例中，腫瘤浸潤細胞之腫瘤細胞-抗原特異性之評估可在裝置上增殖細胞時評估。或者，腫瘤浸潤細胞可在細胞於微流控(或奈流控)裝置中時與轉形劑接觸，此在評估該等細胞特異性識別及/或回應於腫瘤細胞抗原之能力之前或之後進行。在此等實施例中，該等腫瘤浸潤細胞可個別或成組地裝載於隔離室中，及然後可使轉形劑流動進入微流控裝置內及在有助於成功轉形之條件下培養該等細胞。在又其他替代物中，腫瘤浸潤細胞可在於微流控裝置內選擇及自微流控裝置輸出之後與轉形劑接觸。在此等實施例中，對細胞是否已成功轉形之評估可使用習知巨流體技術或微流控技術(例如，藉由將該等細胞再引入微流控裝置內，分離個別細胞，及使單一細胞純系生長以供核酸分析)進行。 在某些實施例中，細胞之純系群可在基因工程化之後選擇。此外，細胞之一組純系群可在基因工程化及選擇後經視需要匯集。 腫瘤浸潤細胞可經基因工程化以直接表現至少一個促發炎多肽，例如，藉由引入編碼待表現之促發炎多肽之構築體，該促發炎多肽通常可操作連接至一或更多種調節元件諸如啟動子。視需要，該等一或更多種調節元件可包括啟動子及一或更多個轉錄增強子。該啟動子可為可誘導的，諸如四環素可誘導、糖皮質激素可誘導、多西環素可誘導、金屬可誘導或二甲胺基二硫代甲酸銅可誘導啟動子。視需要，該促發炎多肽係經由蛋白水解裂解位點在經初始表現時連接至掩蔽部分(參見，例如，WO 2009/025846)。藉由由靶腫瘤表現之蛋白酶於蛋白水解裂解位點處之裂解增強多肽於其預期作用位點處之活性，藉此改善活性-相對於-副作用概況(activity-to-side effects profile)。 腫瘤浸潤細胞亦可經基因工程化以藉由引入編碼誘導或抑制內源性基因之活性之藥劑之構築體(諸如涉及轉錄調節之轉錄因子或傳訊蛋白)來間接表現該至少一個促發炎多肽。 無論該至少一個促發炎多肽之表現是否係直接或間接，基因工程化可使用例如鋅指蛋白、siRNA、TALEN及/或Cas-CRISPR完成。此等技術促進位點特異性DNA裂解，以藉此誘導靶向誘變；誘導細胞DNA序列之靶向刪除；及促進既定染色體基因座上的靶向重組及整合。參見，例如，Burgess (2013) Nature Reviews Genetics 14:80-81, Urnov等人，(2010) Nature 435(7042):646-51；US 20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20090263900；20090117617；20100047805；20110207221；20110301073及WO 2007/014275；20140170753；20140170753。 或者，基因工程化可藉由轉染編碼促發炎多肽之載體並篩選(視需要經藥物選擇)來進行。構築體可為病毒起源，諸如慢病毒載體或逆轉錄病毒載體。此等載體可轉導細胞而不產生免疫原性病毒蛋白或使轉基因變為宿主細胞基因體之永久部分。 慢病毒係逆轉錄病毒之屬，其等可感染分裂及非分裂細胞。慢病毒之數個實例包括HIV (人類免疫缺陷病毒)，包括HIV 1型及HIV 2型；維斯那-梅迪病毒(visna-maedi)，其引起綿羊之腦炎(visna)或肺炎(maedi)；山羊關節炎-腦炎病毒，其引起山羊之免疫缺陷、關節炎及腦病；馬傳染性貧血病毒，其引起馬之自體免疫溶血性貧血及腦病；貓免疫缺陷病毒(FIV)，其引起貓之免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，其引起牛之淋巴結腫大、淋巴細胞增多及可能中樞神經系統感染；及類人猿免疫缺陷病毒(SIV)，其引起子人類靈長類動物之免疫缺陷及腦病。慢病毒基因體係通常組織為5'長末端重複序列(LTR)、gag基因、pol基因、env基因、輔助基因(nef、vif、vpr、vpu)及3' LTR。將病毒LTR分為三個區，稱為U3、R及U5。該U3區含有增強子及啟動子元件。U5區含有聚腺苷酸化信號。R (重複序列)區分離U3及U5區及R區之轉錄序列出現於病毒RNA之5'及3'端。參見，例如，「RNA Viruses: A Practical Approach」 (Cann編，Oxford University Press, (2000)), Narayan及Clements J. Gen. Virology 70:1617-1639 (1989)；Fields等人，Fundamental Virology Raven Press. (1990)；Miyoshi等人，J Virol. 72(10):8150-7 (1998)；美國專利案第6,013,516號。 γ逆轉錄病毒係逆轉錄病毒科家族之屬。例示性逆轉錄病毒包括小鼠幹細胞病毒、鼠科白血病病毒、貓科白血病病毒、貓科肉瘤病毒及禽類網狀內皮組織增生病毒。 病毒載體可引入包裝成病毒粒子之細胞內。包裝細胞系提供用於轉運病毒基因體RNA包裝至病毒顆粒內時所需之病毒蛋白。例示性包裝細胞系包括293 (ATCC CCL X)、HeLa (ATCC CCL 2)、D17 (ATCC CCL 183)、MDCK (ATCC CCL 34)、BHK (ATCC CCL-10)及Cf2Th (ATCC CRL 1430)，如描述於例如，美國專利案第6,218,181號中。 用於促發炎多肽之編碼序列可由逆轉錄病毒啟動子表現，諸如逆轉錄病毒5'長末端重複序列(LTR)啟動子，其通常用於在哺乳動物細胞諸如CMV、SV40、EF1A、PGK、CAGG、UBC啟動子或NFAT(經活化之T細胞之細胞核因子，參見Zhang等人，Mol. Thera 19, 751-759 (2011))中表現。 非病毒DNA轉染或轉座子亦可用於基因工程化腫瘤浸潤細胞。非病毒遞送系統包括例如電穿孔、基於脂質之遞送系統(包括脂質體)、「裸」 DNA及使用聚環糊精化合物之遞送。 若腫瘤浸潤細胞中表現超過一種多肽時，則可將該多肽引入相同或不同構築體上。 在基因工程化後，使細胞繁殖。適用於細胞培養之條件包括適當之培養基(例如，最低必需培養基、RPMI培養基1640或X-vivo 15 (Lonza))，其可含有增殖及存活必需之因子，其等包括血清(例如，胎牛血清或人類血清)、介白素-2 (IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFp及TNF-α或用於細胞生長之其他添加物(包括表面活性劑、人血漿蛋白粉、及還原劑諸如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇)。