CN109922885B - 用于基因组编辑克隆的选择和传代的方法、系统和装置 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于分离具有确定的遗传修饰的细胞克隆群的方法。该方法至少部分地在包含一个或多个隔离坞的微流体装置中进行。该方法包括以下步骤：在微流体装置的对应隔离坞中维持已经受基因组编辑过程的个体细胞(或其前体)；将个体细胞扩增成各自的细胞克隆群；并在每个克隆群的一个或多个细胞中检测第一核酸序列的存在，所述第一核酸序列指示细胞克隆群中存在中靶基因组编辑。还描述了在微流体装置内进行基因组编辑的方法，以及包含根据本文公开的方法产生的一种或多种细胞克隆群的组合物。

Description

用于基因组编辑克隆的选择和传代的方法、系统和装置
领域
该领域总体而言涉及用于对细胞群进行基因组编辑的方法、系统和装置。
背景
基因组修饰技术已被用于研究基因功能几十年。多年来，该领域逐步开发出能够实现越来越大的靶特异性的工具。转座因子提供了稳定改变基因组结构的首批工具之一，但它们的靶位点特异性通常较差，使得它们整合到单个基因组内的许多不同位置。为了实现更高的靶向准确性和更少的靶向事件，开发了“靶向核酸酶”。通过将转录因子的位点特异性DNA结合域与限制酶的核酸内切酶结构域融合，形成早期靶向核酸酶。这种靶向核酸酶的实例包括锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)。通过改变DNA结合域，可以选择性地修饰这种靶向核酸酶的靶特异性。
最近开发的第三种技术基于原核成簇规律间隔短回文重复序列(ClusteredRegularly Interspersed Short Palindromic Repeat，CRISPR)-CRISPR相关(Cas)系统。在细菌和古细菌中发现，CRISPR/Cas作为适应性免疫系统起作用，其中“可编程核酸内切酶”与衍生自CRISPR转录物的小RNA相关联。小RNA将可编程核酸内切酶导向互补DNA序列，通常在感染剂(例如噬菌体)中发现，然后将其切割。为了被切割，靶位点不仅必须与CRISPRRNA互补，而且必须位于靠近由可编程核酸内切酶识别的短序列基序(ProtospacerAdjacent Motif或“PAM”)的位置。2013年，发现由Cas9核酸内切酶和单个RNA分子(称为指导RNA或“gRNA”)组成的简化版本的CRISPR/Cas系统可用于在哺乳动物细胞中诱导内源性基因组位点的靶向核溶解切割。Cong等人(2013),Multiplex genome engineering usingCRISPR/Cas systems,Science339,819-823；Mali等人(2013),RNA-guided human genomeengineering via Cas9,Science 339,823-826；Jinek等人(2013),RNA-programmedgenome editing in human cells,eLife 2,e00471。使用特异性靶向个体基因座的短gRNA编程Cas9核酸酶的相对容易性使其迅速被采用作为基因组编辑的选择方法。
在通过靶向核酸内切酶进行核溶解切割后，内源性细胞DNA修复途径被激活。DNA断裂通常通过被称为非同源末端连接(NHEJ)和同源介导的修复(HDR)的两种主要途径之一修复。在NHEJ中，通过重新连接切割的末端来修复双链断裂，而不涉及任何额外的供体或模板DNA。该修复途径易于出错，导致在断裂位点处的各种大小的插入和/或删除(插入/缺失)。因此，基因编辑的最直接形式依赖于基因功能的插入/缺失介导的破坏；例如，在基因的编码序列中引入移框突变。HDR介导的机制通过提供供体DNA作为修复模板提供了以更精确的方式编辑基因组位点的机会。虽然姐妹染色体天然可用作供体，但外源性引入的DNA可以作为供体模板，特别是在诱导双链断裂的情况下。外源性供体模板允许用任何期望序列置换内源性核苷酸。使用这种方法，突变基因可以转化为其野生型对应物，反之亦然。
尽管基因组修饰/编辑技术已经成为在基因组中引入精确的靶向改变的优良工具，但NHEJ和脱靶修饰的问题仍然存在。此外，识别NHEJ和脱靶修改可能是昂贵且耗时的。本公开尤其解决了当前基因组修饰/编辑技术中存在的这些和其他相关问题。
概述
在第一方面，公开了一种用于在具有至少一个隔离坞的微流体装置中产生遗传修饰细胞克隆群的方法。微流体装置可包括多个隔离坞。该方法可以包括：将第一细胞维持在第一隔离坞；将第一细胞扩增成细胞克隆群；在该细胞克隆群的一个或多个(但不是所有)细胞中检测第一核酸序列的存在，其中该第一核酸序列指示在细胞克隆群中存在中靶(on-target)基因组编辑。在一些实施方案中，第一细胞可以是哺乳动物细胞，例如衍生自人、猿、猴、大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、牛、猪、绵羊、马、狗或猫的细胞。在一些实施方案中，第一细胞可以是免疫细胞，例如T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或其前体。在一些实施方案中，第一细胞可以是干细胞，例如胚胎干细胞、间充质干细胞、脐静脉间充质干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、造血干细胞、脂肪来源的干细胞、牙龈干细胞、肾干细胞或神经干细胞。在一些实施方案中，第一细胞可以是祖细胞，例如骨软骨祖细胞、肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞或内皮祖细胞。
在一些实施方案中，该方法包括使第一细胞与基因组编辑生物分子接触，并将第一细胞引入微流体装置。基因组编辑生物分子可包含供体模板核酸分子。或者，该方法还可以包括使第一细胞与不同于基因组编辑生物分子的供体模板核酸分子接触。供体模板核酸分子可包括第一核酸序列的全部或部分。接触步骤可在将第一细胞引入微流体装置之前或之后进行。可以基于一个或多个特征(例如形态学、大小、目标蛋白质的产生、一种或多种细胞表面标志物的存在，和与抗体的特异性结合相互作用)选择用于转染的第一细胞。选择可以在将第一细胞加载到微流体装置中之前和/或作为将第一细胞置于隔离坞中的一部分进行。
在一些实施方案中，检测第一核酸序列包括从细胞克隆群中选择一个或多个(但不是全部)子细胞，并从一个或多个所选的子细胞中提取核酸。例如，可以在除第一隔离坞之外的微流体装置的区域中或在从微流体装置输出一个或多个子细胞之后提取核酸。提取的核酸可包括DNA(例如，基因组DNA)、RNA等。一旦提取，可以例如通过PCR或全基因组扩增(WGA)扩增核酸。
在某些实施方案中，中靶基因组编辑包括内源性DNA的缺失和/或外源性DNA在基因组的靶位点插入。插入可包含(或编码)功能性生物分子、条形码和报道分子中的至少一种。对于包括插入外源性DNA的中靶基因组编辑，检测第一核酸序列的存在可包括检测全部或部分插入。
在某些实施方案中，该方法可包括在细胞克隆群的多个细胞的一个中检测第二核酸序列和/或第三核酸序列的存在。第一核酸序列和第二核酸序列的组合可以指示细胞克隆群中存在中靶基因组编辑。第三核酸序列的存在可以指示细胞克隆群中存在脱靶基因组编辑。
在某些实施方案中，将第一细胞扩增成细胞克隆群还包括监测克隆群的细胞的一个或多个特征一段时间。可以周期性地或连续地(例如，基本上连续地)进行监测。监测可以包括识别克隆群中细胞的大小和/或形态学的变化。或者或另外地，监测可包括确定第一细胞增殖到细胞克隆群的速率，评估克隆群中细胞产生的目标蛋白质，评估克隆群的细胞中的细胞表面标志物的存在，和/或评估克隆群中的细胞与特异性结合目标抗原的抗体的反应。
在一些实施方案中，隔离坞的至少一个表面(例如，内表面)是条件化的表面。条件化的表面可包括共价连接的分子，每个分子具有与隔离坞(或其部分)的表面共价结合的连接基团和与连接基团共价结合的部分(moiety)。共价连接的分子的部分可以提供例如适于基因组编辑的第一细胞的维持和/或扩增的有机和/或亲水分子层。部分可以是包含聚乙二醇、糖或氨基酸的聚合物。在某些实施方案中，第一亚组的共价连接的分子的每个部分是包含氨基酸的聚合物，并且第二亚组的共价连接的分子的每个部分是包含聚乙二醇或糖的聚合物。
在另一方面，公开了一种用于在微流体装置内进行靶向基因组编辑的方法。微流体装置可以如本文任何其他位置所述地配置。该方法可包括以下步骤：选择用于基因组编辑的第一细胞，将第一细胞放置于微流体装置的编辑区域内，并且当第一细胞位于编辑区域内时，使第一细胞与基因组编辑生物分子接触，使得基因组编辑生物分子在靶位点编辑第一细胞的基因组。接触第一细胞可包括使第一细胞透化。使第一细胞透化可以包括例如对第一细胞进行电穿孔或化学透化。
基因组编辑生物分子可包含靶向核酸。靶向生物分子可包含DNA或RNA。基因组编辑生物分子可包含或编码核酸内切酶。核酸内切酶可以是可可编程核酸内切酶，例如Cas9、Cpfl或NgAgo。或者，核酸内切酶可以是靶向核酸内切酶，例如TALEN蛋白或锌指核酸酶(ZFN)。核酸内切酶可以与细胞穿透肽融合。基因组编辑生物分子可包含一个或多个编码靶向核酸和/或核酸内切酶的表达盒。
在某些实施方案中，基因组编辑生物分子可包含病毒载体，例如慢病毒载体或腺病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体是整合酶缺陷型。在其他实施方案中，基因组编辑生物分子可以与纳米颗粒递送载体连接。因此，使第一细胞与基因组编辑生物分子接触可包括使第一细胞与纳米颗粒递送载体接触。
在一些实施方案中，使第一细胞与基因组编辑生物分子接触还包括使第一细胞与供体模板DNA接触。例如，供体模板DNA可以结合到基因组编辑生物分子或是其部分。或者，基因组编辑生物分子和供体模板DNA可以是分开的分子实体。在一些实施方案中，供体模板DNA可包含插入序列。任选地，插入序列可包含或编码功能性生物分子、条形码序列和报道分子中的至少一种。
在另一方面，公开了包含遗传修饰细胞的克隆群的组合物。克隆群可以通过本文公开的任何一种方法产生。该组合物可包括多个遗传修饰细胞的克隆群，每个群均通过本文公开的任何一种方法产生。该组合物可包含至少1000个遗传修饰细胞，或至少10,000个遗传修饰细胞。该组合物还可包含药学上可接受的载体。
在又一方面，公开了一种具有编辑区域的微流体装置。编辑区域可以如本文任何其他地方所述地配置。例如，编辑区域可以包括支持细胞电穿孔的DEP-配置。编辑区域可包括至少一个表面，该表面是条件化的表面。微流体装置还可包括至少一个隔离坞。
在以下详述、相关附图和权利要求中公开其他方面和实施方案，或以其他方式使其他方面和实施方案变得明显。
附图的简要说明
图1A示出了根据本公开的一些实施方案的与微流体装置和相关控制设备一起使用的系统的示例。
图1B和1C示出了根据本公开的一些实施方案的微流体装置。
图2A和2B示出了根据本公开的一些实施方案的分离坞。
图2C示出了根据本公开的一些实施方案的详细的隔离坞。
图2D-F示出了根据本公开的一些其他实施方案的隔离坞。
图2G示出了根据本公开的实施方案的微流体装置。
图2H示出了根据本公开的实施方案的微流体装置的条件化的表面。
图3A示出了根据本公开的一些实施方案的与微流体装置和相关控制设备一起使用的系统的具体示例。
图3B示出了根据本公开的一些实施方案的成像装置。
图4示出了根据本公开的一些实施方案的细胞的基因组编辑方法中的步骤。
图5示出了根据本公开的一些实施方案的用于识别已经成功进行基因组编辑的细胞的方法中的步骤。
图6A和6B描绘了根据本公开的具体实施方案的基因组编辑细胞的选择。
图7A和7B描绘了根据本公开的具体实施方案的基因组编辑细胞的扩增。
图8描绘了显示根据本公开的具体实施方案的在隔离坞中分离基因组编辑细胞和检测与基因组编辑相关的标志物的图。
图9描绘了根据本公开的具体实施方案的基因组编辑细胞的克隆群。
图10描绘了根据本公开的具体实施方案的基因组编辑细胞的克隆群。
图11A-11D描绘了根据本公开的具体实施方案的将单个基因组编辑细胞扩增成细胞克隆群。
图12描绘了根据本公开的具体实施方案在九天的时间内多个基因组编辑细胞的克隆扩增的图。
图13描绘了根据本公开的具体实施方案使用核酸扩增和分析来识别中靶基因组编辑。
图14A、14B、14C和14D描绘了根据本公开的具体实施方案的在微流体装置的区域中使用电穿孔来转染细胞。
详细描述
本说明书描述了本公开的示例性实施方案和应用。然而，本公开不限于这些示例性实施方案和应用，也不限于示例性实施方案和应用在本文中操作或描述的方式。此外，附图可以示出简化或局部视图，并且附图中的要素的尺寸可能被夸大或者不成比例。另外，当本文使用术语“在......上”、“附接到”、“连接到”、“耦合到”或类似的词时，一个要素(例如，材料、层、衬底等)可以“在另一要素上”、“附接到另一要素”、“连接到另一要素”或“耦合到另一要素”，而不论该一个要素是直接在该另一要素上、附接到该另一要素、连接到该另一要素或耦合到该另一要素，还是在该一个要素和该另一元素之间有一个或多个间隔要素。此外，除非上下文另有规定，否则如果提供方向(例如，上方、下方、顶部、底部、侧面、上、下、在……下、在……上、上部、下部、水平、垂直、“x”、“y”、“z”等)的话，它们是相对的并且仅作为示例提供，并且是为了便于说明和讨论而不是作为限制。另外，在提及要素列表(例如，要素a、b、c)的情况下，这样的提及旨在包括所列要素本身中的任何一个、少于所有列出的要素的任何组合和/或所有列出的要素的组合。说明书中的章节划分仅为了便于查看，并不限制所讨论要素的任何组合。
在微流体特征的尺寸被描述为具有宽度或面积的情况下，通常相对于x轴和/或y轴尺寸来描述该尺寸，这两个尺寸都位于与微流体装置的衬底和/或盖平行的平面内。可以相对于z轴方向描述微流体特征的高度，该z轴方向垂直于平行于微流体装置的衬底和/或盖的平面。在一些情况下，微流体特征(例如通道或通路)的横截面积可以参考x轴/z轴、y轴/z轴或x轴/y轴面积。
如本文所用，“基本上”意指足以用于预期目的。因此，术语“基本上”允许由绝对或完美状态、尺寸、测量、结果等的微小的、无关紧要的变化，例如本领域普通技术人员所预期但不明显影响整体性能的变化。当与数值或者可以表示为数值的参数或特性相关地使用时，“基本上”意味着在百分之十之内。
术语“一”意味着不止一个。
如本文所用，术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
如本文所用，术语“置于”在其含义内包括“位于”。
如本文所用，“微流体装置”或“微流体设备”是这样的装置：其包括一个或多个分离的微流体管路，所述微流体管路被配置为容纳流体，每个微流体管路包括流体互连的管路元件，包括但不限于一个或多个区域、液流路径、一个或多个通道、一个或多个腔室和/或一个或多个坞(pens)；以及至少一个端口(port)，所述端口被配置为允许流体(以及任选地悬浮在流体中的微物体(micro-objects))流入和/或流出微流体装置。通常，微流体装置的微流体管路将包括液流区域(该液流区域可以包括微流体通道)和至少一个腔室，并且将容纳小于约1mL(例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2μL)的流体体积。在某些实施方案中，微流体管路容纳约1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300μL。微流体管路可以被配置为具有与微流体装置中的第一端口(例如，入口)流体性连接的第一端和与微流体装置中的第二端口(例如，出口)流体性连接的第二端。
如本文所用，“纳流体装置”(nanofluidic device)或“纳流体设备”(nanofluidicapparatus)是一种具有微流体管路的微流体装置，所述微流体管路含有至少一个管路元件，所述管路元件被配置为容纳小于约1μL的流体体积，例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1nL或更少。纳流体装置可以包括多个管路元件(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多)。在某些实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳约100pL至1nL、100pL至2nL、100pL至5nL、250pL至2nL、250pL至5nL、250pL至10nL、500pL至5nL、500pL至10nL、500pL至15nL、750pL至10nL、750pL至15nL、750pL至20nL、1至10nL、1至15nL、1至20nL、1至25nL或1至50nL的流体体积。在其他实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳约20nL至200nL、100至200nL、100至300nL、100至400nL、100至500nL、200至300nL、200至400nL、200至500nL、200至600nL、200至700nL、250至400nL、250至500nL、250至600nL、或250至750nL的流体体积。
如本文所用的“微流体通道”或“液流通道”是指微流体装置的液流区域，其长度显著长于水平和垂直尺寸。例如，液流通道可以是水平或垂直尺寸的长度的至少5倍，例如，长度的至少10倍、长度的至少25倍、长度的至少100倍、长度的至少200倍、长度的至少500倍、长度的至少1,000倍、长度的至少5,000倍，或更长。在一些实施方案中，液流通道的长度在约100,000微米至约500,000微米的范围内，包括其间的任何范围。在一些实施方案中，水平尺寸在约100微米至约1000微米(例如，约150至约500微米)的范围内，并且垂直尺寸在约25微米至约200微米的范围内，例如，约40到约150微米。应当注意，液流通道可以在微流体装置中具有各种不同的空间构造，因此不限于理想的线性元件。例如，液流通道可以是或包括具有以下配置的一个或多个部分：弯曲、弯折、螺旋、倾斜、下降，分叉(例如，多个不同的液流路径)，及其任何组合。另外，液流通道沿其路径可以具有不同的横截面积，加宽和收缩以在其中提供所需的流体流动。液流通道可以包括阀，并且阀可以是微流体领域中已知的任何类型。包括阀的微流体通道的实例公开在美国专利6,408,878和9,227,200中，其每一篇均通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“阻塞”通常是指凸块或类似类型的结构，其足够大以便部分地(但不完全地)阻碍目标微物体在微流体装置中的两个不同区域或管路元件之间的移动。两个不同的区域/管路元件可以是例如微流体隔离坞的连接区域和分离区域。
如本文所用，术语“收缩”通常是指微流体装置中的管路元件(或两个管路元件之间的界面)的宽度变窄。收缩可以位于例如本公开的微流体隔离坞的分离区域和连接区域之间的界面处。
如本文所用，术语“透明”是指允许可见光通过而在通过时基本上不改变光的材料。
如本文所用，术语“微物体”通常是指可以根据本公开分离和/或处理的任何微观物体。微物体的非限制性实例包括：无生命的微物体，例如微粒；微珠(例如，聚苯乙烯珠、LuminexTM珠等)；磁珠；微米棒(microrods)；微细线(microwires)；量子点等；生物微物体，例如细胞；生物细胞器；囊泡或复合物；合成囊泡；脂质体(例如，合成的或衍生自膜制品)；脂质纳米筏(nanoraft)等；或无生命微物体和生物微物体的组合(例如，附着于细胞的微珠、脂质体包覆的微珠、脂质体包覆的磁珠等)。珠可以包括共价或非共价连接的部分/分子，例如荧光标志物、蛋白质、碳水化合物、抗原、小分子信号传导部分或能够用于测定的其他化学/生物物质。脂质纳米筏已经被描述在例如Ritchie等人(2009)“Reconstitution ofMembrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs,”Methods Enzymol.,464:211-231中。
如本文所用，术语“细胞”可以与术语“生物细胞”互换使用。生物细胞的非限制性实例包括真核细胞；植物细胞；动物细胞，例如哺乳动物细胞、爬行动物细胞、禽类细胞、鱼细胞等；原核细胞；细菌细胞；真菌细胞；原生动物细胞等；从组织(例如肌肉、软骨、脂肪、皮肤、肝脏、肺、神经组织等)解离的细胞；免疫细胞，例如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等；胚胎(例如，受精卵)；卵母细胞；卵子；精子细胞；杂交瘤；培养的细胞；来自细胞系的细胞；癌细胞；感染的细胞；转染和/或转化的细胞；报告细胞等。哺乳动物细胞可以是例如人、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、牛、灵长类动物等。
如果集落中能够繁殖的所有活细胞是衍生自单个母细胞的子细胞，则生物细胞的集落是“克隆的”。在某些实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单个母细胞不超过10次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单个母细胞不超过14次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均来自单个母细胞不超过17次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单个母细胞不超过20次分裂。术语“克隆细胞”是指同一克隆集落的细胞。
如本文所用，生物细胞的“集落”是指2个或更多个细胞(例如约2至约20、约4至约40、约6至约60、约8至约80、约10至约100、约20至约200、约40至约400、约60至约600、约80至约800、约100至约1000或大于1000个细胞)。
如本文所用，术语“维持(一个或多个)细胞”是指提供包含流体和气体组分以及任选的表面的环境，其提供保持细胞存活和/或扩增所必需的条件。
如本文所用，术语“扩增”在提及细胞时指的是细胞数目的增加。
流体培养基的“组分”是培养基中存在的任何化学或生物化学分子，包括溶剂分子、离子、小分子、抗生素、核苷酸和核苷、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、脂质、脂肪酸、胆固醇、代谢物等。
如本文所用，“捕获部分”是为微物体提供识别位点的化学或生物物质、功能或基序。所选类型的微物体可以识别原位产生的捕获部分，并且可以与原位产生的捕获部分结合或与其具有亲和力。非限制性实例包括抗原、抗体和细胞表面结合基序。
如本文所用，“可流动聚合物”是可溶于或可分散于流体培养基中的聚合物单体或大分子单体(例如，预聚物溶液)。可流动聚合物可以被输入到微流体液流区域并与其中的流体培养基的其他组分一起流动。
如本文所用，“光引发聚合物”是指这样的聚合物(或可用于产生聚合物的单体分子)：其在暴露于光时能够共价交联，形成特定的共价键，改变固定化化学模体(motif)周围的区域选择性化学，或者形成导致物理状态变化的离子对，从而形成聚合物网络。在一些情况下，光引发聚合物可以包括这样的聚合物区段：其与一个或多个能够共价交联的化学部分结合，形成特定的共价键，改变固定化化学模体周围的区域选择性化学，或形成导致物理状态变化的离子对。在一些情况下，光引发聚合物可能需要可光活化的自由基引发剂以引发聚合物网络的形成(例如，通过聚合物的聚合)。
如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)，且包括多克隆和单克隆抗体两者；灵长类化的(primatized)(例如，人源化的)；鼠类；小鼠-人；小鼠-灵长类；和嵌合的；并且可以是完整分子、其片段(例如scFv、Fv、Fd、Fab、Fab'和F(ab)'2片段)或者完整分子和/或片段的多聚体或聚集物；并且可以天然存在或者例如通过免疫、合成或基因工程产生。如本文所用，“抗体片段”是指衍生自抗体或与抗体相关的片段，其与抗原结合并且在一些实施方案中可以被衍生化以表现出通过例如掺入半乳糖残基而促进清除和摄取的结构特征。这包括例如F(ab)、F(ab)'2、scFv、轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)及其组合。
如本文关于流体培养基所用，“使…扩散(diffuse)”和“扩散(diffusion)”是指流体培养基的组分沿着浓度梯度向下的热力学移动。
短语“培养基的流动”意味着流体培养基主要是由于除扩散之外的任何机制的整体移动。例如，培养基的流动可以包括流体培养基由于点之间的压力差而从一个点移动到另一个点。这样的流动可以包括液体的连续的、脉冲的、周期的、随机的、间歇的或往复的流动，或其任何组合。当一种流体培养基流入另一种流体培养基时，可能导致培养基的湍流和混合。
短语“基本上没有流动”是指流体培养基的流速在时间上的平均值小于材料(例如，目标分析物)的组分扩散到流体培养基中或在流体培养基内扩散的速率。这样的材料的组分的扩散速率可以取决于例如温度、组分的大小以及组分和流体培养基之间的相互作用的强度。
如本文关于微流体装置内的不同区域所用的，短语“流体性连接”是指当不同区域基本上充满流体(例如流体培养基)时，每个区域中的流体被连接以形成流体的单个本体。这并不意味着不同区域中的流体(或流体培养基)在组成上必然相同。相反，微流体装置的不同流体性连接的区域中的流体可以具有不同的组成(例如，不同浓度的溶质，例如蛋白质、碳水化合物、离子或其它分子)，当溶质沿着其各自的浓度梯度向下移动和/或流体流过微流体装置时，这些组成处于变化中。
如本文所用，“液流路径”是指一个或多个流体性连接的管路元件(例如，一个或多个通道、一个或多个区域、一个或多个腔室等)，其限定培养基流动的轨迹并受培养基流动的轨迹影响。因此，液流路径是微流体装置的扫过(swept)区域的示例。其他管路元件(例如，未扫过(unswept)区域)可以与包括液流路径的管路元件为流体性连接，而不经受液流路径中的培养基流动的影响。
如本文所用，“分离微物体”将微物体限制在微流体装置内的限定区域。微物体可能仍然能够在原位产生的捕获结构内运动。
