CN111630180A - 装置，制备者技能评估方法、程序和装置，以及测试装置性能评估方法、程序和装置 - Google Patents

Abstract

提供一种装置，包括：多个孔；布置在各孔中并含有特定拷贝数的可扩增试剂的试剂组合物；以及孔划分成的两组或更多组，所述两组或更多组具有以相同特定拷贝数布置的可扩增试剂但除特定拷贝数以外的试剂组合物的组成不同。优选地，除可扩增试剂的特定拷贝数以外的组成包括引物和扩增剂中的至少任一者。更优选地，装置包括特定拷贝数不同的两组或更多组。还更优选地，各孔组至少包括其中可扩增试剂的特定拷贝数为0的阴性对照组和其中可扩增试剂的特定拷贝数接近检测极限的组。

Description

装置，制备者技能评估方法、程序和装置，以及测试装置性能 评估方法、程序和装置

技术领域

本公开涉及装置，制备者技能评估方法、程序和装置，以及测试装置性能评估方法、程序和装置

背景技术

聚合酶链反应(PCR)和定量聚合酶链反应(qPCR)用于例如核酸的定性评估和定量评估。最近，PCR还用于例如基因改造作物或食物(GMO)的阴性测试和病毒污染的阴性测试。因此，需要确保结果的可靠性。

为了确保结果，基于装置温度控制管理和用户维护管理进行装置性能的保证和测量系统的管理。

通过具有已知浓度的核酸样品的连续稀释来产生用于核酸的定性评估和定量评估的一系列核酸样品。例如，提出了通过有限稀释法稀释具有特定碱基序列的DNA片段并基于所获得的稀释溶液的实时PCR结果选择包括目标拷贝数的稀释溶液的方法(例如，参见PTL1)。

还提出了标准核酸试剂盒，其通过将连续稀释成不同浓度的标准核酸溶液密封在多个样品填充部中而获得(例如，参见PTL 2)。

此外，对于测量系统的管理，提出了基于PCR反应期间的温度管理来确保测量结果(例如，参见NPL 1)。

近年来，实时聚合酶链反应(实时PCR)在定性和定量基因测试中变得越来越重要。实时聚合酶链反应的性能评估，尤其是装置间或设施间性能评估很重要。当前，使用利用吸光度基于外部标准物的校准曲线。但是，这些校准曲线不准确地限定核酸的绝对数量。具体地，不能准确地限定绝对数量对于低拷贝数影响很大。

通过对具有已知浓度的核酸样品的连续稀释产生用于这种校准曲线的一系列核酸样品。例如，已提出通过有限稀释法稀释具有特定碱基序列的DNA片段并基于所获得的稀释溶液的实时PCR结果选择包括目标拷贝数的稀释溶液的方法(例如，参见PTL 1)。

最近还提出了如下方法：通过基因重组技术将特定数量(拷贝数)的DNA片段分子引入细胞，培养细胞，并通过操作分离培养的细胞，从而制备含有一拷贝的具有目标碱基序列的DNA的样品(例如，参见PTL 3)。

引用列表

专利文献

PTL 1:日本未审查专利申请公开号2014-33658

PTL 2:日本未审查专利申请公开号2008-141965：

PTL 3:日本未审查专利申请公开号2015-195735

非专利文献

NPL 1:ISO/TS 20836:2005。

发明内容

技术问题

本公开的目的是提供用于适当地评估制备试剂组合物的制备者的技能的装置，或者能够适当地评估测试装置的平面内均匀性、测试装置间性能和测试设施间性能的装置。

问题解决方案

根据本公开的一方面，装置包括多个孔，以及所述孔划分成的两组或更多组，所述两组或更多组的孔中的组成不同。

发明有益效果

本公开可以提供用于适当地评估制备试剂组合物的制备者的技能的装置，或者能够适当地评估测试装置的平面内均匀性、测试装置间性能和测试设施间性能的装置。

附图说明

[图1]图1是示例本公开的装置的实例的透视图。

[图2]图2是示例本公开的装置的实例的侧视图。

[图3]图3是示例本公开的装置的实例的平面图。

[图4]图4是示例本公开的装置的另一实例的平面图。

[图5]图5是示例本公开的装置的另一实例的平面图。

[图6]图6是示例本公开的装置的另一实例的平面图。

[图7]图7是示例本公开的装置的另一实例的平面图。

[图8]图8是示例使用图7的装置生成的校准曲线的实例的图。

[图9]图9是示例本公开的装置的另一实例的平面图。

[图10]图10是示例本公开的装置的另一实例的平面图。

[图11]图11是示例本公开的装置的另一实例的平面图。

[图12]图12是示例本公开的装置的另一实例的平面图。

[图13]图13是示例本公开的装置的另一实例的平面图。

[图14]图14是对已经发生DNA复制的细胞的频率和荧光强度之间的关系实例作图的图。

[图15A]图15A是示例电磁阀型排出头的实例的示例图。

[图15B]图15B是示例压电型排出头的实例的示例图。

[图15C]图15C是示例图15B所示例的压电型排出头的变型实例的示例图。

[图16A]图16A是对施加到压电元件的电压的实例作图的示例图。

[图16B]图16B是对施加到压电元件的电压的另一实例作图的示例图。

[图17A]图17A是示例液滴状态的实例的示例图。

[图17B]图17B是示例液滴状态的实例的示例图。

[图17C]图17C是示例液滴状态的实例的示例图。

[图18]图18是示例被配置以将液滴顺序地着落到孔中的分配装置的实例的示意图。

[图19]图19是示例液滴形成装置的实例的示例图。

[图20]图20是示例图19的液滴形成装置的控制单元的硬件区块的图。

[图21]图21是示例图19的液滴形成装置的控制单元的功能区块的图。

[图22]图22是示例液滴形成装置的操作的实例的流程图。

[图23]图23是示例液滴形成装置的变型实例的示例图。

[图24]图24是示例液滴形成装置的另一变型实例的示例图。

[图25A]图25A是示例飞行液滴中包含两个荧光粒子的情况的图。

[图25B]图25B是示例飞行液滴中包含两个荧光粒子的情况的图。

[图26]图26是对粒子不彼此重叠时的亮度Li与实际测量的亮度Le之间的关系的实例作图的图。

[图27]图27是示例液滴形成装置的另一变型实例的示例图。

[图28]图28是示例液滴形成装置的另一实例的示例图。

[图29]图29是示例用于计数已通过微流路径的细胞的方法的实例的示例图。

[图30]图30是示例用于捕获排出头的喷嘴部的附近部分的图像的方法的实例的示例图。

[图31]图31是对概率P(＞2)与平均细胞数之间的关系作图的图。

[图32]图32是示例制备者技能评估装置的硬件配置的实例的框图。

[图33]图33是示例制备者技能评价装置的功能配置的实例的图。

[图34]图34是示例根据制备者技能评估程序执行的过程的实例的流程图。

[图35]图35是示例测试装置性能评估装置的硬件配置的实例的框图。

[图36]图36是示例测试装置性能评估装置的功能配置的实例的图。

[图37]图37是示例根据测试装置性能评估程序执行的过程的实例的流程图。

[图38]图38是示例实时PCR的温度控制方法的实例的图。

[图39]图39是示例进行了实时PCR的平板实例的图。

[图40]图40是示例图39的结果实例的图。

[图41]图41是示例图39的结果实例的图。

[图42]图42是对图39的结果实例作图的图。

[图43]图43是对根据泊松分布具有变异的拷贝数与变异系数CV之间的关系作图的图。

具体实施方式

(装置)

本发明的装置包括多个孔，以及所述孔划分成的两组或更多组，所述两组或更多组的孔中的组成不同。装置进一步按需包括其他构件。

优选地，本公开的装置包括多个孔，含有特定拷贝数的可扩增试剂的试剂组合物布置于各孔中；以及所述孔划分成的两组或更多组，所述两组或更多组具有以相同特定拷贝数布置的可扩增试剂但除特定拷贝数外的试剂组合物的组成不同。

本公开的装置基于以下发现。现有的稀释方法可有可能会导致不能用(多)拷贝填充一些部分，或者可导致在要布置的绝对数量为仅一个拷贝时不能按设计布置拷贝。因此，不能高准确度地评估测量系统的性能。

本公开的装置还基于以下发现。利用现有的标准核酸试剂盒，不能克服不考虑低拷贝数范围的样品核酸的可能性变异的问题。

本公开的装置还基于以下发现。现有的用于评估测量系统的方法仅基于作为间接因素的温度来评估测量系统，并且不能适当地评估因手动操作而对测量系统造成的影响。

本公开的装置——其包括两组或更多组的孔，组间试剂组合物中所含的可扩增试剂的特定拷贝数相同，但除特定拷贝数之外的试剂组合物组成不同——可用于适当地评估制备试剂组合物的制备者的技能。注意，可扩增试剂的拷贝数可与分子数关联。

优选地，本公开的装置包括多个孔，各孔中布置特定拷贝数的可扩增试剂；以及所述孔划分成的两组或更多组，所述两组或更多组的可扩增试剂的特定拷贝数不同。

本公开的装置基于以下发现。现有的稀释方法可有可能导致一些部分不能用(多)拷贝填充，或者可能导致在要布置的绝对数量为仅一个拷贝时不能按设计布置拷贝。因此，现有的稀释方法不能用于测试装置的平面内特性的评估和定量评估。

本公开的装置还基于以下发现。利用操纵的现有方法是与用于制备样品溶液的方法有关的技术。测试装置的性能评估没有被描述或暗示。此外，这些技术在通量方面存在问题。

本公开的装置——其包括均以特定拷贝数布置可扩增试剂的多个孔划分成的两组或更多组，使得组间可扩增试剂的特定拷贝数不同——使得可以适当地评估测试装置的平面内均匀性、测试装置间性能和测试设施间性能。

当相同碱基序列不以复数引入一个分子时，“分子数”可以与“拷贝数”同义使用。

<孔>

例如，孔的形状、数量、容积、材料和颜色没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择。

孔的形状没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择，只要孔中可布置含有特定拷贝数的可扩增试剂的试剂组合物。孔的形状的实例包括：凹形，如平底、圆底、U底和V底；和基板上的部分。

孔数优选为2以上的复数，更优选5以上，还更优选50以上。

孔数为2以上的多孔板适用。

多孔板的实例包括24孔、48孔、96孔、384孔或1,536孔板。

孔体积没有具体限制，可以根据预期目的被适当选择，并且考虑到在普通核酸测试装置中使用的样品量优选为10微升以上但1,000微升以下。

孔的材料没有具体限制并且可根据预期目的适当地选择。孔的材料的实例包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、氟树脂、丙烯酸树脂、聚碳酸酯、聚氨酯、聚氯乙烯和聚对苯二甲酸乙二醇酯。

孔的颜色的实例包括透明色、半透明色、着色和完全遮光色。

孔的润湿性没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择。孔的润湿性优选是疏水性。当孔的润湿性是疏水性时，可减少可扩增试剂对孔内壁的吸附。此外，当孔的润湿性为疏水性时，孔中的可扩增试剂、引物和扩增剂可以以溶液状态移动。

对孔的内壁赋予疏水性的方法没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。该方法的实例包括形成氟树脂涂覆膜的方法、氟等离子体处理和压花处理。具体地，通过施加赋予100度以上的接触角的疏水性赋予处理，可以抑制由于液体溢出而导致的可扩增试剂减少，并且可以抑制不肯定性(或变异系数)的增加。

<基材>

装置优选为通过在基材中设置孔而获得的平板状装置，但可以是诸如8连管的连接型孔管。

例如，基材的材料、形状、尺寸和结构没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择。

基材的材料没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择。基材的材料的实例包括半导体、陶瓷、金属、玻璃、石英玻璃和塑料。在这些材料中、塑料是优选的。

塑料的实例包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、氟树脂、丙烯酸树脂、聚碳酸酯、聚氨酯、聚氯乙烯和聚对苯二甲酸乙二醇酯。

基材的形状没有具体限制，并可以根据预期目的被适当选择。例如，板状和平板形状是优选的。

基材的结构没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择，并且可以是例如单层结构或多层结构。

<识别单元>

优选地，装置包括识别单元，该识别单元能够实现识别关于可扩增试剂的特定拷贝数的信息。

识别单元没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择。识别单元的实例包括存储器、IC芯片、条形码、QR码(注册商标)、射频识别器(以下也称为“RFID”)、颜色代码和打印体。

识别单元的设置位置和识别单元的数量没有具体限制，并可以根据预期目的被适当选择。

存储在识别单元中的信息的实例不仅包括关于可扩增试剂的特定拷贝数的信息，而且包括分析结果(例如，活性值和发射强度)、可扩增试剂的数量(例如细胞数)、细胞是活的还是死的、特定碱基序列的拷贝数、多个孔中哪个孔被可扩增试剂填充、可扩增试剂的种类、测量日期和时间、以及测量负责人的姓名。

存储在识别单元中的信息可以利用各种读取单元来读取。例如，当识别单元是条形码时，条形码读取器被用作读取单元。

用于在识别单元中写入信息的方法没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择。该方法的实例包括手动输入、通过液滴形成装置直接写入数据的方法——该液滴形成装置被配置以在将可扩增试剂分配到孔中的过程中对可扩增试剂的数量计数、存储在服务器中的数据的传输、以及存储在云系统中的数据的传输。

