CN110437992B - 一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片及其使用方法，属于微流控芯片分析技术领域，该芯片由集成有微管道阵列的聚二甲基硅氧烷盖片和集成有微腔阵列的基片通过可逆键合方式构成，该芯片实现了微管道阵列和微腔阵列的分离，不仅可以增加芯片单位面积上微腔的排布密度，提升液样的数字化分解数目，还可以避免了基于气相或油相移除进样微管道中残留样品液的冗长的数字化分解操作步骤，大大缩短了液相样品大规模数字化分解的时间。另外，使用该芯片时无需精密的微泵驱动和复杂的微阀控制，也无需繁复的宏‑微接口，可简便、快速、低成本地实现液相样品的大规模自动分解和均一分配，有望促进数字化分析技术的发展和广泛应用。

Description

一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片及其使用方法
技术领域
本发明属于微流控芯片分析技术领域，具体涉及一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片及其使用方法。
背景技术
高通量数字化分析技术在高精度核酸定量分析、蛋白质及酶活性测定、单细胞分析等领域具有突出的应用优势，因而近年来受到生物医学界的广泛关注。数字化分析技术的原理就是将样品分解为大量独立的微小单元，使得每个单元包含1个或者0个待分析细胞或分子，从而使得研究人员可以在单细胞水平或单分子水平对待测样品进行精确检测和分析。对于数字化分析技术而言，最关键的环节就是液样的大规模、均一分解。传统的液样大规模、数字化分解通常是采用超声乳化方法来实现的，这种方法虽然可以简便、快速地实现液样的大规模、数字化分解，但是产生的液滴(即微液样单元)是多分散性的、大小不均一，影响后续泊松分布统计学分析，进而影响检测或分析结果的准确性；另外，超声作用可能会对液样中的生物样本产生损伤，且油相中往往需要添加表面活性剂以维持分解液滴的分散性和稳定性，而添加的表面活性剂则可能会对某些分析体系有影响或干扰作用，从而影响结果的可信度。
近年来，随着微流控技术的发展，液滴微流控芯片成为了目前液样大规模、数字化分解的主流平台，这种方法主要是利用两种互不相溶流体界面的不稳定性，通过表面张力和剪切力间的共同作用使含样品的液相在另一互不相溶液相中分散形成大量液滴。这种方法需要精密、昂贵的流体驱动装置实现两种流体相流速的精确控制，同时也需要在油相或水相中添加表面活性剂以防止相邻液滴的融合，这些要求在一定程度上限制了该方法的应用。除了液滴微流控技术，近些年，国际上还发展了一些阵列式的微流控芯片用于实现液样的大规模分解，包括微阀阵列芯片、滑移芯片、亲-疏水图形芯片、集成微管道的微腔阵列芯片[Ven K，Vanspauwen B，Pérez-Ruiz E,et al.Target confinement in small reactionvolumes using microfluidic technologies:a smart approach for single-entitydetection and analysis.ACS sensors,2018,3(2):264-284.]，虽然这些阵列式的液样分解方法无需添加表面活性剂维持分解液样单元的稳定，避免了添加表面活性剂对分析结果的影响，但是这些方法也均有各自明显的缺陷，比如微阀阵列芯片需要外置气压装置和繁复的宏-微接口，滑移芯片需要繁琐的手动操作和操作人员熟练的操作技巧，亲-疏水图形芯片分解液样的效果则受待分解液样和芯片表面的浸润性及流体流速的影响较大，分解效果不稳定，往往对不同液样的分解体积存在较大差异，而集成微管道的微腔阵列芯片在液样分解过程中往往需要利用油相排除充样管道中的液样，以实现各微腔中液样的独立，但通常微管道截面尺度较小、油相粘度较大，导致微管道中流阻较大、分解过程耗时较长；另外，由于集成微管道的微腔阵列芯片中微管道与微腔排布于芯片的同一结构层，导致每一芯片单位面积上微腔的排布密度受限，从而也影响到最终液样的整体分解数目。总之，现有的微流控液样大规模分解方法在分解数目、操作的简便性、应用的成本和可靠性等方面均存在较大的局限。因此，迫切需要发展一种快速、简便、灵活度高、成本低廉的液样大规模、数字化分解工具和方法，满足单分子检测、酶活性分析、单细胞分析等领域对高通量数字化分析技术的需求，促进分子生物学和细胞生物学的快速发展。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片；目的之二在于提供一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片的使用方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片，所述芯片由聚二甲基硅氧烷盖片和基片通过可逆键合方式构成；
