CN107262170A - 一种多重数字pcr芯片及其使用方法 - Google Patents

一种多重数字pcr芯片及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多重数字PCR芯片及其使用方法，该芯片无需精密的微泵驱动和复杂的微阀控制，也无需复杂的宏‑微接口，可简便、快速、低成本地实现样品的大规模自动分解和定量均一分配，与现有的商业化PCR芯片相比，可大大降低数字PCR系统的复杂度和运行成本，并简化实验操作，操作人员无需专业培训。且该芯片通过微腔阵列实现每个PCR反应单元的独立性，无需添加表面活性剂，避免了外加试剂对反应体系的影响。另外，该芯片通过集成多个空间上隔离的微腔阵列区域，并在不同区域的微腔中预先沉积针对不同特定靶标分子的引物，使得芯片一次操作可实现多重检测。该芯片具有操作简便、成本低廉、多重检测能力强的优势，有望促进数字PCR技术的发展和广泛应用。

Description

一种多重数字PCR芯片及其使用方法
技术领域
本发明属于微流控芯片分析技术领域，具体涉及一种多重数字PCR芯片及其使用方法。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR)是一种体外核酸扩增技术，它可使微量靶标核酸在体外高效快速扩增，得以检测和应用。随着分子生物学技术的不断发展，PCR技术不断更新换代，目前正从传统的定量PCR向数字PCR转化发展。数字PCR的原理是通过将试样分解为成千上万甚至数百万个液滴(每个微滴都作为一个独立的PCR反应单元)，直至每个液滴中含一个或零个靶标分子，当所有液滴同时进行PCR扩增后，含有靶标分子的液滴将会因靶标分子扩增产生阳性信号，而不含靶标分子的液滴则没有信号，最后通过对阳性信号进行统计计数，并根据泊松分布公式计算，可以推算出样品的原始浓度或靶标分子含量。数字PCR是一种绝对定量技术，与传统定量PCR相比，具有明显的优势：可不依赖标准曲线而实现绝对核酸定量，对抑制剂具有较高耐受性、可分析复杂混合物，能实现极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定等。该技术特别适合应用于拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究等，在遗传病、癌症、传染病、产前诊断等方面具有广泛的、不可替代的应用前景。借助微流控技术在微流体操控方面的优势，目前国际上已有多个研究小组和公司开发了基于微流控技术的数字PCR系统。比较典型的并且已经得到实际应用的包括Fluidigm公司推出的BioMarkTM系统、Life Technologies公司推出的QuantStudioTM系统、Bio-Rad公司推出的QX100TM系统和RainDance Technologies公司推出的RainDropTM系统。BioMarkTM系统的核心部件为集成了一系列复杂微通道和微阀的PDMS芯片，该系统利用大量的微阀将充满微管道网络的样品分解成大量独立的反应单元，经PCR扩增后，利用扫描仪对实验结果进行判读。QuantStudioTM系统原型为OpenArrayTM系统，其核心部件为集成了大量通孔的不锈钢平板，该平板预先经过特殊的表面处理，使得仅有通孔内部保持亲水性，通过一个配套的加样装置，利用表面张力作用即可轻易实现所有通孔中的液样分配，即完成样品分解。每个通孔都作为独立的PCR反应单元，整个工作流程与BioMarkTM系统基本类似。不同于BioMarkTM和QuantStudioTM系统，QX100TM系统和RainDropTM系统均是利用液滴型微流控芯片将样品分解成成千上万个纳升级的微滴，然后经PCR扩增后，采用类似流式细胞仪的检测器逐个检测每个微滴获取检测结果。整个系统至少包含三个仪器的组合：微液滴生成器、热循环仪和微液滴分析仪。近年来，不少研究者利用上述系统在肿瘤的个体化用药、基因拷贝数变异、产前诊断等方面展开了大量研究。不过，上述系统要大规模推广应用还存在一些技术和成本方面的局限。比如上述系统均需要额外的控制部件来实现进样或样品的分解，导致整个系统的复杂度较高，从而增加了系统的成本，限制了其应用。另外，BioMarkTM和QuantStudioTM系统分解密度均不高，导致其检测精度相对不足、可测的动态范围有限；而QX100TM系统和RainDropTM系统利用液滴型微流控芯片来实现样品的分解，为了维持分解液滴的分散性，需要加入表面活性剂，这类添加剂可能会对某些实验体系有影响或干扰作用，从而影响其结果的可信度，而且这两个系统在检测过程中需要多次液滴转移操作和串行方式的液滴信号读取，导致流程相对复杂、检测过程耗时较长。因此，迫切需要发展新型的数字PCR芯片以降低运行成本、简化操作、提高实验的可靠性以及进一步提高检测的精度，使数字PCR技术从一项“高贵”的实验室技术变成普通实验室和临床检验的常规工具。