<其他构件>

其他构件没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择。其他构件的实例包括密封构件。

-密封构件-

优选装置包括密封构件，以防止异物混入孔中和填充材料流出。

优选密封构件被配置以能够密封至少一个孔并且在穿孔处是可分离的，以便能够分别单独密封或打开每一个孔。

密封构件的形状优选为与孔的内径匹配的帽状、或覆盖孔的开口的膜状。

密封构件的材料的实例包括聚烯烃树脂、聚酯树脂、聚苯乙烯树脂和聚酰胺树脂。

优选密封构件具有能够一次密封所有孔的膜状。还优选密封构件被配置以对需要重新打开的孔和不需重新打开的孔具有不同的粘合强度，以便使用者可以减少不当使用。

本公开的装置包括多个孔，以及布置在所述多个孔中并且各自包含特定拷贝数的可扩增试剂的试剂组合物。

拷贝数是指孔中包含的可扩增试剂中目标或特定碱基序列的数量。

目标碱基序列是指在至少引物和探针区域中包括限定碱基序列的碱基序列。具体地，具有限定总长度的碱基序列也称为特定碱基序列。

特定拷贝数是指上述以一定水平或更高的准确度指定目标碱基序列的数量的拷贝数。

这意味着特定拷贝数被认为是孔中实际包含的特定序列的数量。即，本公开中的特定拷贝数作为数量比按照现有的连续稀释方法获得的预定拷贝数(计算的估计值)更准确或更可靠，并且是不依赖于泊松分布的受控值，即使该值具体地在1,000以下的低拷贝数范围内。当说特定拷贝数是受控值时，优选地，表示不肯定性的变异系数CV相对于平均拷贝数x大致满足CV<1/√x，或满足CV≤20％。因此，使用包括包含特定拷贝数的特定碱基序列的孔的装置使得可以进行比以往更准确的对包含目标碱基序列的样品的定性或定量测试。

当目标碱基序列的数量和包括该序列的核酸分子的数量彼此一致时，“拷贝数”和“分子数”可以彼此关联。

具体地，例如，在诺如病毒的情况下，当病毒数为1时，核酸分子数为1，并且特定拷贝数为1。在GI期酵母的情况下，当酵母细胞数为1时，核酸分子数(相同染色体的数量)为1，并且特定拷贝数为1。在G0/GI期人细胞的情况下，当人细胞数为1时，核酸分子数(相同染色体的数量)为2，并且拷贝数为2。

此外，在两位置处引入了目标碱基序列的GI期酵母的情况下，当酵母细胞数为1时，核酸分子数(相同染色体的数量)为1，并且拷贝数为2。

在本公开中，可扩增试剂的特定拷贝数也可以称为可扩增试剂的绝对数量。

当有多个孔包含可扩增试剂时，至少需要孔中包含相同特定拷贝数的可扩增试剂。

当提到孔中包含相同特定拷贝数的可扩增试剂时，是指可扩增试剂的数量变异在容许范围内，其中变异发生在将可扩增试剂填充在装置中时。可扩增试剂的数量变异是否在容许范围内可以基于下述不肯定性信息来判断。

关于可扩增试剂的特定拷贝数的信息没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择，只要该信息是关于装置中的可扩增试剂的信息。信息的实例包括关于不肯定性的信息、关于下述载体的信息以及关于可扩增试剂的信息。

“不肯定性”在ISO/IEC Guide 99:2007[International Vocabulary of Metrology-Basics and general concepts and related terms(VIM)]中被定义为“表征伴随测量结果的、与测量量合理地相关的数值的变异或离差(分散，dispersion)的参数”。

在此，“与测量量合理地相关的数值”是指测定量的真实值候选。即，不肯定性是指关于因测量目标的制备所涉及的操作和装置而导致的测量结果的变异的信息。不肯定性越大，预期测量结果的变异越大。

例如，不肯定性可以是从测量结果获得的标准偏差，或者是可靠性水平的一半值，其被表示为其中以预定概率或更高概率包含真实值的数值范围。

不肯定性可以按照例如基于Guide to the Expression of Uncertainty inMeasurement(GUM：ISO/IEC Guide 98-3)和Japan Accreditation Board Note 10,Guideline on Uncertainty in Measurement in Test的方法来计算。作为计算不肯定性的方法，例如，有两种类型的适用方法：利用例如被测量值的统计学的A型评估方法，和利用由例如校准证书、制造商的说明书以及公众开放信息获得的关于不肯定性的信息的B型评估方法。

通过将不肯定性转换为标准不肯定性，可以将所有因诸如操作和测量的因素而导致的不肯定性表示为相同的可靠性水平。标准不肯定性表示被测量值的平均值的变异。

在用于计算不肯定性的实例方法中，例如，提取可引起不肯定性的因素，并且计算由于对应因素引起的不肯定性(标准偏差)。然后，根据平方和方法对合成由于对应因素引起的计算不肯定性，以计算合成标准不肯定性。在合成标准不肯定性的计算中，使用平方和方法。因此，在引起不肯定性的因素中，引起足够小的不肯定性的因素可以被忽略。

在本公开的装置中，孔中填充的可扩增试剂的变异系数可以用作关于不肯定性的信息。

变异系数是指各凹部中填充的细胞数量(或可扩增试剂的数量)的变异的相对值，其中，当将细胞被填充在凹部中时变异发生。即，变异系数是指就凹部中填充的细胞(或可扩增试剂)的数量方面的填充准确度。变异系数是通过标准偏差σ除以平均值x而获得的值。在此，将变异系数CV设为通过标准偏差σ除以平均拷贝数(平均填充拷贝数)x而得到的值。在这种情况下，建立由以下式1表示的关系表达式。

[数学式1]

总体上，细胞(或可扩增试剂)在分散液中具有随机分布状态——泊松分布。因此，在通过连续稀释法的随机分布状态下，即泊松分布，可以认为标准偏差σ满足以下式2所示的与平均拷贝数x的关系表达式。因此，在通过连续稀释法稀释细胞(或可扩增试剂)的分散液的情况下，当根据基于标准偏差σ和平均拷贝数x由上式1和式2导出的下式3计算平均拷贝数x的变异系数CV(CV值)时，结果如表1和图43所示。可以从图43获得具有根据泊松分布的变异的拷贝数的变异系数CV。

[数学式2]

[数学式3]

表1

根据表1和图43的结果可以理解，当根据连续稀释法将例如100拷贝数的可扩增试剂的填充到孔中时，反应溶液中将填充的可扩增试剂的最终拷贝数具有至少10％的变异系数(CV)，即使在忽略其他准确度时。

关于可扩增试剂的拷贝数，优选可扩增试剂的变异系数CV和平均特定拷贝数x满足关系：CV＜1/√x，并且更优选满足CV<1/2√x。

关于不肯定性的信息，优选的是，装置包括多个孔，每个孔中包含可扩增试剂，并且关于不肯定性的信息包括关于装置整体基于每个孔中包含的可扩增试剂特定拷贝数的不肯定性的信息。

有一些可想到的引起不肯定性的因素。例如，在将预期可扩增试剂引入细胞并在计数细胞数的同时分配细胞的制备过程中，可想到的因素的实例包括细胞中的可扩增试剂数量(例如，细胞的细胞周期)、被配置以在装置中布置细胞的单元(包括喷墨装置或装置各部分的任何操作结果，如装置的操作定时以及当细胞悬浮液形成液滴形式时液滴中包含的细胞数)、细胞被布置在装置适当位置的频率(例如，布置在孔中的细胞数)、以及由于细胞悬浮液中细胞破坏而造成的污染和可扩增试剂因此在细胞悬浮液中的混合(以下也可描述为污染物混合)。

作为关于可扩增试剂的信息的关于可扩增试剂的数量的信息的实例包括关于装置中所包含的可扩增试剂的数量的不肯定性的信息。

除了特定拷贝数的可扩增试剂之外，试剂组合物还包含用于扩增可扩增试剂(例如，核酸)所需的组分，并且例如包含引物和扩增剂。

引物是具有包括18个以上但30个以下的碱基的互补碱基序列的合成寡核苷酸，并且对聚合酶链反应(PCR)的模板DNA具有特异性。一对引物，即正向引物和反向引物，以将待扩增区域夹在中间的方式设置在两个位置。

用于例如聚合酶链反应(PCR)的扩增剂的实例包括诸如DNA聚合酶的酶、诸如四种碱基(dGTP、dCTP、dATP和dTTP)的基质、Mg²⁺(2mM氯化镁)以及用于维持最佳pH值(7.5到9.5的pH)的缓冲剂。

孔中可扩增试剂、引物和扩增剂的状态没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。例如，可扩增试剂、引物和扩增剂的状态可以是溶液或固体状态。就使用方便而言，可扩增试剂、引物和扩增剂的状态特别优选为溶液状态。在溶液状态下，使用者可以直接将可扩增试剂、引物和扩增剂用于测试。就运输而言，可扩增试剂、引物和扩增剂的状态特别优选为固体状态，更优选为干燥状态。在固体干燥状态下，可以降低可扩增试剂被例如分解酶分解的反应速度，并且可以提高可扩增试剂、引物和扩增剂的储存稳定性。

优选适量的可扩增试剂、引物和扩增剂以固体干燥状态填充在装置中，以使得可以通过在使用装置之前刻将可扩增试剂、引物和扩增剂溶解在缓冲剂或水中而直接使用反应溶液形式的可扩增试剂、引物和扩增剂。

干燥方法没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。干燥方法的实例包括冷冻干燥、加热干燥、热风干燥、真空干燥、蒸汽干燥、抽吸干燥、红外干燥、桶式干燥和旋转干燥。

装置包括两组或更多组的孔，组间可扩增试剂的特定拷贝数相同，但是除特定拷贝数外的试剂组合物的组成不同。例如，当装置的基材是包括多个孔的板时，各组“区域”逐一形成在板上。试剂组合物中可扩增试剂的特定拷贝数不同的两个或更多个区域可以彼此相邻或可以彼此分开。

例如，除了可扩增试剂的特定拷贝数以外的组成不同意味着可以提供可以包含或不包含充当可扩增试剂的核酸以外的任何其他引物或扩增剂的组合。例如，装置的第一组包括(1)包含核酸、引物和扩增剂的组合物，装置的第二组包括(2)包含核酸和引物的组合物，以及装置的第三组包括(3)仅包含核酸的组合物。在制备试剂组合物时，通过手动操作，制备者将引物和扩增剂中的至少任一者添加至(2)和(3)的组合物，并将该试剂组合物用于PCR反应。因此，该装置使得能够例如评估制备试剂组合物的制备者的技能。

当核酸用作可扩增试剂时，制备者的技能的实例包括移液操作、待制备的扩增剂量以及向孔板添加试剂。

在制备时，制备者可已知所用装置的各个组中将包含的核酸、引物(或包括多种引物的引物组)和扩增剂的种类、数量和浓度。这使得制备者还可以以适合于各个组中的种类、数量和浓度的方式制备试剂组合物，并将该试剂组合物用于PCR反应。这使得能够更适当地评估制备者的技能。

此外，可以采用以下模式：装置包括多个孔和位于多个孔中的试剂组合物，并且各试剂组合物至少包含选自可扩增试剂、引物和扩增剂的组合物，其中试剂组合物包括组成不同的两个或多个组。

这种配置使得可以评估制备任意组合物的制备者的技能。

此外，优选该装置包括在可扩增试剂的特定拷贝数上彼此不同的组。即，优选在一个孔和任何其他孔(一个或多个)之间存在可扩增试剂的两种以上的特定拷贝数。两种以上的特定拷贝数的组合的实例包括1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的组合，1、3、5、7和9的组合，以及2、4、6、8和10的组合。

在本公开的装置中，优选一个孔中的可扩增试剂的特定拷贝数为10^N1，而另一孔中的可扩增试剂的特定拷贝数为10^N2(其中N1和N2为相互连续的整数)。这种特定拷贝数的组合的实例包括1、10、100和1,000的组合，以及100、1,000、10,000、100,000和1,000,000的组合。因此，通过本公开的装置可容易生成用于在从低拷贝数到高拷贝数的宽范围内的校准曲线。

本公开的装置包括可扩增试剂的特定拷贝数不同的两组或更多组的孔。例如，当装置的基材是包括多个孔的板时，各组的“区域”逐一形成在板上。在可扩增试剂的特定拷贝数不同的两个或更多个组形成的“区域”中，孔可以彼此相邻或可以彼此分开。

因此，使用本公开的装置，当发现进行实时PCR(一种性能评估)的测试装置包括一个孔(不合格的孔)与存在于不同位置并共享相同特定拷贝数的另一孔相比不适用，可以判断是通过实时PCR再次校准测试装置，还是将不合格的孔从实际样品应用中排除。另外，通过使用本公开的装置定期地对测试装置进行测量，可以得到与该测试装置的平面内位置的Ct值的时间变化有关的信息，并可以基于该信息评估该测试装置的平面内特性。此外，使用布置相同特定拷贝数的装置能够在经受测量的测试装置与另一测试装置之间进行比较。

优选地，孔组中的至少一组是其中可扩增试剂的特定拷贝数接近检测极限的组。

检测极限(LOD)代表通过可检测可扩增试剂(例如，核酸)的方法可检测的可扩增试剂的最小拷贝数。检测极限没有具体限制，可以根据测量方法适当选择，并且可以是例如平均值±3σ。

在本说明书中，当存在特定拷贝数不同的样品组并且每个样品集包括具有相同特定拷贝数的21个样品，并且任何一个样品组都导致从21个样品中的一个样品中检测不到(对应于以95％的概率判断的2σ)时，可以将这种样品组的特定拷贝数中的最小拷贝数用作检测极限。

接近检测极限意味着拷贝数在检测拷贝数极限的±1范围内。

假定本公开的装置至少包括其中可扩增试剂的特定拷贝数接近检测极限的组。例如，假定本公开的装置包括可扩增试剂的特定拷贝数分别为“1”、“2”、“3”，“4”和“5”的组。在这种情况下，当使用本公开的装置进行性能评估的测试装置被证明能够扩增特定拷贝数为“3”以上的组中的可扩增试剂时但不能扩增特定拷贝数“2”以下的组中的可扩增试剂时，可以表明，表示测试装置中的可扩增试剂的特定拷贝数的检测极限的下限值为“3”。此外，当使用本公开的装置进行性能评估的另一相似测试装置被证明能够扩增特定拷贝数为“4”以上的组中的可扩增试剂但不能扩增特定拷贝数为“3”以下的组中的可扩增试剂时，可以表明，表示检测装置中的可扩增试剂的特定拷贝数的检测极限的下限值为“4”。因此，可以确定通过测试装置可检测的可扩增试剂的最小特定拷贝数。