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15及X-Vivo 20、優化劑(Optimizer)，並添加胺基酸、丙酮酸鈉及維生素，可以無血清或補充適當量血清(或血漿)或指定激素群及/或足夠用於細胞之生長及擴增之細胞介素量。抗生素(例如，盤尼西林及鏈黴素)僅包括於實驗培養物中，而非待輸注至個體體內之細胞之培養物中。視需要於活體外使用癌症之抗原刺激TIC。使該等靶細胞維持於支持生長所需之條件 (例如，適當之溫度(例如，37℃)及蒙氣(例如，空氣加5% CO2 )下。較佳地，細胞之產率係至少104、105、106或107個細胞。用於治療之充足產量有時可在1至3天後獲得。有時細胞係培養於雷帕黴素中(以在培養期間限制T細胞之分化及/或耗盡，及/或使細胞之子組處於分化之記憶T細胞階段)。若該等細胞已經分為純系分離物，則個別純系分離物可視需要在向病患投與之前匯集。 在培養經工程化之TIC之後或期間，具有TIC之樣本可針對轉形至TIC中之轉基因之適當整合及表現進行測試。此測試可藉由標準技術進行，諸如定序及/或印漬術。 圖5繪示用於TIC之基因工程化之替代工作流程。在左邊之工作流程中，TIC係在基因轉形之前經分離及擴增。在右邊之工作流程中，腫瘤細胞係在分離TIC之前經基因工程化。 VII.  治療方法 在繁殖後，經基因工程化之腫瘤浸潤細胞以治療癌症之有效方案向病患投與。上文提及之癌症類型中之任何一者係尤其可治療的。該癌症可為原發性癌症或繼發性癌症且可為局部或轉移。較佳地，該等經基因工程化之腫瘤浸潤細胞係投與給最初獲得該等細胞之相同病患(自體治療)。若向不同病患(同種異體治療)投與該等細胞，則該病患通常患有與獲得腫瘤浸潤細胞之病患相同類型之癌症。同樣地，就非腫瘤浸潤細胞之來源之病患而言，該病患及該等細胞係較佳針對避免排斥之HLA相容性進行檢查。較佳地至少五種及更佳地所有六種主要HLA抗原係經匹配。 經基因工程化之腫瘤浸潤細胞係以有效方案投與，有效方案意謂投與之劑量、投與途經及投與頻率延遲失調症之發病、降低失調症之嚴重性及抑制失調症之進一步惡化及/或改善失調症之至少一個跡象或症狀。若病患已患有失調症，則該方案可被稱為治療有效方案。若該病患相對於一般群處於患有失調症之高風險下但仍未出現症狀，則該方案可被稱為預防性有效方案。在一些實例中，相對於相同病患之歷史對照或過往經歷，治療或預防效用可見於個別病患中。在其他實例中，相對於未經治療之病患之對照群，治療或預防效用可在經治療之病患之群中之臨床前或臨床試驗中經證實。 經基因工程化之腫瘤浸潤細胞可全身投與或可直接注射至腫瘤內。靜脈內、動脈內或皮下遞送係較佳用於全身投與。 在向病患投與經基因工程化之腫瘤浸潤細胞前，該病患可經治療以耗盡內源性免疫細胞，特定言之免疫抑制細胞(參見，例如，Dudley等人，J. Clin. Oncol. 23, 2346-2357 (2005)；J. Clin. Oncol. 26, 5233-5239 (2008))。淋巴耗盡增強經轉移之細胞之移植。宿主調節可減輕腫瘤負荷；改善向靶細胞投與之細胞之比率；減少抑制調節T細胞之群；及減少轉移細胞介素之產生以促進經轉移之細胞之增殖。用於宿主調節之典型方案包括環磷醯胺並結合或不結合氟達拉濱或。 若待投與之經基因工程化之腫瘤浸潤細胞自可誘導啟動子表現多肽，則誘導物(例如，用於四環素可誘導啟動子之四環素)係與該等細胞共投與以自啟動子原位誘導表現。共投與意謂該等細胞及誘導物在時間上足夠接近地投與，使得該誘導物誘導由該等細胞編碼之促發炎多肽之表現，與此同時增強細胞對該等細胞所靶向之癌症之作用。例如，該誘導物可在投與細胞後立即投與，該投與可在同一天投與，例如，在投與該等細胞之1、2、3、4、5、6小時或更久後。該誘導物亦可在向病患投與之細胞之一些或大多數(例如，至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多)已成功浸潤腫瘤時投與。另外，該誘導物可定期投與，諸如每天、每2、3、4、5、6或7天、每週等。 使用經基因工程化之腫瘤浸潤細胞之治療可與一或更多種其他治療組合以使治療之腫瘤之環境更促發炎。第二治療可為例如促進免疫反應之輔助治療，諸如QS-21或Ribi及/或促發炎細胞介素。此等細胞介素之實例係淋巴激素、單核因子及傳統多肽激素。細胞介素中包括生長激素，諸如人類生長激素、N-甲硫胺醯基人類生長激素及牛生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；鬆弛素；前鬆弛素；醣蛋白激素，諸如濾泡刺激激素(FSH)、甲狀腺刺激激素(TSH)及黃體成長激素(LH)；表皮生長因子；肝生長因子；纖維母細胞生長因子；泌乳素；胎盤生乳素；腫瘤壞死因子-α及-β；密拉氏管-抑制物質；小鼠促性腺素相關肽；抑制素；促進素；血管內皮細胞生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經生長因子，諸如NGF-α；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β；胰島素樣生長因子-I及-II；紅血球生成素(EPO)；骨誘導因子；干擾素，諸如干擾素-α、-β及-γ群體刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞-CSF (M-CSF)；顆粒細胞-巨噬細胞-CSF (GM-CSF)；及顆粒細胞-CSF (G-CSF)；介白素(IL)，諸如IL-1、IL-la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子，包括LIF及套組配體(KL)。 可自細胞表現之相同類型促發炎多肽中之一些亦可全身投與。一些細胞介素(諸如IL-7及IL-15)可促進經投與之細胞之增殖及抑制內源性抑制T細胞之增殖。 細胞可作為一次性劑量或以某一頻率重複投與，該頻率可為每天、每週、每月、每季度或以無規律間隔投與以回應於病患之病症或治療中之失調症之進展之變化。