微流体(或纳流体)装置可以包括“扫过”(swept)区域和“未扫过”(unswept)区域。如本文所用，“扫过”区域包括微流体管路的一个或多个流体性互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件经受培养基的流动。扫过区域的管路元件可以包括例如区域、通道以及腔室的全部或部分。如本文所用，“未扫过”区域包括微流体管路的一个或多个流体性互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件基本上都不经受流体的流动。未扫过区域可以流体性连接到扫过区域，条件是流体性连接被配置为在扫过区域和未扫过区域之间能够实现扩散培养基但基本上没有培养基的流动。因此，微流体装置可以被配置为基本上将未扫过区域与扫过区域中的培养基的流分离，同时在扫过区域和未扫过区域之间基本上仅能够实现扩散性流体连通。例如，微流体装置的液流通道是扫过区域的示例，而微流体装置的分离区域(下文进一步详细描述)是未扫过区域的示例。
可以在这种微流体装置中测定生物微物体(例如，生物细胞)产生特定生物材料(例如，蛋白质，例如抗体)的能力。在测定的一个特定实施方案中，可以将包含待测定的用于产生目标分析物的生物微物体(例如，细胞)的样品材料加载到微流体装置的扫过区域中。可以选择具有特定特征的那些生物微物体(例如，哺乳动物细胞，例如人细胞)并将其置于未扫过区域中。然后，可以使剩余的样品材料从扫过区域流出，并使测定材料流入到扫过区域中。因为所选的生物微物体处于未扫过区域中，所以所选的生物微物体基本上不受剩余样品材料的流出或测定材料的流入的影响。可以允许所选的生物微物体产生目标分析物，其可以从未扫过区域扩散到扫过区域中，在其中目标分析物可以与测定材料反应以产生局部的可检测的反应，每个反应可以与特定的未扫过区域相关联。可以分析与检测到的反应相关的任何未扫过区域，以确定未扫过区域中的哪些生物微物体(如果有的话)是足够的目标分析物的生产者。
微流体装置和用于操作和观察这种装置的系统。图1A示出了可以用于产生遗传修饰细胞的克隆群的微流体装置100和系统150的实例。示出了微流体装置100的透视图，其盖110被部分切除以提供微流体装置100中的局部视图。微流体装置100通常包括具有液流路径106的微流体管路120，流体培养基180(可以任选地携带一个或多个微物体(未示出))经过液流路径106流入和/或流过微流体管路120。虽然在图1A中示出了单个微流体管路120，但合适的微流体装置可以包括多个(例如，2或3个)这样的微流体管路。无论如何，微流体装置100可以被配置为纳流体装置。如图1A所示，微流体管路120可以包括多个微流体隔离坞124、126、128和130，其中每个隔离坞均可以具有与液流路径106流体性连通的一个或多个开口。在图1A的装置的一些实施方案中，隔离坞可以仅具有与液流路径106流体性连通的单个开口。如下文进一步讨论的，微流体隔离坞包括已被优化用于即使当培养基180流过液流路径106时，仍然将微物体保留在微流体装置(例如微流体装置100)中的各种特征和结构。然而，在描述上述之前，提供了对微流体装置100和系统150的简要说明。
如图1A中大体示出的，微流体管路120由外壳102来限定。尽管外壳102可以被物理地构造成不同的配置，但是在图1A所示的实例中，外壳102被描绘为包括支撑结构104(例如，基部)、微流体管路结构108和盖110。支撑结构104、微流体管路结构108和盖110可以彼此附接。例如，微流体管路结构108可以被布置在支撑结构104的内表面109上，并且盖110可以被布置在微流体管路结构108上方。微流体管路结构108与支撑结构104和盖110一起可以限定微流体管路120的元件。
如图1A所示，支撑结构104可以位于微流体管路120的底部，盖110可以位于微流体管路120的顶部。或者，支撑结构104和盖110可以以其他取向来配置。例如，支撑结构104可以位于微流体管路120的顶部，盖110可以位于微流体管路120的底部。无论如何，可以存在一个或多个端口107，每个端口107均包括进入或流出外壳102的通路。通路的实例包括阀、门、通孔等。如图所示，端口107是由微流体管路结构108中的间隙形成的通孔。然而，端口107可以位于外壳102的其他组件(例如盖110)中。图1A中仅示出了一个端口107，但微流体管路120可以具有两个或更多个端口107。例如，可以存在第一端口107，其用作流体进入微流体管路120的入口，并且可以存在第二端口107，其用作流体离开微流体管路120的出口。端口107是用作入口还是出口可以取决于流体流过液流路径106的方向。
支撑结构104可以包括一个或多个电极(未示出)和一个衬底或多个互连的衬底。例如，支撑结构104可以包括一个或多个半导体衬底，每个半导体衬底电连接到电极(例如，半导体衬底的全部或一部分可以电连接到单个电极)。支撑结构104可以进一步包括印刷电路板组件(“PCBA”)。例如，半导体衬底可以安装在PCBA上。
微流体管路结构108可以限定微流体管路120的管路元件。当微流体管路120填充有流体时，这样的管路元件可以包括可以流体性互连的空间或区域，例如液流区域(其可以包括或者是一个或多个液流通道)、腔室、坞、阱(trap)等。在图1A所示的微流体管路120中，微流体管路结构108包括框架114和微流体管路材料116。框架114可以部分地或完全地包围微流体管路材料116。框架114可以是例如基本上包围微流体管路材料116的相对刚性的结构。例如，框架114可以包括金属材料。
微流体管路材料116可以用空腔等进行图案化(patterned)，以限定微流体管路120的管路元件和互连。微流体管路材料116可以包括柔性材料，例如柔性聚合物(例如橡胶、塑料、弹性体、硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)等)，其可以是透气性的。可以构成微流体管路材料116的材料的其他实例包括模制玻璃；可蚀刻材料，例如硅氧烷(例如，可光图案化的硅氧烷或“PPS”)、光致抗蚀剂(例如，SU8)等。在一些实施方案中，此类材料(以及因此微流体管路材料116)可以是刚性的和/或基本上不透气的。无论如何，微流体管路材料116可以被布置在支撑结构104上和框架114内部。
盖110可以是框架114和/或微流体管路材料116的集成(integral)部件。或者，盖110可以是结构上不同的元件，如图1A所示。盖110可以包括与框架114和/或微流体管路材料116相同或不同的材料。类似地，支撑结构104可以是与框架114或微流体管路材料116分开的结构(如图所示)，或者是框架114或微流体管路材料116的集成部件。同样地，框架114和微流体管路材料116可以是如图1A所示的分离结构或同一结构的集成部件。
在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有类似性质的材料。在一些实施方案中，盖110可以包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，例如PDMS。在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料和可变形材料两者。例如，盖110的一个或多个部分(例如，位于隔离坞124、126、128、130上方的一个或多个部分)可以包括与盖110的刚性材料相交界的可变形材料。在一些实施方案中，盖110可以进一步包括一个或多个电极。该一个或多个电极可以包括导电氧化物，例如氧化铟锡(ITO)，其可以被涂覆在玻璃或类似的绝缘材料上。或者，该一个或多个电极可以是嵌入在可变形材料例如聚合物(例如PDMS)中的柔性电极，例如单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合。已经在例如US 2012/0325665(Chiou等人)中描述了可以用于微流体装置中的柔性电极，其内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，可以修饰盖110(例如，通过条件化向内朝向微流体管路120的表面的全部或一部分)以支持细胞贴附、活力和/或生长。该修饰可以包括合成或天然聚合物的涂层。在一些实施方案中，盖110和/或支撑结构104可以是透光的。盖110还可包括至少一种可透气的材料(例如，PDMS或PPS)。
图1A还示出了用于操作和控制微流体装置(例如微流体装置100)的系统150。系统150包括电源192、成像装置(结合在成像模块164内)以及倾斜装置190(并入倾斜模块166内)。
电源192可以向微流体装置100和/或倾斜装置190提供电力，根据需要提供偏置电压或电流。电源192可以例如包括一个或多个交流(AC)和/或直流(DC)电压或电流源。成像装置(成像模块164的一部分，如下文所讨论的)可以包括用于捕捉微流体管路120内的图像的装置，例如数码相机。在一些情况下，成像装置进一步包括具有快速帧速率和/或高灵敏度(例如，用于低光应用)的检测器。成像装置还可以包括用于将刺激性辐射和/或光束引导到微流体管路120中并收集从微流体管路120(或其中包含的微物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。所发射的光束可以在可见光谱中，并且可以例如包括荧光发射。所反射的光束可以包括源自LED或诸如汞灯(例如高压汞灯)或氙弧灯的宽光谱灯的反射的发射。如关于图3B所讨论的，成像装置可以进一步包括显微镜(或光具组)，其可以包括或不包括目镜。
系统150进一步包括倾斜装置190(倾斜模块166的一部分，如下文所讨论的)，其被配置为使微流体装置100围绕一个或多个旋转轴旋转。在一些实施方案中，倾斜装置190被配置为围绕至少一个轴来支撑和/或保持包括微流体管路120的外壳102，使得微流体装置100(以及因此微流体管路120)可以保持在水平取向(即，相对于x轴和y轴为0°)、垂直取向(即，相对于x轴和/或y轴为90°)或其间的任何取向。微流体装置100(和微流体管路120)相对于轴的取向在本文中被称为微流体装置100(和微流体管路120)的“倾斜”。例如，倾斜装置190可以使微流体装置100相对于x轴倾斜0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或其间的任何角度。水平取向(以及因此x轴和y轴)被定义为垂直于由重力限定的垂直轴。倾斜装置还可以使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴和/或y轴倾斜任何大于90°的角度，或者使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴或y轴倾斜180°，以便完全反转微流体装置100(和微流体管路120)。类似地，在一些实施方案中，倾斜装置190使微流体装置100(和微流体管路120)围绕由液流路径106或微流体管路120的一些其他部分限定的旋转轴倾斜。
在一些情况下，将微流体装置100倾斜成垂直取向，使得液流路径106位于一个或多个隔离坞的上方或下方。如本文所用的术语“上方”表示液流路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上高于一个或多个隔离坞(即，在液流路径106上方的隔离坞中的物体会具有比液流路径中的物体更高的重力势能)。如本文所用的术语“下方”表示液流路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上低于一个或多个隔离坞(即，在液流路径106下方的隔离坞中的物体会具有比液流路径中的物体更低的重力势能)。
在一些情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕平行于液流路径106的轴倾斜。此外，微流体装置100可以被倾斜至小于90°的角度，使得液流路径106位于一个或多个隔离坞的上方或下方，而不是位于隔离坞的正上方或正下方。在其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕垂直于液流路径106的轴倾斜。在另外其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕既不平行也不垂直于液流路径106的轴倾斜。
系统150可以进一步包括培养基源178。培养基源178(例如，容器、贮液器等)可以包括多个部分或容器，每个部分或容器均用于容纳不同的流体培养基180。因此，如图1A所示培养基源178可以是在微流体装置100外部并与之分离的装置。或者，培养基源178可以全部或部分地位于微流体装置100的外壳102内部。例如，培养基源178可以包括作为微流体装置100的一部分的贮液器。
图1A还示出了描绘构成系统150的一部分并且可以与微流体装置100结合使用的控制和监测设备152的实例的简化框图。如图所示，这种控制和监测设备152的实例包括主控制器154，其包括培养基模块160，用于控制培养基源178；运动模块162，用于控制微流体管路120中的微物体(未示出)和/或培养基(例如，培养基液滴)的移动和/或选择；成像模块164，用于控制成像装置(例如，照相机、显微镜、光源或其任何组合)以捕捉图像(例如，数字图像)；以及倾斜模块166，用于控制倾斜装置190。控制设备152还可以包括其他模块168，用于控制、监测或执行关于微流体装置100的其他功能。如图所示，设备152可以进一步包括显示装置170和输入/输出装置172。
主控制器154可以包括控制模块156和数字存储器158。控制模块156可以包括例如数字处理器，该数字处理器被配置为根据被存储为存储器158中的非暂态数据或信号的机器可执行指令(例如，软件、固件、源代码等)进行操作。替代地或另外地，控制模块156可以包括硬连线数字电路和/或模拟电路。可以类似地配置培养基模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168。因此，可以由如上文所讨论地配置的主控制器154、培养基模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168中的任意一个或多个来实施本文所讨论的针对微流体装置100或任何其他微流体设备所执行的功能、过程、动作、行动或过程的步骤。类似地，主控制器154、培养基模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168可以通信地耦接，以发送和接收本文所讨论的任何功能、过程、动作、行动或步骤中使用的数据。
培养基模块160控制培养基源178。例如，培养基模块160可以控制培养基源178，以将所选的流体培养基180输入到外壳102中(例如，通过入口端口107)。培养基模块160还可以控制从外壳102中移除培养基(例如，通过出口端口(未示出))。因此，可以将一种或多种培养基选择性地输入到微流体管路120中以及从其中移除。培养基模块160还可以控制微流体管路120内的液流路径106中的流体培养基180的流动。例如，在一些实施方案中，在倾斜模块166使倾斜装置190将微流体装置100倾斜到期望的倾斜角度之前，培养基模块160停止培养基180在液流路径106中和通过外壳102的流动。
运动模块162可以被配置为控制微流体管路120中的微物体(未示出)的选择、捕集和移动。如下文参考图1B和1C所讨论的，外壳102可以包括介电电泳(DEP)、光电镊子(OET)和/或光电润湿(OEW)配置(图1A中未示出)，并且运动模块162可以控制电极和/或晶体管(例如，光电晶体管)的激活，以选择和移动液流路径106和/或隔离坞124、126、128、130中的微物体(未示出)和/或培养基液滴(未示出)。
成像模块164可以控制成像装置。例如，成像模块164可以接收和处理来自成像装置的图像数据。来自成像装置的图像数据可以包括由成像装置捕捉的任何类型的信息(例如，存在或不存在微物体、培养基液滴、标记(例如荧光标记)的累积等)。通过使用由成像装置捕捉的信息，成像模块164可以进一步计算微流体装置100内物体(例如，微物体、培养基液滴)的位置和/或这些物体的运动速率。
倾斜模块166可以控制倾斜装置190的倾斜运动。替代地或另外地，倾斜模块166可以控制倾斜速率和时间，以优化微物体经由重力向一个或多个隔离坞的转移。倾斜模块166与成像模块164通信地耦接，以接收描述微流体管路120中的微物体和/或培养基液滴的运动的数据。通过使用该数据，倾斜模块166可以调节微流体管路120的倾斜，以便调节微物体和/或培养基液滴在微流体管路120中移动的速率。倾斜模块166还可以使用该数据来迭代地调节微流体管路120中的微物体和/或培养基液滴的位置。
在图1A所示的实例中，微流体管路120被示为包括微流体通道122和隔离坞124、126、128、130。每个坞均包括通向通道122的开口，但是其他部分被包围，使得坞可以将坞内的微物体与通道122的液流路径106或其他坞中的流体培养基180和/或微物体基本上分离。隔离坞的壁从底座的内表面109延伸到盖110的内表面，以提供外壳。坞到微流体通道122的开口被取向为与流体培养基180的流动106成一角度，使得流106不被引导到坞中。流动可以与坞的开口的平面相切或垂直。在一些情况下，坞124、126、128、130被配置为物理地围住微流体管路120内的一个或多个微物体。根据本公开的隔离坞可以包括各种形状、表面和特征，如下文将详细讨论和示出的，其被优化为与DEP、OET、OEW、流体流和/或重力一起使用。
微流体管路120可以包括任何数目的微流体隔离坞。尽管示出了五个隔离坞，但微流体管路120可以具有更少或更多的隔离坞。如图所示，微流体管路120的微流体隔离坞124、126、128和130各自包括不同的特征和形状，这些特征和形状可以提供用于产生细胞克隆群(例如从其他遗传修饰细胞分离一个遗传修饰细胞)的一个或多个益处。遗传修饰细胞的生长、分析和任选的传代(例如通过在有助于遗传修饰细胞形成的条件下使细胞与基因组编辑生物分子接触)全部可以基于个体进行，并且在一些实施方案中，可以在个体时间量程上(on an individual time scale)进行。在一些实施方案中，微流体管路120包括多个相同的微流体隔离坞。
在一些实施方案中，微流体管路120包括多个微流体隔离坞，其中两个或更多个隔离坞包含不同的结构和/或特征，其在产生和分析遗传修饰细胞的克隆群方面提供不同的益处。一个非限制性实例可以包括在一种类型的坞中将单细胞扩增成细胞克隆集落，同时在不同类型的坞中从克隆集落的一个或多个细胞提取核酸。在另一个实施方案中，至少一个隔离坞可以配置成具有适合于细胞电穿孔的电接触。用于产生遗传修饰细胞的克隆群的微流体装置可以包括隔离坞124、126、128和130的任何一个或其变体，和/或可以包括如下讨论的类似于图2B、2C、2D、2E和2F所示的那些配置的坞。
在图1A所示的实施方案中，示出了单个通道122和液流路径106。然而，其他实施方案可以含有多个通道122，每个通道均被配置为包括液流路径106。微流体管路120进一步包括与液流路径106和流体培养基180流体连通的入口阀或端口107，由此流体培养基180可以经由入口端口107进入通道122。在一些情况下，液流路径106包括单个路径。在一些情况下，单个路径被布置为Z字形图案，由此液流路径106以交替的方向穿过微流体装置100两次或更多次。
在一些情况下，微流体管路120包括多个平行的通道122和液流路径106，其中每个液流路径106内的流体培养基180沿相同的方向流动。在一些情况下，每个液流路径106内的流体培养基沿正向或反向中的至少一个方向流动。在一些情况下，配置多个隔离坞(例如，相对于通道122)，使得隔离坞可以并行地加载目标微物体。
在一些实施方案中，微流体管路120进一步包括一个或多个微物体阱132。阱132通常形成在形成通道122的边界的壁中，并且可以与微流体隔离坞124、126、128、130中的一个或多个的开口相对地设置。在一些实施例中，阱132被配置为从液流路径106接收或捕获单个微物体。在一些实施方案中，阱132被配置为从液流路径106接收或捕获多个微物体。在一些情况下，阱132包括基本上等于单个目标微物体的体积的体积。
阱132还可以包括开口，其被配置为帮助目标微物体流入阱132。在一些情况下，阱132包括开口，该开口的高度和宽度基本上等于单个目标微物体的尺寸，由此防止更大的微物体进入微物体阱。阱132可以进一步包括被配置为帮助将目标微物体保留在阱132内的其他特征。在一些情况下，阱132相对于微流体隔离坞的开口对准并且位于通道122的相对侧上，使得当微流体装置100围绕平行于微流体通道122的轴倾斜时，被捕集的微物体按照使得微物体落入隔离坞的开口中的轨迹离开阱132。在一些情况下，阱132包括小于目标微物体的侧通道134，以便有助于穿过阱132的流，从而增加在阱132中捕获微物体的可能性。
在一些实施方案中，经由一个或多个电极(未示出)将介电电泳(DEP)力施加在流体培养基180(例如，在液流路径中和/或在隔离坞中)上，以操纵、运输、分离和分类位于其中的微物体。例如，在一些实施方案中，将DEP力施加到微流体管路120的一个或多个部分，以便将单个微物体从液流路径106转移到期望的微流体隔离坞中。在一些实施方案中，使用DEP力来防止隔离坞(例如，隔离坞124、126、128或130)内的微物体从其中被移位。此外，在一些实施方案中，使用DEP力来从隔离坞中选择性地移除先前根据本公开的实施方案收集的微物体。在一些实施方案中，DEP力包括光电镊子(OET)力。
在其他实施方案中，通过一个或多个电极(未示出)将光电润湿(OEW)力施加到微流体装置100的支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置(例如，有助于限定液流路径和/或多个隔离坞的位置)，以操纵、运输、分离和分类位于微流体管路120中的液滴。例如，在一些实施方案中，将OEW力施加到支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置，以将单个液滴从液流路径106转移到期望的微流体隔离坞中。在一些实施方案中，使用OEW力来防止隔离坞(例如，隔离坞124、126、128或130)内的液滴从其中被移位。此外，在一些实施方案中，使用OEW力来从隔离坞中选择性地去除先前根据本公开的实施方案收集的液滴。
在一些实施方案中，将DEP和/或OEW力与其他力(例如流动和/或重力)组合，以便操纵、运输、分离和分类微流体管路120内的微物体和/或液滴。例如，可以将外壳102倾斜(例如，通过倾斜装置190)，以将液流路径106和位于其中的微物体定位在微流体隔离坞的上方，并且重力可以将微物体和/或液滴运输到坞中。在一些实施方案中，可以在施加其他力之前施加DEP和/或OEW力。在其他实施方案中，可以在施加其他力之后施加DEP和/或OEW力。在其他情况下，可以在施加其他力的同时或者以与其他力交替的方式施加DEP和/或OEW力。
图1B、1C和2A-2H示出了可以用于实施本公开的实施方案的微流体装置的各种实施方案。图1B描述了其中微流体装置200被配置为光致动的电动力学装置的实施方案。本领域已知多种光致动的电动力学装置，包括具有光电镊子(OET)配置的装置和具有光电润湿(OEW)配置的装置。在以下美国专利文献中示出了合适的OET配置的实例，其均通过引用整体并入本文：美国专利号RE 44,711(Wu等人)(最初以美国专利号7,612,355颁发)；和美国专利号7,956,339(Ohta等人)。美国专利号6,958,132(Chiou等人)和美国专利申请公开号2012/0024708(Chiou等人)中示出了OEW配置的实例，上述两者都通过引用整体并入本文。光致动的电动力学装置的另一个实例包括组合的OET/OEW配置，在美国专利公开号20150306598(Khandros等人)和20150306599(Khandros等人)以及其对应的PCT公开WO2015/164846和WO2015/164847中示出其实例，其均通过引用整体并入本文。
已经在例如US 2014/0116881(申请号14/060,117，2013年10月22日提交)、US2015/0151298(申请号14/520,568，2014年10月22日提交)和US 2015/0165436(申请号14/521,447，2014年10月22日提交)中描述了具有坞的微流体装置的实例，其中可以放置、培养和/或监测生物微物体(例如细胞，如哺乳动物细胞，包括免疫细胞和干细胞)，这些申请中的每一个都通过引用整体并入本文。美国申请号14/520,568和14/521,447也描述了分析在微流体装置中培养的细胞的分泌的示例性方法。前述申请中的每一个进一步描述了微流体装置，其被配置为产生介电电泳(DEP)力，例如光电镊子(OET)，或被配置为提供光电润湿(OEW)。例如，US 2014/0116881的图2中所示的光电镊子装置是可以在本公开的实施方案中用于选择和移动单个生物微物体或一组生物微物体的装置的实例。
微流体装置运动配置。如上文所述，系统的控制和监测设备可以包括运动模块，用于选择和移动微流体装置的微流体管路中的物体，例如微物体或液滴。微流体装置可以具有各种运动配置，这取决于被移动物体的类型和其他考虑因素。例如，可以使用介电电泳(DEP)配置来选择和移动微流体管路中的微物体。因此，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括DEP配置，其用于在微流体管路120中的流体培养基180中的微物体上选择性地诱导DEP力，从而选择、捕获和/或移动单个微物体或微物体组。或者，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括电润湿(EW)配置，其用于在微流体管路120中的流体培养基180中的液滴上选择性地诱导EW力，从而选择、捕获和/或移动单个液滴或液滴组。