优选地，布置特定拷贝数的可扩增试剂的组中的至少一组是其中可扩增试剂的特定拷贝数大于定量极限的拷贝数的组。

定量极限(LOQ)表示通过可定量可扩增试剂(例如核酸)的方法可定量的可扩增试剂的最小拷贝数，其中“可定量”表示定量结果可以足够可靠。定量极限没有具体限制，并且可以根据测量方法适当地选择。

在本说明书中，代表拷贝数偏离使用由多个分子种类形成的样品(例如，具有不同特定分子数(具有不同拷贝数)的多个核酸样品)产生的校准曲线的线性的值可以用作定量极限。可选地，可以通过CV值来表示校准曲线的不肯定性。在通过在水平轴上表示拷贝数和在垂直轴上表示Ct值来对CV值作图的图中，例如，CV值低于5％或10％的值(拷贝数)可以用作定量极限。

在定量评估中，可以从校准曲线和PCR效率获得对应于Ct值的分子数(拷贝数或浓度)，而不是Ct值本身。因此，可以基于转换为分子数(拷贝数或浓度)的CV值来设置定量极限。

当本公开的装置至少包括其中可扩增试剂(例如核酸)的特定拷贝数是大于定量极限的拷贝数的组时，例如，可以确定可以确保通过测试装置定量检测的可扩增试剂的最小特定拷贝数，如同可以找到一种测试装置能够在可扩增试剂的特定拷贝数为10以上时确保定量检测，并找到另一种测试装置能够在核酸的特定拷贝数为20以上时确保定量检测。

在本公开的装置中，优选地，孔组中的至少一组是阴性对照组，其中可扩增试剂的特定拷贝数为0。

在本公开的装置中孔组中的至少一组设置为其中可扩增试剂的特定拷贝数为0的阴性对照组的情况下，任何从阴性对照组中检测到可扩增试剂表明检测系统(试剂或装置)异常。在装置中设置阴性对照组的情况下，用户可以在问题出现时立即识别出问题，并可以停止测量和检查问题的根源。

在本公开的装置中，优选地，孔组中的至少一组是阳性对照组，其中可扩增试剂的特定拷贝数为100以上。

在本公开的装置中孔组中的至少一组设置为其中可扩增试剂的特定拷贝数为100以上的阳性对照组的情况下，任何从阳性对照组中未检测到可扩增试剂(的情况)表明检测系统(试剂或装置)异常。在装置中设置阳性对照组的情况下，用户可以在问题出现时立即识别出问题，并可以停止测量和检查问题的根源。

在本公开的装置中，进一步优选，孔组中的至少一组是除阴性对照组外拷贝数最少的组(拷贝数最少的组)，并且拷贝数最少的组至少位于近乎(approximately)装置外围的孔中。

近乎外围处的孔是指最外围的孔和装置上二维布置的孔中自最外围向内几行的孔。最外围的孔和自最外围向内几行的孔的实例包括第一行，或序数较大行但在第47行的孔，或序数较小行的孔。

不同于位于装置中心附近的孔，位于装置最外围的孔在外侧没有其他孔，并在装置和装置外部之间限定了边界。因此，(1)最外围的孔在装置上物理上具有不均匀的热传导，(2)最外围的孔易受PCR装置的温度波动因素的影响，因为这些孔设置在温度控制构件的外围，温度控制构件是构成PCR装置的部件。因此，通过孔组中的至少一组在本公开的装置中设置为除阴性对照组以外拷贝数最小的组(具有最小拷贝数的组)和通过具有最少拷贝数的组设置在至少近乎处于装置外围的孔处，可以以更高的灵敏度检测PCR装置的故障。

优选可扩增试剂是核酸。优选将核酸引入细胞核中。

-核酸-

核酸是指这样的聚合有机化合物：其中源自嘌呤或嘧啶的含氮碱基、糖和磷酸彼此有规律地键合。核酸的实例还包括核酸片段或核酸类似物或核酸片段的类似物。

核酸没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择。核酸的实例包括DNA、RNA和cDNA。

核酸或核酸片段可以是从活物获得的天然产物、或天然产物的加工产物、或利用遗传重组技术产生的产物、或化学合成的人工合成核酸分子。这些核酸中的一种可以单独使用，或这些核酸中的两种以上可以组合使用。利用人工合成的核酸分子，可以抑制杂质并将分子量设定为低水平。这使得可以提高初始反应效率。

人工合成的核酸是指人工合成的核酸，其被产生以具有与天然存在的DNA或RNA相同的组成成分(碱基、脱氧核糖和磷酸)。人工合成的核酸的实例不仅包括具有编码蛋白质的碱基序列的核酸，而且包括具有任意碱基序列的核酸。

核酸或核酸片段的类似物的实例包括与非核酸组分键合的核酸或核酸片段、用标记剂如荧光染料或同位素标记的核酸或核酸片段(例如，用荧光染料或放射性同位素标记的引物或探针)、和人工核酸——即其中一些组分核苷酸的化学结构发生变化的核酸或核酸片段(例如PNA、BNA和LNA)。

核酸的形式没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。核酸形式的实例包括双链核酸、单链核酸和部分双链或单链核酸。也可以使用环状或直链质粒。

核酸可以被修饰或突变。

优选核酸具有特定碱基序列。术语“特定”是指“特别指定”。

特定碱基序列没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。特定碱基序列的实例包括用于感染性疾病测试的碱基序列、天然不存在的非天然碱基序列、动物细胞来源的碱基序列、植物细胞来源的碱基序列、真菌细胞来源的碱基序列、细菌来源的碱基序列和病毒来源的碱基序列。这些碱基序列中的一种可以单独使用，或这些碱基序列中的两种以上可以组合使用。

当使用非天然碱基序列时，特定碱基序列优选具有30％以上但70％以下的GC含量，并且优选具有恒定的GC含量(例如，参见SEQ ID NO.1)。

特定碱基序列的碱基长度没有具体限制，可以根据预期目的被适当选择，并且可以为例如20个碱基对(或mer)以上但10,000个碱基对(或mer)以下的碱基长度。

当使用用于感染性疾病测试的碱基序列时，该碱基序列没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择，只要该碱基序列包括目标感染性疾病的特定碱基序列。优选地，碱基序列包括在官方分析方法或官方宣布方法中指定的碱基序列(例如，参见SEQ ID NO.2和3)。

核酸可以是源自所用细胞的核酸、或通过转基因引入的核酸。当使用通过转基因引入的核酸和质粒作为该核酸时，优选确认每个细胞引入了一个拷贝的核酸。确认引入1个拷贝的核酸的方法没有具体限制，并可以根据预期目的被适当选择。该方法的实例包括测序仪、PCR方法和Southern印迹法。

具有特定碱基序列的一种或两种或更多种核酸可以通过转基因被引入。同样在通过转基因引入仅一种核酸的情况下，根据预期目的，可以串联引入相同种类的碱基序列。

转基因的方法没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择，只要该方法可以在预期位置引入预期拷贝数的特定核酸。该方法的实例包括同源重组、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、TALEN、锌指核酸酶、翻转(Flip-in)和跳入(Jump-in)。在酵母真菌的情况下，就高效和易控制而言，在这些方法中优选同源重组。

-载体-

优选处理处于被携带在载体上的状态的可扩增试剂。当可扩增试剂是核酸时，优选的形式是核酸被具有粒子形状的载体(载体粒子)携带(或更优选地被包封)。

载体没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择。载体的实例包括细胞、树脂、脂质体和微囊。

-细胞--

细胞是指包含可扩增试剂(例如核酸)并形成生物的结构功能单元。

细胞没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择。所有种类的细胞均可被使用，不论细胞是真核细胞、原核细胞、多细胞生物细胞和单细胞生物细胞。这些种类的细胞中的一种可以单独使用，或这些种类的细胞中的两种以上可以组合使用。

真核细胞没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。真核细胞的实例包括动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌、藻类和原生动物。这些种类的真核细胞中的一种，或这些种类的真核细胞中的两种以上可以组合使用。在这些真核细胞中，动物细胞和真菌是优选的。

粘附细胞可以是直接取自组织或器官的原代细胞，或可以是通过使直接取自组织或器官的原代细胞传代几次而获得的细胞。粘附细胞可以根据预期目的被适当选择。粘附细胞的实例包括分化的细胞和未分化的细胞。

分化的细胞没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。分化细胞的实例包括：肝细胞，其是肝脏的实质细胞；星状细胞；Kupffer细胞；内皮细胞，如血管内皮细胞、窦状内皮细胞和角膜内皮细胞；成纤维细胞；成骨细胞；破骨细胞；牙周韧带源细胞；表皮细胞，如表皮角质形成细胞；上皮细胞，如气管上皮细胞、肠上皮细胞、宫颈上皮细胞和角膜上皮细胞；乳腺细胞；周细胞；肌肉细胞，如平滑肌细胞和心肌细胞；肾细胞；胰岛细胞；神经细胞，如周围神经细胞和视神经细胞；软骨细胞；和骨细胞。

未分化的细胞没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。未分化细胞的实例包括：多能干细胞，如属于未分化细胞的胚胎干细胞，和具有多能性的间充质干细胞；单能干细胞，如具有单能性的血管内皮祖细胞；和iPS细胞。

真菌没有具体限制并且可根据预期目的被适当选择。真菌的实例包括霉菌和酵母真菌。这些种类的真菌中的一种可以单独使用，或者这些种类的真菌中的两种或更多种可以组合使用。在这些种类的真菌中，酵母真菌是优选的，因为细胞周期是可调节的并且可以使用单倍体。

细胞周期是指细胞增殖过程，其中细胞经历细胞分裂，并且由细胞分裂产生的细胞(子细胞)成为经历另一细胞分裂以产生新子细胞的细胞(母细胞)。

酵母真菌没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。例如，被同步培养以在G0/G1期同步并且被固定在G1期的酵母真菌是优选的。

此外，例如，作为酵母真菌，对控制G1期细胞周期的佛裸蒙(pheronmone)(性激素)具有增强的敏感性的Bar1缺陷型酵母是优选的。当酵母真菌是Bar1缺陷型酵母时，细胞周期不受控的酵母真菌的丰度比可以降低。这使得可以例如防止孔中包含细胞中的特定核酸的数量增加。

原核细胞没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择。原核细胞的实例包括真细菌和古细菌。这些种类的原核细胞中的一种可以单独使用，或这些种类的原核细胞中的两种以上可以组合使用。

作为细胞，死细胞是优选的。利用死细胞，可以防止分级分离后发生细胞分裂。

作为细胞，在受光时可发光的细胞是优选的。利用在受光时可发光的细胞，可以在对细胞数具有高度精确控制的同时使细胞着落到孔中。

受光意为接收光。

光学传感器是指无源传感器，其被配置以用透镜收集从人眼可见的可见光到近红外线、短波长红外线和波长长于可见光射线的热红外线范围内以获得例如图像数据形式的目标细胞形状的任何光。

--受光时可发光的细胞--

受光时可发光的细胞没有具体限制，并且可根据预期目的被适当选择，只要细胞在受光时可发光。该细胞的实例包括用荧光染料染色的细胞、表达荧光蛋白的细胞和用荧光标记抗体标记的细胞。

用荧光染料染色、表达荧光蛋白或用荧光标记抗体标记的细胞位点没有具体限制。该细胞位点的实例包括全细胞、细胞核和细胞膜。

--荧光染料--

荧光染料的实例包括荧光素、偶氮染料、若丹明、香豆素、芘类、青色素(cyanines)。这些荧光染料中的一种可以单独使用，或这些荧光染料中的两种以上可以组合使用。在这些荧光染料中，荧光素、偶氮染料和若丹明是优选的，并且曙红、伊文思蓝、台盼蓝、若丹明6G、若丹明B和若丹明123是更优选的。

作为荧光染料，可以使用市售的产品。市售产品的实例包括产品名称：EOSIN Y(可从Wako Pure Chemical Industries,Ltd.获得)；产品名称：EVANS BLUE(可从Wako PureChemical Industries,Ltd.获得)，产品名称：TRYPAN BLUE(可从Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.获得)；产品名称：RHODAMINE 6G(可从Wako Pure Chemical Industries,Ltd.获得)；产品名称：RHODAMINE B(可从Wako Pure Chemical Industries,Ltd.获得)；和产品名称：RHODAMINE 123(可从Wako Pure Chemical Industries,Ltd.获得)。

--荧光蛋白--

荧光蛋白的实例包括Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP和KikumeGR。这些荧光蛋白中的可以单独使用，或这些荧光蛋白中的两种以上可以组合使用。

--荧光标记抗体--

荧光标记抗体没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择，只要该荧光标记抗体被荧光标记。荧光标记抗体的实例包括CD4-FITC和CD8-PE。这些荧光标记抗体中的一种可以单独使用，或这些荧光标记抗体在的两种以上可以组合使用。

在游离状态下，细胞的体积平均粒径优选为30微米以下，更优选为10微米以下，特别优选为7微米以下。当细胞的体积平均粒径为30微米以下时，细胞可适当地用于喷墨法或液滴排出单元如细胞分选器。

细胞的体积平均粒径可以通过例如下述测量方法来测量。

从产生的染色酵母分散液中提取10微升，并将其倒在由PMMA形成的塑料载玻片上。然后，利用自动细胞计数器(产品名称：COUNTESS AUTOMATED CELL COUNTER，可从Invitrogen获得)，可以测量细胞的体积平均粒径。细胞数可以通过类似的测量方法获得。