所投與劑量之數量取決於癌症是否可處於永久緩解或僅降低嚴重性或處於暫時緩解。就一些癌症而言，介於1與10之間之劑量係通常足夠的。有時單一推注劑量(視需要以分開之形式)係足夠的。針對癌症之復發可重複進行治療。就持續復發之癌症而言，TIC可以規律間隔投與，例如，每週、每兩週、每月、每季度、每六個月投與至少1、5或10年或病患之一生。 用於非經腸投與之醫藥組合物可於GMP條件下製造。醫藥組合物可以單位劑型(即，用於單一投與之劑量)提供。醫藥組合物可使用一或更多種生理上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑調配。該調配取決於所選投與途徑。就注射而言，細胞可調配於水溶液中，較佳調配於生理上可相容之緩衝劑諸如漢克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理鹽水或乙酸鹽緩衝劑(以減少注射位點處之不適)中。該溶液可含有配方劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，細胞可在使用前冷凍儲存或放置於陰涼處。 使用TIC之治療可與有效對抗所治療癌症之其他治療組合，諸如化學治療、放射、幹細胞治療、外科手術或使用其他生物製劑之治療，該等生物製劑諸如針對HER2抗原之Herceptin™ (曲妥單抗)；針對VEGF之Avastin™ (貝伐單抗)；或針對EGF受體之抗體，諸如(Erbitux™，西妥昔單抗)及Vectibix™ (帕尼單抗)、抗-CTLA、抗-PD-1、抗-PD2抗-PD-L1或抗-PD-L2。化學治療劑包括BRAF抑制劑、苯丁酸氮芥、環磷醯胺或美法侖(melphalan)、卡鉑(carboplatinum)、道諾黴素(daunorubicin)、阿黴素(doxorubicin)、伊達比星(idarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、胺甲喋呤(methotrexate)、氟達拉濱(fludarabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、依託泊苷(etoposide)、拓撲替康(topotecan)、長春新鹼(vincristine)及長春花鹼(vinblastine)。 上文或下文援引之所有專利申請、網址、其他公開案、登錄號及類似物出於所有目的以全文引用之方式併入本文中，該引用之程度就如同各個別項目已特定地及個別地以引用之方式併入一般。若序列之不同版本在不同時間係與登錄號相關聯，則指的是與本申請之有效申請日期下之登錄號相關聯之版本。若適用，則有效申請日期意謂實際申請日期之更早前或涉及登錄號之優先申請案之申請日期。同樣地，若公開案、網址或類似物之不同版本在不同時間下公開，則除非另有指示否則指的是在申請案之有效申請日期下最新公開之版本。除非另有明確指示，否則本發明之任何特徵、步驟、元件、實施例或態樣可與任何其他組合使用。儘管已出於清晰及瞭解之目的藉助於繪示及實例在一些細節上對本發明進行描述，但將明瞭某些變化及修飾可於隨附申請專利範圍之範圍內實踐。 實例實例 1 ：膜製法及珠結合方案 下列方案證實獲得含有蛋白質(及其他生物分子)之樣本及特定言之來自受關注之樣本細胞之膜結合或膜相關蛋白之可行性。該方案係對Jurkat細胞進行以測試所得樣本中已知存在於此等細胞中之蛋白質。該方案可易於擴展至其他細胞類型，包括分離自腫瘤生檢之癌細胞，藉此產生含有適用於針對對抗原之反應性來篩選免疫細胞(諸如T細胞、NK細胞等)之腫瘤細胞特異性(或其他細胞類型特異性)抗原之樣本。 材料： •  Jurkat細胞(ATCCTIB-152 ) •  LiDS-樣本緩衝劑：0.02 g/mL LiDS、10%甘油、0.51 mM EDTA、247 mM Tris，pH8.5 (ThermoFisherB0008 ) •  Qiashredder (Qiagen79654 ) •  DPBS (含有鈣及鎂，ThermoFisher14040-182 ) •  超純水(ThermoFisher10977-015 ) •  EZ-Link Sulfo-NHS-SS-生物素(ThermoFisher21328 )：儲存於-20℃下，使用前取出及在室溫下加熱~30 min；短暫旋轉以收集試管底部之每件事物；使用前立即將164 µL超純水添加至含有1 mg Sulfo-NHS-SS-生物素之1個試管中及移液管上下吸取數次以溶解(產生10 mM溶液) •  完全超迷你(Sigma5892791001 )：製備20x溶液：藉由渦流將1個錠劑溶解於500 µL水中(在4℃或-20℃下穩定4週) •  微小血漿膜蛋白分離套組(Invent BiotechnologiesSM-005 )：使用前，解凍溶液A及B，及添加蛋白酶抑制劑： -      就各樣本而言，500 µL緩衝劑A + 25 µL 20x蛋白酶抑制劑(儲存於冰上) -      就各樣本而言，200 µL緩衝劑B + 10 µL 20x蛋白酶抑制劑(儲存於冰上) -      針對各樣本於冰上製備1個過濾筒 •  BSA：Chromatopur牛血清白蛋白(MP Biomedicals02180561 ) •  塗佈鏈黴親和素之磁性微球(Bangs LaboratoriesCM01N Lot# 11806)，使用前清洗並阻斷： -      Vortex珠，取出300 µL/樣本並轉移至1.5 mL管中 -      用PBS清洗 -      重新懸浮於0.5% BSA中並在4℃ (旋轉)下培養至少1 h -      用PBS清洗，重新懸浮於500 µL DPBS (+ 蛋白酶抑制劑) /樣本中 •  抗-α 1鈉鉀ATP酶(Na/K-ATP酶)抗體(Abcamab7671 ) •  抗-人類CD3抗體，純系SK7 (BioLegend344802 ) •  抗-人類CD45抗體，純系HI30 (BioLegend304002 ) •  F(ab')2-山羊抗-小鼠IgG (H+L)，Alexa Fluor 488 (ThermoFisherA-11017 ) 膜蛋白之生物素化： 1.     計數Jurkat細胞 2.     