图1B和IC中示出了包含DEP配置的微流体装置200的一个实例。虽然为了简化的目的，图1B和1C分别示出了具有区域/腔室202的微流体装置200的外壳102的一部分的侧截面图和顶截面图，但应当理解，区域/腔室202可以是具有更详细结构的流体管路元件的一部分，例如生长室、隔离坞、液流区域或液流通道。此外，微流体装置200可以包括其他流体管路元件。例如，微流体装置200可以包括多个生长室或隔离坞和/或一个或多个液流区域或液流通道，例如本文关于微流体装置100所描述的那些。DEP配置可以被结合到微流体装置200的任何这种流体管路元件中，或者其选择的部分中。还应当理解，上文或下文描述的微流体装置组件和系统组件中的任一个可以被结合到微流体装置200中和/或与微流体装置200组合使用。例如，上述包括控制和监测设备152的系统150可以与微流体装置200一起使用，该微流体装置200包括培养基模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和其他模块168中的一个或多个。
如图1B所示，微流体装置200包括具有底部电极204和覆盖底部电极204的电极活化衬底206的支撑结构104，以及具有顶部电极210的盖110，顶部电极210与底部电极204间隔开。顶部电极210和电极活化衬底206限定区域/腔室202的相对表面。因此，包含在区域/腔室202中的培养基180在顶部电极210和电极活化衬底206之间提供电阻连接(resistiveconnection)。还示出了电源212，其被配置为连接到底部电极204和顶部电极210并且在这些电极之间产生偏置电压，如在区域/腔室202中产生DEP力所需要的。电源212可以是例如交流(AC)电源。
在某些实施方案中，图1B和1C中所示的微流体装置200可以具有光致动的DEP配置。因此，改变来自光源216的光218的图案(其可以由运动模块162控制)可以选择性地激活和去激活电极活化衬底206的内表面208的区域214处的DEP电极的变化图案。(下文中，具有DEP配置的微流体装置的区域214被称为“DEP电极区域”。)如图1C所示，指向电极活化衬底206的内表面208的光图案218可以以诸如正方形的图案照亮选择的DEP电极区域214a(以白色示出)。在下文中将未被照射的DEP电极区域214(交叉阴影线)称为“暗”DEP电极区域214。通过DEP电极活化衬底206(即，从底部电极204直到与液流区域106中的培养基180相交界的电极活化衬底206的内表面208)的相对电阻抗大于在每个暗DEP电极区域214处通过区域/腔室202中的培养基180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对电阻抗。然而，被照亮的DEP电极区域214a表现出通过电极活化衬底206的减小的相对阻抗，其小于通过每个被照亮的DEP电极区域214a处的区域/腔室202中培养基180的相对阻抗。
在电源212被激活的情况下，前述DEP配置在照射的DEP电极区域214a和相邻的暗DEP电极区域214之间的流体培养基180中产生电场梯度，这又产生了吸引或排斥流体培养基180中附近微物体(未示出)的局部DEP力。因此，通过改变从光源216投射到微流体装置200中的光图案218，可以在区域/腔室202的内表面208处的许多不同的此类DEP电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥流体培养基180中微物体的DEP电极。DEP力是吸引还是排斥附近的微物体可以取决于诸如电源212的频率和培养基180和/或微物体(未示出)的介电特性之类的参数。
图1C中所示的被照亮的DEP电极区域214a的方形图案220仅是一个实例。可以通过投射到微流体装置200中的光图案218照亮(并由此激活)DEP电极区域214的任何图案，并且可以通过改变或移动光图案218来重复地改变被照亮/激活的DEP电极区域214的图案。
在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料或由其组成。在这样的实施方案中，电极活化衬底206的内表面208可以是无特征的。例如，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅(a-Si:H)层或由其组成。a-Si:H可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-Si:H层可以具有约500nm至约2.0μm的厚度。在这样的实施方案中，根据光图案218，可以在电极活化衬底206的内表面208上的任何地方以任何图案形成DEP电极区域214。因此，无需固定DEP电极区域214的数目和图案，但是可以将其对应于光图案218。已经在例如美国专利号RE44,711(Wu等人)(最初颁布为美国专利号7,612,355)中描述了具有包括光电导层(例如上文所述的光电导层)的DEP配置的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。
在其他实施方案中，电极活化衬底206可以包括衬底，该衬底包括多个掺杂层、电绝缘层(或区域)和形成半导体集成电路的导电层，例如在半导体领域中已知的。例如，电极活化衬底206可以包括多个光电晶体管，包括例如横向双极光电晶体管，每个光电晶体管均对应于DEP电极区域214。或者，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)，其中每个这样的电极均对应于DEP电极区域214。电极活化衬底206可以包括此类光电晶体管或光电晶体管控制的电极的图案。例如，该图案可以是排列成行和列的基本上为正方形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列，如图2B所示。或者，图案可以是形成六边点格(hexagonal lattice)的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列。无论图案如何，电路元件都可以在电极活化衬底206的内表面208处的DEP电极区域214与底部电极210之间形成电连接，并且可以由光图案218选择性地激活和去激活那些电连接(即，光电晶体管或电极)。当未被激活时，每个电连接都可以具有高阻抗，使得通过电极活化衬底206的相对阻抗(即，从底部电极204到与区域/腔室202中的培养基180相交界的电极活化衬底206的内表面208)大于在相应的DEP电极区214处通过培养基180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对阻抗。然而，当被光图案218中的光激活时，通过电极活化衬底206的相对阻抗小于在每个被照亮的DEP电极区域214处通过培养基180的相对阻抗，从而在相应DEP电极区域214处激活DEP电极，如上所述。因此，以光图案218所确定的方式，可以在区域/腔室202中的电极活化衬底206的内表面208处的许多不同的DEP电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥培养基180中的微物体(未示出)的DEP电极。
已经在例如美国专利号7,956,339(Ohta等人)(参见例如图21和22中所示的装置300及其描述)和美国专利公开号2016/0184821(Hobbs等人)(参见例如整个附图中所示的装置200、502、504、600和700及其描述)中描述了具有包含光电晶体管的电极活化衬底的微流体装置的实例，每一个的全部内容均通过引用并入本文。已经在例如美国专利公开号2014/0124370(Short等人)(参见例如整个附图中所示的装置200、400、500、600和900及其描述)中描述了具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。
在DEP配置的微流体装置的一些实施方案中，顶部电极210是外壳102的第一壁(或盖110)的一部分，并且电极活化衬底206和底部电极204是外壳102的第二壁(或支撑结构104)的一部分。区域/腔室202可以位于第一壁和第二壁之间。在其他实施方案中，电极210是第二壁(或支撑结构104)的一部分，并且电极活化衬底206和/或电极210中的一个或两个是第一壁(或盖110)的一部分。此外，光源216可以替代地用于从下方照亮外壳102。
利用具有DEP构造的图1B-1C的微流体装置200，通过将光图案218投射到微流体装置200中，以便以围绕并捕获微物体的图案(例如，正方形图案220)来激活电极活化衬底206的内表面208的DEP电极区域214a处的第一组一个或多个DEP电极，运动模块162可以选择区域/腔室202中的培养基180中的微物体(未示出)。然后，通过相对于微流体装置200移动光图案218以激活DEP电极区域214处的第二组一个或多个DEP电极，运动模块162可以移动原位产生的捕获的微物体。或者，可以相对于光图案218来移动微流体装置200。
在其他实施方案中，微流体装置200可以具有不依赖于电极活化衬底206的内表面208处的DEP电极的光激活的DEP配置。例如，电极活化衬底206可以包括位于与包括至少一个电极的表面(例如，盖110)相对的位置的选择性可寻址且可激发的电极。可以选择性地打开和闭合开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)以激活或去激活DEP电极区域214处的DEP电极，从而在激活的DEP电极附近的区域/腔室202中的微物体(未示出)上产生净DEP力。取决于诸如电源212的频率和区域/腔室202中的培养基(未示出)和/或微物体的介电性质的特征，DEP力可以吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和去激活一组DEP电极(例如，在形成正方形图案220的一组DEP电极区域214处)，可以在区域/腔室202中捕获和移动区域/腔室202中的一个或多个微物体。图1A中的运动模块162可以控制这类开关，从而激活和去激活各个DEP电极，以选择、捕集和移动区域/腔室202周围的特定微物体(未示出)。具有包括选择性可寻址且可激励电极的DEP配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经被描述在例如美国专利号6,294,063(Becker等人)和6,942,776(Medoro)中，其全部内容通过引用并入本文。
作为又一个示例，微流体装置200可以具有电润湿(EW)配置，其可以代替DEP配置，或者可以位于微流体装置200与具有DEP配置的部分分离的部分中。EW配置可以是光电润湿配置或电培养基上的电润湿(EWOD)配置，两者都是本领域已知的。在一些EW配置中，支撑结构104具有夹在介电层(未示出)和底部电极204之间的电极活化衬底206。介电层可以包括疏水材料和/或可涂覆有疏水材料，如下文所述。对于具有EW配置的微流体装置200，支撑结构104的内表面208是介电层或其疏水涂层的内表面。
介电层(未示出)可以包括一个或多个氧化物层，并且可以具有约50nm至约250nm(例如，约125nm至约175nm)的厚度。在某些实施方案中，介电层可以包括氧化物层，例如金属氧化物(例如，氧化铝或氧化铪)层。在某些实施方案中，介电层可以包括除金属氧化物之外的介电材料，例如硅氧化物或氮化物。无论确切的组成和厚度如何，介电层可以具有约10kΩ至约50kΩ的阻抗。
在一些实施方案中，介电层的向内朝向区域/腔室202的表面涂覆有疏水材料。疏水材料可以包括例如氟化碳分子。氟化碳分子的实例包括全氟聚合物，例如聚四氟乙烯(例如，
Figure GDA0003459753850000271
)或聚(2,3-二氟亚甲基-全氟四氢呋喃)(例如，CYTOPTM)。构成疏水材料的分子可以共价键合到介电层的表面。例如，疏水材料的分子可以借助于诸如硅氧烷基团、膦酸基团或硫醇基团的连接基团共价结合到介电层的表面。因此，在一些实施方案中，疏水材料可以包含烷基封端的硅氧烷、烷基封端的膦酸或烷基封端的硫醇。烷基可以是长链烃(例如，具有至少10个碳或至少16、18、20、22或更多个碳的链)。或者，可以使用氟化(或全氟化)碳链代替烷基。因此，例如，疏水材料可以包括氟代烷基封端的硅氧烷、氟代烷基封端的膦酸或氟代烷基封端的硫醇。在一些实施方案中，疏水涂层的厚度为约10nm至约50nm。在其他实施方案中，疏水涂层的厚度小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)。
在一些实施方案中，具有电润湿配置的微流体装置200的盖110也涂覆有疏水材料(未示出)。疏水材料可以是用于涂覆支撑结构104的介电层的相同疏水材料，并且疏水涂层可以具有与支撑结构104的介电层上的疏水涂层的厚度基本相同的厚度。此外，盖110可以包括以支撑结构104的方式夹在介电层和顶部电极210之间的电极活化衬底206。电极活化衬底206和盖110的介电层可以具有与电极活化衬底206和支撑结构104的介电层相同的组成和/或尺寸。因此，微流体装置200可以具有两个电润湿表面。
在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料，例如如上文所述的那些。因此，在某些实施方案中，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅层(a-Si:H)或由其组成。a-Si:H可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-Si:H层可以具有约500nm至约2.0μm的厚度。或者，如上文所述，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)。具有光电润湿配置的微流体装置在本领域中是已知的和/或可以用本领域已知的电极活化衬底来构建。例如，美国专利号6,958,132(Chiou等人)(其全部内容通过引用并入本文)公开了具有诸如a-Si:H的光电导材料的光电润湿配置，而上文引用的美国专利公开号2014/0124370(Short等人)公开了具有由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底。
因此，微流体装置200可以具有光电润湿配置，并且光图案218可以用于激活电极活化衬底206中的光电导EW区域或光响应EW电极。电极活化衬底206的这类激活的EW区域或EW电极可以在支撑结构104的内表面208(即，覆盖介电层或其疏水涂层的内表面)处产生电润湿力。通过改变入射在电极活化衬底206上的光图案218(或相对于光源216移动微流体装置200)，可以移动与支撑结构104的内表面208接触的液滴(例如，包含水性介质、溶液或溶剂)穿过区域/腔室202中存在的不混溶流体(例如，油介质)。
在其他实施方案中，微流体装置200可以具有EWOD配置，并且电极活化衬底206可以包括不依赖于光来激活的选择性可寻址且可激发的电极。因此，电极活化衬底206可以包括这类电润湿(EW)电极的图案。例如，图案可以是排列成行和列的基本上正方形的EW电极的阵列，如图2B所示。或者，图案可以是形成六边点格的基本上六边形EW电极的阵列。无论图案如何，都可以通过电开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)选择性地激活(或去激活)EW电极。通过选择性地激活和去激活电极活化衬底206中的EW电极，可以在区域/腔室202内移动与经覆盖的介电层或其疏水涂层的内表面208接触的液滴(未示出)。图1A中的运动模块162可以控制此类开关，从而激活和去激活各个EW电极，以选择和移动区域/腔室202周围的特定液滴。具有有选择性可寻址且可激发的电极的EWOD配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经描述在例如美国专利号8,685,344(Sundarsan等人)中，其全部内容通过引用并入本文。
无论微流体装置200的配置如何，电源212可以用于提供为微流体装置200的电路供电的电势(例如，AC电压电势)。电源212可以与图1A中参引的电源192相同或者是其组件。电源212可以被配置为向顶部电极210和底部电极204提供AC电压和/或电流。对于AC电压，电源212可以提供这样的频率范围和平均或峰值功率(例如，电压或电流)范围：其如上文所述，足以产生足够强的净DEP力(或电润湿力)以在区域/腔室202中捕集和移动各个微物体(未示出)，和/或还如上文所述，足以改变区域/腔室202中支撑结构104的内表面208(即，介电层和/或介电层上的疏水涂层)的润湿性质。这样的频率范围和平均或峰值功率范围在本领域中是已知的。参见，例如，美国专利号6,958,132(Chiou等人)、美国专利号RE44,711(Wu等人)(最初作为美国专利号7,612,355颁布)和美国专利申请公开号US2014/0124370(Short等人)、US2015/0306598(Khandros等人)和US2015/0306599(Khandros等人)。
隔离坞。在图2A-2C中描绘的微流体装置230内示出了一般隔离坞224、226和228的非限制性实例。每个隔离坞224、226和228可以包括分离结构232，其限定了分离区域240和将分离区域240流体性连接到通道122的连接区236。连接区域236可以包括通向微流体通道122的近端开口234和通向分离区域240的远端开口238。连接区域236可以被配置为使得从微流体通道122流入隔离坞224、226、228的流体培养基(未示出)的流动的最大穿透深度不延伸到分离区域240中。因此，由于连接区域236，布置在隔离坞224、226、228的分离区域240中的微物体(未示出)或其他材料(未示出)可以与微流体通道122中的培养基180的流分离且基本上不受其影响。
图2A-2C的隔离坞224、226和228各自具有单个开口，该开口直接通向微流体通道122。隔离坞的开口从微流体通道122侧向开放。电极活化衬底206在微流体通道122和隔离坞224、226和228二者的下方。隔离坞的外壳内的电极活化衬底206的上表面(形成隔离坞的底板)被设置在与微流体通道122(或者，如果不存在通道，则为液流区域)内的电极活化衬底206的上表面(形成微流体装置的液流通道(或液流区域)的底板)相同水平面上或基本相同的水平面上。电极活化衬底206可以是无特征的，或者可以具有不规则或图案化的表面，其从其最高凸起到其最低凹陷变化小于约3微米、2.5微米、2微米、1.5微米、1微米、0.9微米、0.5微米、0.4微米、0.2微米、0.1微米或更小。跨越微流体通道122(或液流区域)和隔离坞的衬底的上表面中的高度变化可以小于隔离坞的壁或微流体装置的壁的高度的约3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.5％、0.3％或0.1％。虽然详细描述了微流体装置200，但这也适用于本文所述的微流体装置100、230、250、280、290、320、400、450、500、700中的任一个。
因此，微流体通道122可以是扫过区域的示例，并且隔离坞224、226、228的分离区域240可以是未扫过区域的实例。应当注意，微流体通道122和隔离坞224、226、228可以被配置为包含一种或多种流体培养基180。在图2A-2B所示的实例中，端口222被连接到微流体通道122，并允许将流体培养基180引入到微流体装置230中或从其中移除。在引入流体培养基180之前，微流体装置可以装填有气体，如二氧化碳气体。一旦微流体装置230包含流体培养基180，就可以选择性地产生和停止微流体通道122中的流体培养基180的流242。例如，如图所示，端口222可以被布置在微流体通道122的不同位置处(例如，相对端)，并且可以从用作入口的一个端口222到用作出口的另一个端口222形成培养基的流242。
图2C示出了根据本公开的隔离坞224的实例的详细视图。还示出了微物体246的实例。
已知的是，微流体通道122中的流体培养基180的流242经过隔离坞224的近端开口234可以使培养基180的二次流244进入和/或离开隔离坞224。为了将隔离坞224的分离区域240中的微物体246与二次流244分离，隔离坞224的连接区域236的长度Lcon(即，从近端开口234到远端开口238)应当大于二次流244进入连接区域236的穿透深度Dp。二次流244的穿透深度Dp取决于在微流体通道122中流动的流体培养基180的速度以及与微流体通道122的配置有关的各种参数以及到微流体通道122的连接区域236的近端开口234。对于给定的微流体装置，微流体通道122和开口234的配置将是固定的，而微流体通道122中的流体培养基180的流242的速率将是可变的。因此，对于每个隔离坞224，可以识别通道122中的流体培养基180的流242的最大速度Vmax，确保二次流244的穿透深度Dp不超过连接区域236的长度Lcon。只要微流体通道122中的流体培养基180的流242的速率不超过最大速度Vmax，所得到的二次流244就可以被限制到微流体通道122和连接区域236并且保持在分离区域240之外。因此，微流体通道122中的培养基180的流242将不会将微物体246拖曳出分离区域240。相反，无论微流体通道122中的流体培养基180的流242如何，位于分离区域240中的微物体246将停留在分离区域240中。
此外，只要微流体通道122中的培养基180的流242的速率不超过Vmax，微流体通道122中的流体培养基180的流242就不会把混杂的颗粒(例如，微粒和/或纳米颗粒)从微流体通道122移动到隔离坞224的分离区域240中。因此，使连接区域236的长度Lcon大于二次流244的最大穿透深度Dp可以防止一个隔离坞224被来自微流体通道122或另一个隔离坞(例如，图2D中的隔离坞226、228)的各种各样的颗粒污染。
因为微流体通道122和隔离坞224、226、228的连接区域236可能受到微流体通道122中的培养基180的流242的影响，所以微流体通道122和连接区域236可以被认为是微流体装置230的扫过(或液流)区域。另一方面，隔离坞224、226、228的分离区域240可以被认为是未扫过(或非液流)区域。例如，微流体通道122中的第一流体培养基180中的组分(未示出)可以基本上仅通过第一培养基180的组分从微流体通道122扩散通过连接区域236并进入分离区域240中的第二流体培养基248中而与分离区域240中的第二流体培养基248混合。类似地，分离区域240中的第二培养基248的组分(未示出)可以基本上仅通过第二培养基248的组分从分离区域240扩散通过连接区域236并进入微流体通道122中的第一培养基180中而与微流体通道122中的第一培养基180混合。在一些实施方案中，隔离坞的分离区域与液流区域之间通过扩散进行的流体培养基交换的程度大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大于约99％的流体交换。第一培养基180可以是与第二培养基248相同的培养基或不同的培养基。此外，第一培养基180和第二培养基248可以开始相同，然后变得不同(例如，通过分离区域240中的一个或多个细胞来条件化第二培养基248，或者通过改变流过微流体通道122的培养基180)。
如上所述，由微流体通道122中的流体培养基180的流242引起的二次流244的最大穿透深度Dp可以取决于多个参数。这些参数的实例包括：微流体通道122的形状(例如，微流体通道可以将培养基引导到连接区域236中，将培养基从连接区域236转移，或者沿着基本上垂直于通向微流体通道122的连接区域236的近端开口234的方向引导培养基)；微流体通道122在近端开口234处的宽度Wch(或横截面积)；和连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon(或横截面积)；微流体通道122中的流体培养基180的流242的速度V；第一培养基180和/或第二培养基248的粘度，等等。
在一些实施方案中，微流体通道122和隔离坞224、226、228的尺寸可以相对于微流体通道122中的流体培养基180的流242的向量如下定向：微流体通道宽度Wch(或微流体通道122的横截面积)可以基本上垂直于培养基180的流242；连接区域236在开口234处的宽度Wcon(或横截面积)可以基本上平行于微流体通道122中的培养基180的流242；和/或连接区域的长度Lcon可以基本上垂直于微流体通道122中的培养基180的流242。前述仅是示例，并且微流体通道122和隔离坞224、226、228的相对位置可以相对于彼此为其他取向。
如图2C所示，连接区域236的宽度Wcon从近端开口234到远端开口238可以是均匀的。因此，连接区域236在远端开口238处的宽度Wcon可以在本文中为连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon所标识的任何范围内。或者，连接区域236在远端开口238处的宽度Wcon可以大于连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon。
如图2C所示，分离区域240在远端开口238处的宽度可以与连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon基本上相同。因此，分离区域240在远端开口238处的宽度可以在本文中为连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon所标识的任何范围内。或者，分离区域240在远端开口238处的宽度可以大于或小于连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon。此外，远端开口238可以小于近端开口234，并且连接区域236的宽度Wcon可以在近端开口234和远端开口238之间变窄。例如，使用各种不同的几何形状(例如，斜切连接区域、使连接区域成斜面)，连接区域236可以在近端开口和远端开口之间变窄。此外，连接区域236的任何部分或子部分(例如，连接区域与近端开口234相邻的一部分)可以变窄。
图2D-2F描绘了包含微流体管路262和液流通道264的微流体装置250的另一示例性实施方案，其是图1A的相应微流体装置100、管路132和通道134的变体。微流体装置250还具有多个隔离坞266，其是上述隔离坞124、126、128、130、224、226或228的另外的变体。特别地，应当理解，图2D-2F中所示的装置250的隔离坞266可以代替装置100、200、230、280、290、300中的上述隔离坞124、126、128、130、224、226或228中任一个。类似地，微流体装置250是微流体装置100的另一变体，并且还可以具有与上述微流体装置100、200、230、280、290、300相同或不同的DEP配置，以及本文所述的其他微流体系统组件中的任一个。