细胞悬浮液中的细胞浓度没有具体限制，可以根据预期目的被适当选择，并且优选为5×10⁴细胞/mL以上5×10⁸细胞/mL以下，更优选5×10⁴细胞/mL以上但5×10⁷细胞/mL以下。当细胞数为5×10⁴细胞/mL以上但5×10⁸细胞/mL以下时，可以确保细胞无失误地被包含在排出的液滴中。可以以与测量体积平均粒径相同的方式，用自动细胞计数器(产品名称：COUNTESS AUTOMATED CELL COUNTER，可从Invitrogen获得)测量细胞数。

包含核酸的细胞的细胞数没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择，只要细胞数为复数。

-树脂-

树脂的材料、形状、尺寸和结构没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择，只要该树脂可以携带可扩增试剂(例如核酸)。

-脂质体-

脂质体是由包含脂质分子的脂质双层形成的脂质囊泡。具体地，脂质体是指包含脂质的封闭囊泡，其包括通过基于脂质分子的疏水基团和亲水基团的极性而产生的脂质双层与外部环境隔开的空间。

脂质体是由使用脂质的脂质双层形成的闭合囊泡，并且在闭合囊泡的空间中包含水相(内部水相)。内部水相包含例如水。脂质体可以是单层的(单层层状或具有单个双层的单层状)或多层层状(多层状，具有包括多个双层的洋葱样结构，其中各个层被水层隔开)。

作为脂质体，可以包封可扩增试剂(例如核酸)的脂质体是优选的。包封形式没有具体限制。“包封”是指核酸被包含在内部水相和脂质体层中的形式。该形式的实例包括在由层形成的封闭空间中包封核酸的形式、在层本身中包封核酸的形式以及这些形式的组合。

脂质体的尺寸(平均粒径)没有具体限制，只要脂质体可以包封可扩增试剂(例如核酸)。脂质体优选具有球形形式或接近球形形式的形式。

构成脂质体的脂质双层的组分(层组分)选自脂质。作为脂质，可以使用可溶于水溶性有机溶剂和酯系有机溶剂的混合溶剂中的任意脂质。脂质的具体实例包括磷脂、磷脂以外的脂质、胆固醇和这些脂质的衍生物。这些组分可以由一种组分或多种组分形成。

-微胶囊-

微胶囊是指具有壁材料和中空结构的微小粒子，并且可以将可扩增试剂(例如，核酸)包封在中空结构中。

微胶囊没有具体限制，并且例如可以根据预期目的适当地选择壁材料和微胶囊尺寸。

微胶囊的壁材料的实例包括聚氨酯树脂、聚脲、聚脲-聚氨酯树脂、脲-甲醛树脂、三聚氰胺-甲醛树脂、聚酰胺、聚酯、聚砜酰胺、聚碳酸酯、聚亚磺酸酯、环氧树脂、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙酸乙烯酯和明胶。这些壁材料中的一种可以单独使用，或这些壁材料中的两种以上可以组合使用。

微胶囊的尺寸没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择，只要该微胶囊可以包封可扩增试剂(例如，核酸)。

制备微胶囊的方法没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。该方法的实例包括原位方法、界面聚合方法和凝聚法。

图1是示例本公开的装置的实例的透视图。图2是图1的装置的侧视图。在装置1中，在基材2中设置多个孔3，并且在孔3中以特定拷贝数填充作为可扩增试剂的核酸4。在图1和图2中，参考标记5表示密封构件。

图3是示例本公开的装置的实例的平面图。在图3的装置中，10拷贝特定拷贝数的核酸和引物几乎位于96孔板的整个表面上。在中央处，0拷贝的阴性对照(NTC)位于两个位置，具有1,000个拷贝的核酸并且具有引物和扩增剂的阳性对照(PC)位于两个位置处。

使用图3的装置进行实时PCR。Ct(循环阈值(Threshold Cycle))值的测量结果如图4所示。平均Ct值为37.1。Ct值的标准偏差为1.00。CV值[(标准偏差/平均Ct值)×100]为2.70。在图4中，“UD”表示未检测到Ct值。

例如，在实时PCR中，首先，主混合物(可从Thermo Fisher Scientific Inc.获得，TAQMAN通用PCR主混合物)(1微升)、用于扩增特定碱基序列的正向引物和反向引物(各0.5nmol)和探针(0.4nmol)加入装置中的各样品。随后，可以使用实时PCR装置(可从ThermoFisher Scientific Inc.获得，QUANTSTUDIO 7FLEX)进行扩增和检测。

Ct值表示反应的荧光信号越过阈值线的时刻的循环数。由于Ct值线性降低至目标初始量的对数，可以基于Ct值计算DNA的初始拷贝数。

阈值线表示观察到从计算出的基线信号开始统计学显著增加时的信号水平，并且意为实时PCR反应的阈值。

因此，可以基于例如平均Ct值、Ct值的标准偏差、CV值[(标准偏差/平均Ct值)100]和[(Ct值(最大)－Ct值(最小))/2·平均Ct值]×100，来评估装置的平面内特性。

在图5的装置中，3拷贝特定拷贝数的核酸、引物和扩增剂几乎位于96孔板的整个表面上。在板中心处，0拷贝的阴性对照(NTC)位于四个位置。

使用图5的装置进行实时PCR，以测量Ct值并计算平均Ct值。当具有特定拷贝数(3拷贝)的孔的Ct值在平均Ct值的10％以内时，显示该孔为“ο”。当具有特定拷贝数(3拷贝)的孔的Ct值大于平均Ct值的10％时，显示该孔为“×”。结果示于图6。在图6中，“UD”表示未检测到Ct值。

结果是，96孔板外围四个孔处的Ct值大于平均Ct值的10％。表明外围的这四个孔不适用以低拷贝数。因此，可以判断是再次通过实时PCR进行校准，还是不将外围的这四个孔用于实际样品。

例如，通过使用参考图3至图6描述的装置进行测量一定时间段，可以获得Ct值的时间变化。因此，如同测试装置的平面内特性，当获得大于平均Ct值的10％的值作为孔的Ct值时，可以进行测试装置的校准或采取不使用该测试位置的措施。此外，由于布置的拷贝的特定拷贝数是绝对值，使用具有以相同特定拷贝数布置的拷贝的装置能够实现测试装置之间的性能比较。

在图7所示的96孔板中，布置了2拷贝、3拷贝、5拷贝、10拷贝、20拷贝、50拷贝和100拷贝的特定拷贝数的核酸、引物和扩增剂，并且中心处布置0拷贝的阴性对照(NTC)和500拷贝核酸的阳性对照(PC)和引物。

使用图7的装置进行实时PCR，以测量Ct值。图8中显示对垂直轴上的Ct值和在水平轴上的拷贝数作图的校准曲线。相关系数(R²)用作测试装置的性能指标。在这种情况下，相关系数是0.99。相关系数是指示数据与校准曲线的一致程度的值，并且反映校准曲线的线性。位于最外围的最少拷贝数(在此例中，2拷贝)可以充当平面内均匀性的指标。

在图9的装置中，特定拷贝数为2拷贝、10拷贝和100拷贝的核酸、引物和扩增剂位于96孔板的中心处，并且0拷贝阴性对照(NTC)和500拷贝核酸阳性对照(PC)以及引物位于中心处。位于最外围和从最外围向内包括一水平行和两垂直行的近似外围上的最小拷贝数(在此例中，2拷贝)可以充当平面内均匀性的指标。

在图10的装置中，特定拷贝数为2拷贝、10拷贝和100拷贝的核酸、引物和扩增剂位于96孔板中每个特定拷贝数的20个孔中，最少拷贝数(在此例中，2拷贝)位于最外围，并且特定拷贝数为100拷贝的孔也充当阳性对照(PC)。位于最外围的最少拷贝数(在此例中，2拷贝)可以充当平面内均匀性的指标。

在图11的装置中，特定拷贝数为3拷贝、5拷贝、10拷贝和100拷贝的核酸和引物位于在96孔板中，并且最少拷贝数(在此例中，2拷贝)位于最外围并呈十字形。0拷贝阴性对照(NTC)和500拷贝核酸阳性对照(PC)、引物和扩增剂被布置。

在图12的装置中，特定拷贝数为2拷贝、5拷贝、10拷贝和100拷贝的核酸以及引物位于96孔板中，并且最少拷贝数(在此例中，2拷贝)位于最外围。0拷贝阴性对照(NTC)和500拷贝核酸阳性对照(PC)以及引物位于中心。

在图13的装置中，特定拷贝数为2拷贝、10拷贝和100拷贝的核酸、引物和扩增剂位于384孔板的中心，并且最小拷贝数(在此例中，2拷贝)位于板其余部分。位于最外围和从最外围向内包括5水平行和8垂直行的近外围上的最少拷贝数(在此例中，2拷贝)可以充当平面内均匀性的指标。

通过使用参考图7和图9至图13描述的装置进行测量一定时间段，可以获得Ct值的时间变化。因此，如同测试装置的平面内特性，当获得偏离质量控制值的值时，可以进行测试装置的校准或采取不使用该测量位置的措施。此外，由于布置的拷贝的拷贝数是绝对值，因此使用具有以相同拷贝数布置的拷贝的装置能够实现测试装置之间的性能比较。

<装置制备方法>

下面将描述使用包括特定核酸细胞的装置制备方法。

本公开的装置制备方法包括：制备包含多个包含特定核酸的细胞和溶剂的细胞悬浮液的细胞悬浮液制备步骤；以液滴形式排出细胞悬浮液以使液滴相继着落在平板的孔中的液滴着落步骤；在液滴被排出后和液滴落入孔中之前用传感器对液滴中包含的细胞数计数的细胞数计数步骤；以及从孔中的细胞提取核酸的核酸提取步骤，优选包括计算细胞悬浮液制备步骤、液滴着落步骤和细胞数计数步骤中的核酸估计数的肯定性程度的步骤、输出步骤和记录步骤，并且根据需要进一步包括其他步骤。

<<细胞悬浮液制备方法>>

细胞悬浮液制备步骤是制备包含多个包含特定核酸的细胞和溶剂的细胞悬浮液的步骤。

溶剂是指用于分散细胞的液体。

细胞悬浮液的悬浮是指细胞分散地存在于溶剂中的状态。

制备是指制备操作。

-细胞悬浮液-

细胞悬浮液包含多个包含特定核酸的细胞和溶剂，优选包含添加剂，并且根据需要进一步包含其他组分。

所述多个包含特定核酸的细胞如上所述。

--溶剂--

溶剂没有具体限制并且可根据预期目的被适当选择。溶剂的实例包括水、培养液、分离液、稀释剂、缓冲剂、有机物溶解液、有机溶剂、聚合物凝胶溶液、胶体分散液、电解水溶液、无机盐水溶液、金属水溶液以及这些液体的混合液。这些溶剂中的一种可以单独使用，或这些溶剂中的两种以上可以组合使用。这些溶剂中，水和缓冲剂是优选的，并且水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和Tris-EDTA缓冲剂(TE)是更优选的。

--添加剂--

添加剂没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。添加剂的实例包括界面活化剂、核酸和树脂。这些添加剂中的一种可以单独使用，或这些添加剂中的两种以上可以组合使用。

界面活化剂可防止细胞相互聚集并提高连续加载稳定性。

界面活化剂没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。界面活化剂的实例包括离子界面活化剂和非离子界面活化剂。这些界面活化剂中的一种可以单独使用，或这些界面活化剂中的两种以上可以组合使用。在这些界面活化剂中，非离子界面活化剂是优选的，因为蛋白质不因非离子界面活化剂而被修饰或去活——尽管取决于非离子界面活化剂的添加量。

离子界面活化剂的实例包括脂肪酸钠、脂肪酸钾、α-磺基脂肪酸酯钠、直链烷基苯磺酸钠、烷基硫酸酯钠、烷基醚硫酸酯钠和α-烯烃磺酸钠。这些离子界面活化剂中的一种可以单独使用，或这些离子界面活化剂中的两种以上可以组合使用。在这些离子界面活化剂中，脂肪酸钠是优选的，十二烷基磺酸钠(SDS)是更优选的。

非离子界面活化剂的实例包括烷基糖苷、烷基聚氧乙烯醚(例如，BRIJ系列)、辛基酚乙氧基化物(例如、TRITON X系列、IGEPAL CA系列、NONIDET P系列和NIKKOL OP系列)、聚山梨酸酯(例如，TWEEN系列，如TWEEN 20)、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、烷基麦芽糖苷、蔗糖脂肪酸酯、糖苷脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯和脂肪酸单甘油酯。这些非离子界面活化剂中的一种可以单独使用，或这些非离子界面活化剂中的两种以上可以组合使用。在这些非离子界面活化剂中，聚山梨酯是优选的。

界面活化剂的含量没有具体限制，可以根据预期目的被适当选择，并且优选相对于细胞悬浮液的总量为0.001质量％以上但30质量％以下。当界面活化剂的含量为0.001质量％以上时，可以获得添加界面活化剂的效果。当界面活化剂的含量为30质量％以下时，可以抑制细胞的聚集，使得可以严格控制细胞悬浮液中的核酸分子数。

核酸没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择，只要该核酸不影响检测目标核酸的检测。核酸的实例包括ColE1 DNA。利用这种核酸，可以防止具有特定碱基序列的核酸附着至孔的壁表面。

树脂没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择。树脂的实例包括聚乙烯酰亚胺。

--其他材料--

其他材料没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。其他材料的实例包括交联剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、湿润剂和分散剂。

<细胞分散方法>

细胞分散方法没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择。该方法的实例包括诸如珠磨机的介质方法、诸如超声均质器的超声方法、以及诸如French压机的利用压差的方法。这些方法中的一种可以单独使用，或这些方法中的两种以上可以组合使用。在这些方法中，超声方法是更优选的，因为超声方法对细胞的损害低。利用介质方法，高压碎力可能会破坏细胞膜或细胞壁，并且介质可能会作为污染物混合。