製備分液以供西方墨點轉漬法分析： -      離心2x106 個細胞 -      用PBS清洗 -      溶解於LiDS-樣本緩衝劑中並通過Qiashredder管柱離心以剪切DNA -      於4℃下儲存幾天，在-80℃下儲存更久 3.     藉由離心法，使用DPBS將多重之15x106 個細胞洗三次 4.     將各集結粒重新懸浮於500 µL DPBS中，轉移至1.5 mL管內並添加10 µL新製10 mM Sulfo-NHS-SS-生物素 5.     在室溫下旋轉30 min 6.     用冷DPBS清洗三次並用細胞集結粒處理以富集膜溶離份 7.     處理1樣本以供西方墨點轉漬法分析(參見上文)。 圖6顯示經Na/K-ATP酶(存在於血漿膜中之蛋白質)及GAPDH (胞漿蛋白)染色之例示性西方墨點轉漬法。 使用微小血漿膜分離套組富集膜溶離份： 所有步驟於冰上進行，在4℃下離心。 1.     將集結粒重新懸浮於緩衝劑A中：200 µl用於＜5x106 個細胞；500 µl用於＞5x106 個細胞 2.     於冰上培養10 min 3.     劇烈渦流10-30 sec，立即轉移至冰上過濾筒 4.     給過濾筒加蓋，在16,000 g下離心30 sec (若細胞溶解產物不通過，則增加至2 min) 5.     將集結粒重新懸浮於收集管中，轉移至相同過濾器並再次離心 6.     廢棄過濾器，藉由劇烈渦流將集結粒重新懸浮10 sec 7.     在700 g下離心1 min (以使完整細胞核集結成粒) 8.     在新鮮1.5 ml管中於16,000 g / 4℃下將上清液離心30 min (→上清液含有細胞溶質；集結粒=總膜蛋白溶離份) 9.     藉由渦流將集結粒重新懸浮於200 µl緩衝劑B中，或移液管上下吸取 10.   在7,800 g / 4℃下離心20 min →集結粒含有細胞器膜蛋白 11.   將上清液(膜溶離份)小心轉移至新鮮2.0 ml管內 使膜溶離份結合至塗佈鏈黴親和素之磁性微球： 1.     將80 µL各膜溶離份添加至500 µL珠 2.     在4℃下旋轉o/n 3.     保存未結合之溶離份以供西方墨點轉漬法分析 4.     於0.5% BSA/PBS +蛋白酶抑制劑中旋轉30 min 5.     用PBS清洗 6.     重新懸浮於250 µL 0.1% BSA/PBS +蛋白酶抑制劑中 自珠釋放膜溶離份(使用DTT裂解S-S結合)： 1.     取出50 µL珠分液 2.     放置於磁鐵上並移除溶液 3.     將珠重新懸浮於50 µL含有50 mM DTT (1x還原劑，ThermoFisherB0009 )之LiDS-樣本緩衝劑中 4.     在室溫下培養2 hr (每隔~30 min混合) 抗體染色： 1.     針對各抗體取出50 µL等分之珠(來自步驟24)置於下列稀釋劑中 -       CD3 (1:200) -       CD45 (1:100) -       Na/K-ATP酶(1:100) -       無一級抗體 2.     在4℃下旋轉30 min 3.     添加800 µL PBS以清洗，另外用PBS清洗1x 4.     在4℃下於二級抗體(Alexa488-結合之山羊抗-小鼠)中以1:300培養30 min (旋轉，體積：200 µL於0.5% BSA/PBS +蛋白酶抑制劑中) 5.     添加800 µL PBS以清洗，另外用PBS清洗1x 6.     重新懸浮於20 µL 0.5% BSA/PBS +蛋白酶抑制劑中 7.     於螢光顯微鏡上成像 圖7顯示塗佈經CD3、CD45或Na/K-ATP酶染色之Jurkat細胞膜溶離份之珠。CD3及CD45兩者與NA/K-ATP酶(其呈現為暗斑)相比均強烈呈現。圖8顯示與HEK293細胞之比較。此處Na/K-ATP酶染色相同，但缺乏CD3及CD45。結果證實自細胞膜製劑分離之蛋白質可成功偶合至珠。此等珠可與免疫細胞混合以判定對存在於細胞膜製劑中之蛋白質(或其他生物分子)抗原呈反應性之細胞。實例 2 ：自總腫瘤生檢分離腫瘤浸潤細胞 腫瘤生檢係獲得自患有癌症之病患。腫瘤生檢係經機械分離，從而回收具有15%存活率之7x105 個細胞。該等細胞用抗-CD3/抗-CD28磁珠(DYNABEADS™, Thermofisher Scientific, Cat. No. 11453D)培養整夜。第二天，收集非黏附細胞並使其等流入經Opto-Select™技術(Berkeley Lights, Inc.)組態之OptoFluidic™微流控裝置內。該微流控裝置包括微流控通道及複數個流體連接至微流控通道之NanoPen™室。T細胞/珠重懸浮液藉由使該重懸浮液流動通過流體入口並進入微流控通道內而引入微流控裝置內。停止流動及藉由傾斜晶片及容許重力將T細胞/珠拉入室內而將該等細胞/珠隨意裝載於NanoPen™室(如本文描述，隔離圍欄之一種類型)內。使含有RPMI+10% FBS、2%人類血清及6000U IL2之T細胞培養基灌注於微流控裝置之整個微流控通道，歷時三(3)天時間。 在三天培養週期後，分析裝載於NanoPen™室內之細胞之生長。在於第0天裝載之總計3087個NanoPen™室中，細胞生長可見於該等室之439個(或14.2%)中。 此實驗之結果證實回應於T細胞培養基之腫瘤浸潤細胞(TIC)可成功分離自總腫瘤生檢並於OptoFluidic™微流控裝置中擴增。實例 3 ：自腫瘤引流淋巴結分離 T 細胞 來自腫瘤引流淋巴結之細針抽吸物(FNA)係獲得自與實例2中相同之病患。該FNA係經機械分離，及所得材料係經過濾及離心沉降。回收具有91%存活率之2.3x106 個細胞。該等細胞係用抗-CD3/抗-CD28磁珠(DYNABEADS™, Thermofisher Scientific, Cat. No. 11453D)培養整夜。第二天，收集非黏附細胞及用經PE-CF594螢光染料標記之抗-CD4及抗-CD8抗體染色。C細胞(其等係CD4+或CD8+)係藉由FACS分離及流入經Opto-Select™技術(Berkeley Lights, Inc.)組態之OptoFluidic™微流控裝置內。該微流控裝置包括微流控通道及複數個流體連接至微流控通道之NanoPen™室。