所述聚二甲基硅氧烷盖片上集成一个或多个微管道阵列，所述微管道阵列由多个微通道凹槽平行排列而成，所述多个微通道凹槽的一端均与串联通道凹槽连通，另一端均为盲端，所述串联通道凹槽与所述微管道阵列上一一对应设置的进样口连通；
所述基片上集成有一个或多个微腔阵列；
所述微管道阵列中的微通道凹槽开口与所述微腔阵列中微腔开口相对设置，单个所述微管道阵列的投影面积覆盖单个与之对应的微腔阵列，且单个所述微管道阵列中任意相邻两个微通道凹槽之间的间距小于与之对应的微腔阵列中单个微腔的口径。
优选的，所述聚二甲基硅氧烷盖片的厚度为1-5mm。
优选的，所述微腔阵列中各微腔的几何形状尺度均一致，微腔形状为圆柱形、椭圆柱形、多边柱形或球冠形中的一种。
优选的，所述基片上微腔的总个数为10000以上。
优选的，所述基片的材质为硅、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯、环烯烃共聚物、聚苯乙烯或环氧树脂中的一种。
2、所述的一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片的使用方法，包括如下步骤：
(1)将聚二甲基硅氧烷盖片上集成有一个或多个微管道阵列的一面与基片上集成有一个或多个微腔阵列的一面对准贴合，使各微管道阵列区域覆盖与之对应的微腔阵列区域，获得一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片；
(2)将步骤(1)中获得的芯片置于真空容器中进行至少30min脱气处理，并真空封装备用；
(3)向经步骤(2)处理后的芯片的进样口滴加待分解的液相样品，使所述芯片中形成封闭微管道-微腔体系，经真空脱气处理的所述聚二甲基硅氧烷盖片吸收微管道-微腔体系中的空气，产生负压驱动所述液相样品进入并充满所述芯片中微管道-微腔体系；
(4)待所述芯片中各微腔充满所述液相样品后，将所述聚二甲基硅氧烷盖片从所述基片上剥离，即实现所述液相样品的大规模、快速数字化分解。
优选的，待所述聚二甲基硅氧烷盖片从所述基片上剥离后，还包括对所述基片进行封盖工序，以防止所述微腔中液相样品的水分挥发。
优选的，所述封盖以滴加油相、粘贴自粘性胶片或覆盖涂覆聚二甲基硅氧烷的玻璃实现。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片及其使用方法，该芯片中将微管道阵列和微腔阵列分别集成在聚二甲基硅氧烷盖片和基片上，实现了微管道阵列和微腔阵列的分离，这种使进样结构(即微管道阵列)和样品数字化存储结构(即微腔阵列)分处盖片和基片的芯片形式，一方面避免了进样微管道与微腔排布于芯片的同一结构层，所导致芯片单位面积上微腔的排布密度受限的问题，可增加芯片单位面积上微腔的排布密度，从而提升液样的数字化分解数目；另一方面，该芯片形式可在充样过程完成后，通过直接剥离盖片实现微腔阵列中各微腔液样之间的隔离，完成样品的数字化分解，避免了基于气相或油相移除进样微管道中残留样品液的冗长的数字化分解操作步骤，大大缩短了液相样品大规模数字化分解的时间。另外，该芯片盖片采用聚二甲基硅氧烷，使盖片在经后期预脱气处理后，该盖片会不断吸收微管道-微腔体系中空气，使得芯片微管道-微腔体系中形成负压，从而驱动液相样品进入并充满芯片中微管道-微腔体系，因此，使用该芯片时无需精密的微泵驱动和复杂的微阀控制，也无需繁复的宏-微接口，可简便、快速、低成本地实现液相样品的大规模自动分解和均一分配，有望促进数字化分析技术的发展和广泛应用。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为本发明中液相样品大规模、快速数字化分解芯片结构示意图(聚二甲基硅氧烷盖片集成有一个微管道阵列，基片上集成有一个微腔阵列)；