<细胞筛选方法>

细胞筛选方法没有具体限制，并可以根据预期目的被适当选择。该方法的实例包括通过湿式分类、细胞分选器和过滤器进行的筛选。这些方法中的一种可以单独使用，或这些方法中的两种以上可以组合使用。在这些方法中，通过细胞分选器和过滤器进行的筛选是优选的，因为该方法对细胞的损害低。

优选通过测量细胞的细胞周期，估计细胞悬浮液中包含的细胞数中具有目标碱基序列的核酸数。

测量细胞周期意为定量由于细胞分裂导致的细胞数。

估计核酸数意为基于细胞数获得核酸的拷贝数。

要计数的无需是细胞数，而可以是目标碱基序列的数量。通常，认为目标碱基序列的数量等于细胞数是可靠的，因为作为被计数细胞而选择的细胞是各自包含一个目标碱基序列的细胞(＝1个目标碱基序列/细胞)，或者因为通过基因重组每个细胞中引入了一个目标碱基序列。然而，核酸复制发生在细胞中，以使细胞在特定循环中经历细胞分裂。细胞周期因细胞种类而异。通过从细胞悬浮液中提取预定量的溶液和测量多个细胞的周期，可以计算一个细胞中包含的目标碱基序列数的预期值和估计值的肯定性程度。这可以通过例如用流式细胞仪观察核染色细胞来实现。

肯定性程度是指在存在发生一些事件的可能性时事先预测的一个特定事件的发生概率。

计算是指通过计算操作得出所需值。

图14是对已经发生目标碱基序列复制的细胞的频率和荧光强度之间的关系的实例作图的图。如图14所示，基于目标碱基序列复制是否存在，两个峰出现在直方图上。因此，可以计算已经发生目标碱基序列复制的细胞的存在百分比。基于该计算结果，可以计算一个细胞中包含的平均目标碱基序列数。目标碱基序列的估计数可以通过计数的细胞数乘以所获得的平均目标碱基序列数来计算。

优选在制备细胞悬浮液之前进行控制细胞周期的操作。通过将细胞均匀地制备为发生复制前的状态或发生复制后的状态，可以基于细胞数更准确地计算目标碱基序列的数量。

优选计算估计的特定拷贝数的肯定性程度(概率)。通过计算肯定性程度(概率)，可以基于这些值将肯定性程度以方差或标准偏差表示和输出。当将叠加多个因子的影响时，可以采用常用标准偏差的平方和的平方根。例如，排出细胞数的正答率(correct answerpercentage)、细胞中的DNA数以及排出细胞着落在孔中的着落比可用作所述因子。可以选择一个高影响因子用于计算。

<<液滴着落步骤>>

液滴着落步骤是以液滴形式排出细胞悬浮液以使液滴相继着落在平板的孔中的步骤。

液滴是指通过表面张力形成的液体聚集体。

排出意为使细胞悬浮液以液滴的形式飞行。

“相继”是指“按顺序”。

着落是指使液滴到达孔。

作为排出单元，可以适当地使用被配置以液滴形式排出细胞悬浮液的单元(以下也称为“排出头”)。

以液滴形式排出细胞悬浮液的方法的实例包括基于喷墨法的按需方法和连续方法。在这些方法中，在连续方法的情况下，存在如下趋势：所用细胞悬浮液的死体积高，这是由于例如直到排出状态变得稳定为止的空排、液滴量的调、和甚至在孔之间转移期间的液滴持续形成。在本公开中，就细胞数调节而言，优选抑制由死体积引起的影响。因此，在两种方法中，按需方法是更优选的。

按需方法的实例包括多种已知的方法，如对液体施加压力以排出液体的压力施加法、通过加热引起膜沸腾而排出液体的热法、以及通过静电吸引来吸引液滴以形成液滴的静电法。在这些方法中，基于以下原因，压力施加法是优选的。

在静电法中，需要以面对排出单元的方式布置电极，该排出单元被配置以保持细胞悬浮液和形成液滴。在装置制备方法中，将用于接收液滴的平板布置在面对位置处。因此，优选不设置电极，以增加平板配置的纬度。

在热法中，有局部加热集中可影响作为生物材料的细胞的风险，以及加热器部分结垢的风险。热影响取决于所含部件或平板的用途。因此，无需一概排除热法。然而，压力施加法是优选的，因为压力施加法的加热器部分结垢风险低于热法。

压力施加法的实例包括利用压电元件向液体施加压力的方法、以及利用诸如电磁阀的阀门施加压力的方法。图15A至图15C中示例了可用于排出细胞悬浮液的液滴的液滴生成装置的配置实例。

图15A是示例电磁阀型排出头的实例的实例图。电磁阀型排出头包括电动机13a、电磁阀112、液体室11a、细胞悬浮液300a和喷嘴111a。

作为电磁阀型排出头，例如，可以适当地使用可从Tech Elan LLC获得的分配器。

图15B是示例压电型排出头的实例的实例图。压电型排出头包括压电元件13b、液体室11b、细胞悬浮液300b和喷嘴111b。

作为压电型排出头，例如，可以适当地使用可从Cytena GmbH获得的单细胞打印机。

可以使用这些排出头中的任意种。然而，通过电磁阀的压力施加法不能反复高速形成液滴。因此，为了提高板生产通量，优选使用压电法。使用常见压电元件13b的压电型排出头可能由于沉降而引起细胞浓度不均匀，或者可能具有喷嘴堵塞。

因此，更优选的配置是图15C所示的配置。图15C是使用图15B所示的压电元件的压电型排出头的变型实例的实例图。图15C的排出头包括压电元件13c、液体室11c、细胞悬浮液300c和喷嘴111c。

在图15C的排出头中，当从未示例的控制装置向压电元件13c施加电压时，施加图纸水平方向上的压缩应力。这可使膜在图纸上下方向上变形。

按需方法之外的任何其他方法的实例包括用于连续形成液滴的连续方法。当通过加压从喷嘴推出液滴时，连续方法利用压电元件或加热器施加有规律的波动，使得可以连续地形成微小的液滴。此外，连续方法可以通过以施加电压来控制液滴的排出方向，而选择是使飞行的液滴落入孔中还是将液滴回收在回收单元中。这种方法被用于细胞分选器或流式细胞仪中。例如，可以使用可从Sony Corporation获得的名为CELL SORTER SH800Z的装置。

图16A是示例对施加到压电元件的电压的实例作图的实例图。图16B是示例对施加到压电元件的电压的另一实例作图的实例图。图16A对用于形成液滴的驱动电压作图。根据电压的高或低水平(V_A、V_B和V_C)，可以形成液滴。图16B对用于在不排出液滴的情况下搅拌细胞悬浮液的电压作图。

在不排出液滴期间，输入不高到足以排出液滴的多个脉冲能够使液体室内的细胞悬浮液被搅拌，使得可以抑制细胞沉降引起的浓度分布发生。

下面将描述可以在本公开中使用的排出头的液滴形成操作。

通过向压电元件上形成的上下电极施加脉冲电压，排出头可以排出液滴。图17A至图17C是示例对应时刻的液滴状态的实例图。

在图17A中，首先，在向压电元件13c施加电压后，膜12c突然变形以在液体室11c中保持的细胞悬浮液和膜12c之间产生高压。该压力将液滴通过喷嘴部向外推出。

接下来，如图17B所示，在直到压力向上松弛为止的一段时间内，液体通过喷嘴部被连续推出，以使液滴增长。

最后，如图17C所示，当膜12c返回到初始状态时，细胞悬浮液和膜12c之间的界面附近的液体压力降低，从而形成液滴310’。

在装置制备方法中，形成有孔的平板被固定在可移动平台上，并通过驱动平台与由排出头形成液滴的组合，液滴相继着落在凹部中。这里描述了连同移动平台一起移动平板的方法。然而，自然，移动排出头也可以。

平板没有具体限制，可以使用生物领域中常用的且形成有孔的板。

平板中的孔数没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择。孔数可以是单数或复数。

图18是示例分配装置400的实例的示意图，该分配装置400被配置以使液滴相继着落到平板的孔中。

如图18所示，被配置以使液滴着落的分配装置400包括液滴形成装置401、平板700、平台800和控制装置900。

在分配装置400中，平板700被布置在可移动平台800上。平板700具有多个孔710(凹部)，从液滴形成装置401的排出头排出的液滴310着落在孔710中。控制装置900被配置以移动平台800和控制液滴形成装置401的排出头与各孔710之间的相对位置关系。这能够使包含荧光染色细胞350的液滴310从液滴形成装置401的排出头被相继地排出到孔710中。

控制装置900可以被配置以包括例如CPU、ROM、RAM和主存储器。在这种情况下，控制装置900的各种功能可以通过记录在例如ROM中、被读出到主存储器中并由CPU执行的程序来实现。但是，控制装置900的部分或全部可以仅通过硬件来实现。可选地，控制装置900可以被配置具有例如物理上的多个装置。

当使细胞悬浮液落入孔中时，优选使将要排出到孔中的液滴以获得多个水平的方式着落。

多个水平是指充当标准的多个参考。

作为多个水平，优选的是，孔中多个包括特定核酸的细胞具有预定的浓度梯度。有了浓度梯度，核酸可以有利地用作校准曲线的试剂。可以利用由传感器计数的值来控制所述多个水平。

作为平板，优选使用例如1孔微管、8连管、96孔板和384孔板。当孔数为复数时，可以将相同数量的细胞分配到这些板的孔中，或者也可以将不同水平的细胞数分配到孔中。可以有一个孔不包含细胞。具体地，为了制备用于评估被配置以定量评估核酸量的实时PCR装置或数字PCR装置的板，优选分配多个水平的核酸数。例如，可想到制备其中以7个水平分配细胞(或核酸)的板，即约1个细胞、2个细胞、4个细胞、8个细胞、16个细胞、32个细胞和64个细胞。利用这种板，可以检查例如实时PCR装置或数字PCR装置的定量性、线性和评估下限。

<<细胞数计数步骤>>

细胞数计数步骤是在液滴排出之后和液滴落入孔之前，利用传感器对液滴中包含的细胞数计数的步骤。

传感器是指被配置以通过利用一些科学原理将自然现象或人工产物的机械、电磁、热、声学或化学性质或由这些性质指示的空间信息/时间信息转换为信号(作为容易被人或机器处理的不同介质)的装置。

计数是指对数量计数。

细胞数计数步骤没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择，只要细胞数计数步骤在液滴排出之后和液滴落在孔中之前利用传感器计数液滴中包含的细胞数。细胞数计数步骤可以包括在排出之前观察细胞的操作和在着落之后计数细胞的操作。

为了计数在液滴排出之后和液滴落入孔之前液滴中包含的细胞数，优选在液滴正处于在孔开口上方的位置和预期液滴将无失误地进入板上的孔中的时刻观察液滴中的细胞。

用于观察液滴中的细胞的方法的实例包括光学检测方法和电学或磁学检测方法。

-光学检测方法-

参考图19、参考图23和图24，下面将描述光学检测方法。

图19是示例液滴形成装置401的实例的实例图。图23和图24是示例液滴形成装置401A和401B的其他实例的实例图。如图19所示，液滴形成装置401包括排出头(液滴排出单元)10、驱动单元20、光源30、光接收元件60和控制单元70。

在图19中，通过在用特定色素对细胞荧光染色后将细胞分散在预定溶液中而获得的液体用作细胞悬浮液。通过用具有特定波长并从光源发射的光照射由排出头形成的液滴，和利用光接收元件检测由细胞发出的荧光，来计数细胞。在此，除了利用荧光色素对细胞进行染色的方法之外，还可以利用细胞中初始包含的分子发出的自发荧光。可选地，可以预先将用于产生荧光蛋白的基因(例如，GFP(绿色荧光蛋白))引入细胞，以使细胞可以发射荧光。

光照射意味着施加光。

排出头10包括液体室11、膜12和驱动元件13，并且可以以液滴形式排出悬浮荧光染色细胞350的细胞悬浮液300。

液体室11是液体保持部，其被配置以保持悬浮有荧光染色细胞350的细胞悬浮液300。在液体室11的下表面中形成有作为通孔的喷嘴111。液体室11可以由例如金属、硅或陶瓷形成。荧光染色细胞350的实例包括被荧光色素染色的无机粒子和有机聚合物粒子。

膜12是固定在液体室11的上端部分的膜状部件。膜12的平面形状可以是例如圆形，但是也可以是例如椭圆形或四边形。

驱动元件13被设置在膜12的上表面上。驱动元件13的形状可以被设计以与膜12的形状匹配。例如，在膜12的平面形状为圆形的情况下，优选设置圆形驱动元件13。

通过从驱动单元20向驱动元件13提供驱动信号，可使膜12振动。膜12的振动可使包含荧光染色细胞350的液滴310通过喷嘴111排出。

当将压电元件用作驱动元件13时，例如，驱动元件13可以具有通过以下获得的结构：为压电材料的上表面和下表面提供电极，该电极之间施加电压。在这种情况下，当驱动单元20在压电元件的上下电极之间施加电压时，在图纸的水平方向上施加压缩应力，使得膜12可以在图纸的上下方向振动。作为压电材料，例如，可以使用锆酸钛酸铅(PZT)。另外，可以使用各种压电材料，如氧化铁铋、金属铌酸盐、钛酸钡或通过向这些材料添加金属或不同氧化物而获得的材料。

光源30被配置以用光L照射飞行的液滴310。飞行状态是指从液滴310从液滴排出单元10排出到液滴310着落在着落目标上为止的状态。飞行的液滴310在向液滴310被光L照射的位置处具有近似球形形状。光L的光束形状为近似圆形。