图2D-2F的微流体装置250包括支撑结构(在图2D-2F中不可见，但可以与图1A中所描绘的装置100的支撑结构104相同或基本上类似)、微流体管路结构256和盖(在图2D-2F中不可见，但可以与图1A中所描绘的装置100的盖122相同或基本上类似)。微流体管路结构256包括框架252和微流体管路材料260，其可以与图1A中所描绘的装置100的框架114和微流体管路材料116相同或基本上类似。如图2D所示，由微流体管路材料260所定义的微流体管路262可以包括多个通道264(示出了两个，但可以有更多个)，多个隔离坞266与其为流体性连接。
每个隔离坞266可以包括分离结构272、分离结构272内的分离区域270、以及连接区域268。从微流体通道264处的近端开口274到分离结构272处的远端开口276，连接区域268将微流体通道264流体性连接至分离区域270。通常，根据上文对图2B和2C的讨论，通道264中的第一流体培养基254的流278可以产生从微流体通道264进入和/或离开隔离坞266的相应连接区域268的第一培养基254的二次流282。
如图2E所示，每个隔离坞266的连接区域268通常包括在至通道264的近端开口274与至分离结构272的远端开口276之间延伸的区域。连接区域268的长度Lcon可以大于二次流282的最大穿透深度Dp，在这种情况下，二次流282将延伸到连接区域268中而不被再引导向分离区域270(如图2D所示)。或者，如图2F所示，连接区域268可以具有小于最大穿透深度Dp的长度Lcon，在这种情况下，二次流282将延伸通过连接区域268并且被再引导向分离区域270。在后一种情况下，连接区域268的长度Lc1和Lc2的和大于最大穿透深度Dp，使得二次流282不延伸到分离区域270中。无论连接区域268的长度Lcon是否大于穿透深度Dp，或者连接区域268的长度Lc1和Lc2的和是否大于穿透深度Dp，通道264中的第一培养基254的不超过最大速度Vmax的流278会产生具有穿透深度Dp的二次流，并且隔离坞266的分离区域270中的微物体(未示出，但可以与图2C中所示的微物体246相同或基本上类似)不会被通道264中的第一培养基254的流278拖曳离开分离区域270。通道264中的流278也不会将各种各样的物质(未示出)从通道264拖曳到隔离坞266的分离区域270中。这样，扩散是微流体通道264中的第一培养基254中的组分可以从微流体通道264移动到隔离坞266的分离区域270中的第二培养基258中的唯一机制。类似地，扩散是隔离坞266的分离区域270中的第二培养基258中的组分可以从分离区域270移动到微流体通道264中的第一培养基254中的唯一的机制。第一培养基254可以是与第二培养基258相同的培养基，或者第一培养基254可以是与第二培养基258不同的培养基。或者，第一培养基254和第二培养基258可以在开始时相同，然后变得不同，例如，通过分离区域270中的一个或多个细胞条件化第二培养基，或者通过改变流过微流体通道264的培养基。
如图2E所示，微流体通道264中微流体通道264的宽度Wch(即，横切流体培养基流过微流体通道的方向，如图2D中的箭头278所示)可以基本上垂直于近端开口274的宽度Wcon1，并且因此基本上平行于远端开口276的宽度Wcon2。然而，近端开口274的宽度Wcon1和远端开口276的宽度Wcon2不需要基本上彼此垂直。例如，近端开口274的宽度Wcon1定向于其上的轴(未示出)与远端开口276的宽度Wcon2定向于其上的另一轴之间的角度可以不同于垂直，并因此不是90°。可选择的定向角度的实例包括以下任一范围中的角度：约30°至约90°、约45°至约90°、约60°至约90°等。
在隔离坞室(例如，124、126、128、130、224、226、228或266)的各种实施方案中，分离区域(例如240或270)被配置为包含多个微物体。在其他实施方案中，分离区域可以被配置为包含仅一个、两个、三个、四个、五个或类似的相对较少数目的微物体。因此，分离区域的体积可以是例如至少1×106、2×106、4×106、6×106立方微米或更大。
在隔离坞的各种实施方案中，微流体通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的宽度Wch可以在以下任一范围内：约50-1000微米、50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米和100-120微米。在一些其他实施方案中，微流体通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的宽度Wch可以在约200-800微米、200-700微米或200-600微米的范围内。以上仅是示例，并且微流体通道122的宽度Wch可以在其他范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。此外，在微流体通道的除了隔离坞的近端开口之外的区域中，微流体通道122的Wch可以被选择为在任何这些范围内。
在一些实施方案中，隔离坞的高度为约30至约200微米或约50至约150微米。在一些实施方案中，隔离坞的横截面积为约1×104-3×106平方微米、2×104–2×106平方微米、4×104–1×106平方微米、2×104–5×105平方微米、2×104–1×105平方微米或约2×105–2×106平方微米。
在隔离坞的各种实施方案中，微流体通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的高度Hch可以在以下任何范围内：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。前述仅仅是示例，并且微流体通道(例如，122)的高度Hch可以在其他范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围)。在微流体通道的除了隔离坞的近端开口之外的区域中，微流体通道122的高度Hch可以被选择为在任何这些范围内。
在隔离坞的各种实施方案中，微流体通道(例如，122)在近端开口(例如234)处的横截面积可以在以下任何范围内：500-50,000平方微米、500-40,000平方微米、500-30,000平方微米、500-25,000平方微米、500-20,000平方微米、500-15,000平方微米、500-10,000平方微米、500-7,500平方微米、500-5,000平方微米、1,000-25,000平方微米、1,000-20,000平方微米、1,000-15,000平方微米、1,000-10,000平方微米、1,000-7,500平方微米、1,000-5,000平方微米、2,000-20,000平方微米、2,000-15,000平方微米、2,000-10,000平方微米、2,000-7,500平方微米、2,000-6,000平方微米、3,000-20,000平方微米、3,000-15,000平方微米、3,000-10,000平方微米、3,000-7,500平方微米或3,000至6,000平方微米。前述仅仅是示例，并且微流体通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的横截面积可以在其他范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)的长度Lcon可以是在以下任何范围内：约1-600微米、5-550微米、10-500微米、15-400微米、20-300微米、20-500微米、40-400微米、60-300微米、80-200微米或约100-150微米。前述仅仅是示例，并且连接区域(例如，236)的长度Lcon可以在与前述示例不同的范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度Wcon可以在以下任何范围内：20-500微米、20-400微米、20-300微米、20-200微米、20-150微米、20-100微米、20-80微米、20-60微米、30-400微米、30-300微米、30-200微米、30-150微米、30-100微米、30-80微米、30-60微米、40-300微米、40-200微米、40-150微米、40-100微米、40-80微米、40-60微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、50-80微米、60-200微米、60-150微米、60-100微米、60-80微米、70-150微米、70-100微米和80-100微米。前述仅仅是示例，并且连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度Wcon可以与前述示例不同(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度Wcon可以至少与隔离坞打算用于的微物体(例如，生物细胞，例如哺乳动物细胞、免疫细胞、干细胞等)的最大尺寸一样大。例如，将要放入哺乳动物细胞的隔离坞的连接区域236在近端开口234)处的宽度Wcon可以是以下范围的任一种：约20至约100微米、约30至约90微米、约40至约80微米、约50至约70微米或约60微米。前述仅仅是示例，并且连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度Wcon可以与前述示例不同(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)的长度Lcon与连接区域(例如，236)在近端开口234处的宽度Wcon的比可以大于或等于任何以下比值：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或更大。以上仅仅是示例，并且连接区域236的长度Lcon与连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon的比可以与前述示例不同。
在微流体装置100、200、23、250、280、290、320、400、450、500、700的各种实施方案中，Vmax可以被设定为约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.7、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10微升/秒或更大。以上仅仅是示例，并且Vmax可以与前述示例不同(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在具有隔离坞的微流体装置的各种实施方案中，隔离坞的分离区域(例如，240)的体积可以是例如至少1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1.0×106、1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×107、1.6×107、1.7×107、1.8×107、1.9×107、2.0×107立方微米或更大。在一些实施方案中，隔离坞的分离区域的体积可以在由任何两个以上端点所限定的范围内(例如约3×105至约1×106立方微米、约8×105和约1.5×106立方微米或约1.3×106至2.0×106立方微米)。在各种实施方案中，隔离坞的体积可以是约约3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106、2.0×106、2.5×106、3.0×106、3.5×107、4.0×107、4.5×107或约5.0×107立方微米或更大。在一些实施方案中，隔离坞的分离区域的体积可以在由任何两个以上端点所限定的范围内(例如约5×105至约1×106立方微米、约1×106至约1.5×106立方微米或约1.5×106至2.0×106立方微米)。在一些实施方案中，隔离坞的体积可以是约250皮升至约5纳升、约500皮升至约1纳升、约1纳升至约1.5纳升、约1.5纳升至约2.0纳升、约2.0纳升至约2.5纳升、约2.5纳升至约3.0纳升、约3.0纳升至约3.5纳升或两个以上端点所限定的任何范围内。
在各种实施方案中，微流体装置具有如本文所讨论的任何实施方案中所配置的隔离坞，其中微流体装置具有约5至约10个隔离坞、约10至约50个隔离坞、约100至约500个隔离坞；约200至约1000个隔离坞、约500至约1500个隔离坞、约1000至约2000个隔离坞或约1000至约3500个隔离坞。隔离坞不需要全部是相同的尺寸，并且可以包括多种配置(例如，隔离坞内不同的宽度、不同的特征)。
图2G示出了根据一个实施方案的微流体装置280。图2G中示出的微流体装置280是微流体装置100的程式化示意图。在实施中，微流体装置280及其组成管路元件(例如，通道122和隔离坞128)会具有本文所讨论的尺寸。图2G中所示的微流体管路120具有两个端口107、四个不同的通道122和四个不同的液流路径106。微流体装置280进一步包括向每个通道122开口的多个隔离坞。在图2G所示的微流体装置中，隔离坞具有与图2C中所示的坞类似的几何形状，因此具有连接区域和分离区域这两者。因此，微流体管路120包括扫过区域(例如，通道122和连接区域236在二次流244的最大穿透深度Dp内的部分)和非扫过区域(例如，分离区域240和连接区域236不在二次流244的最大穿透深度Dp内的部分)这两者。
图3A至3B示出了可用于操作和观察根据本公开的微流体装置(例如，100、200、230、250、280、290、300)的系统150的各种实施方案。如图3A所示，系统150可以包括结构(“巢”)300，其被配置为保持微流体装置100(未示出)或本文所述的任何其他微流体装置。巢300可以包括插座(socket)302，其能够与微流体装置320(例如，光致动的电动力学装置100)交界并提供从电源192到微流体装置320的电连接。巢300还可以包括集成的电信号生成子系统304。电信号生成子系统304可以被配置为向插座302提供偏置电压，使得当插座302保持微流体装置320时，在微流体装置320中的一对电极两端施加偏置电压。因此，电信号生成子系统304可以是电源192的一部分。将偏置电压施加到微流体装置320的能力并不意味着当插座302保持微流体装置320时会一直施加偏置电压。相反，在大多数情况下，将间歇地施加偏压电压，例如，仅在需要促进在微流体装置320中生成电动力(例如介电电泳或电润湿)时施加偏置电压。
如图3A所示，巢300可以包括印刷电路板组件(PCBA)322。电信号生成子系统304可以被安装在PCBA 322上并被电集成到其中。示例性支撑件也包括安装在PCBA 322上的插座302。
通常，电信号生成子系统304将包括波形发生器(未示出)。电信号生成子系统304还可以包括示波器(未示出)和/或被配置为放大从波形发生器接收到的波形的波形放大电路(未示出)。示波器(如果有的话)可以被配置为测量供给至由插座302保持的微流体装置320的波形。在某些实施方案中，示波器在微流体装置320附近(并且远离波形发生器)的位置处测量波形，从而确保更精确地测量实际施加到装置的波形。从示波器测量所获得的数据可以被例如作为对波形发生器的反馈提供，并且波形发生器可以被配置为基于这样的反馈调整其输出。合适的组合式波形发生器和示波器的示例是Red PitayaTM。
在某些实施方案中，巢300进一步包括控制器308，例如用于检测和/或控制电信号生成子系统304的微处理器。合适的微处理器的实例包括ArduinoTM微处理器，例如ArduinoNanoTM。控制器308可以用于执行功能和分析，或者可以与外部主控制器154(图1A中所示)进行通信以执行功能和分析。在图3A所示的实施方案中，控制器308通过界面310(例如，插头或连接器)与主控制器154通信。
在一些实施方案中，巢300可以包括电信号生成子系统304，其包括Red PitayaTM波形发生器/示波器单元(“Red Pitaya单元”)和波形放大电路，该波形放大电路将RedPitaya单元所产生的波形放大并且将放大的电压传送给微流体装置100。在一些实施方案中，Red Pitaya单元被配置为测量微流体装置320处的放大的电压，然后根据需要调节其自身的输出电压，使得微流体装置320处测量到的电压是期望值。在一些实施方案中，波形放大电路可以具有由安装在PCBA 322上的一对DC-DC转换器产生的+6.5V至-6.5V的电源，从而在微流体装置100处产生高达13Vpp的信号。
如图3A所示，支撑结构300(例如，巢)可以进一步包括热控制子系统306。热控制子系统306可以被配置为调节由支撑结构300保持的微流体装置320的温度。例如，热控制子系统306可以包括Peltier热电装置(未示出)和冷却单元(未示出)。Peltier热电装置可以具有被配置为与微流体装置320的至少一个表面相交界的第一表面。冷却单元可以是例如冷却块(未示出)，例如液体冷却铝块。Peltier热电装置的第二表面(例如，与第一表面相对的表面)可以被配置为与这种冷却块的表面交界。冷却块可以被连接到流体路径314，流体路径314被配置为使冷却的流体循环通过冷却块。在图3A所示的实施方案中，支撑结构300包括入口316和出口318，以从外部贮液器(未示出)接收冷却的流体，将冷却的流体引入到流体路径314并通过冷却块，然后将冷却的流体返回到外部贮液器。在一些实施方案中，Peltier热电装置、冷却单元和/或流体路径314可以被安装在支撑结构300的壳体312上。在一些实施方案中，热控制子系统306被配置为调节Peltier热电装置的温度，以实现微流体装置320的目标温度。例如，Peltier热电装置的温度调节可以通过热电电源实现，例如通过PololuTM热电电源(Pololu Robotics and Electronics Corp.)实现。热控制子系统306可以包括反馈电路，例如由模拟电路提供的温度值。或者，反馈电路可以由数字电路提供。
在一些实施方案中，巢300可以包括具有反馈电路的热控制子系统306，该反馈电路是包括电阻器(例如，具有1kΩ+/-0.1％的阻抗，+/-0.02ppm/C0的温度系数)和NTC热敏电阻(例如，具有1kΩ+/-0.01％的标称阻抗)的模拟分压器电路(未示出)。在一些情况下，热控制子系统306测量来自反馈电路的电压，然后使用计算出的温度值作为机载PID控制环路算法的输入。来自PID控制环路算法的输出可以驱动例如PololuTM马达驱动器(未示出)上的定向和脉冲宽度调制的信号引脚，以致动热电电源，从而控制Peltier热电装置。
巢300可以包括串行端口324，其允许控制器308的微处理器经由界面310(未示出)与外部主控制器154进行通信。另外，控制器308的微处理器可以与电信号生成子系统304和热控制子系统306进行通信(例如，经由Plink工具(未示出))。因此，经由控制器308、界面310和串行端口324的组合，电信号生成子系统304和热控制子系统306可以与外部主控制器154进行通信。以这种方式，除了其他方面之外，主控制器154还可以通过执行用于输出电压调节的换算计算(scaling calculation)来辅助电信号生成子系统304。经由耦接到外部主控制器154的显示装置170提供的图形用户界面(GUI)(未示出)可以被配置为绘制分别从热控制子系统306和电信号生成子系统304获得的温度和波形数据。替代地或另外地，GUI可以允许更新控制器308、热控制子系统306和电信号生成子系统304。
如上文所讨论的，系统150可以包括成像装置。在一些实施方案中，成像装置包括光调制子系统330(参见图3B)。光调制子系统330可以包括数字镜像装置(DMD)或微快门阵列系统(MSA)，其中任一个都可以被配置为接收来自光源332的光并将接收到的光的一部分发送到显微镜350的光具组中。或者，光调制子系统330可以包括产生其自身光的装置(因此无需光源332)，例如有机发光二极管显示器(OLED)、硅基液晶(LCOS)装置、铁电硅基液晶装置(FLCOS)或透射式液晶显示器(LCD)。光调制子系统330可以是例如投影仪。因此，光调制子系统330能够发射结构光和非结构光。在某些实施方案中，系统150的成像模块164和/或运动模块162可以控制光调制子系统330。
在某些实施方案中，成像装置进一步包括显微镜350。在这样的实施方案中，巢300和光调制子系统330可以单独被配置为安装在显微镜350上。显微镜350可以是例如标准研究级别的光学显微镜或荧光显微镜。因此，巢300可以被配置为安装在显微镜350的载物台344上和/或光调制子系统330可以被配置为安装在显微镜350的端口上。在其他实施方案中，本文所述的巢300和光调制子系统330可以是显微镜350的集成部件。
在某些实施方案中，显微镜350可以进一步包括一个或多个检测器348。在一些实施方案中，检测器348由成像模块164控制。检测器348可以包括目镜、电荷耦合器件(CCD)、相机(例如，数码相机)或其任何组合。如果存在至少两个检测器348，则一个检测器可以是例如快速帧率相机，而另一个检测器可以是高灵敏度相机。此外，显微镜350可以包括光具组，其被配置为接收从微流体装置320反射和/或发射的光，并将反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到一个或多个检测器348上。显微镜的光具组还可以包括用于不同检测器的不同镜筒透镜(未示出)，使得每个检测器上的最终放大率可以是不同的。
在某些实施方案中，成像装置被配置为使用至少两个光源。例如，可以使用第一光源332来产生结构光(例如，经由光调制子系统330)，并且可以使用第二光源334来提供非结构光。第一光源332可以产生用于光致动的电运动和/或荧光激发的结构光，且第二光源334可以用于提供亮视场照明。在这些实施方案中，运动模块164可以用于控制第一光源332，并且成像模块164可以用于控制第二光源334。显微镜350的光具组可以被配置为(1)接收来自光调制子系统330的结构光，并且当微流体装置(例如，光致动的电动力学装置)被巢300保持时，将结构光聚焦在该装置中的至少第一区域上，以及(2)接收从微流体装置反射和/或发射的光，并将这种反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到检测器348上。光具组可以进一步被配置为接收来自第二光源的非结构光，并且当微流体装置被巢300保持时，将非结构光聚焦在微流体装置的至少第二区域上。在某些实施方案中，微流体装置的第一和第二区域可以是重叠的区域。例如，第一区域可以是第二区域的亚组。在其他实施方案中，第二光源334可以另外地或替代地包括激光，其可以具有任何合适的光波长。图3B中所示的光具组的表示仅是示意性表示，并且光具组可以包括另外的滤光器、陷波滤波器、透镜等。当第二光源334包括用于亮视场和/或荧光激发的一个或多个光源以及激光照明时，光源的物理布置可以与图3B中所示的不同，并且可以在光具组内的任何合适的物理位置引入激光照明。光源432和光源402/光调制子系统404的示意性位置也可以互换。
在图3B中，第一光源332被显示为将光提供给光调制子系统330，其将结构光提供给系统355的显微镜350的光具组(未示出)。第二光源334被显示为经由分束器336将非结构光提供给光具组。来自光调制子系统330的结构光和来自第二光源334的非结构光一起从分束器336通过光具组行进到达第二分束器(或二向色滤光器338，取决于光调制子系统330提供的光)，光在此通过物镜336向下反射到样品平面342。然后，从样品平面342反射和/或发射的光向上返回通过物镜340、通过分束器和/或二向色滤光器338，并返回到二向色滤光器346。到达二向色滤光器346的光的仅仅一部分穿过并到达检测器348。
在一些实施方案中，第二光源334发射蓝光。利用适当的二向色滤光器346，从样品平面342反射的蓝光能够穿过二向色滤光器346并到达检测器348。相反，来自光调制子系统330的结构光从样品平面342反射，但不穿过二向色滤光器346。在该实例中，二向色滤光器346滤除波长长于495nm的可见光。只有从光调制子系统发射的光不包括短于495nm的任何波长时，对来自光调制子系统330的光的这种滤除才算完成(如图所示)。在实施中，如果来自光调制子系统330的光包括短于495nm的波长(例如，蓝色波长)，则来自光调制子系统的一些光会穿过滤光器346到达检测器348。在这样的实施方案中，滤光器346作用为改变从第一光源332和第二光源334到达检测器348的光量之间的平衡。如果第一光源332显著强于第二光源334，则这可能是有益的。在其他实施方案中，第二光源334可以发射红光，并且二向色滤光器346可以滤除除了红光之外的可见光(例如，波长短于650nm的可见光)。
涂覆溶液和涂覆剂。不希望受理论的限制，当微流体装置的至少一个或多个内表面已经被条件化或涂覆以便呈现有机和/或亲水分子层(其提供微流体装置和保持在其中的生物微物体之间的主要界面)时，可以促进微流体装置(例如，DEP配置的和/或EW配置的微流体装置)内的生物微物体(例如，生物细胞)的维持(即，生物微物体在微流体装置内表现出增加的活力、更大的扩增和/或更大的可移植性)。在一些实施方案中，微流体装置的一个或多个内表面(例如，DEP配置的微流体装置的电极活化衬底的内表面、微流体装置的盖和/或管路材料的表面)可以用涂覆溶液和/或涂覆剂处理或改性，以产生所需的有机和/或亲水分子层。
涂层可以在引入生物微物体之前或之后施加，或者可以与生物微物体同时引入。在一些实施方案中，生物微物体可以在包含一种或多种涂覆剂的流体培养基中输入到微流体装置中。在其他实施方案中，在将生物微物体引入到微流体装置中之前，将微流体装置(例如，DEP配置的微流体装置)的内表面用包含涂覆剂的涂覆溶液处理或“预处理”。