另外，对于实际应用来说，现有的数字PCR系统还存在另一个重大局限，即在多重检测方面能力不足。因为现有的数字PCR系统通常采用探针法荧光定量PCR技术，一方面受到标记探针的荧光通路的限制，另一方面当构建多重PCR时，需要在系统中增加更多的引物及探针，增加了反应体系的复杂度，降低了检测的特异性及扩增效率。因此现有的数字PCR系统大多只能一次反应检测一种基因突变，往往难以实现多重检测。但是实际的生物分析和临床应用中，往往需要对样品实现高灵敏的多重检测。因此，提高数字PCR技术的多重检测能力无疑是目前该技术亟待解决的一个关键问题。目前这方面的研究报道较少。Zhong等用同一种荧光素FAM标记不同突变类型的探针，然后以不同的浓度加入到PCR混合液中，利用数字PCR反应后阳性乳滴的荧光强度来判断发生了何种突变以及突变的类型[Zhong Q,Bhattacharya S,Kotsopoulos S,et al.Multiplex digital PCR:breaking the onetarget per color barrier of quantitative PCR.Lab on a Chip,2011,11(13):2167-2174.]，但是由于PCR扩增产物的荧光强度往往容易受到其它因素的干扰，因此该方法在多重数字PCR检测的准确性和可靠性存在一定不足。因此，发展简单、可靠、通用性好的多重数字PCR方法具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于：(1)提供一种多重数字PCR芯片；(2)提供一种多重数字PCR芯片的使用方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种多重数字PCR芯片，所述芯片由顶层玻璃盖片、中层聚二甲基硅氧烷薄膜和底层玻璃基片构成；
所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜上设置有样品进样口Ⅰ、微腔阵列结构、废液出口Ⅰ，所述微腔阵列结构为至少两个，每个所述微腔阵列结构上均设置有引物进样口Ⅰ，多个微腔阵列结构上的引物进样口Ⅰ通过一微管道Ⅰ上与多个引物进样口Ⅰ呈一一对应关系的分支微管分别同样品进样口Ⅰ连通，多个微腔阵列结构在与其上的引物进样口Ⅰ相对端均通过一微管道Ⅱ与废液出口Ⅰ连通；
所述顶层玻璃盖片设置有与所述样品进样口Ⅰ相对应且相互连通的样品进样口Ⅱ、与所述引物进样口Ⅰ相对应且相互连通的引物进样口Ⅱ、与所述废液出口Ⅰ相对应且相互连通的废液出口Ⅱ；
所述底层玻璃基片开设有凹槽和与所述凹槽连通的进口和出口，所述凹槽在所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜上的投影面积覆盖所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜上所设的多个微腔阵列结构；
所述顶层玻璃盖片与所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜键合形成封闭微管路体系，所述底层玻璃基片与所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜键合形成封闭空腔。
进一步，所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜上至少设置一个样品进样口Ⅰ和一个废液出口Ⅰ；所述顶层玻璃盖片上至少设置一个样品进样口Ⅱ和一个废液出口Ⅱ。
进一步，所述微腔阵列结构包含至少1000个微腔，且每个微腔阵列中每个微腔的几何形状尺度均一致，微腔形状为圆柱形、椭圆柱形、多边柱形或球冠形中的一种。
进一步，所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜厚度为50～300微米。