优选的是，光L的光束直径是液滴310的直径的大约10倍至100倍。这是为了确保即使在液滴310的位置波动时液滴310也无失误地被来自光源30的光L照射。

但是，如果光L的光束直径远大于液滴310的直径的100倍，则不是优选的。这是因为照射液滴310的光的能量密度降低，从而降低在充当激发光的光L下发出的荧光Lf的光量，使得光接收元件60检测荧光Lf。

光源30发出的光L优选为脉冲光。优选使用例如固态激光器、半导体激光器和染料激光器。当光L是脉冲光时，脉冲宽度优选为10微秒以下，更优选为1微秒以下。每单位脉冲的能量优选大约0.1微焦耳以上，更优选1微焦耳以上，尽管在很大程度上取决于光学系统，如是否存在聚光。

光接收元件60被配置以，在荧光染色细胞350被包含在飞行液滴310中时，接收荧光染色细胞350在吸收作为激发光的光L后发出的荧光Lf。由于荧光Lf从荧光染色细胞350向所有方向发射，光接收元件60可以被布置在可接收荧光Lf的任意位置。在此，为了提高对比度，优选将光接收元件60布置在不会发生由光源30发出的光L直接入射到光接收元件60的位置处。

光接收元件60没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当地选择，只要光接收元件60是能够接收由荧光染色细胞350发出的荧光Lf的元件。这样的光学传感器是优选的：被配置以在用具有特定波长的光照射液滴时，接收来自液滴中的细胞的荧光。光接收元件60的实例包括一维元件，如光电二极管和光电传感器。当需要高灵敏度测量时，优选使用光电倍增管和Avalanche光电二极管。作为光接收元件60，可以使用二维元件，如CCD(电荷联接装置)、CMOS(互补金属氧化物半导体)和栅门CCD(gate CCD)。

由荧光染色细胞350发出的荧光Lf比由光源30发出的光L弱。因此，可以在光接收元件60的前台(光接收表面侧)安装被配置以缩减光L的波长范围的滤光器。这能够使光接收元件60获得荧光染色细胞350的极高对比度的图像。作为滤光器，例如，可以使用陷波滤光器，其被配置以缩减包括光L的波长在内的特定波长范围。

如上所述，光源30发出的光L优选为脉冲光。光源30发出的光L可以是连续振荡的光。在这种情况下，优选控制光接收元件60以能够在飞行的液滴310被连续振荡的光照射的时刻接收光，以使光接收元件60接收荧光Lf。

控制单元70具有控制驱动单元20和光源30的功能。控制单元70还具有以下功能：获得基于由光接收元件60接收的光量的信息和对液滴310中包含的荧光染色细胞350的数量计数(数量为零的情况也被包括在内)。参考图20至图22，以下将描述包括控制单元70的操作的液滴形成装置401的操作。

图20是示例图19的液滴形成装置的控制单元的硬件区块的图。图21是示例图19的液滴形成装置的控制单元的功能区块的图。图22是示例液滴形成装置的操作的实例的流程图。

如图20所示，控制单元70包括CPU 71、ROM 72、RAM 73、I/F 74和总线75。CPU 71、ROM72、RAM 73和I/F 74经由总线75彼此联接。

CPU 71被配置以控制控制单元70的各种功能。充当存储单元的ROM 72被配置以存储将由CPU 71执行以控制控制单元70的各种功能和各种信息的程序。充当存储单元的RAM 73被配置以用作例如CPU 71的工作区域。RAM 73还被配置以能够存储预定信息以暂时一段时间。I/F 74是被配置以将液滴形成装置401联接到例如另一装置的接口。液滴形成装置401可以经由I/F 74联接至例如外部网络。

如图21所示，控制单元70包括排出控制单元701、光源控制单元702和细胞数计数单元(细胞数感测单元)703作为功能区块。

参考图21和图22，对液滴形成装置401计数的细胞数(粒子数)进行说明。

在步骤S11中，控制单元70的排出控制单元701将排出指令输出至驱动单元20。当从排出控制单元701接收到排出指令后，驱动单元20将驱动信号提供给驱动元件13以使膜12振动。膜12的振动使得包含荧光染色细胞350的液滴310通过喷嘴111排出。

接下来，在步骤S12中，与液滴310的排出同步(与驱动单元20向液滴排出单元10提供的驱动信号同步)，控制单元70的光源控制单元702向光源30输出用于光照指令。根据该指示，打开光源30以用光L照射飞行的液滴310。

在此，光源30发光不是与液滴排出单元10排出液滴310(驱动部20向液滴排出单元10提供驱动信号)同步，而是与液滴310已经飞行到预定位置的时刻同步，以使液滴310被光L照射。即，光源控制单元702控制光源30在液滴310从液滴排出单元10排出后(从驱动单元20向液滴排出单元10提供驱动信号后)延迟预定时间段时发光。

例如，可以预先测量在驱动信号被提供给液滴排出单元10时将排出的液滴310的速度v。基于测量的速度v，可以计算从液滴310被排出到液滴310到达预定位置为止所花费的时间t，以便光源30的光照射时刻可以从驱动信号被提供给液滴排出单元10的时刻后延迟时间段t。这使得能够良好地控制发光，并且能够确保液滴310无失误地被来自光源30的光照射。

接下来，在步骤S13中，控制单元70的细胞数计数单元703基于来自光接收元件60的信息，对液滴310中包含的荧光染色细胞350的数量计数(数量为零的情况也被包括在内)。来自光接收元件60的信息指示荧光染色细胞350的亮度(光量)和面积值。

细胞数计数单元703可以通过例如将光接收元件60所接收的光量与预定阈值进行比较，来对荧光染色细胞350的数量计数。在这种情况下，可以使用一维元件或可以使用二维元件作为光接收元件60。

当将二维元件用作光接收元件60时，细胞数计数单元703可以利用进行图像处理的方法，以基于从光接收元件60获得的二维图像来计算荧光染色细胞350的亮度或面积。在这种情况下，细胞数计数单元703可以通过以下对荧光染色细胞350的数量计数：通过图像处理来计算荧光染色细胞350的亮度或面积值，和将所计算的亮度或面积值与预定阈值进行比较。

荧光染色细胞350可以是细胞或染色的细胞。染色细胞是指被荧光色素染色的细胞或可以表达荧光蛋白的细胞。

染色细胞的荧光色素没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。荧光色素的实例包括荧光素、若丹明、香豆素、芘类、青色素和偶氮色素。这些荧光色素中的一种可以单独使用，或这些荧光色素中的两种以上可以组合使用。在这些荧光色素中，曙红、伊文思蓝、台盼蓝、若丹明6G、若丹明B和若丹明123是更优选的。

荧光蛋白的实例包括Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP和KikumeGR。这些荧光蛋白中的一种可以单独使用，或这些荧光蛋白中的两种以上可以组合使用。

以此方式，在液滴形成装置401中，驱动单元20向液滴排出单元10提供驱动信号，该液滴排出单元10保持悬浮有荧光染色细胞350的细胞悬浮液300，以使液滴排出单元10排出包含荧光染色细胞350的液滴310，并且飞行的液滴310被来自光源30的光L照射。然后，飞行液滴310中包含的荧光染色细胞350在充当激发光的光L下发射荧光Lf，并且光接收元件60接收荧光Lf。然后，细胞数计数单元703基于来自光接收元件60的信息，对飞行液滴310中包含的荧光染色细胞350的数量计数。

也就是说，液滴形成装置401被配置以当场实际观察飞行液滴310中包含的荧光染色细胞350的数量。在计数荧光染色细胞350的数量时，这可以实现比迄今为止获得的更好的准确度。另外，由于飞行液滴310中所含的荧光染色细胞350被光L照射并且发出荧光Lf，该荧光Lf将被光接收元件60接收，能够得到具有高对比度的荧光染色细胞350的图像，并且可以减少荧光染色细胞350的数量错误计数的发生。

图23是示例图19的液滴形成装置401的变型实例的实例图。如图23所示。液滴形成装置401A与液滴形成装置401(参见图19)的不同之处在于，在光接收元件60的前台配置有反射镜40。关于与已经描述的实施方式中相同的部件的描述可省略。

在液滴形成装置401A中，将反射镜40布置在光接收元件60的前台可以提高光接收元件60的布局的自由度。

例如，在图19的布局中，当喷嘴111和着落目标彼此靠近时，存在着落目标与液滴形成装置401的光学系统(具体地，光接收元件60)之间发生干涉的风险。利用图23的布局，可以避免干扰的发生。

即，通过改变如图23所示的光接收元件60的布局，可以缩小液滴310所着落的着落目标与喷嘴111之间的距离(间隙)，并且抑制在错误位置上的着落。由此，可以提高分配准确度。

图24是示例图19的液滴形成装置401的另一变型实例的实例图。如图24所示，液滴形成装置401B与液滴形成装置401(参见图19)的不同之处在于，除了被配置以接收由荧光染色细胞350发出的荧光Lf₁光接收元件60之外，还设置有光接收元件61，其被配置以接收由荧光染色单元350发出的荧光Lf₂。关于与已经描述的实施方式中相同的部件的描述可省略。

荧光Lf₁和Lf₂表示从荧光染色细胞350向所有方向发出的荧光的部分。可以将光接收元件60和61布置在可以接收到由荧光染色细胞350向不同方向发出的荧光的任意位置处。可将三个或更多个光接收元件设置在可接收到由荧光染色细胞350向不同方向发出的荧光的位置处。光接收元件可以具有相同的规格或不同的规格。

在一个光接收元件的情况下，当飞行的液滴310中包含多个荧光染色细胞350时，存在细胞数计数单元703可能错误地计数液滴310中包含的荧光染色细胞350的数量的风险(可能发生计数错误的风险)，因为荧光染色细胞350可能彼此重叠。

图25A和图25B是示例在飞行的液滴中包含两个荧光染色细胞的情况的图。例如，如图25A所示，可能存在荧光染色细胞350₁和350₂彼此重叠的情况，或者如图25B所示，可能存在荧光染色细胞350₁和350₂不彼此重叠的情况。通过设置两个以上的光接收元件，可以减少荧光染色细胞重叠的影响。

如上所述，细胞数计数单元703可以通过以下对荧光粒子的数量计数：通过图像处理计算荧光粒子的亮度或面积值，和将计算出的亮度或面积值与预定阈值进行比较。

当安装两个以上的光接收元件时，通过采用指示从这些光接收元件获得的亮度值或面积值中的最大值的数据，可以抑制计数错误的发生。对此将参考图26进行更详细地描述。

图26是对粒子不彼此重叠时的亮度Li与实际测量的亮度Le之间的关系的实例作图的图。如图26所示，当液滴中的粒子不彼此重叠时，Le等于Li。例如，在假设一个细胞的亮度为Lu的情况下，当每个液滴的细胞数为1时，Le等于Lu，并且当每个液滴的细胞数为n(n：自然数)时，Le等于nLu。

然而，实际上，当n为2以上时，由于粒子可能彼此重叠，实际测量的亮度为Lu≤Le≤nLu(图26中的半色调点状网格部分)。因此，在每个液滴的细胞数为n的情况下，可以将阈值设定为例如(nLu-Lu/2)≤阈值＜(nLu+Lu/2)。当安装多个光接收元件时，通过采用从这些光接收元件获得的数据之中的最大值，可以抑制计数错误的发生。可以采用面积值代替亮度。

当安装多个光接收元件时，可以根据用于基于将获得的多个形状数据来估计细胞数量的算法来判断细胞的数量。

可以理解，通过被配置以接收由荧光染色细胞350向不同方向发出的荧光的多个光接收元件，液滴形成装置401B可以进一步减少荧光染色细胞350的数量的错误计数发生频率。

图27是示例图19的液滴形成装置401的另一变型实例的实例图。如图27所示，液滴形成装置401C与液滴形成装置401(参见图19)的不同之处在于，设置液滴排出单元10C而代替液滴排出单元10。关于与已经描述的实施例中相同的部件的描述可以省略。

液滴排出单元10C包括液体室11C、膜12C和驱动元件13C。液体室11C在顶部具有大气暴露部115，该大气暴露部115被配置以使液体室11C的内部暴露于大气，并且可以通过大气暴露部115将混在细胞悬浮液300中的气泡排空。

膜12C是固定在液体室11C的下端的膜状构件。在膜12C的大致中央处形成有作为通孔的喷嘴121，并且膜12C的振动使液体室11C中保持的细胞悬浮液300以液滴310的形式通过喷嘴121排出。由于液滴310通过膜12C的振动的惯性而形成，可以排出细胞悬浮液300——即使在细胞悬浮液300具有高表面张力(高粘度)时。膜12C的平面形状可以是例如圆形，但是也可以是例如椭圆形或四边形。

膜12C的材料没有具体限制。然而，如果膜12C的材料非常柔性，则膜12C容易发生振动，并且不容易能够在不需要排出时立即停止振动。因此，具有一定硬度的材料是优选的。作为膜12C的材料，例如，可以使用金属材料、陶瓷材料和具有一定硬度的聚合物材料。

具体地，当细胞用作荧光染色细胞350时，膜的材料优选是与细胞或蛋白质的粘附性低的材料。总体上，细胞的粘附性被称取决于材料相对于水的接触角。当材料具有高亲水性或高疏水性时，该材料与细胞的粘附性低。作为具有高亲水性的材料，可以使用各种金属材料和陶瓷(金属氧化物)。作为具有高疏水性的材料，例如，可以使用氟树脂。

这种材料的其他实例包括不锈钢、镍、和铝、以及二氧化硅、氧化铝和氧化锆。另外，可想到通过涂覆材料的表面来降低细胞粘附性。例如，可以用上述金属或金属氧化物材料涂覆材料的表面，或用模拟细胞膜的合成磷脂聚合物(例如，LIPIDURE，可从NOF Corporation获得)涂覆材料的表面。