在一些实施方案中，微流体装置的至少一个表面包括涂层材料，其提供适于维持和/或扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层(例如提供如下文所述的条件化的表面)。在一些实施方案中，微流体装置的基本上所有内表面都包括涂层材料。经涂覆的内表面可以包括液流区域(例如，通道)、腔室或隔离坞的表面，或其组合。在一些实施方案中，多个隔离坞中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在其他实施方案中，多个液流区域或通道中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在一些实施方案中，多个隔离坞中的每一个和多个通道中的每一个的至少一个内表面都涂覆有涂层材料。
涂覆剂/溶液。可以使用任何方便的涂覆剂/涂覆溶液，包括但不限于：血清或血清因子、牛血清白蛋白(BSA)、聚合物、去污剂、酶及其任何组合。
基于聚合物的涂层材料。至少一个内表面可以包括包含聚合物的涂层材料。聚合物可以与至少一个表面共价或非共价地结合(或可以非特异性地粘附)。聚合物可以具有多种结构基序，例如嵌段聚合物(和共聚物)、星形聚合物(星形共聚物)和接枝或梳形聚合物(接枝共聚物)中所发现的，所有这些都可以适用于本文公开的方法。
聚合物可以包括含有亚烷基醚部分的聚合物。大量的含亚烷基醚的聚合物可以适用于本文所述的微流体装置。一类非限制性示例性的含亚烷基醚的聚合物是两性非离子嵌段共聚物，其包括在聚合物链内具有不同比例和位置的聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)子单元的嵌段。
Figure GDA0003459753850000441
聚合物(BASF)是这类嵌段共聚物，并且在本领域中已知适合于在与活细胞接触时使用。聚合物的平均分子量Mw的范围可以为约2000Da至约20KDa。在一些实施方案中，PEO-PPO嵌段共聚物可以具有大于约10(例如，12-18)的亲水-亲油平衡(HLB)。可用于产生经涂覆的表面的具体
Figure GDA0003459753850000442
聚合物包括
Figure GDA0003459753850000443
L44、L64、P85和F127(包括F127NF)。另一类含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG Mw<100,000Da)或可替代地，聚氧乙烯(PEO，Mw>100,000)。在一些实施方案中，PEG可以具有约1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da的Mw。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有羧酸部分的聚合物。羧酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚乳酸(PLA)。在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磷酸酯部分的聚合物，该磷酸酯部分在聚合物主链的末端处或者从聚合物的主链悬垂。在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磺酸部分的聚合物。磺酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚苯乙烯磺酸(PSSA)或聚茴香脑磺酸。在进一步的实施方案中，涂层材料可以包括含有胺部分的聚合物。聚氨基聚合物可以包括天然多胺聚合物或合成的多胺聚合物。天然多胺的实例包括精胺、亚精胺和腐胺。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有糖部分的聚合物。在一个非限制性实例中，诸如黄原胶或葡聚糖的多糖可以适合于形成可以在微流体装置中减少或防止细胞贴附的材料。例如，大小为约3kDa的葡聚糖聚合物可以用于为微流体装置内的表面提供涂层材料。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有核苷酸部分的聚合物，即核酸，其可以具有核糖核苷酸部分或脱氧核糖核苷酸部分，从而提供聚电解质表面。核酸可以仅含有天然核苷酸部分或者可以含有非天然核苷酸部分，其包含核碱基、核糖或磷酸酯部分类似物，例如7-脱氮腺嘌呤、戊糖、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯部分，但不限于此。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有氨基酸部分的聚合物。含有氨基酸部分的聚合物可以包括含有天然氨基酸的聚合物或含有非天然氨基酸的聚合物，其均可以包括肽、多肽或蛋白质。在一个非限制性实例中，蛋白质可以是牛血清白蛋白(BSA)和/或包含白蛋白的血清(或多种不同血清的组合)和/或一种或多种作为涂覆剂的其他类似蛋白质。血清可以来自任何方便的来源，包括但不限于胎牛血清、绵羊血清、山羊血清、马血清等。在某些实施方案中，BSA在涂覆溶液中的存在范围为约1mg/mL至约100mg/mL，包括5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL，或更高或介于其间的任何值。在某些实施方案中，血清在涂覆溶液中的存在范围可以为约20％(v/v)至约50％v/v，包括25％、30％、35％、40％、45％，或更高或介于其间的任何值。在一些实施方案中，BSA可以作为涂覆剂以5mg/mL存在于涂覆溶液中，而在其他实施方案中，BSA可以作为涂覆剂以70mg/mL存在于涂覆溶液中。
在某些实施方案中，血清作为涂覆剂以30％存在于涂覆溶液中。在一些实施方案中，可以在涂层材料内提供细胞外基质(ECM)蛋白质，用于获得优化的细胞贴附以促进细胞生长。可以包含在涂层材料中的细胞基质蛋白质可以包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、含RGD的肽(例如纤连蛋白)或层粘连蛋白。在其他实施方案中，可以在微流体装置的涂层材料内提供生长因子、细胞因子、激素或其他细胞信号传导物质。
在一些实施方案中，涂层材料可以包括含有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分或氨基酸部分中超过一种的聚合物。在其他实施方案中，经聚合物条件化的表面可以包括超过一种聚合物的混合物，其中每种聚合物均具有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分和/或氨基酸部分，其可以独立地或同时地并入到涂层材料中。
共价连接的涂层材料。在一些实施方案中，至少一个内表面包括共价连接的分子，其提供适于在微流体装置内维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层，为这些细胞提供条件化的表面。
共价连接的分子包括连接基团，其中连接基团与微流体装置的一个或多个表面共价连接，如下文所述。连接基团还与被配置为提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分共价连接。
在一些实施方案中，被配置为提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括烷基或氟代烷基(其包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子表面)；磺酸盐阴离子；羧基甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。
在各种实施方案中，被配置为在微流体装置中提供适于维持/扩增的生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括非聚合部分，例如烷基部分、取代的烷基部分(例如，氟代烷基部分(包括但不限于全氟代烷基部分))、氨基酸部分、醇部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸部分、氨基磺酸部分或糖部分。或者，共价连接的部分可以包括聚合部分，其可以是上文所述的任何部分。
在一些实施方案中，共价连接的烷基基团部分可以包含形成直链(例如，至少10个碳或至少14、16、18、20、22或更多个碳的直链)的碳原子并且可以是非支链的烷基基团部分。在一些实施方案中，烷基基团可以包括取代的烷基基团(例如，烷基基团中的一些碳可被氟化或全氟化)。在一些实施方案中，烷基基团可以包括第一区段(其可以包括全氟代烷基)，其连接至第二区段(其可以包括未取代的烷基基团)，其中第一和第二区段可以直接或间接(例如，通过醚链接)连接在一起。烷基基团的第一区段可以位于连接基团的远端，并且烷基基团的第二区段可以位于连接基团的近端。
在其他实施方案中，共价连接的部分可以包括至少一个氨基酸，其可以包括超过一种类型的氨基酸。因此，共价连接的部分可以包括肽或蛋白质。在一些实施方案中，共价连接的部分可以包括氨基酸，其可以提供两性离子表面以支持细胞生长、活力、可移植性(portability)或其任何组合。
在其他实施方案中，共价连接的部分可以包括至少一个亚烷基氧化物部分，并且可以包括如上文所述的任何亚烷基氧化物聚合物。一类有用的含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG Mw<100,000Da)或者聚氧乙烯(PEO，Mw>100,000)。在一些实施方案中，PEG可以具有约1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da的Mw。
共价连接的部分可以包括一种或多种糖类。共价连接的糖类可以是单糖、二糖或多糖。可以修饰共价连接的糖类，以引入反应性配对部分，其允许偶联或加工用于表面的附接。示例性的反应性配对部分可以包括醛、炔烃或卤代部分。可以以随机方式修饰多糖，其中可以修饰每种糖单体或仅修饰多糖内的一部分糖单体，以提供可以直接或间接偶联至表面的反应性配对部分。一个实例可以包括葡聚糖多糖，其可以经过非支链的连接部分间接地偶联到表面。
共价连接的部分可以包括一个或多个氨基基团。氨基基团可以是取代的胺部分、胍部分、含氮杂环部分或杂芳基部分。含氨基的部分可以具有允许对微流体装置内以及任选地对隔离坞和/或液流区域(例如，通道)内的环境进行pH修饰的结构。
提供经条件化的表面的涂层材料可以仅包含一类共价连接的部分，或者可以包括超过一种不同类型的共价连接的部分。例如，经氟代烷基条件化的表面(包括全氟代烷基)可以具有多个共价连接的部分，它们全部相同，例如具有相同的连接基团和与表面的共价连接、相同的总长度和相同数目的氟代亚甲基单元，包括氟代烷基部分。或者，涂层材料可以具有超过一种类型的与表面连接的共价连接部分。例如，涂层材料可以包括具有共价连接的具有指定数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基部分的分子，并且还可包括另一组分子，其具有共价连接到具有更大数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基链的带电荷部分，其可以提供在经涂覆的表面上呈现较大部分的能力。在这种情况下，具有不同的、空间要求更低的末端和更少的主链原子的第一组分子能够有助于使整个衬底表面功能化，从而防止与构成衬底本身的硅/氧化硅、氧化铪或氧化铝的不期望的贴附或接触。在另一个实例中，共价连接的部分可以提供两性离子表面，其在表面上以随机的方式呈现交替的电荷。
经条件化的表面性质。除了经条件化的表面的组成之外，其他因素(例如涂层材料的物理厚度)可能影响DEP力。各种因素可能改变涂层材料的物理厚度，例如在衬底上沉积涂层材料或涂层材料与衬底反应的方式(例如，气相沉积、液相沉积、旋涂、泛涂和静电涂布)。在一些实施方案中，经条件化的表面的厚度为小于10nm(例如约1nm至约10nm；约1nm至约7nm；约1nm至约5nm；或其间的任何单个值)。在其他实施方案中，由共价连接的部分形成的经条件化的表面可以具有约10nm至约50nm的厚度。在一些实施方案中，当共价连接至微流体装置的表面(例如，DEP配置的衬底表面)时，经条件化的表面的共价连接的部分可以形成单层，并且可以具有小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)的厚度。通常，经条件化的表面不要求完美形成的单层来适当地作用于在DEP配置的微流体装置内操作。
经条件化的表面还可以具有有益于与生物分子一起使用的性质。例如，含有氟代(或全氟代)碳链的经条件化的表面可以减少表面结垢量。如本文所用，表面污垢是指沉积在微流体装置的表面上的任意物质的量，其可以包括生物材料(例如，蛋白质及其降解产物、核酸和各自的降解产物，等等)的永久性或半永久性沉积。
单一或多部分经条件化的表面。如下文所述的，共价连接的涂层材料可以通过已经含有被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分的分子的反应形成。或者，共价连接的涂层材料可以在两步顺序中通过将被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分偶联至表面修饰配体(它本身已经与表面共价连接)而形成。
制备共价连接的涂层材料的方法。在一些实施方案中，共价连接至微流体装置的表面(例如，包括隔离坞和/或液流区域的至少一个表面)的涂层材料具有式1或式2的结构。当将涂层材料一步引入到表面中时，它具有式1的结构，而当将涂层材料以多步法引入时，它具有式2的结构。
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涂层材料可以共价连接到DEP配置或EW配置的衬底的表面的氧化物上。DEP或EW配置的衬底可以包括硅、氧化硅、氧化铝或氧化铪。氧化物可以作为衬底的初始化学结构的一部分存在，或者可以被如下所讨论地引入。
涂层材料可以经由连接基团(“LG”)与氧化物连接，该连接基团可以是由硅氧烷或膦酸基团与氧化物反应而形成的甲硅烷氧基或膦酸酯基团。被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分可以是本文所述的任何部分。连接基团LG可以直接或间接连接到被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。当连接基团LG直接连接至该部分时，不存在任选的连接部分(“L”)，且n为0。当连接基团LG间接连接至该部分时，存在连接部分L，且n为1。连接部分L可以具有线性部分，其中线性部分的骨架可以包括1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何组合的非氢原子，其受本领域中已知的化学键合的限制。它可以被选自醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基、亚芳基、亚杂芳基或杂环基的一个或多个部分的任何组合所中断。在一些实施方案中，连接部分L的骨架可以包括10至20个原子。在其他实施方案中，连接部分L的骨架可以包括约5个原子至约200个原子；约10个原子至约80个原子；约10个原子至约50个原子；或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，骨架原子均为碳原子。
在一些实施方案中，可以在多步法中向衬底的表面添加将被配置为提供适合维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分，并且该部分具有上文所示的式2的结构。该部分可以是上文所述的任何部分。
在一些实施方案中，偶联基团CG表示由反应性部分Rx和反应性配对部分Rpx(即，被配置为与反应性部分Rx反应的部分)的反应所得到的基团。例如，一种典型的偶联基团CG可以包括羧酰氨基基团，其是氨基与羧酸衍生物(例如，活化的酯、酰氯等)反应的结果。其他CG可以包括亚三唑基、羧酰氨基、硫代酰氨基、肟、巯基、二硫化物、醚或烯基基团，或者可以在反应性部分与其相应的反应性配对部分反应时形成的任何其他合适的基团。偶联基团CG可以位于连接基团L的第二末端(即，邻近被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分的末端)，连接基团L可以包括如上文所述的元素的任何组合。在一些其他实施方案中，偶联基团CG可以中断连接基团L的骨架。当偶联基团CG是亚三唑基时，它可以是由Click偶联反应产生的产物并且可以进一步被取代(例如，二苯并环辛烯基稠合的亚三唑基)。
在一些实施方案中，使用化学气相沉积将涂层材料(或表面修饰配体)沉积在微流体装置的内表面上。可任选地改进气相沉积工艺，例如，通过暴露于溶剂浴、超声处理或其组合而预清洁盖110、微流体管路材料116和/或衬底(例如，DEP配置的衬底的电极活化衬底206的内表面208，或EW配置的衬底的支撑结构104的介电层)。替代地或另外地，这种预清洁可以包括在氧等离子体清洁剂中处理盖110、微流体管路材料116和/或衬底，其可以去除各种杂质，同时引入经氧化的表面(例如，表面上的氧化物，其可以如本文所述进行共价修饰)。或者，可以使用液相处理，例如盐酸和过氧化氢的混合物或硫酸和过氧化氢的混合物(例如，食人鱼溶液，其可以具有约3:1至约7:1的硫酸与过氧化氢的比率)代替氧等离子体清洁剂。
在一些实施方案中，在微流体装置200已经被组装以形成限定微流体管路120的外壳102之后，使用气相沉积来涂覆微流体装置200的内表面。不希望受理论的限制，将这样的涂层材料沉积在完全组装的微流体管路120上可能有益于防止由微流体管路材料116和电极活化衬底206介电层和/或盖110之间变弱的结合所引起的分层。在采用两步法的实施方案中，可以通过如上文所述的气相沉积引入表面修饰配体，随后引入被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。该随后的反应可以通过在溶液中将表面修饰的微流体装置暴露于合适的偶联剂来进行。
图2H描绘了微流体装置290的横截面视图，该微流体装置290具有提供经条件化的表面的示例性共价连接的涂层材料。如所示，涂层材料298(示意性地示出)可以包括与底座286(其可以是DEP衬底)的内表面294和微流体装置290的盖288的内表面292两者共价结合的紧密堆积的分子单层。涂层材料298可以被设置在邻近且向内面向微流体装置290的外壳284的基本上所有内表面294、292上，在一些实施方案中并且如上文所讨论的，包括用于定义微流体装置290内的管路元件和/或结构的微流体管路材料的表面(未示出)。在可选的实施方案中，涂层材料298可以仅被设置在微流体装置290的一个或一些内表面上。
在图2H所示的实施方案中，涂层材料298可以包括单层有机硅氧烷分子，每个分子均经由甲硅烷氧基连接部分296共价键合到微流体装置290的内表面292、294。可以使用任何上文所讨论的涂层材料298(例如，烷基封端的、氟代烷基封端的部分、PEG封端的部分、葡聚糖封端的部分或含有有机硅氧基部分的正电荷或负电荷的末端部分)，其中末端部分被设置在其面向外壳的末端(即，涂层材料298的单层的未与内表面292、294结合并且邻近外壳284的部分)。
在其他实施方案中，用于涂覆微流体装置290的内表面292、294的涂层材料298可以包括阴离子、阳离子或两性离子部分，或其任何组合。不希望受理论的限制，通过在微流体管路120的外壳284的内表面上提供阳离子部分、阴离子部分和/或两性离子部分，涂层材料298可以与水分子形成强的氢键，使得所产生的水合水充当将生物微物体与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。另外，在涂层材料298与涂覆剂结合使用的实施方案中，涂层材料298的阴离子、阳离子和/或两性离子可以与存在于外壳284中的培养基180(例如，涂覆溶液)中的非共价涂覆剂(例如，溶液中的蛋白质)的带电荷部分形成离子键。
在其他实施方案中，涂层材料可以包含或经化学修饰以在其面向外壳的末端提供亲水涂覆剂。在一些实施方案中，涂层材料可以包括含亚烷基醚的聚合物，例如PEG。在一些实施方案中，涂层材料可以包括多糖，例如葡聚糖。与上文所讨论的带电荷部分(例如，阴离子、阳离子和两性离子部分)一样，亲水涂覆剂可以与水分子形成强的氢键，使得所得的水合水充当将生物微物体与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。
适当的涂层处理和修饰的进一步细节可以在美国专利公开号US2016/0312165中找到，其通过引用整体并入。
用于在微流体装置的隔离坞内维持细胞活力的另外的系统组件。为了促进细胞群落的生长和/或扩增，可以通过系统的另外的组件提供有利于维持功能细胞的环境条件。例如，此类另外的组件可以提供营养物、细胞生长信号传导物质、pH调节、气体交换、温度控制和从细胞中除去废产物。例如，在美国专利公开号US2016/0312165中已描述了这些类型的另外的组件。
用于选择和/或产生基因组编辑细胞的方法、系统和装置。所公开的方法、系统和装置适用于选择和扩增基因组编辑细胞以产生细胞克隆群，其可筛选期望的基因型(例如，靶向基因组编辑，任选地与对基因组的无脱靶修饰组合)。所公开的方法、系统和装置还适用于在细胞位于微流体装置内时在细胞中进行靶向基因组编辑或非靶向基因组编辑，其中任一个可包括转染。
图4示出了在微流体装置内编辑一个细胞(或多个细胞)的基因组的示例性方法中的步骤。微流体装置可包括具有介电电泳(DEP)配置和/或电润湿(EW)配置的衬底。例如，衬底可以具有DEP配置，并且任选地具有EW配置。DEP配置和/或EW配置可以至少部分地光学致动。因此，例如，微流体装置的DEP配置的衬底或其一部分可包括光电镊子(OET)配置。类似地，微流体装置的EW配置的衬底或其一部分可包括光电润湿(OEW)配置。需要放置一个或多个微物体(例如，细胞、珠子等)的步骤可以使用介电电泳力(例如，OET力)进行，和/或需要移动液滴(例如，可以包含微物体)的步骤可以使用电润湿力(例如，OEW力)来进行，这取决于所使用的微流体装置的实施方案和配置。如下所述，该方法中的一些步骤可以在微流体装置外部进行。
图4的方法任选地从步骤402选择用于基因组编辑的细胞开始。可以基于许多不同的标准和/或特征来选择细胞，所述标准和/或特征包括但不限于：形态学、大小、运动性(例如趋化性)、目的蛋白质的产生、对特定抗体的反应、一种或多种细胞表面标志物的存在、分化能力和/或增殖速率。选择可以是或可以包括从混合细胞类型的起始群中去除不需要的细胞的阴性选择。
可以在微流体装置内进行识别目标细胞的各种细胞标准和/或特征的测定。可以测定目的蛋白质的产生，例如，如美国专利号8,921,055和美国专利申请公开号2015/0151298和2016/0160259中所述，其全部内容通过引用并入本文。细胞大小、形态学和/或增殖可以使用细胞检测算法来量化，例如如美国专利申请公开号2016/0171686所述，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，如果基于一种或多种时间依赖性特征(例如增殖速率、可能响应或不响应刺激的目标分析物(例如，蛋白质)的产生速率，或运动速率)来选择用于转染的细胞，可能必须将细胞维持在微流体装置内(例如，在一个或多个隔离坞内)一段时间和/或使细胞与一种或多种试剂接触。在一些实施方案中，可以以自动方式监测一种或多种细胞标准和/或特征。
在一些实施方案中，可能必须扩增微流体装置内的细胞以测定细胞标准和/或目标特征。类似地，对于一些测定，例如测量目标分析物，将细胞扩增到细胞克隆群以增加测定信号(例如，将分泌蛋白的量增加到足以量化的量)可能是有帮助的。无论细胞是否扩增，可以相对于绝对值或芯片上对照来测量测定信号。如本文所用，“扩增细胞”是指在合适的培养基中维持细胞一段足以使细胞有丝分裂并产生至少两个子细胞的时间，每个子细胞都是有活力的。适用于微流体装置的细胞培养基已描述于例如美国专利申请公开号2016/0312165中，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，可基于与先前进行的处理相关的一个或多个特征来选择细胞，所述特征例如先前的转染和/或基因组编辑，包括将外源性DNA成功整合到细胞基因组内的特定位点(在本文中称为“靶位点”)和/或从细胞基因组内的靶位点成功删除内源性DNA。在一些实施方案中，选择用于基因组编辑的细胞可以是同源的(即，具有基本上相同或相似的细胞特征)。在其他实施方案中，选择用于转染的细胞可以是异源的(即，表现出不同的细胞特征)。
取决于实施方案，可以基于多于一种细胞标准和/或特征来选择用于基因组编辑的细胞。因此，在一些实施方案中，在微流体装置内或在将细胞加载到微流体装置之前可以进行两个或更多个选择步骤，其中每个步骤可以独立于其他选择步骤。例如，细胞可以使用流式细胞术进行第一选择(或者可以在微流体装置外部进行的另一种技术，例如使用磁珠进行阳性或阴性分选)，之后可以将细胞引入微流体装置中，并基于大小、形态学、细胞表面标志物等进行第二选择。第二选择可包括使用力(例如DEP或OET力)将所选的细胞移离未选择的细胞，或反之亦然。
在一些实施方案中，可能必须扩增所选的细胞以使细胞群适于基因组编辑，其可包括转染和各种后续步骤。如下所述，一些转染方法(例如电穿孔)增加细胞的孔隙率，并且因此可能损伤细胞或以其他方式影响它们的活力。在使用这类转染方法的实施方案中，可能必须转染大量选择的细胞以获得足够数量的活转染细胞。