單一細胞係接著使用Opto-Select™技術(如本文描述，其使用DEP力)裝載於個別NanoPen™室內。總計466個NanoPen™室裝載單一細胞。使含有RPMI+10%FBS、2%人類血清及6000U IL2之T細胞培養基灌注於微流控裝置之整個微流控通道，歷時三(3)天時間。 在三天培養週期後，分析細胞之生長。在第0天裝載於NanoPen™室內之總計80個T細胞(約17%)在第3天前可見形成純系群體。 此實驗之結果證實位於腫瘤相鄰淋巴結內之T細胞可經分離及在OptoFluidic™微流控裝置中成功擴增成純系群。位於腫瘤引流淋巴結中之T細胞被認為可能係腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。實例 4 ：自腎細胞癌生檢分離腫瘤浸潤 T 細胞 腎細胞癌(RCC)生檢係獲得自病患。該RCC生檢係經機械分離，從而回收具有70%存活率之6.6x106 個細胞。所得細胞經FACS分選以得到CD45+細胞，從而分離具有74%存活率之1.7x106 個細胞。該等CD45+細胞用抗-CD3/抗-CD28磁珠(DYNABEADS™, Thermofisher Scientific, Cat. No. 11453D)培養整夜。第二天，收集非黏附細胞及使其等流入經Opto-Select™技術(Berkeley Lights, Inc.)組態之OptoFluidic™微流控裝置內。該微流控裝置包括微流控通道及複數個流體連接至微流控通道之NanoPen™室，及進一步包括經共價連接之聚乙二醇(PEG)調節之內表面。藉由傾斜微流控裝置及容許重力將T細胞/珠拉入室內而將該等T細胞/珠隨意裝載於NanoPen™室內。在將T細胞/珠裝載於NanoPen™室內後，含有RPMI+10%FBS、2%人類血清及6000U IL2之T細胞培養基，歷時四(4)天時間，之後，分析該等細胞之CD4/CD8表現及生長。 在第0天裝載之各種NanoPen™室顯示CD4+/CD8+細胞於NanoPen™室中之生長。此實驗之結果證實腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)可成功分離自RCC生檢及於OptoFluidic™微流控裝置中擴增。實例 5 ：奈流控裝置中之人類 T 細胞擴增 將自外周血液分離之CD3+人類T淋巴細胞以1個珠/1個細胞之比率與抗-CD3/抗-CD28磁珠(DYNABEADS™, Thermo Fisher Scientific, Inc.)混合。使混合物在37℃下於5% CO2 培養器中培養5小時。培養後，該T細胞/珠混合物係經重新懸浮及引入經Opto-Select™技術(Berkeley Lights, Inc.)組態之OptoFluidic™微流控裝置內。該微流控裝置包括微流控通道及複數個流體連接至微流控通道之NanoPen™室。T細胞/珠重懸浮液藉由使該重懸浮液流動通過流體入口並進入微流控通道內而引入微流控裝置內。停止流動及藉由傾斜微流控裝置及容許重力將T細胞/珠拉入室內而將該等T細胞/珠隨意裝載於NanoPen™室內。在將T細胞/珠裝載於NanoPen™室內後，使含有RPMI、10% FBS、2%人類AB血清及50 U/ml IL2 (R&D系統)之T細胞培養基灌注於微流控裝置之整個微流控通道，歷時四(4)天時間。該等NanoPen™室及其中含有之任何T細胞及珠每隔30分鐘成像，歷時整個4天培養週期。 圖9係單一NanoPen™室於0、24、48、72及96小時培養下之一系列時移影像，其中CD3+人類T淋巴細胞根據前述方法於微流控裝置內成功擴增。正如所見，在時間t=0下之少量T細胞在96小時晶片上培養後導致T細胞之寡純系群(oligo-clonal population)。實例 6 ：人類 T 細胞於奈流控裝置中之選擇性擴增 將自外周血液分離之人類CD14+單核細胞於含有RPMI、10% FBS、2%人類AB血清、100 ng/ml GM-CSF及50 ng/ml IL-4 (R&D系統)之DC培養基中培養7天以促進樹枝狀細胞(DC)之分化。在培養之最後2天期間將250 ug/ml LPS (R&D系統)添加至培養基中以促進DC活化。 同種異體供體T淋巴細胞係以~10個T細胞/1個DC之比率與來自前述培養之DC混合及在37℃下於5% CO2 培養器中培養5小時。培養後，該T細胞/DC混合物係經重新懸浮及引入經Opto-Select™技術(Berkeley Lights, Inc.)組態之OptoFluidic™微流控裝置內。該微流控裝置包括微流控通道及複數個流體連接至微流控通道之NanoPen™室。T細胞/DC重懸浮液藉由使重懸浮液流動通過流體入口並進入微流控通道內而引入微流控裝置內。停止流動及藉由傾斜裝置及容許重力將T細胞/DC拉入室內而將該等T細胞/DC隨意裝載於NanoPen™室內。 將T細胞/DC裝載於NanoPen™室內後，使含有RPMI、10% FBS、2%人類AB血清及50 U/ml IL2 (R&D系統)之T細胞培養基灌注於晶片之整個微流控通道，歷時4天時間。NanoPen™室及其中含有之任何T細胞及DC每隔30分鐘成像，歷時整個4天培養週期。 圖10A係單一NanoPen™室於0、24、48、72及96小時培養下之一系列時移影像，其中CD3+人類T淋巴細胞係以根據前述方法在晶片上選擇性擴增。正如所見，在96小時之晶片上培養後，該等DC刺激T細胞之顯著擴增。然而，僅1%-2%奈米孔最初用至少一個T細胞接種及至少一個DC顯示T細胞擴增，此證實圖10A中可見之擴增係選擇性的。 在4天培養時間之最後16小時期間，用以灌注晶片之培養基係以Click-It EdU試劑(Thermo Fisher Scientific, Inc.)補充，讓T細胞吸收該試劑並將其併入其等DNA內。在培養時間後，清洗該等細胞，用3.7%甲醛固定，及滲透0.1% Triton-X。EdU併入係藉由監測德克薩斯紅(Texas Red)通道中之螢光進行偵測。圖11A提供顯示覆蓋於經選擇性擴增之T細胞之亮場影像上之EdU螢光訊號之影像。實例 7 ：人類 T 細胞於奈流控裝置中之抗原 - 特異性擴增 將自外周血液分離之人類CD14+單核細胞於含有RPMI、10% FBS、2%人類AB血清、100 ng/ml GM-CSF及50 ng/ml IL-4 (R&D系統)之DC培養基中培養7天以促進樹枝狀細胞(DC)之分化。