进一步，所述底层玻璃基片上至少设置一个进口和一个出口。
进一步，所述底层玻璃基片上开设的凹槽高度为30～500微米。
2、一种多重数字PCR芯片的使用方法，包括如下步骤：
(1)将多个具有微柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷微泵和多个具有通孔结构的聚二甲基硅氧烷微泵同时置于真空容器中进行至少60分钟脱气处理，并分别真空封装备用；
(2)取经步骤(1)处理后的具有微柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷微泵与多重数字PCR芯片的底层玻璃基片贴合，使具有微柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷微泵的微柱阵列区覆盖底层玻璃基片上所有的进口和出口；再取经步骤(1)处理后的具有通孔结构的聚二甲基硅氧烷微泵与多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ贴合，使具有通孔结构的聚二甲基硅氧烷微泵的通孔与顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ相通，未贴合的通孔面以胶带密封；
(3)在经步骤(2)处理后的多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的各引物进样口Ⅱ分别滴加不同引物，使各引物进样口Ⅱ与废液出口Ⅱ之间的封闭微管路体系与外界空间隔离，由于经步骤(1)处理后的具有微柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷微泵和具有通孔结构的聚二甲基硅氧烷微泵共同吸收了封闭微管路体系中的空气形成负压，通过负压驱动不同引物进入中层聚二甲基硅氧烷薄膜上设置的微腔阵列结构中的各微腔中；
(4)将步骤(3)中多重数字PCR芯片上的具有微柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷微泵和具有通孔结构的聚二甲基硅氧烷微泵剥离，然后将芯片顶层玻璃盖片上设置的引物进样口Ⅱ以胶带密封后对芯片进行冷冻干燥处理；
(5)取出经步骤(4)处理后的多重数字PCR芯片，重复步骤(2)的处理方式；
(6)在经步骤(5)处理后的多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的样品进样口Ⅱ滴加样品溶液，使样品进样口Ⅱ与废液出口Ⅱ之间的封闭微管路体系与外界空间隔离，由于经步骤(1)处理后的具有微柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷微泵和具有通孔结构的聚二甲基硅氧烷微泵共同吸收了封闭微管路体系中的空气形成负压，通过负压驱动样品溶液进入中层聚二甲基硅氧烷薄膜上设置的微腔阵列结构中的各微腔中；
(7)将步骤(6)中多重数字PCR芯片上的具有微柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷微泵和具有通孔结构的聚二甲基硅氧烷微泵剥离，分别在多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的样品进样口Ⅱ、引物进样口Ⅱ和废液出口Ⅱ及底层玻璃基片上设置的进口和出口滴加油相，所述油相通过毛细作用填充顶层玻璃盖片与中层聚二甲基硅氧烷薄膜键合形成封闭微管路体系中除微腔阵列结构外其它空间和底层玻璃基片与中层聚二甲基硅氧烷薄膜键合形成封闭空腔；分别实现中层聚二甲基硅氧烷薄膜上微腔阵列结构中各个微腔之间反应体系的隔离以及防止PCR反应过程中微腔中液滴水分的快速挥发；
(8)将经过步骤(7)处理后的多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的样品进样口Ⅱ、引物进样口Ⅱ和废液出口Ⅱ以及底层玻璃基片上设置的进口和出口以胶带密封后，置于原位PCR仪上进行热循环扩增反应；