在图4的方法的步骤404中，放置可能未被选择(如果跳过步骤402)的细胞用于转染。如本文所用，术语“转染”是指将核酸构建体(其可以是基因组编辑生物分子、供体模板等的一部分)移动到细胞内部。因此，步骤404可以包括将所选的细胞移动到配置用于转染的微流体装置的区域(即，“转染区域”或“编辑区域”)。在一些实施方案中，其中选择细胞用于在微流体装置内(部分地或完全地)转染，选择细胞可以从其中选择细胞的微流体装置的区域(即，“选择区域”)移动到微流体装置的编辑区域。例如，选择区域可以是微流体通道，并且编辑区域可以是配置用于细胞转染的腔室。或者，选择区域可以是微流体装置中的腔室，并且编辑区域可以是微流体装置中的单独腔室。在其他实施方案中，步骤404可以包括将已经选择的细胞加载到微流体装置中，然后将细胞移动到编辑区域。例如，如果选择细胞用于在微流体装置外部进行转染，则可以将所选的细胞加载到微流体装置中并直接运输到编辑区域(例如，通过液流路径，例如微流体通道)。在其他实施方案中，步骤404可以包括将细胞(无论是否选择)直接加载到微流体装置的编辑区域中。取决于微流体装置的实施方案和配置，可以使用液流流动、重力、离心力、DEP力(例如，OET力)、EW力(例如，OEW力)或其任何组合来移动细胞，如本文其他地方所讨论的。
编辑区域可以根据所使用的微流体装置的实施方案和类型而变化。在一些实施方案中，编辑区域包含一系列腔室，每个腔室可配置用于有限数量细胞的遗传修饰。例如，编辑区域可以包括多个隔离坞，每个隔离坞被配置为促进细胞转染(如下文进一步讨论的)。多个隔离坞可以打开微流体装置中的一个或多个微流体通道中的任何一个，例如共同的微流体通道。在其他实施方案中，编辑区域是微流体装置内的大腔室或类似的容纳区域，其中腔室/容纳区域被配置为促进细胞转染(如下文进一步讨论的)。在其他实施方案中，编辑区域位于专用于细胞转染的第一微流体装置中，并且第一微流体装置连接(例如，通过管道或一些其他类型的导管)至第二微流体装置，该第二微流体装置适合于维持、培养和/或扩增转染的细胞和/或测定转染的细胞是否存在期望的遗传改变。如下文所讨论的，取决于所进行的转染的类型，编辑区域可以包含促进用基因组编辑生物分子转染细胞的物理特征或结构。
在一些实施方案中，特别是其中在微流体装置内部分地或完全地选择细胞的实施方案，步骤404可以包括从所选的细胞中分离出未选择用于基因组编辑的细胞(“未选择的细胞”)。例如，可以将所选的细胞从选择区域移动到编辑区域，而将未选择的细胞留在选择区域。或者，可以将所选的和未选择的细胞都移动到编辑区域中，然后可以将未选择的细胞移出编辑区域。无论如何，可以丢弃未选择的细胞。例如，未选择的细胞可以移动到指定用于过量或不需要的细胞的微流体装置的区域。或者，可以从微流体装置冲洗未选择的细胞，并任选地丢弃。例如，微流体装置可以包括选择区域，该选择区域包括微流体通道，并且在所选的细胞移动到编辑区域之后，未选择的细胞可以用培养基流冲洗出通道(和微流体装置)。
在图4的方法的步骤406中，编辑所选的细胞。编辑可以以各种方式完成。在各种实施方案中，编辑包括使一个或多个细胞与任选地与供体模板组合的基因组编辑生物分子接触。如本文所用，术语“基因组编辑生物分子”是指在进入细胞后能够促进对细胞基因组的稳定改变的分子、复合物或大分子组装体。如本文所用，“稳定”改变是通过编辑细胞的分裂产生的子细胞保留的改变(即，由于与基因组编辑生物分子接触而改变的细胞)。稳定的改变可以保持至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十五次、二十次、二十五次或更多次细胞分裂。在一些实施方案中，细胞基因组的稳定改变包括在细胞的核或线粒体DNA中插入和/或删除核酸。在一些实施方案中，细胞基因组的稳定改变包括以稳定的方式改变细胞的核或线粒体DNA的表达或活性的表观遗传学改变。基因组编辑生物分子可以与一种或多种生物或有机分子和/或一种或多种无机分子或离子非共价结合或以其他方式混合。
基因组编辑生物分子可包含核酸分子，由核酸分子组成或基本上由核酸分子组成。核酸分子可以是单链的(例如，单链RNA、DNA或其组合)或双链的(例如，双链RNA、DNA或其杂合体)。基因组编辑生物分子可包含一个或多个表达盒，其中任何一个可包含核酸分子。或者，基因组编辑生物分子可包含可含有核酸分子的病毒载体。病毒载体可以是衍生自慢病毒(例如，整合酶缺陷型慢病毒载体)、腺病毒等的载体。
基因组编辑生物分子可包含核酸酶，例如核酸内切酶，其促进细胞基因组的改变。例如，核酸酶可切割DNA，产生双链断裂，当双链断裂被细胞修复时，其被修饰以包括外源性核酸序列的插入和/或内源性核酸序列的删除。核酸酶可以以位点特异性方式起作用，从而实现靶向基因组编辑。如本文所用，“靶向基因组编辑”是指在细胞基因组中的预选靶位点处引入外源性核酸和/或在细胞的遗传物质中的预选靶位点处删除内源性核酸。在一些实施方案中，核酸酶由基因组编辑生物分子编码。例如，核酸酶可以由基因组编辑生物分子所包含的核酸分子(或表达盒)编码。或者，核酸酶可以是蛋白质。例如，核酸酶可以与核酸分子复合，并且复合物可以包含在基因组编辑生物分子中。在一些实施方案中，核酸酶可以是核酸指导的核酸内切酶，并且核酸分子可以是指导核酸。核酸指导的核酸内切酶可以是RNA指导的核酸内切酶或DNA指导的核酸内切酶。Cas9(例如，spCas9、stCas9、nmCas9、eSpCas9)和Cpfl是可以在所公开的方法中使用的RNA指导的核酸内切酶的非限制性实例。格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregori)Argonaute(NgAgo)是可以在所公开的方法中使用的DNA指导的核酸内切酶的非限制性实例。在其他实施方案中，核酸酶可以是锌指核酸酶(ZNF)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，其中任一种都可以与Fok1结合。适用于所公开的方法的其他核酸酶和相关的DNA结合分子是本领域技术人员已知的。参见，例如，Richardson等人,Enhancing homology-directed genome editing by catalyticallyactive and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA,NatureBiotechnology 34:339–344(2016)；和Slaymaker等人,Rationally engineered Cas9nucleases with improved specificity,Science,351(6268):84-8。
在其他实施方案中，基因组编辑生物分子可包含促进外源性DNA随机整合到细胞基因组中(本文称为“非靶向基因组编辑”)的元件。例如，基因组编辑生物分子可包含t核酸分子，其包括重复元件(例如，反向重复序列)和任选的转座酶。转座酶可以由核酸分子编码，由单独的核酸分子编码，或者可以是蛋白质，其可以与核酸分子复合。
在一些实施方案中，基因组编辑生物分子可以与一种或多种蛋白质、脂质、有机离子、无机离子或其任何组合复合或以其他方式结合。复合/结合可以促进基因组编辑生物分子进入细胞。例如，蛋白质和/或脂质可以是病毒衣壳或脂质体的一部分。或者，基因组编辑生物分子所包含的蛋白质可以与细胞穿透肽融合。例如，蛋白质可以是与细胞穿透肽融合的核酸内切酶或转座酶。
除上述之外，本领域已知适用于靶向和非靶向基因组编辑的各种基因组编辑生物分子。参见，例如，Nayerossadat等人,Viral and nonviral delivery systems for genedelivery,Adv.Biomed Res.1:27(2012)；和Zuris等人,Cationic lipid-mediateddelivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitroand in vivo,Nature Biotech 33:73-80(2015)。
基因组编辑生物分子可包含供体模板核酸，例如供体模板DNA分子。或者，基因组编辑生物分子和供体模板可以是不同的分子或大分子实体。如本文所用，“供体模板”或“靶向核酸构建体”是包含递送序列的核酸分子；“递送序列”是选择用于引入细胞基因组的核酸序列。对于其中基因组编辑生物分子和供体模板是不同的实体的实施方案，编辑所选的一个细胞(或多个细胞)的基因组的方法还可以包括使一个或多个细胞与供体模板接触的步骤。供体模板可以例如与基因组编辑生物分子组合提供，例如以混合物形式提供。或者，可以在不同时间(例如，顺序地)使一个或多个细胞与基因组编辑生物分子和供体模板接触。
供体模板的递送序列是包含或编码功能性生物分子的核酸序列，所述功能性生物分子与被修饰的细胞(“所选的细胞”或“靶细胞”)的基因组中的突变或功能缺陷互补。例如，递送序列可以包括基因或相关调节序列的至少一部分；基因、其部分或调节序列可以是野生型序列或其功能性变体。功能性变体可以是等位基因变体(例如，已知的或新的等位基因变体)，其可以包括一个或多个点突变(例如，单个碱基的改变、插入或删除)，相对于野生型序列，其基本上不会降低变体的功能。
或者，供体模板的递送序列可以是被配置为在靶细胞的基因组中产生突变或功能缺陷的核酸序列。例如，递送序列可包括基因或相关调节序列的至少一部分，其包括功能降低的非野生型序列。功能降低的非野生型序列可包括一个或多个删除、一个或多个点突变(例如，单个碱基的改变、插入或删除)，或其任何组合；功能降低(相对于对应的野生型序列评估)可以是部分的或完全的。
作为另一个替代方案，供体模板的递送序列可以包括包含或编码功能性生物分子的核酸序列，所述功能性生物分子赋予修饰的细胞非典型功能活性。例如，递送序列可以：包括基因的超功能性(hyper-functional)等位基因或其部分，能够提高细胞中基因的总活性水平；包括配置用于在靶细胞的基因组中的非典型位点引入的调节序列(例如，调节序列可以位于来自靶细胞基因组中的靶位点的序列的侧翼)；编码融合蛋白(例如，T细胞受体融合蛋白，例如CAR-T蛋白等)；包括在与靶细胞的物种不同的物种的基因组中发现的序列(例如，递送序列可以来自第一哺乳动物，例如人，并且被遗传修饰的细胞可以来自第二哺乳动物，如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、牛等)；包括编码报道分子的序列；和/或包括对靶细胞来说外源的合成序列。报道分子可以是在已经遗传修饰的细胞中可检测的分子。例如，报道分子可以是荧光蛋白(例如，GFP等)或模拟荧光蛋白的RNA序列(例如“菠菜”RNA适体)。或者，报道分子可以是细胞表面标志物(其可以具有或不具有除用作标志物之外的额外活性)、提供对选择性试剂(例如抗生素)的抗性的蛋白质或产生可量化信号的酶，如辣根过氧化物酶。
供体模板的递送序列可包括条形码序列。条形码序列(或“标签序列”)可以是不同基因组编辑生物分子(或供体模板)之间不同的核苷酸的随机序列(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多核苷酸)。在一些实施方案中，条形码序列可包含通常在靶细胞的基因组中未发现的或至少不接近(例如，在1、2、3、4、5、10或更多kb内)目标细胞基因组中的靶位点的位置的序列。
供体模板还可以包含一个或多个靶向核酸序列，其位于递送序列侧翼的一侧或两侧。如本文所用，“靶向核酸序列”是与靶细胞基因组中靶位点侧翼的核酸序列足够同源以增加供体模板核酸和靶位点的核酸序列之间的同源重组的可能性和保真度(fidelity)的序列。
在一些实施方案中，放置在微流体芯片的编辑区域内的细胞的基因组编辑包括使细胞经受一种或多种增加细胞渗透性和/或细胞孔隙率的力，从而提高转染效率。取决于所使用的力的类型，微流体装置的编辑区域可包含有助于在细胞的细胞膜中产生力和/或形成孔的对应结构或元件。
在一些实施方案中，放置在微流体芯片的编辑区域内的细胞的基因组编辑包括电穿孔细胞。例如，通过向细胞施加DEP力，可以实现T细胞的电穿孔。本领域已经描述了DEP力用于电穿孔细胞，包括例如Valley等人,Parallel single-cell light-inducedelectroporation and dielectrophorectic manipulation,Lab on a Chip 9:1714-17102(2009)。因此，微流体装置的编辑区域可具有DEP配置，其可如本文其他地方所公开，包括OET配置。微流体装置的编辑区域可包括与微流体装置的其他区域中的衬底不同的衬底。衬底与盖和/或微流体管路材料组合可以限定编辑区域。
编辑区域的衬底可包括至少一个电极。衬底的至少一个电极可以形成向内朝向编辑区域的衬底表面的选择部分。或者，衬底的至少一个电极可以在编辑区域内形成衬底的全部或基本上全部的向内朝向表面。无论如何，至少一个电极可以是单个分立电极。或者，至少一个电极可以是多个分立电极。当存在多个分立电极时，电极可以形成有序阵列(例如n×m阵列，其中n和m各自是具有1或更大值的整数，或者这种n×m阵列的任何部分)。有序阵列的电极可以单独寻址。衬底的至少一个电极中的一个或多个(例如，每个)可以由金属制成。金属可以是例如半导体加工中使用的任何金属，包括非氧化金属(例如，Au、Pt等)或其合金，和/或堆叠的金属层。可以通过晶体管开关(包括光电晶体管开关)控制金属电极的激活。
编辑区域的衬底可包括至少一个电极和光电导层。衬底的光电导层可以形成向内朝向编辑区域的衬底表面的选择部分，或者光电导层可以形成所有(或基本上全部)的向内朝向编辑区域的衬底表面。衬底的至少一个电极可以电耦合到光电导层，同时保持与编辑区域中存在的流体绝缘。光电导层可包括一个或多个光电晶体管。或者，光电导层可包括氢化非晶硅层(a-Si：H)，由其组成或基本上由其组成。
细胞的基因组编辑可以包括将细胞置于针对电穿孔优化的缓冲液中，例如低电导率缓冲液。例如，低电导率缓冲液可以存在于编辑区域中，并且将细胞移动到编辑区域中可以构成将细胞放置在缓冲液中。低电导率缓冲液可以使由电穿孔引起的细胞损伤最小化。
放置在微流体芯片的编辑区域内的细胞的基因组编辑可以包括使细胞的细胞膜收缩或变形，以增加细胞渗透性和/或孔隙率，从而提高转染效率。为了实现这种收缩或变形，微流体装置的编辑区域可包括被配置为使靶细胞收缩或变形的物理结构。例如，编辑区域可以具有包括一个或多个收缩的微流体通道。如本文所用，微流体通道中的“收缩”是通道中宽度小于靶细胞的平均直径(在T细胞的情况下，其可以根据T细胞是否激活而变化)的部分。整个通道可以变窄以形成收缩，或者通道可以包括由小于目标细胞的平均直径的距离分开的阻挡件(例如，杆)。可以例如通过微流体管路材料的图案化来形成通道壁中的收缩或阻挡件。或者，原位形成的水凝胶结构通过有效地减小通道的宽度或通过提供阻挡件可用于在微流体通道内产生一个或多个收缩。如本文其他地方所述，水凝胶结构可以通过将结构光引导到可光活化的聚合物上而原位产生。例如，通过光调制子系统引导的结构化UV光可以激活微流体装置的编辑区域内的特定位置的可光活化聚合物的聚合。作为另一个实例，可以在位于编辑区域内的靶细胞周围“抽拉(drawn)”水凝胶结构，引起靶细胞的收缩。在一些实施方案中，编辑区域内的水凝胶结构还可用于：限制含有基因组编辑生物分子的培养基的扩散，从而将基因组编辑生物分子保持在靶细胞附近以促进成功转染；和/或包含(或密封)微流体装置的编辑区域内的靶细胞。
在一些实施方案中，放置在微流体芯片的编辑区域内的细胞的基因组编辑包括在微结构上刺穿(impale)细胞。该过程在本领域中称为“刺穿转染(impalefection)”。在这些实施方案中，微流体装置的编辑区域的一个或多个内表面208可以用微结构(例如纳米管)图案化。在一些实施方案中，微结构可以注入包含基因组编辑生物分子的介质，或者微结构可以用于捕获包含基因组编辑生物分子的微物体，例如珠子。在某些实施方案中，DEP力可用于将细胞推到微结构上，使得微结构刺穿细胞。在其他实施方案中，可以使用培养基流将细胞推到微结构上，使得微结构刺穿细胞。培养基流可以以本文所述的任何方式或者本领域已知的其他方式产生，包括泵送培养基通过微流体装置和局部流动。例如，在美国专利申请公开号2016/0158757中已经描述了微流体装置内的局部流动的产生，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，放置在微流体芯片的编辑区域内的细胞的基因组编辑包括使细胞经受高强度超声频率。可以选择超声频率以诱导孔形成(声孔效应)，并且可以在细胞存在促进孔形成的物质时任选地应用。当暴露于超声时经受声空化的微气泡可以用作促进孔形成的物质。
在一些实施方案中，放置在微流体芯片的编辑区域内的细胞的基因组编辑包括使细胞与包含基因组编辑生物分子(和任选的供体模板)的磁性纳米颗粒接触。在这样的实施方案中，微流体装置的转染区域可包括磁体，其可整合到支撑结构中或微流体装置的衬底中。无论如何，一旦细胞适当地置于编辑区域中，就可以可控制地施加磁力，以迫使细胞与磁性纳米颗粒接触。
取决于实施方案，施加力以促进细胞渗透性和/或孔隙度(包括孔形成)可以在使靶细胞与基因组编辑生物分子(和，任选地，供体模板)接触之后或基本上同时进行。基因组编辑生物分子(和供体模板，如果需要)可以通过流体培养基流过编辑区域的方式直接引入编辑区域，这可以与将靶细胞引入编辑区域同时发生(例如，靶细胞和基因组编辑生物分子可以是流入编辑区域的混合物的一部分)。或者，可以间接引入基因组编辑生物分子(和供体模板，如果需要)，例如通过从流过开口的流体培养基扩散到编辑区域。在其他替代方案中，基因组编辑生物分子可以与转染结构的表面(例如编辑区域内的壁或阻挡件、微结构或纳米颗粒)相结合。在将靶细胞移动到编辑区域之前，将靶细胞移动到编辑区域的同时(例如，如果结构存在于与细胞相同的培养基中)，或在靶细胞移动到编辑区域之后(例如，如果结构可以通过选择性力(例如DEP)移动到编辑区域中)，微结构和纳米颗粒转染结构可以定位到编辑区域中。微流体装置的编辑区域内的流体培养基可包含促进细胞渗透性和/或细胞孔隙率和细胞转染的不同分子或化合物。
可以使用多种上述将基因组编辑生物分子引入细胞的方法，但是某些方法可以提供使细胞毒性最小化和/或编辑特定细胞类型的优点。例如，编码核酸内切酶的mRNA的电穿孔(任选地与指导RNA(gRNA)组合)可以促进原代细胞的离体基因编辑。或者，直接递送纯化的核酸内切酶蛋白质或核酸内切酶-核酸复合物(例如，Cas9蛋白-gRNA复合物)可以实现高水平的基因编辑，这种递送受到电穿孔或与细胞穿透肽融合(其避免了电穿孔介导的毒性)的影响。病毒载体提供了高效递送基因组编辑生物分子的额外方法，同时使细胞毒性最小化。例如，慢病毒载体可用于高效转导造血干细胞；并且整合酶缺陷型慢病毒载体可以有利地用于将基因组编辑生物分子瞬时引入靶细胞。腺病毒载体还可以在多种细胞类型中实现高水平的离体转导，同时仅瞬时表达基因组编辑生物分子(例如，核酸内切酶)的功能性组分。慢病毒和腺病毒载体均提供足以携带多种核酸酶和/或gRNA表达盒的载货能力(cargocapacity)，因此可以允许基因组内的几个靶位点的多重编辑。
一旦一个或多个靶细胞(例如，靶细胞群)经受了基因组编辑过程，通常必须确定是否已经成功编辑了任何细胞。使用如本文所述的微流体装置(特别是具有配置用于单细胞分离和扩增的隔离坞的微流体装置)可以有助于成功编辑的细胞的识别。图5示出了用于选择、分析和识别已经经受成功靶向(或非靶向)基因组编辑事件的细胞的示例性方法500中的步骤。在方法500的步骤502，已经经受基因组编辑过程的细胞任选地扩增成克隆群。扩增成克隆群可以包括从基因组编辑的细胞群中分离单个细胞并将单个细胞扩增成不同的克隆群。例如，可以在微流体装置中的对应隔离坞中分离单个细胞，并在有助于单细胞扩增成克隆集落的条件下培养。衍生自单细胞的细胞克隆群的产生有助于基因组分析，如下文进一步讨论的。方法500可以用基因组编辑的细胞进行，所述细胞已经通过本领域已知的或本文描述的任何方法编辑，无论编辑过程是在微流体装置内还是在微流体装置外部进行(即，在将基因组编辑的细胞群加载到微流体装置之前)。
在一些实施方案中，方法500包括对基因组编辑的细胞群进行初始选择以富集包括成功的基因组编辑(例如，成功的靶向编辑)的细胞的步骤(图5中未显示)。可以在步骤502之前、期间或之后进行第一选择。
初始选择可以基于在预编辑的细胞和/或经过编辑过程而未被成功编辑的细胞中未表达(或以可检测的较低水平表达)的可检测标志物。例如，成功的基因组编辑可以引入编码可检测标志物的外源性核酸序列或产生可检测标志物的生物分子，例如蛋白质。或者，成功的基因组编辑可以引入外源性核酸序列，其包括非编码调节序列，该调节序列增加编码可检测标志物的内源核酸序列或产生可检测标志物的生物分子(例如蛋白质)的表达。如上所讨论的，外源性核酸序列可以是供体模板的一部分，其可以是基因组编辑生物分子的一部分。可检测标志物可以是例如生物分子的表位，例如定位于细胞表面的蛋白质或碳水化合物分子。或者，标志物可以是产生光的生物分子，其可以具有细胞内定位。产生光的生物分子的实例包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物、生物发光蛋白及其衍生物、切割在切割时发光的底物的酶等。“可检测的较低水平”可以是相对于经受了成功的基因组编辑的细胞中可检测标志物的水平的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。
可以在将基因组编辑的细胞加载到微流体装置之前进行基因组编辑的细胞亚群的初始选择。例如，表达特定细胞表面表位的基因组编辑的细胞可以通过荧光激活细胞分选(FACS)、基于磁珠的结合或在本领域中已知的任何其他分选技术选自已经进行基因编辑的细胞群。然后，可以将从这种选择(即，“芯片外”选择)获得的细胞亚群加载到微流体装置中用于进一步处理，例如根据图5的方法500等。或者，可以在将基因组编辑细胞群加载到微流体装置之后，进行基因组编辑细胞亚群的基于可检测标志物的选择。例如，成像可用于检测表达特定细胞表面表位的细胞，其可用抗体或具有荧光标记物的其他特异性结合剂标记。作为另一个实例，成像可用于检测表达产生光的生物分子的细胞。无论可检测标志物的确切性质(无论是蛋白质，碳水化合物还是光产生)，都可以选择被识别为具有可检测标志物的细胞并将其移入对应的隔离坞中。因此，例如，可以在基因组编辑群的细胞位于微流体装置中的液流区域(例如，微流体通道)内时进行细胞的检测和选择。
可以定量可检测标志物(或“报道分子”)的量，并且可以选择具有最小阈值量的可检测标志物的细胞用于进一步处理(例如，根据方法500)。在一些实施方案中，可能是有益的是，将一个或多个个体细胞扩增成细胞克隆群以确定克隆群的细胞是否表现出随时间和/或一次或多次细胞分裂之后稳定的可检测标志物的水平增加。例如，如下所讨论的，可能是有益的是，确定产生GFP作为报道分子的单个细胞在单个细胞扩增成细胞克隆群时是否稳定地产生GFP。类似地，在基因组编辑产生功能能力的情况下，如可以由新的信号传导受体或酶提供，可能需要在测定功能能力之前将个体细胞扩增成对应的细胞群。
此外，对于其中细胞在用基因组编辑生物分子(和/或供体模板)转染期间受力的实施方案，可能是有用的是，将转染的细胞扩增成克隆群以确定转染是否对细胞活力具有任何影响。类似地，在一些实施方案中，可能是有益的是，监测细胞扩增以确定细胞是否以预期速率增殖。例如，因为脱靶基因组编辑可以激活癌基因或以其他方式破坏细胞周期调节，异常细胞增殖可以指示脱靶基因组编辑。
如上所讨论的，基因组编辑的细胞可以包含靶向基因组编辑，其可以是中靶或脱靶或非靶向(即，随机)基因组编辑。如本文所用，“中靶基因组编辑”(或“中靶基因组修饰”)是指将来自供体模板的核酸序列成功整合到细胞的基因组的靶位点和/或从靶位点删除内源性DNA；“脱靶基因组编辑”(或“脱靶基因组修饰”)是指来自基因组编辑生物分子或供体模板的核酸序列整合到靶位点之外的细胞基因组的位点，和/或从靶细胞之外的细胞基因组的位点删除内源性DNA。无论是中靶、脱靶还是非靶向，可以通过表征其基因组序列或其部分来识别含有基因组编辑的细胞。因此，例如，在方法500的步骤504，已成功修饰以具有中靶或非靶向基因组编辑的细胞可以通过表征其基因组序列来识别。这样的表征可包括细胞裂解、核酸提取和进一步处理步骤(例如，片段化、标记和/或扩增)。例如，使用对第一核酸序列和/或第二核酸序列具有特异性的引物扩增提取的(和任选片段化的和/或标记的)核酸可以允许检测中靶基因组编辑。或者，或另外，表征是基因组测序(例如，选择基因组区域的DNA测序、全基因组测序、选择mRNA转录物的RNA测序、全转录物组测序等)。这种测序结果的分析可用于识别第一核酸序列和/或第二核酸序列，从而允许检测中靶基因组编辑。
为了使用需要核酸提取的技术，通常需要将单个基因组编辑的细胞扩增成细胞克隆群，以使可以处理克隆群的细胞亚组以用于基因组分析，而克隆群的细胞另一亚组可以保留以随后使用(其可以包括从微流体装置输出和芯片外生长)。因此，在一些实施方案中，基因组编辑细胞的克隆群的基因组序列的表征包括从克隆群中选择一个或多个细胞并对一个或多个细胞进行基因组表征。步骤504可以部分地或完全地在微流体装置外部(即，“芯片外”)进行。例如，表征基因组编辑的细胞的基因组可以包括从细胞克隆群输出一个或多个细胞，并且在这样的输出之后，进行细胞裂解、核酸提取和进一步处理和/或芯片外核酸测序。或者，表征基因组编辑细胞的基因组可以包括将一个或多个克隆群的细胞从隔离坞内移动到微流体装置中的另一个腔室，在另一个腔室中进行细胞裂解和核酸提取，然后输出提取的核酸用于进一步处理和/或芯片外测序。
根据实施方案，识别成功的中靶(或非靶向)基因组编辑的任何方法可以以任何顺序与任何其他方法组合。例如，在一些实施方案中，可以通过基于一种或多种可检测标志物(或报道分子)的存在最初选择个体细胞，分离每个个体标志物阳性细胞并将其扩增成克隆群，然后从克隆群的一个或多个细胞中提取DNA(和/或RNA)用于进一步处理和/或基因组测序以确认成功的中靶(或非靶向)基因组编辑，进而识别含有中靶(或非靶向)基因组编辑的细胞。在其他实施方案中，可以通过首先将单个细胞分离并扩增成克隆群，然后确定每个克隆群中标志物(或报道分子)的存在，然后从所选(或所有)克隆群的一个或多个细胞中提取DNA(和/或RNA)用于进一步处理和/或测序以确认成功的中靶(或非靶向)基因组编辑，进而识别含有中靶(或非靶向)基因组编辑的细胞。在其他实施方案中，可以通过首先检测单个细胞中中靶(或非靶向)基因组编辑的功能特性(例如，基因组编辑产生或删除的蛋白质的功能活性)，将单个细胞分离并扩增成克隆群，然后从克隆群的一个或多个细胞中提取DNA(和/或RNA)用于进一步处理和/或测序以确认成功的中靶(或非靶向)基因组编辑，进而识别具有中靶(或非靶向)基因组编辑的细胞。在其他实施方案中，可以通过首先将单个细胞分离并扩增成克隆群，然后检测每个克隆群中中靶(或非靶向)基因组编辑的功能特性(例如，基因组编辑产生或删除的蛋白质的功能活性)，然后从所选(或所有)克隆群的一个或多个细胞中提取DNA(和/或RNA)用于进一步处理和/或测序以确认成功的中靶(或非靶向)基因组编辑，进而识别具有中靶(或非靶向)基因组编辑的细胞。