喷嘴121优选形成为在膜12C的大致中央处具有大致正圆形的通孔。在这种情况下，喷嘴121的直径没有具体限制，但是优选是荧光染色细胞350的尺寸的两倍以上，以防止喷嘴121被荧光染色细胞350堵塞。当荧光染色细胞350例如是动物细胞，特别是人细胞时，喷嘴121的直径根据所用的细胞优选为10微米以上，更优选为100微米以上，因为人细胞通常具有约5微米至50微米的尺寸。

另一方面，当液滴极大时，难以实现形成微小液滴的目的。因此，喷嘴121的直径优选为200微米以下。即，在液滴排出单元10C中，喷嘴121的直径通常在10μm至200μm的范围内。

驱动元件13C形成在膜12C的下表面上。驱动元件13C的形状可以被设计以与膜12C的形状匹配。例如，当膜12C的平面形状为圆形时，优选在喷嘴121的周围形成具有环形(环状)平面形状的驱动元件13C。用于驱动驱动元件13C的驱动方法可以与用于驱动驱动元件13的驱动方法相同。

驱动单元20可以选择性地(例如，交替地)向驱动元件13C施加排出波形——用于使膜12C振动以形成液滴310，和搅拌波形——用于使膜12C振动到不形成液滴310为止的程度。

例如，排出波形和搅拌波形都可以是矩形波，并且可以将用于搅拌波形的驱动电压设置为低于用于排出波形的驱动电压。这使得可以不因施加搅拌波形而形成液滴310。即，能够根据驱动电压高低来控制膜12C的振动状态(振动度)。

在液滴排出单元10C中，驱动元件13C形成在膜12C的下表面上。因此，当通过驱动元件13C使膜12振动时，能够在液体室11C内产生从下部朝向上部的方向的流动。

这里，荧光染色细胞350从较低位置向上移动，以在液体室11C中产生对流，从而搅拌包含荧光染色细胞350的细胞悬浮液300。液体室11C中从下部到上部的流动使沉降的聚集的荧光染色细胞350均匀地分散在液体室11C中。

即，通过将排出波形施加到驱动元件13C和控制膜12C的振动状态，驱动单元20能够使液体室11C中保持的细胞悬浮液300以液滴310的形式通过喷嘴121排出。此外，通过将搅拌波形施加到驱动元件13C和控制膜12C的振动状态，驱动单元20可以搅拌液体室11C中保持的细胞悬浮液300。在搅拌期间，没有液滴310通过喷嘴121排出。

以此方式，在没有液滴310形成的情况下搅拌细胞悬浮液300可以防止荧光染色细胞350在膜12C上沉降和聚集，并且可以将荧光染色细胞350分散在细胞悬浮液300中而无不均匀。这可抑制喷嘴121堵塞以及液滴310中的荧光染色细胞350的排出数量变异。这使得可以长时间持续以液滴310形式稳定地排出包含荧光染色细胞350的细胞悬浮液300。

在液滴形成装置401C中，气泡可混入液体室11C中的细胞悬浮液300中。同样在这种情况下，在大气暴露部115被设置在液体室11C的顶部的情况下，液滴形成装置401C可以通过大气暴露部115将细胞悬浮液300中混合的气泡排空到外部空气。这使得能够连续稳定地形成液滴310，而不需要处置大量液体以排空气泡。

即，当在喷嘴121附近的位置存在混合气泡时或当膜12C上存在多个混合气泡时，会影响排出状态。因此，为了长时间稳定形成液滴，需要消除混合气泡。通常，存在于膜12C上的混合气泡自主地或通过膜12C的振动向上移动。由于液体室11C设置有大气暴露部115，混合的气泡可以通过大气暴露部115排出。这使得可以防止空排发生——即使在液体室11C中混入气泡时，能够实现液滴310的连续和稳定形成。

在不形成液滴的时刻，可以使膜12C振动至不形成液滴为止的程度，以主动地使气泡在液体室11C中向上移动。

-电学或磁学检测方法-

在电学或磁学检测方法的情况下，如图28所示，被配置以对细胞数计数的线圈200作为传感器被安装在排出头的紧下方，该排出头被配置将细胞悬浮液以液滴310'的形式从液体室11'排出到平板700'上。细胞涂有磁珠，该磁珠用特定蛋白质修饰并且可以粘附至细胞。因此，当磁珠粘附的细胞通过线圈时，产生感应电流以能够实现飞行液滴中是否存在细胞的检测。通常，细胞在细胞表面上具有细胞特异性蛋白质。用可以粘附到该蛋白质的抗体修饰磁珠，可以使磁珠能够粘附到细胞。作为这种磁珠，可以使用现成的产品。例如，可以使用DYNABEADS(注册商标)，可从Veritas Corporation获得。

<在排出前观察细胞的操作>

在排出前观察细胞的操作可以通过例如图29所示的计数通过微流路径250的细胞350’的方法或图30所示的捕获排出头的喷嘴部附近的部分的图像的方法来进行。图29的方法是在细胞分选装置中使用的方法，并且例如可以使用可从Sony Corporation获得的CELLSORTER SH800Z。在图29中，光源260将激光发射到微流路径250中，并且检测器255检测通过聚光透镜265的散射光或荧光。这使得能够在形成液滴时区分细胞的存在与否或细胞的种类。基于已经通过微流路径250的细胞数，该方法能够估计已经着落在预定孔中的细胞数。

作为图30所示的排出头10’，可以使用可从Cytena GmbH获得的单细胞打印机。在图30中，可以通过以下估计着落在预定孔中的细胞数：通过在排出之前通过图像捕获单元255'经由透镜265'捕获喷嘴部附近的部分的图像和基于捕获的图像估计喷嘴部附近存在的细胞350”已被排出，或通过基于排出前后捕获的图像之间的差异估计被认为已经排出的细胞数。图30的方法是更优选的，因为该方法能够实现按需液滴形成，而图29的计数已通过微流路径的细胞的方法连续地产生液滴。

<在着落后计数细胞的操作>

在着落后计数细胞的操作可以通过以下方法进行：使用例如荧光显微镜观察平板中的孔来检测荧光染色细胞的方法。该方法被描述于例如Sangjun等，PLoS One，第6(3)卷，e17455。

在排出液滴之前或着落之后观察细胞的方法具有下述问题。根据将制备的平板种类，最优选观察正在被排出的液滴中的细胞。在排出前观察细胞的方法中，基于已通过流路的细胞数和排出之前(以及排出之后)的图像观察来计数被认为已着落的细胞数。因此，不确认细胞是否已经实际被排出，并且可能发生意外错误。例如，可能存在如下情况：由于喷嘴部被污染，液滴没有被适当地排出，而是附着至喷嘴板，从而没有使液滴中的细胞着落。此外，可能会出现以下问题：细胞滞留在喷嘴部的狭窄区域中，或者排出操作导致细胞超出设想地移动并移到观察范围之外。

用于检测平板上着落后的细胞的方法也存在问题。首先，需要制备可以用显微镜观察的板。作为可以被观察的板，通常使用具有透明平坦底表面的板，特别是具有由玻璃形成的底表面的板。然而，存在这种特殊板与普通孔的使用不兼容的问题。此外，当细胞数大时，如几十个细胞，存在由于细胞可能彼此重叠而不能正确计数的问题。因此，优选除了在液滴排出之后和液滴落在孔中之前利用传感器和细胞数计数单元计数对液滴中所含的细胞数以外，还进行在排出前观察细胞的操作和在着落后计数细胞的操作。

作为光接收元件，可以使用包括一个或少数个光接收部分的光接收元件，如光电二极管、Avalanche光电二极管和光电倍增管。另外，可以使用包括二维阵列形式的光接收元件的二维传感器，如CCD(电荷联接装置)、CMOS(互补金属氧化物半导体)和栅门CCD。

当使用包括一个或少数个光接收部分的光接收元件时，可以想到使用预先制备的校准曲线基于荧光强度来判断所含细胞数。在此，飞行液滴中是否存在细胞的二元检测是常用的。当细胞悬浮液以细胞浓度足够低使得液滴中几乎只包含1或0个细胞的状态排出时，因此通过二元检测可获得足够准确的计数。在细胞悬浮液中随机分布细胞的前提下，认为飞行液滴中的细胞数符合泊松分布，并且液滴中包含两个以上细胞的概率P(>2)由下式(1)表示。图31是对概率P(＞2)与平均细胞数之间的关系作图的图。在此，λ是表示液滴中的平均细胞数并且细胞悬浮液中的细胞浓度乘以排出的液滴体积而得到的值。

P(>2)＝1-(1+λ)×e^-λ---式(1)

<＜<计算细胞悬浮液制备步骤、液滴着落步骤和细胞数计数步骤中的核酸估计数的肯定性程度的步骤>>>

计算细胞悬浮液制备步骤、液滴着落步骤和细胞数计数步骤中的核酸估计数的肯定性程度的步骤是计算细胞悬浮液制备步骤、液滴着落步骤以及细胞数计数步骤每一个步骤中的肯定性程度的步骤。

核酸估计数的肯定性程度可以以与计算细胞悬浮液制备步骤中的肯定性程度相同的方式计算。

计算肯定性程度的时刻可以在细胞数计数步骤的下一步骤中集中进行，或可以在细胞悬浮液制备步骤、液滴着落步骤和细胞数计数步骤每一个步骤结束时进行，以使肯定性程度在细胞数计数步骤的下一步骤中加和。换句话说，这些步骤中的肯定性程度仅需在进行加和前的任意时刻被计算。

<<输出步骤>>

输出步骤是输出粒子数计数单元基于传感器测量的检测结果对落在孔中的细胞悬浮液中所包含的细胞数计数的步骤。

计数值是指粒子数计数单元基于传感器测量的检测结果计算出的孔中包含的细胞数。

输出意为在接收到输入后，以电子信息形式向充当计数结果存储单元的外部服务器发送由诸如电动机、通信装置和计算器的装置计数的值，或者将计数值打印作为打印物。

在输出步骤中，通过在板制备期间通过观察或估计板各孔中的细胞数或核酸数而获得的观察值或估计值被输出到外部存储单元。

输出可以与细胞数计数步骤同时执行，或者可以在细胞数计计数步骤之后执行。

<<记录步骤>>

记录步骤是记录在输出步骤中输出的观察值或估计值的步骤。

记录步骤可以由记录单元适当地进行。

记录可以与输出步骤同时进行，或者可以在输出步骤之后进行。

记录不仅意为将信息提供给记录介质，而且还意为将信息存储在存储单元中。

<<核酸提取步骤>>

核酸提取步骤是从孔中的细胞提取核酸的步骤。

提取意为破坏例如细胞膜和细胞壁以拣出核酸。

作为从细胞提取核酸的方法，已知在90℃至100℃下对细胞进行热处理的方法。通过在90℃以下的热处理，有DNA不可被提取的可能。通过100℃以上的热处理，有DNA可能分解的可能。在此，优选在添加界面活化剂的情况下进行热处理。

界面活化剂没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。界面活化剂的实例包括离子界面活化剂和非离子界面活化剂。这些界面活化剂中的一种可以单独使用，或这些界面活化剂中的两种以上可以组合使用。在这些界面活化剂中，非离子界面活化剂是优选的，因为尽管取决于非离子界面活化剂的添加量，蛋白质不被非离子界面活化剂修饰和去活。

离子界面活化剂的实例包括脂肪酸钠、脂肪酸钾、α-磺基脂肪酸酯钠、直链烷基苯磺酸钠、烷基硫酸酯钠、烷基醚硫酸酯钠和α-烯烃磺酸钠。这些离子界面活化剂中的一种可以单独使用，或这些离子界面活化剂中的两种以上可以组合使用。这些离子界面活化剂中，脂肪酸钠是优选的，并且十二烷基硫酸钠(SDS)是更优选的。

非离子界面活化剂的实例包括烷基糖苷、烷基聚氧乙烯醚(例如，BRIJ系列)、辛基酚乙氧基化物(例如，TRITON X系列、IGEPAL CA系列、NONIDET P系列和NIKKOL OP系列)、聚山梨酸酯(例如，TWEEN系列，如TWEEN 20)、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、烷基麦芽糖苷、蔗糖脂肪酸酯、糖苷脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯和脂肪酸单甘油酯。这些非离子界面活化剂中的一种可以单独使用，或这些非离子界面活化剂中的两种以上可以组合使用。在这些非离子界面活化剂中，聚山梨酸酯是优选的。

界面活化剂的含量优选为，相对于孔中细胞悬浮液的总量，0.01质量％以上但5.00质量％以下。当界面活化剂的含量为0.01质量％以上时，界面活化剂可有效用于DNA提取。当界面活化剂的含量为5.00质量％以下时，可以防止PCR期间对扩增的抑制。作为能够同时获得这两种效果的数值范围，0.01质量％以上但5.00质量％以下的范围是优选的。

上述方法可能不能从具有细胞壁的细胞充分提取DNA。用于这种情况的方法的实例包括渗透压休克程序、冻融法、酶消化法、DNA提取试剂盒的应用、超声处理法、French挤压法和均质器法。在这些方法中，酶消化法是优选的，因为该方法可以减少被提取DNA的损失。

<<其他步骤>>

其他步骤没有具体限制，并可以根据预期目的被适当选择。其他步骤的实例包括酶去活步骤和改变除可扩增试剂的特定拷贝数以外的组成的步骤。

-酶去活步骤-

酶去活步骤是使酶去活的步骤。

酶的实例包括DNA酶、RNA酶和在核酸提取步骤中用于提取核酸的酶。

使酶去活的方法没有具体限制，并且可以根据预期目的被适当选择。可以适当使用已知的方法。

<<改变可扩增试剂的特定拷贝数以外的组成的步骤>>

改变可扩增试剂的特定拷贝数以外的组成的步骤意为，可以提供可以包含或不包含用作可扩增试剂的核酸以外的任何其他引物或扩增剂的组合。具体地，一个孔包括(1)包含核酸、引物和扩增剂的组合物，另一孔包括(2)包含核酸和引物的组合物，再另一孔包括(3)仅包含核酸的组合物。制备试剂组合物的制备者在制备试剂组合物时通过手动操作将引物和扩增剂添加到(2)和(3)的组合物，并将该试剂组合物用于PCR反应。