(9)通过荧光显微镜或扫描仪对经步骤(8)处理后的多重数字PCR芯片进行荧光信号读取和分析。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种多重数字PCR芯片及其使用方法，该多重数字PCR芯片无需精密的微泵驱动和复杂的微阀控制，也无需复杂的宏-微接口，可简便、快速、低成本地实现样品的大规模自动分解和定量均一分配，与现有的商业化PCR芯片相比，可大大降低数字PCR系统的复杂度和运行成本，并简化实验操作，操作人员无需专业培训。且该芯片通过微腔阵列实现每个PCR反应单元的独立性，无需添加表面活性剂，避免了外加试剂对反应体系的影响。另外，该芯片通过集成多个空间上隔离的微腔阵列区域，并在不同区域的微腔中预先沉积针对不同特定靶标分子的引物，使得芯片一次操作可实现多重检测，因每个区域只进行单重PCR反应，避免了传统多重PCR反应体系中多对引物共存时的反应竞争性问题，也无需多通道检测设备，因此其可检测的靶标分子的种类(即多重检测能力)不受荧光通道数目等条件的限制，进一步增强了数字PCR技术实际应用的可行性。总之，本发明提供的多重数字PCR芯片具有操作简便、成本低廉、多重检测能力强的优势，有望促进数字PCR技术的发展和广泛应用。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为本发明多重数字PCR芯片各组成部分结构示意图；
图2为本发明多重数字PCR芯片结构示意图；
图3为本发明多重数字PCR芯片与预脱气PDMS微泵组装示意图；
图4为本发明多重数字PCR芯片使用方法流程示意图；
图5为本发明多重数字PCR芯片中不同引物对分区预储存流程示意图。
具体实施方式
下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。
图1为本发明多重数字PCR各组成部分结构示意图，图1中顶层玻璃盖片上设置有样品进样口Ⅱ、引物进样口Ⅱ和废液出口Ⅱ；中层聚二甲基硅氧烷薄膜上设置有样品进样口Ⅰ、多个微腔阵列结构、废液出口Ⅰ，每个微腔阵列结构上均设置有引物进样口Ⅰ，多个微腔阵列结构上的引物进样口Ⅰ通过一微管道Ⅰ上与多个引物进样口Ⅰ呈一一对应关系的分支微管分别同样品进样口Ⅰ连通，多个微腔阵列结构在与其上的引物进样口Ⅰ相对端均通过一微管道Ⅱ与废液出口Ⅰ连通；底层玻璃基片开设有凹槽和与所述凹槽连通的进口和出口。
图2为本发明多重数字PCR芯片结构示意图，该芯片由顶层玻璃盖片、中层聚二甲基硅氧烷薄膜和底层玻璃基片构成，组装后，所述顶层玻璃盖片与所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜键合形成封闭微管路体系，所述底层玻璃基片与所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜键合形成封闭空腔。
图3为本发明多重数字PCR芯片与预脱气聚二甲基硅氧烷(PDMS)微泵组装示意图，进行组装时，具有微柱阵列结构的PDMS微泵与多重数字PCR芯片的底层玻璃基片贴合，使具有微柱阵列结构的PDMS微泵的微柱阵列区覆盖底层玻璃基片上所有的进口和出口；具有通孔结构的PDMS微泵与多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ贴合，使具有通孔结构的PDMS微泵的通孔与顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ相通，未贴合的通孔面以胶带密封。
图4为本发明多重数字PCR芯片使用方法流程示意图，由图可知，(1)将具有微柱阵列结构的PDMS微泵和具有通孔结构的PDMS微泵同时置于真空容器中进行脱气处理，并分别真空封装备用，如图4a、4b所示；(2)将脱气处理的PDMS微泵与芯片进行组装，具体为将具有微柱阵列结构的PDMS微泵与多重数字PCR芯片的底层玻璃基片贴合，使具有微柱阵列结构的PDMS微泵的微柱阵列区覆盖底层玻璃基片上所有的进口和出口；具有通孔结构的PDMS微泵与多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ贴合，使具有通孔结构的PDMS微泵的通孔与顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ相通，未贴合的通孔面以胶带密封，如图4c所示；(3)在芯片顶层玻璃盖片上设置的液样进样口滴加液样，使液样进样口与废液出口Ⅱ之间的封闭微管路体系与外界空间隔离，由于经脱气处理后的PDMS微泵共同吸收了封闭微管路体系中的空气形成负压，通过负压驱动液样分别进入中层PDMS薄膜上设置的微腔阵列结构中，直至多余的液样由顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ排出以保证各液样独立分配至微腔阵列结构的各微腔中，如图4d、4e和4f所示；(4)将芯片上PDMS微泵剥离，分别在多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的样品进样口Ⅱ、引物进样口Ⅱ和废液出口Ⅱ及底层玻璃基片上设置的进口和出口滴加油相，所述油相通过毛细作用填充顶层玻璃盖片与中层PDMS薄膜键合形成封闭微管路体系中除微腔阵列结构外其它空间和底层玻璃基片与中层PDMS薄膜键合形成封闭空腔，如图4g所示；(5)最后将芯片顶层玻璃盖片上设置的样品进样口Ⅱ、引物进样口Ⅱ和废液出口Ⅱ以及底层玻璃基片上设置的进口和出口以胶带密封，如图4h所示。
图5为本发明多重数字PCR芯片中不同引物对分区预储存流程示意图，由图可知，将不同引物滴加到芯片顶层玻璃盖片上设置的各引物进样口上，如图5a所示；使芯片顶层玻璃盖片上设置的各引物进样口与废液出口Ⅱ之间的封闭微管路体系与外界空间隔离，脱气处理后的PDMS微泵共同吸收了封闭微管路体系中的空气形成负压，通过负压驱动各引物分别进入中层PDMS薄膜上设置的微腔阵列结构中，如图5b所示；直至多余的液样由顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ排出，最终各液样独立分配至各微腔阵列结构的各微腔中，实现不同引物在各自微腔阵列区域的数字化分解，如图5c所示；将芯片的各引物进样口以胶带密封后进行冷冻干燥处理，实现不同引物在各自微腔阵列区域的预储存，如图5d所示。
实施例1
利用多重数字PCR芯片进行循环肿瘤DNA“液体活检”研究，以肺癌患者外周血中KRAS突变检测为例，具体步骤如下：
(1)芯片、引物和样品准备
分别制作包含7个微腔阵列的多重数字PCR芯片、具有微柱阵列结构的PDMS微泵和具有通孔结构的PDMS微泵；
分别针对KRAS 1号外显子12密码子和13密码子的7个突变位点制备7对特异性引物(其中12密码子6个突变位点：Gly12Asp、Gly12Val、Gly12Ser、Gly12Cys、Gly12Ala、Gly12Arg，13密码子1个突变位点：Gly13Asp)；
从肺癌患者外周血血清中提取循环DNA，并将提取的DNA样品与聚合酶、探针、缓冲液等混合制备样品溶液；
(2)微泵处理
将多个具有微柱阵列结构的PDMS微泵和多个具有通孔结构的PDMS微泵同时置于真空容器中进行至少60分钟脱气处理，并分别真空封装备用；
(3)多重数字PCR芯片与微泵组装
取经步骤(2)处理后的具有微柱阵列结构的PDMS微泵与多重数字PCR芯片的底层玻璃基片贴合，使具有微柱阵列结构的PDMS微泵的微柱阵列区覆盖底层玻璃基片上所有的进口和出口；再取经步骤(2)处理后的具有通孔结构的PDMS微泵与多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ贴合，使具有通孔结构的PDMS微泵的通孔与顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ相通，未贴合的通孔面以胶带密封；
(4)引物分配
在经步骤(3)处理后的多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的7个引物进样口Ⅱ分别滴加步骤(1)中制备的7种引物，使各引物进样口Ⅱ与废液出口Ⅱ之间的封闭微管路体系与外界空间隔离，由于经步骤(2)处理后的具有微柱阵列结构的PDMS微泵和具有通孔结构的PDMS微泵共同吸收了封闭微管路体系中的空气形成负压，通过负压驱动7种引物分别进入中层PDMS薄膜上设置的与各引物进样口Ⅱ对应的微腔阵列结构中的各微腔中，直至多余的引物由顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ排出以保证各引物独立分配至各微腔中；
(5)引物干燥沉积处理
将步骤(4)中多重数字PCR芯片上的具有微柱阵列结构的PDMS微泵和具有通孔结构的PDMS微泵剥离，然后将多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的7个引物进样口Ⅱ以胶带密封后对芯片进行冷冻干燥处理；
(6)样品分配