在500的步骤506，可以分析被识别为已成功进行基因组编辑的细胞群，以识别包含脱靶基因组编辑的群。与中靶基因组编辑一样，可以使用可检测标志物(或报道分子)和/或通过分析从所选(或所有)克隆群的一个或多个细胞中提取的核酸来评估脱靶基因组编辑(或有缺陷的非靶向编辑)的存在。例如，报道分子可以是供体模板(以及任选地，如上所讨论的基因组编辑生物分子)的一部分或由供体模板编码，其被配置使得为可检测标志物/报道分子或编码可检测标志物/报道分子的部分当成功编辑后缺失，但当编辑脱靶(或有缺陷)时可以保留。类似于方法500的步骤504，步骤506的全部或部分可以在芯片外进行。此外，步骤506的全部或部分可以与步骤504的全部或部分并行进行。例如，可以从克隆群的一个或多个细胞中提取核酸并“深度测序”以识别中靶基因组编辑和脱靶基因组编辑。类似地，在使用可检测标志物识别脱靶/有缺陷的基因组编辑的实施方案中，可以在克隆单个细胞以形成细胞群之前、期间或之后和在检测与中靶/成功的基因组编辑相关的标志物之前、期间或之后进行检测脱靶/有缺陷的标志物的步骤。在后一方面，可以使用交通灯报告系统(Traffic Light Reporter system)，允许基于不同报道分子的产生同时识别中靶基因组编辑和脱靶基因组编辑。
对于技术人员显而易见的是，出于进一步扩增具有成功的中靶(或非靶向)基因组编辑的细胞的目的，可以在步骤504和/或步骤506之后重复方法500的步骤502。可以进行将单个细胞进一步扩增成亚克隆群，然后重复步骤504(和任选地，步骤506)，以确定中靶(或非靶向)基因组编辑是否随时间稳定。步骤502、504和506中的任何一个可以以任何顺序或同时重复多次；并且可以连续评估可检测标志物(或报道分子)的存在，同时将单个细胞扩增成克隆群。此外，在任何前述方法中，条形码序列在插入细胞基因组时可用于识别克隆衍生自成功编辑的亲本细胞的子细胞。条形码序列可以例如与包括核酸扩增(例如，PCR)和/或核酸测序的步骤结合使用，以识别中靶和/或脱靶基因组编辑。
在方法500的步骤508，选择被识别为包含成功的中靶(或非靶向)基因组编辑的细胞克隆群用于输出。在方法500的步骤510，从微流体装置输出所选克隆群的一个或多个细胞(例如，用于进一步培养、扩增和/或处理)。
在确定基因组编辑成功的方法中使用的微流体装置可以是本文公开的任何微流体装置。在某些实施方案中，微流体装置可具有含有DEP配置的衬底，DEP配置可包括OET配置、由OET配置组成或基本上由OET配置组成。在一些实施方案中，微流体装置可具有含有EW配置的衬底，EW配置可包括OEW配置，由OEW配置组成或基本上由OEW配置组成。在一些实施方案中，微流体装置可具有衬底，该衬底具有含有DEP配置(其可包括OET配置、由OET配置组成或基本上由OET配置组成)的第一部分，以及含有EW配置(其可包括OEW配置，由OEW配置组成或基本上由OEW配置组成)的第二部分。根据微流体装置的配置，可以使用DEP力、OET力、EW力、OEW力、流体流动、局部流动、气泡驱动流动或其任何组合来进行需要选择和/或移动单个细胞(或细胞组)的步骤，无论是放置在隔离坞中、输出等。类似地，可以使用EW力、OEW力、流体流动、局部流动、泡沫驱动流动或其任何组合来进行需要移动培养基的步骤，无论是出于向细胞提供营养物和/或试剂还是出于运输细胞或其他微物体的目的。作为一个具体的实例，可以在微流体装置的DEP(和/或OET)配置部分中使用DEP(和/或OET)力来选择基因组编辑的细胞并将其移入和移出隔离坞，通过流体流携带至微流体装置的EW(和/或OEW)配置部分，然后使用EW(和/或OEW)力进行细胞裂解和核酸提取及处理，以操作含有细胞、核酸和/或试剂的液滴。
可用于所公开的方法的细胞。可以在微流体装置内扩增并且任选地在其中进行遗传修饰的细胞包括但不限于真核细胞，包括获自或衍生自蠕虫、昆虫、鱼、爬行动物、两栖动物、禽类、哺乳动物等的细胞。蠕虫细胞可以来自任何类型的蠕虫，包括例如自由生活蠕虫(free-living worm)，例如属于隐杆线虫(Caenorhabditis)属(例如秀丽隐杆线虫(C.elegans))或寄生虫。昆虫细胞可以来自任何类型的昆虫，包括果蝇，例如属于果蝇(Drosophila)属(例如黑腹果蝇(D.melanogaster))，以及蚊子，例如属于按蚊(Anopheles)属(例如冈比亚按蚊(A.gambiae))或伊蚊(Aedes)属(例如，埃及伊蚊(A.aegypti)、白纹伊蚊(A.albopictus)、波利尼西亚伊蚊(A.polynesiensis))。鱼细胞可以来自任何类型的鱼，包括被研究的鱼，例如丹鱼(Danio)属的鱼(例如斑马鱼(D.rerio))，或被消费的鱼，例如鳟鱼(例如麦奇钩吻鳟(Oncorhynchus mykiss)等)、鲤鱼(例如，草鱼(Ctenopharyngodonidella)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、锦鲤(Cyprinus carpio)等)，鲑鱼(例如大西洋鲑鱼(Salmo salar)等)、鲶鱼(例如土鲶(Silurus asotus)等)等。爬行动物细胞可以来自任何类型的爬行动物，包括蜥蜴类(例如，壁虎、变色龙、鬣鳞蜥等)、鳄鱼(例如，短吻鳄、鳄鱼等)、蛇类(例如，响尾蛇、眼镜蛇、蟒蛇、大蟒、珊瑚蛇、曼巴蛇、蝰蛇、花园蛇等)，或隐颈亚目(如淡水龟、海龟、乌龟等)。两栖动物细胞可以来自任何类型的两栖动物，包括蛙(例如非洲爪蟾(Xenopus laevis)、美国牛蛙(Lithobates catesbeianus)、牛蛙(Ranacatesbeiana)等)，或蟾蜍(例如，蟾蜍科(Bufonidae)等)。禽类细胞可以来自任何类型的禽，包括鸡(例如原鸡(Gallus gallus))、火鸡、雉等。哺乳动物细胞可以来自任何类型的哺乳动物，驯养的或野生的，包括啮齿动物，例如大鼠(例如，大鼠(Rattus)属)、小鼠(例如，小鼠(Mus)属)、豚鼠(例如，豚鼠(Cavia)属)等、兔(例如，穴兔属(Oryctolagus)、棉尾兔属(Sylvilagus)或琉球兔属(Pentalagus))、绵羊(例如，盘羊(Ovis)属)、山羊(例如，山羊(Capra)属)、猪(例如，猪(Sus)属)、牛(例如牛属(Bos)或野牛属(Bison))、马(例如马(Equus)属)，灵长类动物，包括简鼻亚目(haplorrhine)灵长类(例如，猴子)和原猴(strepsirrhines)灵长类(例如，狐猴等)和猿，例如猩猩(例如，猩猩(Pongo)属)、大猩猩(例如，大猩猩(Gorilla)属)、黑猩猩(例如黑猩猩(Pan)属)和人(例如，人(Homo)属)。
来自多细胞生物的细胞可以是多种不同细胞类型中的任何一种，包括免疫系统细胞和干/祖细胞。免疫系统的细胞，特别是来自哺乳动物免疫系统的细胞，可包括：T淋巴细胞；表达选自CD3、CD4、CD8、T-bet、GATA-3、CD25、Foxp3、ROR-γT、CD38和CD40的至少一种蛋白质的细胞；B淋巴细胞；NK细胞；表达选自CD56和CD16的至少一种蛋白质的细胞；巨噬细胞；表达选自F4/80、Siglec-3、γ受体、CD19、CD20和CD21的至少一种蛋白质的细胞。干/祖细胞可包括全能细胞、多能细胞、多潜能细胞和寡能细胞。根据期望的特定基因组编辑和产物基因组编辑细胞的特定用途，可以选择细胞类型(及其可分化水平)。
因此，在一些实施方案中，可以选择具有全能、多能(pluripotent)或多潜能(multipotent)行为的干细胞。全能干细胞与早期受精卵相当，后者可分化为胚胎发育和移植所需的任何细胞类型。对于人类受精卵，全能性通常在受精后约第5天消失。
多能干细胞有可能分化成三个胚层中的任何一个：内胚层(例如，内部胃粘膜、胃肠道、肺等的细胞)、中胚层(例如，肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖细胞等)或外胚层(例如，表皮细胞、神经系统的细胞，包括神经元等)。该类型包括胚胎干细胞(ESC)。该类型还包括由体细胞核移植(ntESC)产生的ES。这些细胞可以通过取出供卵的细胞核，随后插入成体细胞的细胞核(其可以包括但不限于皮肤细胞)产生。基因重编程和再激活可以通过转移过程触发。使得到的细胞生长至胚泡状态，分离其内细胞团以产生ntESC。这些细胞可用于治疗性克隆，而不是生殖性克隆。另一种相关类型的多能细胞是单性生殖干细胞(pESC)。单性生殖细胞(Parthenotes)可用于产生与患者免疫系统匹配的多能细胞来源，或可用作供体或其同胞的干细胞来源。在微流体装置中产生pESC的方法描述于题为“体外胚胎的产生和选择”(Generation and Selection of Embryos In-Vitro)的美国专利申请公开号2016/0257918中，其内容通过引用整体并入本文。
多能干细胞还包括诱导性多能干细胞(iPSC)。诱导性多能干细胞(iPSC)可以来自患者自身的体细胞，通常是皮肤成纤维细胞。可以通过引入一组所选的基因来诱导多能性，所述基因将特定的体细胞类型重编程回到早期的未分化状态。引入的典型基因包括Sox2、Oct4(也称为Pou5fl)、cMyc和Klf4。或者，可以使用与这些基因相关的转录因子、miRNA和所选的小分子来实现重编程。可以使用LIN28、mRNA结合蛋白和/或Glis1(一种转录因子)特别替代c-myc，减少对致癌性的担忧。可以促进iPSC形成的这种小分子的一些实例包括组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂和丙戊酸。包括3-脱氮新诺霉素A(3-deazaoneplanocin A)的小分子鸡尾酒(DZNep)也可用于化学重编程成体细胞。此外，可以使用ALK5抑制剂SB431412和促分裂原活化蛋白激酶抑制剂PD0325901的组合，任选地包括Thiazovivin。在一些实施方案中，肾上皮细胞可以仅通过两个因子SOX2和Oct4诱导为多能性，提供iPSC。
通过识别Fbx15(一种ESC特异性基因)或Nanog，可以从混合细胞群中选择多能iPSC。与使用Fbx15选择的iPSC相比，使用Nanog选择iPSC可以提供具有与ESC更相似的干细胞状态的iPSC。NANOG蛋白是Rex1启动子的转录激活因子，用于维持表达，其中Rex1也是多能性活性的标志物。NANOG通过各种转录因子和蛋白激酶的网络阻止分化。多能性的其他标志物可包括TRA-1-60(唾液酸化硫酸角质素蛋白聚糖(sialylated keratan sulfateproteoglycan)，其是人干细胞定义性抗原)、TRA-1-81(也是人干细胞定义性抗原)、SSEA4(阶段特异性早期胚胎糖脂抗原)、碱性磷酸酶、FGF4(成纤维细胞生长因子4)、ESG1、DPPA2(发育多能性基因2)、DPPA4(发育多能性基因4)和TERT(端粒酶逆转录酶)。
然而，一些多能干细胞(特别是iPSC)可以限制它们从三种胚层(即外胚层、中胚层和内胚层)分化成一种或多种细胞的程度，以及对自我更新的一些限制。此外，一些类型的多能干细胞可能具有限定的(committed)分化的倾向，其与胚胎来源的ESC相比有所改变。
通常称为干细胞的其他细胞类型是多潜能的，包括例如造血细胞的细胞。这些细胞通常可能具有分化成多种细胞类型的潜力，但不具有多能细胞可具有的很多种细胞类型。已经识别出多种细胞类型具有这些群的亚组，其可以是干细胞，包括但不限于脂肪细胞、肌成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、骨髓(造血)、人脐带组织或血细胞、神经细胞、血细胞、肾上皮细胞和间充质细胞。可替代地，各种这些细胞可以称为祖细胞，因为依赖于祖细胞/干细胞的特定类型，它们部分地限定为分化至不同程度。一个实例是骨软骨祖细胞，其从间充质细胞(多潜能干细胞)分化，并且自身可以分化成软骨细胞或成骨细胞，但不能分化成间充质细胞可以分化成的所有细胞类型。
作为另一个实例，造血细胞可以产生不同的血细胞类型，但可能不会分化成非血细胞类型。在另一个实例中，人脐带组织(HUCT)可以产生可以有利地被使用的间充质干细胞，表现出比其他多潜能干细胞或iPSC更少的“成熟”行为，并且可以触发更少的移植物对宿主疾病(排斥)。间充质干细胞可分化成各种结缔组织，可能分化成肌细胞、成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。间充质干细胞的另一个来源是在人的第三个臼齿内发现的。牙周或牙龈组织也可以提供间充质组的干细胞用于肌腱工程。
在其他实施方案中，人脐带血干细胞可以分化成神经元细胞。肾上皮干细胞是从尿中非侵入性收集的，可用于肾脏修复。
提出脂肪干细胞易于从整容手术程序获得，并且可以使用干细胞相关基因标志物识别，包括Oct4、Rex1、Sox2以及CD34。可用于识别和分离这些可分化细胞的其他标志物可包括CD10的皮下衍生ASC以及血管来源的ASC中的高表达，以及CD200的低表达。ASC提供间充质干细胞。
基因组修饰细胞的用途。可以使用基因编辑来解决单基因病症，以改善与基因缺陷相关的病理生理学。基因病症可选自常染色体显性遗传病、常染色体隐性遗传病、X连锁或Y连锁遗传病。
一些示例性常染色体显性遗传基因病可受益于基因编辑的干/祖细胞的递送，包括但不限于亨廷顿病(在4p16.3的亨廷顿蛋白基因)；Marfan综合征(原纤维蛋白缺陷，与结缔组织疾病相关(在15q21.1的FBN1基因))；家族性高胆固醇血症(最常见的形式之一是LDL受体缺陷(在19p13.1-13的LDLR基因)或载脂蛋白B缺陷(在2p24.1的APOB基因))；多囊肾病(多囊蛋白缺陷(最常见的是多囊蛋白1(在16p13.3的PKD1基因)或多囊蛋白2(在4q22.1的PKD2基因)缺陷)；神经纤维瘤病(在17q11.2的NF-1基因)；和视网膜母细胞瘤(在13q14的RB1基因)。
可以通过施用基因编辑的干/祖细胞来治疗的一些示例性常染色体隐性遗传基因病可以包括但不限于ADA-SCID(导致严重联合免疫缺陷的腺嘌呤脱氨酶缺乏症(在20q13.12的ADA基因))、囊性纤维化(氯离子通道缺陷(在7q31.2的CFTR基因))；镰状细胞性贫血(影响β珠蛋白基因，导致血管闭塞性危象，伴有永久性器官损伤(在11p15.5的HbS基因))；泰伊-萨克斯二氏病(Tay Sachs)(己糖胺酶A缺乏症(在15q24.1的HEXA基因))；α-1抗胰蛋白酶缺乏症(由弹性蛋白酶活性过高导致的肺和肝损伤(在14q32.1的SERPINA1基因))和苯丙酮尿症(苯丙氨酸羟化酶突变(在12q22-q24.2的PAH基因))。例如，ADA SCID治疗可以将基因编辑的造血细胞引入骨髓中，以向免疫系统提供校正量的腺苷脱氨酶。或者，可以为此目的编辑和引入iPSC。
X染色体上存在许多病症，并且可能受益于基因组编辑的干/祖细胞治疗。实例包括但不限于血友病(凝血因子VIII因子(在Xq28的F8基因)；杜兴氏(Duchenne)肌肉萎缩症(在Xp21的肌萎缩蛋白基因)；和瑞特(Rett)综合征(在Xq28的X连锁MECP2基因)。
虽然用这种方法可以更容易地解决单基因病症，但也可能解决多位点疾病(multiloci disease)，例如糖尿病、哮喘或多发性硬化。当例如慢病毒或AAV载体的足够大的载体含有多组靶向基因编辑生物分子时，可以进行基因组信息的多重修饰。
存储设备。还提供了用于存储用于执行本文公开的任何方法的非暂时性机器可读指令的机器可读存储设备。机器可读指令可以可选地提供对用于获得图像的成像设备的控制。
实施例
实施例1：采用ARF1/GFP基因组编辑生物分子的靶向基因组编辑
用1微克Cas9编码质粒、靶向内源性ARF1序列的指导RNA
Figure GDA0003459753850000721
和包含与编码绿色荧光蛋白(GFP)的插入框内融合的ARF1的一部分的供体模板DNA转染HeLa细胞(1×106个细胞)
Figure GDA0003459753850000722
粗体和斜体部分编码GFP。GFP充当敲入报道分子。用lipofectamin作为转染剂进行转染。
转染后，将基因组编辑的细胞群输入具有SSRL10涂层的OptoSelectTM芯片(Berkeley Lights,Emeryville,CA)。芯片包括微流体通道和OET配置的衬底，具有打开每个微流体通道的多个NanoPenTM腔室(即，隔离坞)和具有限定通道和隔离坞的基部的表面的OET配置的衬底。选择来自基因组编辑的细胞群的单细胞，并移入对应的隔离坞中，然后在芯片上孵育，通过芯片的微流体通道定期灌注新鲜培养基。
预期含有具有ARF1-GFP的中靶基因组编辑的细胞具有高尔基体定位的荧光图案，已知其位于细胞的核周区域。图6A和6B描绘了输入芯片后以及选择和移动到隔离坞中的转染的HeLa细胞的图像。如图6A所示，将输入到微流体芯片的细胞单独重新置于对应的隔离坞中以扩增成克隆群。在图6A所示的图像中，左起第四坞中的细胞发射荧光(呈现白色)，表明存在GFP报道分子。GFP表明用基因组编辑生物分子成功转染了细胞。图6B显示了用于激活OET配置的衬底并因此产生对表达GFP的细胞有活性的OET力的光图案(显示为白色光条)。白色光条在微流体通道的方向上的移动导致OET力的有效移动和从隔离坞输出表达GFP的细胞。
图7A和7B描绘了在从微流体芯片输出后沉积在96孔板的孔中的转染的HeLa细胞。图7A描绘了在孔板中培养两天后的输出细胞。图7B描绘了在孔板中培养六天后的输出细胞的放大视图。如图7B所示，输出细胞继续产生GFP(以白色显示)，其位于细胞的核周区域。
图8描绘了微流体芯片的图，其显示了芯片中隔离坞的相对位置，每个坞中的细胞数量，以及每个坞中的细胞是否产生由GFP产生的荧光信号。图中的每一行对应一行隔离坞。含有产生GFP的细胞的坞(使用用于异氰酸荧光素或“FITC”的过滤器定量)用星号表示，并用灰色着色；使用大圆圈表示具有多个细胞的坞。如图中所示，整个微流体装置中的许多细胞产生GFP。
图9和10描绘了在不同时间点的微流体芯片的图像。图9显示了多个最初加载有单个细胞的隔离坞，所述单个细胞在芯片上培养六天后已扩增成细胞克隆群。两个隔离坞(标有单和双星号)包含已扩增为克隆群的产生GFP的单细胞(以白色显示)；两个隔离坞中的细胞克隆群的所有细胞均产生绿色荧光蛋白，其位于细胞的核周(高尔基体)区域。图10显示了在芯片上培养九天后(即三天后)的相同的多个隔离坞。如图10所示，由于克隆扩增，包含产生GFP的细胞的两个隔离坞(用单和双星号标记)含有比图9中更大数目的细胞；同样，克隆群中的所有细胞都表达GFP。
图11A-11D提供了在图9和10中标记有单个星号的隔离坞在累进时间点的放大视图。如图11A(培养零小时)、11B(培养一天)、11C(培养三天)和11D(培养六天)所示，在第0天加载到隔离坞中的单个细胞随着它复制为细胞克隆群而稳定地产生GFP。
图12是在9天培养期内来自图9和10中描绘的隔离坞的细胞计数图。代表包含产生GFP的细胞的两个隔离坞的线以灰色着色并用单或双星号标记，如图9和10中所示。
输出后，裂解来自所选克隆的细胞，并提取基因组DNA并通过PCR扩增。基于PCR的扩增包括第一PCR反应，其具有正向引物F1和反向引物R1，其被设计用于扩增缺少GFP插入物的ARF1区域(图13，左图，上部条带)。
Figure GDA0003459753850000741
基于PCR的扩增还包括第二PCR反应，其具有正向引物F2和反向引物R2，其被设计用于扩增其中插入GFP编码核酸的ARF1等位基因的前100bp(图13，右图，下部条带)。
Figure GDA0003459753850000742
图13是来自所选克隆的扩增的DNA电泳并用溴化乙锭染色后的琼脂糖凝胶的图像。标记为“WT”的泳道含有从野生型HeLa细胞提取的DNA产生的扩增子。标记为“克隆”1、2、3和4的泳道包括从由ARF1/GFP实验所选的细胞的克隆提取的DNA产生的扩增子。下部条带(用箭头和标记“GFP插入物”表示)对应于包含编码GFP的核酸的扩增子。上部条带(用箭头和标记“WT”表示)对应于内源性ARF1序列的扩增子；仅当细胞具有至少一个缺乏中靶基因组编辑的等位基因时它才存在。如图13所示，克隆2的泳道具有(i)表明在ARF1靶位点存在编码GFP的DNA的条带，和(ii)表明存在编码WT ARF1的DNA的条带。这些条带表明克隆2的中靶基因组编辑是杂合的-也就是说，克隆2中只有一条染色体经受了中靶基因组编辑。相反，克隆1具有单一条带，表明在ARF1靶位点存在编码GFP的DNA；克隆1没有表明存在编码WTARF1的DNA的条带，表明克隆1的中靶基因组编辑是纯合的。如所预期的，野生型细胞(WT)的泳道仅具有指示存在编码WT ARF1的DNA的条带。
实施例2：CHO细胞的芯片上的转染
将含有中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞与含有编码GFP的核酸的质粒载体的混合物的低电导率缓冲液输入OptoSelectTM芯片(Berkeley Lights,Emeryville,CA)。该芯片包括微流体通道和OET配置的衬底，具有打开每个微流体通道的多个NanoPenTM腔室(即，隔离坞)和具有限定通道和隔离坞的基部的表面的OET配置的衬底。OET配置的衬底包括非晶硅层。使用OET力将CHO细胞在芯片上电穿孔(从1.6V至5V，持续8至80ms)，使细胞摄取GFP质粒。
图14B和14D是芯片上CHO细胞电穿孔后几分钟(图14B)和电穿孔后一天(图14D)的明场图像。图14A和14C分别描绘了在电穿孔后几分钟和电穿孔后一天由CHO细胞产生的GFP(以白色显示)。如图14C所示，几个细胞在微流体装置内电穿孔后一天成功产生GFP。
实施例3：实施方案
以下编号的项目提供了关于本文描述的实施方案的进一步的非限制性细节。
项目1.一种用于在包括隔离坞的微流体装置中产生遗传修饰细胞克隆群的方法，所述方法包括：
将第一细胞维持在微流体装置的隔离坞中，其中第一细胞已经受基因组编辑过程；
将第一细胞扩增成细胞克隆群；并且
在克隆群的一个或多个细胞中检测第一核酸序列的存在，其中第一核酸序列指示在细胞克隆群中存在中靶基因组编辑。
项目2.如项目1所述的方法，其中第一细胞是哺乳动物细胞。
项目3.如项目2所述的方法，其中第一细胞是人细胞、啮齿动物细胞、牛细胞、羊细胞、猪细胞、犬细胞或猫细胞。
项目4.如项目1至3中任一项所述的方法，其中第一细胞是免疫细胞。
项目5.如项目4所述的方法，其中免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或其前体。
项目6.如项目1至4中任一项所述的方法，其中第一细胞是干细胞。
项目7.如项目6所述的方法，其中干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞、脐静脉间充质干细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。
项目8.如项目6所述的方法，其中干细胞是造血干细胞、脂肪来源的干细胞、牙龈干细胞、肾干细胞或神经干细胞。
项目9.如项目1至4中任一项所述的方法，其中第一细胞是祖细胞。
项目10.如项目9所述的方法，其中祖细胞是骨软骨祖细胞、肌成纤维细胞、皮肤成纤维细胞或内皮祖细胞。
项目11.如项目1至14中任一项所述的方法，还包括：
使第一细胞与基因组编辑生物分子接触；并且
将第一细胞引入微流体装置。
项目12.如项目11所述的方法，其中基因组编辑生物分子包含供体模板核酸分子。
项目13.如项目11所述的方法，还包括：
使第一细胞与供体模板核酸分子接触。
项目14.如项目13所述的方法，其中第一细胞基本上同时与基因组编辑生物分子和供体模板核酸分子接触。
项目15.如项目12至14中任一项所述的方法，其中供体模板核酸分子包含第一核酸序列的全部或部分。
项目16.如项目11至15中任一项所述的方法，其中转染第一细胞的步骤在将第一细胞引入微流体装置的步骤之前进行。
项目17.如项目11至15中任一项所述的方法，其中转染第一细胞的步骤在将第一细胞引入微流体装置的步骤之后进行。
项目18.如项目17所述的方法，其中转染第一细胞根据项目46至84中任一项进行。
项目19.如项目11至18中任一项所述的方法，还包括基于选自形态学、大小、目标蛋白质的产生、一种或多种细胞表面标志物的存在，和与特定抗体的反应的一个或多个特征选择用于转染的第一细胞。
项目20.如项目19所述的方法，还包括将第一细胞放置于隔离坞中，其中所述放置在选择第一细胞之后进行。
项目21.如项目1至20中任一项所述的方法，其中微流体装置包括具有DEP配置的衬底，并且其中该方法还包括使用介电电泳(DEP)力将第一T细胞放置于隔离坞中。
项目22.如项目1至21中任一项所述的方法，其中检测第一核酸序列包括：
从细胞克隆群中选择一个或多个细胞；并且
从一个或多个所选的细胞中提取核酸。
项目23.如项目22所述的方法，还包括：
将一个或多个所选的细胞移出第一个隔离坞；并且
从微流体装置输出一个或多个所选的细胞，其中核酸在微流体装置外部提取。
项目24.如项目22所述的方法，还包括：将一个或多个所选的细胞从第一隔离坞移动到微流体装置的单独区域，其中核酸在单独区域中提取。
项目25.如项目22至24中任一项所述的方法，还包括扩增提取的核酸。
项目26.如项目25所述的方法，其中扩增提取的核酸包括进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。
项目27.如项目25所述的方法，其中扩增提取的核酸包括进行全基因组扩增(WGA)。
项目28.如项目25至27中任一项所述的方法，其中扩增提取的核酸包括扩增第一核酸序列。
项目29.如项目22至28中任一项所述的方法，其中提取的核酸包含基因组DNA。
项目30.如项目22至29中任一项所述的方法，其中提取的核酸包含核糖核酸(RNA)。
项目31.如项目30所述的方法，还包括用逆转录酶逆转录提取的RNA。
项目32.如项目1至31中任一项所述的方法，其中中靶基因组编辑包括在基因组的靶位点删除内源性脱氧核糖核酸(DNA)。