图2为本发明中液相样品大规模、快速数字化分解芯片结构示意图(聚二甲基硅氧烷盖片上集成有多个微管道阵列，基片上集成有多个微腔阵列)；
图3为本发明中液相样品大规模、快速数字化分解芯片使用方法流程示意图；
图4为本发明中液相样品大规模、快速数字化分解芯片应用于数字PCR分析实验结果图；
图5为本发明中液相样品大规模、快速数字化分解芯片应用于数字ELISA分析流程示意图；
图6为本发明中液相样品大规模、快速数字化分解芯片应用于单细胞分析流程示意图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
图1为本发明中液相样品大规模、快速数字化分解芯片结构示意图，由图1可知，该芯片由聚二甲基硅氧烷盖片和基片通过可逆键合方式构成，其中，聚二甲基硅氧烷盖片上集成一个微管道阵列，该微管道阵列由多个微通道凹槽平行排列而成，多个微通道凹槽的一端均与串联通道凹槽连通，另一端均为盲端，串联通道凹槽与微管道阵列上对应设置的进样口连通；基片上集成有一个微腔阵列；微管道阵列中的微通道凹槽开口与微腔阵列中微腔开口相对设置，微管道阵列的投影面积覆盖微腔阵列，且微管道阵列中任意相邻两个微通道凹槽之间的间距小于微腔阵列中单个微腔的口径。
图2为本发明中液相样品大规模、快速数字化分解芯片结构示意图，由图2可知，该芯片由聚二甲基硅氧烷盖片和基片通过可逆键合方式构成，其中，聚二甲基硅氧烷盖片上集成多个微管道阵列，单个微管道阵列由多个微通道凹槽平行排列而成，多个微通道凹槽的一端均与串联通道凹槽连通，另一端均为盲端，串联通道凹槽与微管道阵列上一一对应设置的进样口连通；基片上集成有多个微腔阵列；微管道阵列中的微通道凹槽开口与微腔阵列中微腔开口相对设置，单个微管道阵列的投影面积覆盖单个与之对应的微腔阵列，且单个微管道阵列中任意相邻两个微通道凹槽之间的间距小于与之对应的微腔阵列中单个微腔的口径。
图3为本发明中液相样品大规模、快速数字化分解芯片使用方法流程示意图，由图3可知，(1)将聚二甲基硅氧烷盖片上集成有一个或多个微管道阵列的一面与基片上集成有一个或多个微管道阵列的一面对准贴合，使各微管道阵列区域覆盖与之对应的微腔阵列区域，获得一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片，将该芯片置于真空容器中进行至少30min脱气处理，并真空封装备用，如图3中a所示；(2)向经步骤(1)处理后的芯片的进样口滴加待分解的液相样品，使芯片中形成封闭微管道-微腔体系，经真空脱气处理的聚二甲基硅氧烷盖片吸收微管道-微腔体系中的空气，产生负压驱动所述液相样品进入并充满该芯片中微管道-微腔体系，如图3中b、c、d所示；(3)待芯片中各微腔充满液相样品后，将聚二甲基硅氧烷盖片从基片上剥离，即实现所述液相样品的大规模、快速数字化分解，如图3中e所示；(4)待聚二甲基硅氧烷盖片从基片上剥离后，以油相、自粘性胶片或涂覆聚二甲基硅氧烷的玻璃封盖，以防止所述微腔中液相样品的水分挥发，如图3中f所示。
实施例1
本发明中液相样品大规模、快速数字化分解芯片在数字PCR分析中应用
(1)芯片制备：利用软光刻技术制作分别制作集成微管道阵列PDMS盖片和包含约2万个微腔的集成微腔阵列PDMS基片，其中，每个微腔的形状为圆柱形，直径为100微米，深为100微米；将集成微腔阵列PDMS基片非结构面与玻璃片键合，形成复合基片，再将PDMS盖片上集成有微管道阵列的一面与复合基片上集成有微腔阵列的一面对准贴合，使微管道阵列区域覆盖微腔阵列区域，获得液相样品大规模、快速数字化分解芯片；
(2)芯片脱气：步骤(1)中获得的芯片置于真空容器中进行至少30min脱气处理，并真空封装备用；
(3)进样：向经步骤(2)处理后的芯片的进样口滴加20微升包含核酸样品、聚合酶、探针、缓冲液的液相样品，使芯片中形成封闭微管道-微腔体系，利用脱气PDMS盖片吸收微管道-微腔体系中的空气形成负压，驱动该液相样品进入并充满芯片中微管道-微腔体系；
(4)数字化分解：待芯片中各微腔充满该液相样品后，将聚二甲基硅氧烷盖片从基片上剥离，使得基片上所有微腔中液相样品各自独立，形成数字化、离散液相样品，即实现所述液相样品的大规模、快速数字化分解；