取出经步骤(5)处理后的多重数字PCR芯片，重复步骤(3)的处理方式；然后在顶层玻璃盖片上设置的样品进样口Ⅱ滴加步骤(1)中制备的样品溶液，使样品进样口Ⅱ与废液出口Ⅱ之间的封闭微管路体系与外界空间隔离，由于经步骤(2)处理后的具有微柱阵列结构的PDMS微泵和具有通孔结构的PDMS微泵共同吸收了封闭微管路体系中的空气形成负压，通过负压驱动样品溶液进入中层PDMS薄膜上设置的微腔阵列结构中的各微腔中，直至多余的样品溶液由顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ排出以保证各样品溶液独立分配至各微腔中，进入各微腔中的样品溶液将沉积在各微腔底部的引物溶解，形成完整的PCR反应体系；
(7)填充油相
将步骤(6)中多重数字PCR芯片上的具有微柱阵列结构的PDMS微泵和具有通孔结构的PDMS微泵剥离，分别在多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的样品进样口Ⅱ、引物进样口Ⅱ和废液出口Ⅱ及底层玻璃基片上设置的进口和出口滴加油相，所述油相通过毛细作用填充顶层玻璃盖片与中层PDMS薄膜键合形成封闭微管路体系中除微腔阵列结构外其它空间和底层玻璃基片与中层PDMS薄膜键合形成封闭空腔；分别实现中层PDMS薄膜上微腔阵列结构中各个微腔之间反应体系的隔离以及防止PCR反应过程中微腔中液滴水分的快速挥发；
(8)PCR反应
将经过步骤(7)处理后的多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的样品进样口Ⅱ、引物进样口Ⅱ和废液出口Ⅱ以及底层玻璃基片上设置的进口和出口以胶带密封，然后置于原位PCR仪上进行热循环扩增反应；
(9)信号读取和分析
通过荧光显微镜或扫描仪对经步骤(8)处理后的多重数字PCR芯片进行荧光信号读取和分析，分析肺癌患者KRAS突变的类型及含量，为病程监测和靶向治疗用药提供指导。
实施例2
利用多重数字PCR芯片进行多重食源性病菌检测，以检测样品中肠毒性大肠埃希菌(E.coli-ETEC)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、沙门氏菌(Salmonella spp)、大肠埃希菌0157:H7(E.coli-0157:H7)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)六种食源性病菌为例，具体步骤如下：
(1)芯片、引物和样品准备
分别制作包含6个微腔阵列的多重数字PCR芯片、具有微柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微泵和具有通孔结构的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微泵；
分别针对肠毒性大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠埃希菌0157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌制备6对特异性引物；
利用磁珠法从待检测样品中提取核酸，并将提取的核酸样品与聚合酶、探针、缓冲液等混合制备样品溶液；
(2)微泵处理
将多个具有微柱阵列结构的PDMS微泵和多个具有通孔结构的PDMS微泵同时置于真空容器中进行至少60分钟脱气处理，并分别真空封装备用；
(3)多重数字PCR芯片与微泵组装
取经步骤(2)处理后的具有微柱阵列结构的PDMS微泵与多重数字PCR芯片的底层玻璃基片贴合，使具有微柱阵列结构的PDMS微泵的微柱阵列区覆盖底层玻璃基片上所有的进口和出口；再取经步骤(2)处理后的具有通孔结构的PDMS微泵与多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ贴合，使具有通孔结构的PDMS微泵的通孔与顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ相通，未贴合的通孔面以胶带密封；
(4)引物分配