项目33.如项目1至32中任一项所述的方法，其中中靶基因组编辑包括在基因组的靶位点插入外源性脱氧核糖核酸(DNA)。
项目34.如项目32所述的方法，其中插入编码功能性生物分子、条形码和/或报道分子。
项目35.如项目33或34所述的方法，其中检测第一核酸序列的存在包括检测插入的全部或部分。
项目36.如项目1至35中任一项所述的方法，还包括：在克隆群的一个或多个细胞中检测第二核酸序列的存在，其中第一核酸序列和第二核酸序列的组合指示细胞克隆群中存在中靶基因组编辑。
项目37.如项目1至36中任一项所述的方法，还包括：在细胞克隆群的一个或多个细胞中检测额外的核酸序列的存在，其中额外的核酸序列指示细胞克隆群中存在脱靶基因组编辑。
项目38.如项目37所述的方法，其中脱靶基因组编辑包括在靶位点之外的基因组的位点的内源性DNA的删除和/或外源性DNA的插入。
项目39.如项目1至38中任一项所述的方法，其中微流体装置包括具有含介电电泳(DEP)配置的衬底的第一部分和具有含电润湿(EW)配置的衬底的第二部分，并且其中隔离坞位于微流体装置的第一部分。
项目40.如项目1至38中任一项所述的方法，其中微流体装置包括具有介电电泳(DEP)配置的第一衬底和具有电润湿(EW)配置的第二衬底，第一和第二衬底通过桥接区域连接，并且其中隔离坞位于包含第一衬底的微流体装置的部分。
项目41.如项目1至40中任一项所述的方法，其中将第一细胞扩增成细胞克隆群还包括监测克隆群的细胞的一个或多个特征一段时间。
项目42.如项目41所述的方法，其中在一段时间内周期性地进行监测。
项目43.如项目41或42所述的方法，其中监测包括识别克隆群中细胞的大小和/或形态学的变化。
项目44.如项目41至43中任一项所述的方法，其中监测包括确定第一细胞增殖到细胞克隆群的速率。
项目45.如项目41至44中任一项所述的方法，其中监测包括评估目标蛋白质的产生、一种或多种细胞表面标志物的存在和/或与特定抗体的反应。
项目46.一种在微流体装置内进行靶向基因组编辑的方法，该方法包括：
选择用于基因组编辑的第一细胞；
将第一细胞放置于微流体装置的编辑区域内；并且
当第一细胞位于编辑区域内时：
使第一细胞与基因组编辑生物分子接触，基因组编辑生物分子被配置为在基因组中的靶位点编辑第一细胞的基因组；
使得基因组编辑生物分子在靶位点编辑第一细胞的基因组。
项目47.如项目46所述的方法，其中基因组编辑生物分子包含核酸内切酶。
项目48.如项目46所述的方法，其中基因组编辑生物分子包含编码核酸内切酶的核酸。
项目49.如项目47或48所述的方法，其中核酸内切酶是可编程核酸内切酶。
项目50.如项目49所述的方法，其中可编程核酸内切酶选自Cas9、Cpfl和NgAgo。
项目51.如项目46至50中任一项所述的方法，其中基因组编辑生物分子包含靶向核酸。
项目52.如项目51所述的方法，其中靶向核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)。
项目53.如项目51所述的方法，其中靶向核酸包含核糖核酸(RNA)。
项目54.如项目51所述的方法，其中基因组编辑生物分子包含一个或多个编码靶向核酸和核酸内切酶的表达盒。
项目55.如项目47或48所述的方法，其中核酸内切酶包含TALEN蛋白或锌指蛋白。
项目56.如项目46或48至54中任一项所述的方法，其中基因组编辑生物分子包含病毒载体。
项目57.如项目56所述的方法，其中病毒载体是慢病毒载体。
项目58.如项目57所述的方法，其中慢病毒载体是整合酶缺陷型。
项目59.如项目56所述的方法，其中病毒载体是腺病毒载体。
项目60.如项目47或55所述的方法，其中核酸内切酶与细胞穿透肽融合。
项目61.如项目46至60中任一项所述的方法，其中使第一细胞与基因组编辑生物分子接触还包括使第一细胞与供体模板DNA接触。
项目62.如项目61所述的方法，其中基因组编辑生物分子包含供体模板DNA。
项目63.如项目61所述的方法，其中基因组编辑生物分子和供体模板DNA是不同的分子。
项目64.如项目61至63中任一项所述的方法，其中供体模板DNA包含插入序列，并且其中插入序列任选地编码功能性生物分子、条形码序列和/或报道分子。
项目65.如项目46至64中任一项所述的方法，其中接触第一细胞的步骤包括使第一细胞透化。
项目66.如项目65所述的方法，其中使第一细胞透化包括使第一细胞电穿孔或化学透化。
项目67.如项目46至55和61至66中任一项所述的方法，其中基因组编辑生物分子与纳米颗粒递送载体或微结构结合，并且其中使第一细胞与基因组编辑生物分子接触包括使第一细胞与纳米颗粒递送载体或微结构接触。
项目68.如项目46至67中任一项所述的方法，其中第一细胞是哺乳动物细胞。
项目69.如项目68所述的方法，其中第一细胞是人细胞、啮齿动物细胞、牛细胞、羊细胞、猪细胞、犬细胞或猫细胞。
项目70.如项目46至69中任一项所述的方法，其中第一细胞是免疫细胞。
项目71.如项目70所述的方法，其中免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或其前体。
项目72.如项目46至69中任一项所述的方法，其中第一细胞是干细胞。
项目73.如项目72所述的方法，其中干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞、脐静脉间充质干细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。
项目74.如项目72所述的方法，其中干细胞是造血干细胞、脂肪来源的干细胞、牙龈干细胞、肾干细胞或神经干细胞。
项目75.如项目46至69中任一项所述的方法，其中第一细胞是祖细胞。
项目76.如项目75所述的方法，其中祖细胞是骨软骨祖细胞、肌成纤维细胞、皮肤成纤维细胞或内皮祖细胞。
项目77.如项目46至76中任一项所述的方法，其中对第一细胞的基因组的靶位点的编辑包括删除。
项目78.如项目46至77中任一项所述的方法，其中对第一细胞的基因组的靶位点的编辑包括插入外源性核酸序列。
项目79.如项目78所述的方法，其中外源性核酸序列包括编码功能性生物分子、条形码和/或报道分子的核酸序列。
项目80.如项目46至79中任一项所述的方法，其中微流体装置的至少一个内表面或其一部分是经条件化的表面。
项目81.如项目80所述的方法，其中微流体装置包括隔离坞，并且其中隔离坞的至少一个内表面是经条件化的表面。
项目82.如项目80或81所述的方法，其中经条件化的表面包括共价连接的分子，每个分子具有与至少一个内表面或其一部分共价结合的连接基团和与连接基团共价结合的部分，其中共价连接的分子的部分提供适于基因组编辑的第一细胞的维持和/或扩增的有机和/或亲水分子层。
项目83.如项目82所述的方法，其中每个部分是包含聚乙二醇、糖或氨基酸的聚合物。
项目84.如项目82所述的方法，其中第一亚组的共价连接的分子的每个部分是包含氨基酸的聚合物，并且其中第二亚组的共价连接的分子的每个部分是包含聚乙二醇或糖的聚合物。
项目85.如项目1至45中任一项所述的方法，其中隔离坞的至少一个内表面是经条件化的表面。
项目86.如项目85所述的方法，其中经条件化的表面包括共价连接的分子，每个分子具有与至少一个内表面或其一部分共价结合的连接基团和与连接基团共价结合的部分，其中共价连接的分子的部分提供适于基因组编辑的第一细胞的维持和/或扩增的有机和/或亲水分子层。
项目87.如项目86所述的方法，其中每个部分是包含聚乙二醇、糖或氨基酸的聚合物。
项目88.如项目86所述的方法，其中第一亚组的共价连接的分子的每个部分是包含氨基酸的聚合物，并且其中第二亚组的共价连接的分子的每个部分是包含聚乙二醇或糖的聚合物。
项目89.如项目1至45或85至88中任一项所述的方法，其中微流体装置包含多个隔离坞，并且其中所述方法在多个细胞上进行，从而产生多个遗传修饰细胞的克隆群。
项目90.如项目89所述的方法，其中对多个细胞并行地进行所述方法的一个或多个步骤。
项目91.如项目1至45或85至90中任一项所述的方法，还包括：
将遗传修饰细胞的克隆群的一个或多个细胞从微流体装置输出到孔板中，和
在孔板中培养一个或多个输出的细胞。
项目92.一种组合物，其包含遗传修饰细胞的克隆群，其中克隆群通过项目1至91中任一项所述的方法产生。
项目93.如项目92所述的组合物，还包含多个遗传修饰细胞的克隆群，其中每个克隆群均通过项目1至91中任一项所述的方法产生。
项目94.如项目93所述的组合物，其中多个克隆群一起包含至少1000个遗传修饰细胞。
项目95.如项目93所述的组合物，其中多个克隆群一起包含至少10,000个遗传修饰细胞。
项目96.如项目92至95中任一项所述的组合物，还包含药学上可接受的载体。
尽管在本说明书中已经描述了特定实施方案和应用，但是这些实施方案和应用仅是示例性的，并且许多变形是可能的。
序列表
<110> G·G·拉维厄（LAVIEU, Gregory G.）
A·莫西亚罗（MOCCIARO, Annamaria）
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<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向内源性ARF1序列的引导RNA
<400> 1
actggctgtc caatcagctc cgg 23
<210> 2
<211> 876
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 包含与编码绿色荧光蛋白（GFP）的插入物框内融合的ARF1的部分的供体模板DNA
<400> 2
ctgcactcac tacgccacag gaactggtac attcaggcca cctgcgccac cagcggcgac 60
gggctctatg aaggactgga ctggctgtcc aatcaactac gaaaccagaa gggatcgtca 120
ggtcgggatc caggctcagg ttctggagtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 180
gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 240
gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 300
aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 360
agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 420
tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 480
gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 540
gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 600
atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 660
gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 720
cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 780
aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 840
ggcatggacg agctgtacaa gtaggcggcc gcgact 876
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 设计来扩增缺少GFP插入的ARF1区域的正向引物F1
<400> 3
acctccccaa cgccatgaat gcgg 24
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 设计来扩增缺少GFP插入的ARF1区域的反向引物R1
<400> 4
tgctaggcgg ggtctccc 18
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 设计来扩增含有插入其中的GFP编码核酸的ARF1等位基因的前100bp的 正向引物F2
<400> 5
acctccccaa cgccatgaat gcgg 24
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 设计来扩增含有插入其中的GFP编码核酸的ARF1等位基因的前100bp的 反向引物R2
<400> 6
gtggcatcgc cctcgccctc g 21

Claims (96)

1.一种在包括隔离坞的微流体装置中产生遗传修饰细胞克隆群的方法，所述方法包括：
将第一细胞维持在微流体装置的隔离坞中，其中第一细胞已经受基因组编辑过程；
将第一细胞在微流体装置的隔离坞内扩增成细胞克隆群；
在克隆群的第一亚组的一个或多个细胞中检测第一核酸序列的存在，其中第一核酸序列指示在细胞克隆群中存在中靶基因组编辑；和
保存细胞克隆群的第二亚组。
2.如权利要求1所述的方法，其中第一细胞是哺乳动物细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其中第一细胞是人细胞、啮齿动物细胞、牛细胞、羊细胞、猪细胞、犬细胞或猫细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其中第一细胞是免疫细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其中免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或其前体。
6.如权利要求1所述的方法，其中第一细胞是干细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其中干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞、脐静脉间充质干细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。
8.如权利要求6所述的方法，其中干细胞是造血干细胞、脂肪来源的干细胞、牙龈干细胞、肾干细胞或神经干细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其中第一细胞是祖细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其中祖细胞是骨软骨祖细胞、肌成纤维细胞、皮肤成纤维细胞或内皮祖细胞。
11.如权利要求1所述的方法，还包括：
使第一细胞与基因组编辑生物分子接触；并且
将第一细胞引入微流体装置。
12.如权利要求11所述的方法，其中基因组编辑生物分子包含供体模板核酸分子。
13.如权利要求11所述的方法，还包括：
使第一细胞与供体模板核酸分子接触。
14.如权利要求13所述的方法，其中第一细胞基本上同时与基因组编辑生物分子和供体模板核酸分子接触。
15.如权利要求12所述的方法，其中供体模板核酸分子包含第一核酸序列的全部或部分。
16.如权利要求11所述的方法，其中将第一细胞与基因组编辑生物分子接触的步骤在将第一细胞引入微流体装置的步骤之前进行。
17.如权利要求11所述的方法，其中将第一细胞与基因组编辑生物分子接触的步骤在将第一细胞引入微流体装置的步骤之后进行。
18.如权利要求17所述的方法，其中将第一细胞与基因组编辑生物分子接触的步骤如下进行：
选择用于基因组编辑的第一细胞；
将第一细胞放置于微流体装置的编辑区域内；并且
当第一细胞位于编辑区域内时：
使第一细胞与基因组编辑生物分子接触，基因组编辑生物分子被配置为在基因组中的靶位点编辑第一细胞的基因组；
使得基因组编辑生物分子在靶位点编辑第一细胞的基因组。
19.如权利要求11所述的方法，还包括基于选自形态学、大小、目标蛋白质的产生、一种或多种细胞表面标志物的存在，和与特定抗体的反应的一个或多个特征选择第一细胞。
20.如权利要求19所述的方法，还包括将第一细胞放置于隔离坞中，其中所述放置在选择第一细胞之后进行。
21.如权利要求1所述的方法，其中微流体装置包括具有DEP配置的衬底，并且
其中该方法还包括使用介电电泳(DEP)力将第一细胞放置于隔离坞中。
22.如权利要求1所述的方法，其中检测第一核酸序列包括：
从细胞克隆群中选择一个或多个细胞；并且
从一个或多个所选的细胞中提取核酸。
23.如权利要求22所述的方法，还包括：
将一个或多个所选的细胞移出第一个隔离坞；并且
从微流体装置输出一个或多个所选的细胞，其中核酸在微流体装置外部提取。
24.如权利要求22所述的方法，还包括：
将一个或多个所选的细胞从第一隔离坞移动到微流体装置的单独区域，其中核酸在单独区域中提取。
25.如权利要求22所述的方法，还包括扩增提取的核酸。
26.如权利要求25所述的方法，其中扩增提取的核酸包括进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。
27.如权利要求25所述的方法，其中扩增提取的核酸包括进行全基因组扩增(WGA)。
28.如权利要求25所述的方法，其中扩增提取的核酸包括扩增第一核酸序列。
29.如权利要求22所述的方法，其中提取的核酸包含基因组DNA。
30.如权利要求22所述的方法，其中提取的核酸包含核糖核酸(RNA)。
31.如权利要求30所述的方法，还包括用逆转录酶逆转录提取的RNA。
32.如权利要求1所述的方法，其中中靶基因组编辑包括在基因组的靶位点删除内源性脱氧核糖核酸(DNA)。
33.如权利要求1所述的方法，其中中靶基因组编辑包括在基因组的靶位点插入外源性脱氧核糖核酸(DNA)。
34.如权利要求32所述的方法，其中插入编码功能性生物分子、条形码和/或报道分子。
35.如权利要求33所述的方法，其中检测第一核酸序列的存在包括检测插入的全部或部分。
36.如权利要求1所述的方法，还包括：
在克隆群的一个或多个细胞中检测第二核酸序列的存在，其中第一核酸序列和第二核酸序列的组合指示细胞克隆群中存在中靶基因组编辑。
37.如权利要求1所述的方法，还包括：
在细胞克隆群的一个或多个细胞中检测额外的核酸序列的存在，其中额外的核酸序列指示细胞克隆群中存在脱靶基因组编辑。
38.如权利要求37所述的方法，其中脱靶基因组编辑包括在靶位点之外的基因组的位点的内源性DNA的删除和/或外源性DNA的插入。
39.如权利要求1所述的方法，其中微流体装置包括具有含介电电泳(DEP)配置的衬底的第一部分和具有含电润湿(EW)配置的衬底的第二部分，并且其中隔离坞位于微流体装置的第一部分。
40.如权利要求1所述的方法，其中微流体装置包括具有介电电泳(DEP)配置的第一衬底和具有电润湿(EW)配置的第二衬底，第一和第二衬底通过桥接区域连接，并且其中隔离坞位于包含第一衬底的微流体装置的部分。
41.如权利要求1所述的方法，其中将第一细胞扩增成细胞克隆群还包括监测克隆群的细胞的一个或多个特征一段时间。
42.如权利要求41所述的方法，其中在一段时间内周期性地进行监测。
43.如权利要求41所述的方法，其中监测包括识别克隆群中细胞的大小和/或形态学的变化。
44.如权利要求41所述的方法，其中监测包括确定第一细胞增殖到细胞克隆群的速率。
45.如权利要求41所述的方法，其中监测包括评估目标蛋白质的产生、一种或多种细胞表面标志物的存在和/或与特定抗体的反应。
46.一种在微流体装置内进行靶向基因组编辑的方法，该方法包括：
选择用于基因组编辑的第一细胞；
将第一细胞放置于微流体装置的编辑区域内；并且
当第一细胞位于编辑区域内时：
使第一细胞与基因组编辑生物分子接触，基因组编辑生物分子被配置为在基因组中的靶位点编辑第一细胞的基因组；
使得基因组编辑生物分子在靶位点编辑第一细胞的基因组。
47.如权利要求46所述的方法，其中基因组编辑生物分子包含核酸内切酶。
48.如权利要求46所述的方法，其中基因组编辑生物分子包含编码核酸内切酶的核酸。
49.如权利要求47所述的方法，其中核酸内切酶是可编程核酸内切酶。
50.如权利要求49所述的方法，其中可编程核酸内切酶选自Cas9、Cpfl和NgAgo。
51.如权利要求46所述的方法，其中基因组编辑生物分子包含靶向核酸。
52.如权利要求51所述的方法，其中靶向核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)。
53.如权利要求51所述的方法，其中靶向核酸包含核糖核酸(RNA)。
54.如权利要求51所述的方法，其中基因组编辑生物分子包含一个或多个编码靶向核酸和核酸内切酶的表达盒。
55.如权利要求47所述的方法，其中核酸内切酶包含TALEN蛋白或锌指蛋白。
56.如权利要求46所述的方法，其中基因组编辑生物分子包含病毒载体。
57.如权利要求56所述的方法，其中病毒载体是慢病毒载体。
58.如权利要求57所述的方法，其中慢病毒载体是整合酶缺陷型。
59.如权利要求56所述的方法，其中病毒载体是腺病毒载体。
60.如权利要求47所述的方法，其中核酸内切酶与细胞穿透肽融合。
61.如权利要求46所述的方法，其中使第一细胞与基因组编辑生物分子接触还包括使第一细胞与供体模板DNA接触。
62.如权利要求61所述的方法，其中基因组编辑生物分子包含供体模板DNA。
63.如权利要求61所述的方法，其中基因组编辑生物分子和供体模板DNA是不同的分子。
64.如权利要求61所述的方法，其中供体模板DNA包含插入序列，并且其中插入序列任选地编码功能性生物分子、条形码序列和/或报道分子。
65.如权利要求46所述的方法，其中接触第一细胞的步骤包括使第一细胞透化。
66.如权利要求65所述的方法，其中使第一细胞透化包括使第一细胞电穿孔或化学透化。
67.如权利要求46所述的方法，其中基因组编辑生物分子与纳米颗粒递送载体或微结构结合，并且其中使第一细胞与基因组编辑生物分子接触包括使第一细胞与纳米颗粒递送载体或微结构接触。
68.如权利要求46所述的方法，其中第一细胞是哺乳动物细胞。
69.如权利要求68所述的方法，其中第一细胞是人细胞、啮齿动物细胞、牛细胞、羊细胞、猪细胞、犬细胞或猫细胞。
70.如权利要求46所述的方法，其中第一细胞是免疫细胞。
71.如权利要求70所述的方法，其中免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或其前体。
72.如权利要求46所述的方法，其中第一细胞是干细胞。
73.如权利要求72所述的方法，其中干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞、脐静脉间充质干细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。
74.如权利要求72所述的方法，其中干细胞是造血干细胞、脂肪来源的干细胞、牙龈干细胞、肾干细胞或神经干细胞。
75.如权利要求46所述的方法，其中第一细胞是祖细胞。
76.如权利要求75所述的方法，其中祖细胞是骨软骨祖细胞、肌成纤维细胞、皮肤成纤维细胞或内皮祖细胞。
77.如权利要求46所述的方法，其中对第一细胞的基因组的靶位点的编辑包括删除。
78.如权利要求46所述的方法，其中对第一细胞的基因组的靶位点的编辑包括插入外源性核酸序列。
79.如权利要求78所述的方法，其中外源性核酸序列包括编码功能性生物分子、条形码和/或报道分子的核酸序列。
80.如权利要求46所述的方法，其中微流体装置的至少一个内表面或其一部分是经条件化的表面。
81.如权利要求80所述的方法，其中微流体装置包括隔离坞，并且其中隔离坞的至少一个内表面是经条件化的表面。
82.如权利要求80所述的方法，其中经条件化的表面包括共价连接的分子，每个分子具有与至少一个内表面或其一部分共价结合的连接基团和与连接基团共价结合的部分，其中共价连接的分子的部分提供适于基因组编辑的第一细胞的维持和/或扩增的有机和/或亲水分子层。
83.如权利要求82所述的方法，其中每个部分是包含聚乙二醇、糖或氨基酸的聚合物。
84.如权利要求82所述的方法，其中第一亚组的共价连接的分子的每个部分是包含氨基酸的聚合物，并且其中第二亚组的共价连接的分子的每个部分是包含聚乙二醇或糖的聚合物。
85.如权利要求1所述的方法，其中隔离坞的至少一个内表面是经条件化的表面。
86.如权利要求85所述的方法，其中经条件化的表面包括共价连接的分子，每个分子具有与至少一个内表面或其一部分共价结合的连接基团和与连接基团共价结合的部分，其中共价连接的分子的部分提供适于基因组编辑的第一细胞的维持和/或扩增的有机和/或亲水分子层。
87.如权利要求86所述的方法，其中每个部分是包含聚乙二醇、糖或氨基酸的聚合物。
88.如权利要求86所述的方法，其中第一亚组的共价连接的分子的每个部分是包含氨基酸的聚合物，并且其中第二亚组的共价连接的分子的每个部分是包含聚乙二醇或糖的聚合物。
89.如权利要求1所述的方法，其中微流体装置包含多个隔离坞，并且其中所述方法在多个细胞上进行，从而产生多个遗传修饰细胞的克隆群。
90.如权利要求89所述的方法，其中对多个细胞并行地进行所述方法的一个或多个步骤。
91.如权利要求1所述的方法，还包括：
将遗传修饰细胞的克隆群的一个或多个细胞从微流体装置输出到孔板中，和
在孔板中培养一个或多个输出的细胞。
92.一种组合物，其包含遗传修饰细胞的克隆群，其中克隆群通过权利要求1所述的方法产生。
93.如权利要求92所述的组合物，还包含多个遗传修饰细胞的克隆群，其中每个克隆群均通过权利要求1所述的方法产生。
94.如权利要求93所述的组合物，其中多个克隆群一起包含至少1000个遗传修饰细胞。
95.如权利要求93所述的组合物，其中多个克隆群一起包含至少10,000个遗传修饰细胞。
96.如权利要求92所述的组合物，还包含药学上可接受的载体。
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