(5)液样密封：完成数字化分解后，将一片旋涂PDMS预聚体的玻璃封盖在集成微腔阵列的基片上，实现分解液相样品的封闭，形成的玻璃-PDMS-玻璃的三明治夹心结构保证了PCR热循环过程中的低水分挥发；
(6)PCR反应：将步骤(5)封闭后的芯片置于原位PCR仪上进行热循环扩增反应；
(7)信号获取和分析：通过荧光显微镜对步骤(6)完成PCR反应后的芯片进行荧光信号读取和数据分析，结果如图4所示，图4中a-d分别显示了液相样品中靶标核酸分子浓度分别为104、103、102、10copies/μL的PCR扩增结果，图e为以去离子水为阴性对照的PCR扩增结果，图f显示此芯片检测出的靶标分子拷贝数与预测的靶标分子拷贝数之间能很好吻合。
实施例2
本发明中液相样品大规模、快速数字化分解芯片在数字ELISA分析中应用
将本发明中液相样品大规模、快速数字化分解芯片应用于数字ELISA分析中，该芯片的使用方法流程示意图如图5所示。
(1)芯片制备：利用软光刻技术制作分别制作集成微管道阵列PDMS盖片和包含约10万个微腔的集成微腔阵列PDMS基片，其中，每个微腔的形状为圆柱形，直径为6微米，深为5微米；将PDMS盖片上集成有微管道阵列的一面与基片上集成有微腔阵列的一面对准贴合，使微管道阵列区域覆盖微腔阵列区域，获得液相样品大规模、快速数字化分解芯片；
(2)液样准备：将5微升包含修饰有捕获抗体的磁珠溶液(约10万个磁珠，每个磁珠直径约5微米)加入待测样品溶液中，室温下温育2小时；然后离心去除上清液，利用PBS缓冲液将磁珠清洗两次，再将磁珠加入耦联β-半乳糖苷酶的检测抗体溶液中，室温下温育30分钟；再将磁珠利用PBS缓冲液清洗5次，并重悬于10微升封闭液中；
(3)芯片脱气：步骤(1)中获得的芯片置于真空容器中进行至少30min脱气处理，并真空封装备用，如图5中a所示；
(4)进样：向经步骤(3)处理后的芯片的进样口滴加20微升步骤(2)中准备的含磁珠的液相样品，使芯片中形成封闭微管道-微腔体系，利用脱气PDMS盖片吸收微管道-微腔体系中的空气形成负压，驱动该液相样品进入并充满芯片中微管道-微腔体系，同时在流体粘滞力和永磁体磁力共同作用下，磁珠进入各微腔，如图5中b、c、d所示；
(5)数字化分解：待芯片中各微腔充满该液相样品后，将聚二甲基硅氧烷盖片从基片上剥离，使得基片上所有微腔中液相样品各自独立，形成数字化、离散液相样品，即实现所述液相样品的大规模、快速数字化分解，如图5中e所示；
(6)显色反应：将步骤(5)包含数字化、离散液相样品的基片置于真空干燥器中处理5分钟，除去各微腔中液样水分；再将一片经真空脱气处理的集成微管道阵列的PDMS盖片迅速贴合于干燥后的基片上，再次形成微管道-微腔体系，如图5中f所示，并在该PDMS盖片上设置的进样口加入20微升包含荧光性底物FDG(Fluorescein di-β-D-galactopyranoside)的溶液，利用脱气PDMS盖片吸收微管道-微腔体系中空气形成负压，驱动FDG溶液填充芯片微管道-微腔体系，如图5中g、h所示；待芯片所有微管道-微腔体系全部充满FDG溶液后，迅速将该PDMS盖片从基片上剥离，如图5中i所示，并在基片表面滴加约180微升石蜡油密封各微腔，如图5中j所示，使得各微腔独立进行酶促显色反应；
(7)信号获取和分析：将步骤(6)中完成显色反应的基片置于荧光显微镜载物台上荧光信号读取、统计和数据分析。
实施例3
本发明中液相样品大规模、快速数字化分解芯片在单细胞分析中应用
将本发明中液相样品大规模、快速数字化分解芯片应用于单细胞分析中，该芯片的使用方法流程示意图如图6所示。
(1)芯片制备：利用软光刻技术制作分别制作集成微管道阵列PDMS盖片和包含约10万个微腔的集成微腔阵列PDMS基片，其中，每个微腔的形状为圆柱形，直径为60微米，深为50微米；将PDMS盖片上集成有微管道阵列的一面与基片上集成有微腔阵列的一面对准贴合，使微管道阵列区域覆盖微腔阵列区域，获得液相样品大规模、快速数字化分解芯片；
(2)芯片脱气：步骤(1)中获得的芯片置于真空容器中进行至少30min脱气处理，并真空封装备用，如图6中a所示；