在经步骤(3)处理后的多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的6个引物进样口Ⅱ分别滴加步骤(1)中制备的6种引物，使各引物进样口Ⅱ与废液出口Ⅱ之间的封闭微管路体系与外界空间隔离，由于经步骤(2)处理后的具有微柱阵列结构的PDMS微泵和具有通孔结构的PDMS微泵共同吸收了封闭微管路体系中的空气形成负压，通过负压驱动6种引物分别进入中层PDMS薄膜上设置的与各引物进样口Ⅱ对应的微腔阵列结构中的各微腔中，直至多余的引物由顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ排出以保证各引物独立分配至各微腔中；
(5)引物干燥沉积处理
将步骤(4)中多重数字PCR芯片上的具有微柱阵列结构的PDMS微泵和具有通孔结构的PDMS微泵剥离，然后将多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的6个引物进样口Ⅱ以胶带密封后对芯片进行冷冻干燥处理；
(6)样品分配
取出经步骤(5)处理后的多重数字PCR芯片，重复步骤(3)的处理方式；然后在顶层玻璃盖片上设置的样品进样口Ⅱ滴加步骤(1)中制备的样品溶液，使样品进样口Ⅱ与废液出口Ⅱ之间的封闭微管路体系与外界空间隔离，由于经步骤(2)处理后的具有微柱阵列结构的PDMS微泵和具有通孔结构的PDMS微泵共同吸收了封闭微管路体系中的空气形成负压，通过负压驱动样品溶液进入中层PDMS薄膜上设置的微腔阵列结构中的各微腔中，直至多余的样品溶液由顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ排出以保证各样品溶液独立分配至各微腔中，进入各微腔中的样品溶液将沉积在各微腔底部的引物溶解，形成完整的PCR反应体系；
(7)填充油相
将步骤(6)中多重数字PCR芯片上的具有微柱阵列结构的PDMS微泵和具有通孔结构的PDMS微泵剥离，分别在多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的样品进样口Ⅱ、引物进样口Ⅱ和废液出口Ⅱ及底层玻璃基片上设置的进口和出口滴加油相，所述油相通过毛细作用填充顶层玻璃盖片与中层PDMS薄膜键合形成封闭微管路体系中除微腔阵列结构外其它空间和底层玻璃基片与中层PDMS薄膜键合形成封闭空腔；分别实现中层PDMS薄膜上微腔阵列结构中各个微腔之间反应体系的隔离以及防止PCR反应过程中微腔中液滴水分的快速挥发；
(8)PCR反应
将经过步骤(7)处理后的多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的样品进样口Ⅱ、引物进样口Ⅱ和废液出口Ⅱ以及底层玻璃基片上设置的进口和出口以胶带密封后，置于原位PCR仪上进行热循环扩增反应；
(9)信号读取和分析
通过荧光显微镜或扫描仪对经步骤(8)处理后的多重数字PCR芯片进行荧光信号读取，分析待测样品中所含细菌的类型及含量，为食品安全监管提供支持或为肠道性感染疾病用药提供指导。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种多重数字PCR芯片，其特征在于，所述芯片由顶层玻璃盖片、中层聚二甲基硅氧烷薄膜和底层玻璃基片构成；
所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜上设置有样品进样口Ⅰ、微腔阵列结构、废液出口Ⅰ，所述微腔阵列结构为至少两个，每个所述微腔阵列结构上均设置有引物进样口Ⅰ，多个微腔阵列结构上的引物进样口Ⅰ通过一微管道Ⅰ上与多个引物进样口Ⅰ呈一一对应关系的分支微管分别同样品进样口Ⅰ连通，多个微腔阵列结构在与其上的引物进样口Ⅰ相对端均通过一微管道Ⅱ与废液出口Ⅰ连通；
所述顶层玻璃盖片设置有与所述样品进样口Ⅰ相对应且相互连通的样品进样口Ⅱ、与所述引物进样口Ⅰ相对应且相互连通的引物进样口Ⅱ、与所述废液出口Ⅰ相对应且相互连通的废液出口Ⅱ；
所述底层玻璃基片开设有凹槽和与所述凹槽连通的进口和出口，所述凹槽在所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜上的投影面积覆盖所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜上所设的多个微腔阵列结构；
所述顶层玻璃盖片与所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜键合形成封闭微管路体系，所述底层玻璃基片与所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜键合形成封闭空腔。