在培養之最後2天將250 ug/ml LPS (R&D系統)添加至培養基中以促進DC活化。在添加LPS之同時，該等DC亦係經10 uM破傷風毒素(TT)抗原(Sigma-Aldrich Co.)及10 uM艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr Virus)(EBV)抗原(EastCoast Bio, Inc.)脈衝。 自體供體T淋巴細胞係以~10個T細胞/1個DC之比率與來自前述培養物之TT-及經EBV脈衝之DC混合及在37℃下於5% CO2 培養器中培養5小時。培養後，將該T細胞/DC混合物重新懸浮及引入經Opto-Select™技術(Berkeley Lights, Inc.)組態之OptoFluidic™微流控裝置內。該微流控裝置包括微流控通道及複數個流體連接至微流控通道之NanoPen™室。T細胞/珠重懸浮液藉由使該重懸浮液流動通過流體入口並進入微流控通道內而引入微流控裝置內。停止流動及藉由傾斜裝置及容許重力將T細胞/DC拉入室內而將該等T細胞/DC隨意裝載於NanoPen™室內。 將T細胞/DC裝載於NanoPen™室內後，使含有RPMI、10% FBS、2%人類AB血清及50 U/ml IL2 (R&D系統)之T細胞培養基灌注於晶片之整個微流控通道，歷時五(5)天時間。NanoPen™室及其中含有之任何T細胞及珠每隔30分鐘成像，歷時整個5天培養週期。 圖10B係單一NanoPen™室於0、24、48、72、96及110小時培養下之一系列時移影像，其中CD3+人類T淋巴細胞根據前述方法於晶片上選擇性擴增。如所見，在110小時之晶片上培養後，該等DC刺激T細胞之顯著擴增。然而，僅1%-2%室最初用至少一個T細胞接種及至少一個DC顯示T細胞擴增，此證實圖10B中可見之擴增係抗原特異性的。 在5天培養週期之最後16小時期間，用以灌注晶片之培養基係以Click-It EdU試劑(Thermo Fisher Scientific, Inc.)補充，讓T細胞吸收該試劑及將其併入其等DNA內。在培養週期後，清洗該等細胞，用3.7%甲醛固定，及滲透0.1% Triton-X。EdU併入係藉由監測德克薩斯紅通道中之螢光進行偵測。圖11B提供顯示覆蓋於經選擇性擴增之T細胞之亮場影像上之EdU螢光訊號之影像。實例 8 ：在經調節之微流控表面上培養及輸出 T 淋巴細胞。 材料。來自AllCells Inc.之CD3+細胞及以1個珠/1個細胞之比率與抗-CD3/抗-CD28磁珠(DYNABEADS™, Thermofisher Scientific, Cat. No. 11453D)混合。該混合物係於與培養實驗本身相同之培養基中在37℃下於5% CO2 培養器中培養5小時。培養後，重新懸浮該T細胞/珠混合物以供使用。 培養基。RPMI-1640 (GIBCO®, ThermoFisher Scientific, Cat. No. 11875-127)、10% FBS、2%人類AB血清(50 U/ml IL2; R&D系統)。 系統及微流控裝置。系統及微流控裝置：由Berkeley Lights, Inc製造。該系統包括至少一個流動控制器、溫度控制器、流體介質調節及泵組件、用於經光活化之DEP組態之光源、用於微流控裝置之顯微鏡載物臺及相機。該微流控裝置係經Opto-Select™技術組態之OptoFluidic™裝置。該微流控裝置包括微流控通道及複數個流體連接至微流控通道之NanoPen™室，且該等室具有約7X105 立方微米之體積。另外，該微流控裝置具有經共價連接之聚葡萄糖調節之表面。 引發方案。使250微升100%二氧化碳以12微升/sec之速率流入。之後，使250微升含有0.1% Pluronic® F27 (Life Technologies® Cat# P6866)之PBS以12微升/sec流入。引發之最終步驟包括250微升PBS以12微升/sec流入。接著引入培養基。 灌注方案。灌注方法係下列兩種方法中之任何一者： 1.以0.01微升/sec灌注2 h；以2微升/sec灌注64 sec；及重複。 2.以0.02微升/sec灌注100 sec；停止流動500 sec；以2微升/sec灌注64 sec；及重複。 T細胞(加珠)懸浮液藉由使重懸浮液流動通過流體入口並進入微流控通道內而引入微流控裝置內。停止流動及藉由傾斜裝置及容許重力將T細胞/珠拉入室內將T細胞/珠隨意裝載於NanoPen™室內。 將T細胞/珠裝載於NanoPen™室內後，使培養基灌注於微流控裝置之整個微流控通道，歷時4天時間。圖12A顯示T細胞於微流控裝置之NanoPen™室之經聚葡萄糖調節之表面上之生長。細胞於經聚葡萄糖調節之表面上之生長係相對於相似微流控裝置(資料未顯示)之未經調節之表面得到改善。 然後藉由重力(例如，傾斜微流控裝置)自NanoPen™室移除T細胞。圖12B顯示在二十分鐘時間結束時自生長室移除之程度，其證實輸出經擴增之T細胞至流動通道內之極佳能力，其優於自相似微流控裝置之未經調節之表面移除T細胞之能力。T細胞然後自微流控裝置(未顯示)輸出。實例 9 ：人類 T 細胞之基因工程化 人類T細胞係經基因修飾以使用CRISPR/Cas9技術移除功能PD-1。基因編輯係根據Schumann等人，(2015), Proc. Nat’l Acad. Sci. 112(33):10437-442之方案完成。遵循該基因編輯，將所得T細胞引入經Opto-Select™技術(Berkeley Lights, Inc.)組態之OptoFluidic™微流控裝置內。該微流控裝置包括微流控通道及複數個流體連接至微流控通道之NanoPen™室。將T細胞裝載於NanoPen™室內，之後，將T細胞培養基灌注於整個微流控通道以讓T細胞擴增。在培養數天后，發現T細胞已於NanoPen™室內擴增(參見圖13A)。如圖13B中顯示，用經螢光標記之抗-PD-1抗體染色T細胞群顯示於微流控裝置中生長之大部分T細胞缺乏PD-1之表現及因此已經成功修飾。 此實驗之結果證實T細胞可經基因修飾及接著於微流控裝置內經成功擴增。實例 10 ：用經基因工程化之 T 細胞治療黑色素瘤之方法 步驟1：自患有黑色素瘤之病患獲得一或更多個黑色素瘤腫瘤生檢。 