(3)进样：向经步骤(2)处理后的芯片的进样口滴加20微升含细胞的液相样品，使芯片中形成封闭微管道-微腔体系，利用脱气PDMS盖片吸收微管道-微腔体系中的空气形成负压，驱动该液相样品进入并充满芯片中微管道-微腔体系，同时在流体粘滞力和重力共同作用下，细胞进入各微腔，如图6中b、c、d所示；
(4)数字化分解：待芯片中各微腔充满该液相样品后，将聚二甲基硅氧烷盖片从基片上剥离，使得基片上所有微腔中液相样品各自独立，形成数字化、离散液相样品，即实现所述液相样品的大规模、快速数字化分解，如图6中e所示；
(5)细胞培养和生长分析：将步骤(4)形成的、包含数字化、离散液相样品的基片浸入含特定细胞刺激因子的培养液中，并放置于具有温控功能的显微镜载物台上，设置温度为37℃，通过显微镜实时观测微腔中细胞生长状况，如图6中f所示；
(6)细胞提取分析：选定步骤(5)中对刺激因子有特异响应的细胞或细胞团，利用集成玻璃微吸管的精密三维自动平台吸取选定的细胞或细胞团，并转移至微型离心管中，开展后续基因分析，如图6中g、h所示。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片，其特征在于，所述芯片由聚二甲基硅氧烷盖片和基片通过可逆键合方式构成；
所述聚二甲基硅氧烷盖片上集成一个或多个微管道阵列，所述微管道阵列由多个微通道凹槽平行排列而成，所述多个微通道凹槽的一端均与串联通道凹槽连通，另一端均为盲端，所述串联通道凹槽与所述微管道阵列上一一对应设置的进样口连通；
所述基片上集成有一个或多个微腔阵列；
所述微管道阵列中的微通道凹槽开口与所述微腔阵列中微腔开口相对设置，单个所述微管道阵列的投影面积覆盖单个与之对应的微腔阵列，且单个所述微管道阵列中任意相邻两个微通道凹槽之间的间距小于与之对应的微腔阵列中单个微腔的口径。
2.如权利要求1所述的一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片，其特征在于，所述聚二甲基硅氧烷盖片的厚度为1-5mm。
3.如权利要求1所述的一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片，其特征在于，所述微腔阵列中各微腔的几何形状尺度均一致，微腔形状为圆柱形、椭圆柱形、多边柱形或球冠形中的一种。
4.如权利要求1所述的一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片，其特征在于，所述基片上微腔的总个数为10000以上。
5.如权利要求1所述的一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片，其特征在于，所述基片的材质为硅、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯、环烯烃共聚物、聚苯乙烯或环氧树脂中的一种。
6.权利要求1-5任一项所述的一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将聚二甲基硅氧烷盖片上集成有一个或多个微管道阵列的一面与基片上集成有一个或多个微腔阵列的一面对准贴合，使各微管道阵列区域覆盖与之对应的微腔阵列区域，获得一种液相样品大规模、快速数字化分解芯片；
（2）将步骤（1）中获得的芯片置于真空容器中进行至少30min脱气处理，并真空封装备用；
（3）向经步骤（2）处理后的芯片的进样口滴加待分解的液相样品，使所述芯片中形成封闭微管道-微腔体系，经真空脱气处理的所述聚二甲基硅氧烷盖片吸收微管道-微腔体系中的空气，产生负压驱动所述液相样品进入并充满所述芯片中微管道-微腔体系；
（4）待所述芯片中各微腔充满所述液相样品后，将所述聚二甲基硅氧烷盖片从所述基片上剥离，即实现所述液相样品的大规模、快速数字化分解。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，待所述聚二甲基硅氧烷盖片从所述基片上剥离后，还包括对所述基片进行封盖工序，以防止所述微腔中液相样品的水分挥发。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述封盖以滴加油相、粘贴自粘性胶片或覆盖涂覆聚二甲基硅氧烷的玻璃实现。
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