2.如权利要求1所述的一种多重数字PCR芯片，其特征在于，所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜上至少设置一个样品进样口Ⅰ和一个废液出口Ⅰ；所述顶层玻璃盖片上至少设置一个样品进样口Ⅱ和一个废液出口Ⅱ。
3.如权利要求1所述的一种多重数字PCR芯片，其特征在于，所述微腔阵列结构包含至少1000个微腔，且每个微腔阵列中每个微腔的几何形状尺度均一致，微腔形状为圆柱形、椭圆柱形、多边柱形或球冠形中的一种。
4.如权利要求1所述的一种多重数字PCR芯片，其特征在于，所述中层聚二甲基硅氧烷薄膜厚度为50～300微米。
5.如权利要求1所述的一种多重数字PCR芯片，其特征在于，所述底层玻璃基片上至少设置一个进口和一个出口。
6.如权利要求1所述的一种多重数字PCR芯片，其特征在于，所述底层玻璃基片上开设的凹槽高度为30～500微米。
7.一种多重数字PCR芯片的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将多个具有微柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷微泵和多个具有通孔结构的聚二甲基硅氧烷微泵同时置于真空容器中进行至少60分钟脱气处理，并分别真空封装备用；
(2)取经步骤(1)处理后的具有微柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷微泵与多重数字PCR芯片的底层玻璃基片贴合，使具有微柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷微泵的微柱阵列区覆盖底层玻璃基片上所有的进口和出口；再取经步骤(1)处理后的具有通孔结构的聚二甲基硅氧烷微泵与多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ贴合，使具有通孔结构的聚二甲基硅氧烷微泵的通孔与顶层玻璃盖片上设置的废液出口Ⅱ相通，未贴合的通孔面以胶带密封；
(3)在经步骤(2)处理后的多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的各引物进样口Ⅱ分别滴加不同引物，使各引物进样口Ⅱ与废液出口Ⅱ之间的封闭微管路体系与外界空间隔离，通过负压驱动不同引物进入中层聚二甲基硅氧烷薄膜上设置的微腔阵列结构中的各微腔中；
(4)将步骤(3)中多重数字PCR芯片上的具有微柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷微泵和具有通孔结构的聚二甲基硅氧烷微泵剥离，然后将芯片顶层玻璃盖片上设置的引物进样口Ⅱ以胶带密封后对芯片进行冷冻干燥处理；
(5)取出经步骤(4)处理后的多重数字PCR芯片，重复步骤(2)的处理方式；
(6)在经步骤(5)处理后的多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的样品进样口Ⅱ滴加样品溶液，使样品进样口Ⅱ与废液出口Ⅱ之间的封闭微管路体系与外界空间隔离，通过负压驱动样品溶液进入中层聚二甲基硅氧烷薄膜上设置的微腔阵列结构中的各微腔中；
(7)将步骤(6)中多重数字PCR芯片上的具有微柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷微泵和具有通孔结构的聚二甲基硅氧烷微泵剥离，分别在多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的样品进样口Ⅱ、引物进样口Ⅱ和废液出口Ⅱ及底层玻璃基片上设置的进口和出口滴加油相，所述油相通过毛细作用填充顶层玻璃盖片与中层聚二甲基硅氧烷薄膜键合形成封闭微管路体系中除微腔阵列结构外其它空间和底层玻璃基片与中层聚二甲基硅氧烷薄膜键合形成封闭空腔；
(8)将经过步骤(7)处理后的多重数字PCR芯片的顶层玻璃盖片上设置的样品进样口Ⅱ、引物进样口Ⅱ和废液出口Ⅱ以及底层玻璃基片上设置的进口和出口以胶带密封后，置于原位PCR仪上进行热循环扩增反应。
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