步驟2：分離該腫瘤生檢以獲得單一腫瘤衍生之細胞之混合物。 步驟3：使用抗-CD8及/或抗-CD4抗體藉由FACS或MACS選擇分選腫瘤衍生之細胞以獲得腫瘤浸潤T細胞之富集群。(或者，或另外，可採用移除非淋巴細胞之陰性選擇)。 步驟4：用編碼IL-2之構築體轉染腫瘤浸潤T細胞該富集群。 •  使用CRISPR-Cas9技術以將該編碼IL-2之構築體靶向基因體之預選定區。 •  視需要，該構築體可包括四環黴素-可誘導啟動子。 步驟5：自經轉染之細胞群標記、選擇及分離T細胞。 •  用經螢光標記之抗-CD4及/或抗-CD8抗體標記經轉染之細胞群。(或者，可使用經螢光標記之抗-CD3抗體)。 •  使經標記之細胞流入Berkeley Lights™微流控裝置之流動通道內及使該流動停止。 •  選擇經螢光標記之細胞及將其等個別放置於Berkeley Lights™微流控裝置中之隔離室內。 •  恢復流體於微流控裝置中之流動，藉此使任何殘餘、非所需之細胞流出該微流控裝置。 步驟6：於晶片上(即，於該微流控裝置內)將個別經分離之T細胞擴增為純系群。 •  於晶片上將經分離之T細胞培養1至3天。 •  視需要，將一或更多個黑色素瘤腫瘤細胞(來自病患)放置於在培養前已具有經分離之T細胞之各隔離室內。 •  視需要，在雷帕黴素(rapamycin)之存在下培養該等T細胞(以在培養期間限制T細胞之分化及/或耗盡及/或使細胞之子組維持在分化之記憶T細胞階段)。 步驟7：就形成純系群體之個別T細胞而言，輸出1至2個細胞以供基因體分析 •  偵測攜載經適當整合之構築體之細胞(例如，使用基因體DNA序列) •  視需要，偵測其中該IL-2轉基因構築體係功能活性的細胞。例如，分析cDNA之IL-2表現。若使用可誘導四環黴素啟動子，TIL可於cDNA之分析前曝露於四環黴素。 •  視需要，偵測T細胞標記物之表現(例如，使用cDNA序列) 步驟8：輸出及匯集攜載經適當整合、功能活性轉基因構築體之所需T細胞純系。 步驟9：將經匯集之T細胞純系注射至提供黑色素瘤腫瘤生檢之病患內。 •  注射103 -105 個經基因工程化之T細胞。 步驟10：視需要，若使用四環黴素-可誘導啟動子，則等待經基因工程化之T細胞達成黑色素瘤腫瘤，然後向病患投與四環黴素。實例 11 ： 用經基因工程化之幹記憶 T 細胞 (TSCM) 治療黑色素瘤之方法 遵循與實例10基本上相同之方案，除以下外： •  在步驟7中：識別表現幹細記憶T細胞標記物之T細胞純系。 •  在步驟8中：匯集攜載經適當整合、功能活性轉基因構築體之TSCM純系。 •  在步驟9中：將103 至104 個經基因工程化之TSCM注射至提供黑色素瘤腫瘤生檢之病患中。實例 12 ：用經基因工程化之 T 效應記憶細胞 (TEM) 治療黑色素瘤之方法 遵循與實例10基本上相同之方案，除以下外： •  在步驟7中：識別表現T效應記憶細胞標記物之T細胞純系。 •  在步驟8中：匯集攜載經適當整合、功能活性轉基因構築體之TEM純系。 •  在步驟9中：將104 至105 個經基因工程化之TEM注射至提供黑色素瘤腫瘤生檢之病患中。實例 13 ：用經基因工程化之 TSCM 及 TEM 治療黑色素瘤之方法 遵循與實例10基本上相同之方案，除以下外： •  在步驟7中：識別表現幹記憶T細胞標記物之T細胞純系及表現T效應記憶細胞標記物之T細胞純系。 •  在步驟8中：匯集攜載經適當整合、功能活性轉基因構築體之TSCM及TEM純系。 •  在步驟9中：將104 至105 個經基因工程化之TSCM及TEM細胞注射至提供黑色素瘤腫瘤生檢之病患中。實例 14 ：用經基因工程化之 B 細胞治療黑色素瘤之方法 遵循與實例10相同之方案，除以下外： •  在步驟2中：使用抗-CD19抗體藉由FACS或MACS選擇分選細胞。 •  在步驟5中：用抗-CD20抗體標記經轉染之細胞。 •  在步驟4中作為抗-CD20抗體之替換物包括將抗IgM、IgD、CD38、CD27、CD138、PNA及GL7中之任何一者之抗體。 •  在步驟6中：於晶片上擴增個別經分離之B細胞。 •  在步驟7中：輸出1至2個B細胞以供基因體分析。 •  在步驟8中：輸出及匯集攜載經適當整合、功能活性轉基因構築體之所需血漿B細胞純系。 •  在步驟9中：注射104 至105 個經基因工程化之血漿B細胞。 實例15：用表現抗-CTLA抗體之經基因工程化之TIL治療黑色素瘤之方法 遵循與實例10至14中任一項基本上相同之方案，除以下外： •  在步驟4中：用編碼抗-CTLA-4抗體之構築體轉染TIL。實例 16 ：用表現抗-CD3抗體之經基因工程化之TIL治療黑色素瘤之方法 遵循與實例10至14中任一項基本上相同之方案，除以下外： •  在步驟4中：用編碼抗-CD3抗體之構築體轉染TIL。實例 17 ：用表現細菌超抗原之經基因工程化之TIL治療黑色素瘤之方法 遵循與實例10至14中任一項基本上相同之方案，除以下外： •  在步驟4中：用編碼SEA超抗原之構築體轉染TIL。實例 18 ：用表現促發炎多肽及基質降解酶之經基因工程化之TIL治療黑色素瘤之方法 遵循與實例10至17中任一項基本上相同之方案，除以下外： •  在步驟4中：用進一步編碼肝素酶之構築體轉染TIL。
100‧‧‧微流控裝置102‧‧‧外殼104‧‧‧支撐結構106‧‧‧微流控環路132之內表面112‧‧‧微流控環路結構114‧‧‧框架116‧‧‧微流控環路材料122‧‧‧蓋子124‧‧‧流體出入口126‧‧‧流體通路132‧‧‧微流控環路134‧‧‧流動通道136‧‧‧隔離室138‧‧‧隔離室140‧‧‧隔離室142‧‧‧連接區144‧‧‧隔離區146‧‧‧隔離結構152‧‧‧近端開口154‧‧‧遠端開口170‧‧‧控制/監測系統172‧‧‧控制模組174‧‧‧控制器176‧‧‧記憶體180‧‧‧控制/監測設備202‧‧‧介質/第一介質204‧‧‧第二介質212‧‧‧流動214‧‧‧第二流動222‧‧‧微小物體240‧‧‧流動區242‧‧‧內表面300‧‧‧微流控裝置302‧‧‧第一壁304‧‧‧第一電極306‧‧‧第二壁308‧‧‧電極活化基板310‧‧‧第二電極312‧‧‧電源314‧‧‧靶向區314a‧‧‧照明DEP電極區320‧‧‧光源322‧‧‧光/光圖案322'‧‧‧正方形圖案/光圖案336‧‧‧隔離室342‧‧‧連接區344‧‧‧隔離區346‧‧‧隔離結構352‧‧‧近端開口354‧‧‧遠端開口400‧‧‧微流控裝置402‧‧‧第一流體介質/第一介質404‧‧‧第二介質412‧‧‧微流控環路結構414‧‧‧框架416‧‧‧微流控環路材料432‧‧‧微流控環路434‧‧‧流動通道436‧‧‧生長室442‧‧‧連接區444‧‧‧隔離區446‧‧‧隔離結構472‧‧‧近端開口474‧‧‧遠端開口482‧‧‧流動484‧‧‧第二流動Dp‧‧‧最大滲透深度Lcon‧‧‧長度LC1‧‧‧長度LC2‧‧‧ 長度Wcon‧‧‧寬度Wcon1‧‧‧寬度Wcon2‧‧‧寬度Wch‧‧‧寬度WCH‧‧‧寬度
圖1A係用於分離腫瘤浸潤細胞之例示性微流控裝置之透視圖。 圖1B係圖1A之微流控裝置之側面、橫剖面圖。 圖1C係圖1A之微流控裝置之頂部、橫剖面圖。 圖1D係具有介電泳(DEP)組態之例示性微流控裝置之側橫剖面圖。 圖1E係圖1D之微流控裝置之頂部、橫剖面圖。 圖2繪示具有流動通道及隔離室之微流控裝置之一部分之實例，且其中自該流動通道至隔離室中之隔離區之連接區之長度係大於在該流動通道中流動之介質之滲透深度。 圖3係具有流動通道及隔離室之微流控裝置之一部分之另一實例，且其中該隔離室包含自該流動通道至隔離區之連接區，其係長於在流動通道中流動之介質之滲透深度。 圖4A至4C顯示具有流動通道及隔離室之微流控裝置之一部分之另一實例。 圖5顯示可作為本發明之實施例實踐之例示性工作流程。 圖6顯示來自Jurkat細胞之各種溶離份之西方墨點轉漬法。 圖7顯示塗佈經抗-CD3、抗-CD45或抗-Na/K-ATP酶抗體染色之Jurkat細胞膜溶離份之珠。 圖8顯示塗佈經與如圖7中相同之抗體染色之HEK293細胞之珠。 圖9顯示單一NanoPen™室於0、24、48、72及96小時培養下之一系列時移影像(time-lapse image)。 圖10A顯示單一NanoPen™室於0、24、48、72及96小時培養下之一系列時移影像。 圖10B顯示單一NanoPen™室於0、24、48、72、96及110小時培養下之一系列時移影像。 圖11A及11B顯示覆蓋於經選擇性擴增之T細胞之亮場影像(bright-field image)上之EdU螢光訊號。 圖12A顯示T細胞於微流控裝置之NanoPen™室之經聚葡萄糖調整之表面上之生長。 圖12B顯示自NanoPen™室移除T細胞之程度。 圖13A顯示NanoPen™室中之經擴增之T細胞。 圖13B顯示PD-1於經擴增之T細胞中之表現。 該等圖式可顯示簡化或部分視圖，及該等圖式中之元件大小可為清晰起見而經放大或否則未按比例繪製。

Claims (23)

  1. 一種經分離之腫瘤浸潤細胞，其經基因工程化以提供增加之促發炎蛋白表現；其中該促發炎蛋白不是嵌合抗原受體(CAR)，其中該腫瘤浸潤細胞係衍生自分離自實體腫瘤生檢之細胞；其中該腫瘤浸潤細胞進一步經工程化以表現基質降解酶，其中該基質降解酶係選自膠原酶、基質金屬蛋白酶及胞漿素原活化物；且其中該促發炎蛋白包含細胞介素、趨化介素、微生物抗原、抑制抗體或其組合。
  2. 如請求項1之經分離之腫瘤浸潤細胞，其經基因工程化以表現編碼轉錄活化物之外源性核酸，該轉錄活化物增加該促發炎蛋白之表現。
  3. 如請求項1之經分離之腫瘤浸潤細胞，其經基因工程化以表現編碼該促發炎蛋白之外源性核酸。
  4. 如請求項3之經分離之腫瘤浸潤細胞，其進一步包含編碼CAR之核酸。
  5. 如請求項1至4中任一項之經分離之腫瘤浸潤細胞，其中該細胞係T細胞，或其中該細胞表現至少一種選自由CD3、CD4及CD8組成之群之標記物。
  6. 如請求項1至4中任一項之經分離之腫瘤浸潤細胞，其中該細胞係NK 細胞，或其中該細胞表現至少一種選自CD56及CD16之標記物。
  7. 如請求項3之經分離之腫瘤浸潤細胞，其中該外源性核酸編碼該細胞介素。
  8. 如請求項7之經分離之腫瘤浸潤細胞，其中該細胞介素係IL-21。
  9. 如請求項3之經分離之腫瘤浸潤細胞，其中該外源性核酸編碼該趨化介素。
  10. 如請求項9之經分離之腫瘤浸潤細胞，其中該趨化介素係選自由RANTES、IP-10、CXCL9及CXCL10組成之群。
  11. 如請求項1至4中任一項之經分離之腫瘤浸潤細胞，其中該促發炎蛋白係呈融合蛋白表現。
  12. 如請求項1之經分離之腫瘤浸潤細胞，其中該抑制抗體特異性結合至CTLA-4、PD-1、PD-2、PD-L1、PD-L2、4-1BB、CD40、CD20、IgM、IgD、CD38、CD27、CD138、PNA及GL7中之一者。
  13. 一種經基因工程化之如請求項1至12中任一項之經分離之腫瘤浸潤細胞之用途，其係用於製備治療患有癌症之病患之醫藥品。
  14. 如請求項13之用途，其中該癌症係黑色素瘤、乳癌、泌尿生殖癌、神經系統癌、腸癌或肺癌。
  15. 如請求項13之用途，其中該等經基因工程化之腫瘤浸潤細胞包含以操作方式連接至可誘導啟動子之外源性核酸，且其中該醫藥品進一步包括可誘導該外源性核酸表現之藥劑，或係與可誘導該外源性核酸表現之藥劑併用。
  16. 如請求項13至15中任一項之用途，其中該醫藥品係用於向該病患投與至少103個經基因工程化之腫瘤浸潤細胞。
  17. 如請求項13至15中任一項之用途，其中該醫藥品係用於向該病患投與103-105個經基因工程化之腫瘤浸潤細胞。
  18. 如請求項17之用途，其中該等經基因工程化之腫瘤浸潤細胞包含經基因工程化之腫瘤浸潤細胞群之混合物，各群係選殖衍生自單個經基因工程化之腫瘤浸潤細胞。
  19. 如請求項18之用途，其中該混合物中至少95%的細胞來自經基因工程化之腫瘤浸潤細胞之其中一個純系群。
  20. 一種組合物，其包含經基因工程化之腫瘤浸潤細胞群之混合物，各群係選殖衍生自單個經基因工程化之如請求項1至12中任一項之經分離之 腫瘤浸潤細胞。
  21. 如請求項20之組合物，其中該混合物中至少95%的細胞係來自經基因工程化之腫瘤浸潤細胞之其中一個純系群。
  22. 如請求項20之組合物，其中該組合物包含至少104個細胞。
  23. 如請求項20至22中任一項之組合物，其進一步包含醫藥上可接受之載劑。
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