改变可扩增试剂的特定拷贝数以外的组成的步骤可以通过机器分配而不是手动操作来执行。这使得可以准确地分配引物和扩增剂。

因此，该装置能够实现例如制备试剂组合物的制备者的技能评估。

本公开的装置被广泛地用于例如生物技术相关行业、生命科学行业和医疗保健行业，并且可以适当用于例如仪器校准或校准曲线生成以及测试装置准确性管控。

在装置用于感染性疾病的情况下，该装置适用于规定为官方分析方法或官方公布方法的方法。

(制备者技能评估方法、制备者技能评估装置和制备者技能评估程序)

本公开的制备者技能评估方法是用于评估制备试剂组合物的制备者的技能的制备者技能评估方法，包括Ct值信息获得步骤：使用本公开的装置获得关于本公开的装置中Ct值的信息；和技能评估步骤：基于获得Ct值的信息来评估制备者的技能；并且按需进一步包括的其他步骤。

本公开的制备者技能评估装置是被配置以对制备试剂组合物的制备者的技能进行评估的制备者技能评估装置，包括Ct值信息取得单元，其被配置以利用本公开的装置来取得本公开的装置中关于Ct值的信息；和技能评估单元，其被配置以基于所获得的关于Ct值的信息来评估制备者的技能；并且按需进一步包括其他单元。

本公开的制备者技能评估程序是用于评估制备试剂组合物的制备者的技能的制备者技能评估程序，并且使计算机执行包括下列的过程：利用本公开的装置获得本公开的装置中关于Ct值的信息，和基于所获得的关于Ct值的信息评估制备者的技能。

通过例如本公开的制备者技能评估装置的控制单元进行控制与执行本公开的制备者技能评估方法具有相同的含义。因此，制备者技能评估方法的细节也将通过对本公开的制备者技能评估装置的描述来说明。此外，本公开的制备者技能评估程序通过使用例如计算机作为硬件资源而实现本公开的制备者技能评估装置。因此，本公开的制备者技能评估程序的细节也将通过对本公开的制备者技能评估装置的描述来说明。

<Ct值信息获得步骤和Ct值信息获得单元>

Ct值信息获得步骤是利用本公开的装置获得本公开的装置中关于Ct值的信息的步骤，并且由Ct值信息获得单元执行。

Ct值表示反应的荧光信号越过阈值线的时刻的循环数。由于Ct值线性降低至目标的初始量的对数，可以基于Ct值计算DNA的初始拷贝数。

阈值线表示观察到从计算出的基线信号开始统计学显著增加时的信号水平，并且意为实时PCR反应的阈值。

基线是指荧光信号几乎没有变化时PCR初始循环中的信号水平。

关于Ct值的信息的实例包括Ct值、平均Ct、标准偏差、CV值[(标准偏差/平均Ct)×100]和[(Ct(最大)－Ct(最小))/2·平均值Ct]×100。

<技能评估步骤和技能评估单元>

技能评估步骤是基于关于Ct值的信息来评估制备者的技能的步骤，并且由技能评估单元执行。

制备者的技能的实例包括，关于装置中除核酸以外的组成，制备者通过手动操作来制备试剂组合物的技能。

可以基于利用本公开的装置进行的制备试剂组合物的PCR反应以及与所要获得的Ct值信息的比较，评估制备者的技能。

为了评估制备者的技能，制备者可以在提供样品待比较的标准样品的同一装置上制备样品，或者可以在不同的装置上制备样品。作为通过使制备者在提供样品待比较的标准样品的同一装置上制备样品来评估制备者的技能的方法，例如自动分配装置或认证技术人员在孔上制备试剂，而待评估的制备者在同一装置的不同孔上制备试剂。然后，将从各个孔中的PCR反应获得的Ct值相互比较。以这种方式，可以评估制备者的技能。作为通过使制备者在提供样品待比较的标准样品的同一装置上制备样品的方法来评估制备者的技能的方法，例如自动分配装置或认证技术人员在第一装置上制备试剂，而待评估的制备者在第二装置上制备试剂。然后，将利用所制备的第一和第二装置从PCR反应获得的Ct值相互比较。以这种方式，可以评估待评估的制备者的技能。

<其他步骤和其他单位>

其他步骤和其他单元没有具体限制，并且可以根据预期目的适当地选择。其他步骤和其他单元的实例包括显示步骤和显示单元。

可以使用计算机来执行本公开的制备者技能评估程序的过程，该计算机包括构成制备者技能评估装置的控制单元。

下面将描述制备者技能评估装置的硬件配置和功能配置。

<制备者技能评估装置的硬件配置>

图32是示例制备者技能评估装置100的硬件配置的实例的框图。

如图32中所示，制备者技能评估装置100包括CPU(中央处理单元)101、主存储装置102、辅存储装置103、输出装置104、输入装置105和通信接口(通信I/F)106。这些单元通过总线107相互联接。

CPU 101是被配置以执行各种控制和操作的处理装置。CPU 101通过执行OS(操作系统)和存储在例如主存储装置102中的程序来实现各种功能。即，在本实例中，CPU 101通过执行制备者技能评估程序而充当制备者技能评估装置100的控制单元130。

CPU 101还总体上控制制备者技能评估装置100的操作。在本实例中，CPU 101用作被配置以总体上控制制备者技能评估装置100的操作的装置。然而，这是非限制性的。例如，可以使用FPGA(现场可编程门阵列)。

制备者技能评估程序和各种数据库不需要存储在例如主存储装置102或辅存储装置103中。制备者技能评估程序和各种数据库可以存储在例如任何其他信息处理装置中，该信息处理装置通过例如因特网、LAN(局域网)和WAN(广域网)联接到制备者技能评估装置100。制备者技能评估装置100可以被配置以从这种其他信息处理装置接收制备者技能评估程序和各种数据库，并执行制备者技能评估程序和各种数据库。

主存储装置102被配置以存储各种程序和存储例如执行各种程序所需的数据。

主存储装置102包括未示出的ROM(只读存储器)和RAM(随机存取存储器)。

ROM存储例如各种程序，如BIOS(基本输入/输出系统)。

当由CPU 101执行ROM中存储的各种程序时，RAM用作要开发的工作区域。RAM没有具体限制，并且可以根据预期目的适当地选择。RAM的实例包括DRAM(动态随机存取存储器)和SRAM(静态随机存取存储器)。

辅存储装置103没有具体限制，并且可以根据预期目的适当地选择，只要辅存储装置103可以存储各种信息。辅存储装置103的实例包括固态驱动器和硬盘驱动器。作为辅存储装置103，例如，还可以使用诸如CD(压缩盘)驱动器、DVD(数字多功能光盘)驱动器和BD(蓝光(注册商标)盘)驱动器的便携式存储装置。

作为输出装置104，例如，可以使用显示器和扬声器。显示器没有具体限制，并且可以使用适当的已知显示器。显示器的实例包括液晶显示器和有机EL显示器。

输入装置105没有具体限制，并且可以使用适当的已知输入装置，只要该输入装置可以接收对制备者技能评估装置100的各种请求。输入装置的实例包括键盘、鼠标和触摸板。

通信接口(通信I/F)106没有具体限制，并且可以使用适当的已知通信接口。通信接口的实例包括无线或有线通信装置。

上述硬件配置可以实现制备者技能评估装置100的处理功能。

<制备者技能评估装置的功能配置>

图22是示例制备者技能评估装置100的功能配置的实例的图。

如图22所示，制备者技能评估装置100包括输入单元110、输出单元120、控制单元130和存储单元140。

控制单元130包括Ct值信息获得单元131和技能评估单元132。控制单元130被配置以总体上控制制备者技能评估装置100。

存储单元140包括Ct值信息数据库141和技能评估结果数据库142。在下文中，“数据库”也可以被称为“DB”。

Ct值信息获得单元131被配置以利用表示存储在存储单元140的Ct值信息DB 141中的关于Ct值的信息的数据来获得关于Ct值的信息。如上所述，Ct值信息DB 141存储例如表示先前通过实验获得的Ct值的数据。注意，关于与该装置相关联的Ct值的信息可以被存储在Ct值信息DB 141中。对DB的输入可以经由与制备者技能评估装置100联接的其他信息处理装置来执行或者由操作者来执行。

技能评估单元132被配置以基于关于Ct值的信息来评估制备者的技能。用于评估制备者的技能的具体方法的实例包括由所获得的Ct值计算标准偏差并基于所计算的标准偏差来评估制备者的技能的方法。

通过技能评估单元132评估制备者的技能的结果被存储在存储单元140的技能评估结果DB 142中。

接下来，将描述本公开的制备者技能评估程序的过程程序。图23是示例制备者技能评估装置100的控制单元130中的制备者技能评估程序的过程程序的流程图。

在步骤S110中，制备者技能评估装置100的控制单元130的Ct值信息获得单元131获得表示与存储在存储单元140的Ct值信息DB 141中的Ct值有关的信息的数据，并且使过程移至步骤S111。

在步骤S111中，制备者技能评估装置100的控制单元130的技能评估单元132基于所获得的关于Ct值的信息来评估制备者的技能，并且使处理移至步骤S112。

在步骤S112中，制备者技能评估装置100的控制单元130将获得的制备者技能评估结果存储在存储单元140的技能评估结果DB 142中，并结束过程。

(测试装置性能评估方法、测试装置性能评估装置和测试装置性能评估程序)

本公开的测试装置性能评估方法是用于评估被配置以对测试目标进行测试的测试装置的性能的测试装置性能评估方法，包括Ct值信息获得步骤：利用本公开的装置获得本公开的装置中关于Ct值的信息；以及性能评估步骤：基于关于Ct值的信息来评估测试装置的性能的；并且按需进一步包括其他步骤。

本公开的测试装置性能评估装置是被配置以评估被配置以对测试目标进行测试的测试装置的性能的测试装置性能评估装置，并且包括Ct值信息获得单元，其被配置以利用本公开的装置获得本公开的装置中关于Ct值的信息；以及性能评估单元，其被配置以基于关于Ct值的信息来评估测试装置的性能；并且按需进一步包括其他单元。

本公开的测试装置性能评估程序是用于评估被配置以对测试目标进行测试的测试装置的性能的测试装置性能评估程序，并且使计算机执行包括以下的过程：利用本公开的装置获得本公开的装置中关于Ct值的信息的处理，和基于关于Ct值的信息评估测试装置的性能。

通过例如本公开的测试装置性能评估装置的控制单元执行的控制与执行本公开的测试装置性能评估方法具有相同的含义。因此，测试装置性能评估方法的细节也将通过对本公开的测试装置性能评估装置的描述来说明。此外，本公开的测试装置性能评估程序通过使用例如计算机作为硬件资源来实现本公开的测试装置性能评估装置。因此，本公开的测试装置性能评估程序的细节也将通过对本公开的测试装置性能评估装置的描述来说明。

<Ct值信息获得步骤和Ct值信息获得单元>

Ct值信息获得步骤是利用本公开的装置获得本公开的装置中关于Ct值的信息的步骤，并且由Ct值信息获得单元执行。

通过使用本公开的装置进行实时PCR，可以获得Ct值。

关于Ct值的信息的实例包括平均Ct值、Ct值的标准偏差、CV值[(标准偏差/平均Ct值)×100]和[(Ct值(最大)－Ct值(最小))/2·平均Ct值]×100。

可以从装置中提供的并且可扩增试剂的特定拷贝数不同的两组或更多组中的每组获得关于Ct值的信息。

<性能评估步骤和性能评估单元>

性能评估步骤是基于关于Ct值的信息来评估测试装置的性能的步骤，并且由性能评估单元执行。

在定性评估中，使用本公开的装置进行实时PCR以测量Ct值并计算平均Ct值。通过在孔中Ct值在平均Ct值的10％以内时将孔分级为“ο”，并且在孔中Ct值大于平均Ct值的10％时将孔分级为“×”，可以评估平面内特性。

通过使用本公开的装置进行测量一定时间段，可以获得Ct值的时间变化。因此，如同平面内特性，当孔的Ct值大于平均Ct值的10％时，可以进行测试装置的校准或采取不使用该测量位置的措施。此外，由于布置的拷贝的特定拷贝数是绝对值，使用具有以相同特定拷贝数布置的拷贝的装置能够实现测试装置之间的性能比较。

在定量评估中，通过使用本公开的装置进行测量一定时间段，可以获得Ct值的时间变化。因此，如同平面内特性，当获得偏离质量控制值的值时，可以测试装置的校准或采取不使用该测量位置的措施。此外，由于布置的拷贝的特定拷贝数是绝对值，使用具有以相同拷贝数布置的拷贝的装置能够实现测试装置之间的性能比较。

在定量评估中，可以从校准曲线和PCR效率获得与Ct值相对应的分子数(拷贝数或浓度)，而不是Ct值本身。因此，可以使用诸如分子数(拷贝数或浓度)的值或转换为分子数(拷贝数或浓度)的CV值和分子数(转换为拷贝数或浓度)计算出的(最大值－最小值)/2·平均值×100来执行测试装置之间的性能评估。

<其他步骤和其他单元>

其他步骤和其他单元没有具体限制，并且可以根据预期目的适当地选择。其他步骤和其他单元的实例包括显示步骤和显示单元。

可以使用包括构成测试装置性能评估装置的控制单元的计算机来执行根据本公开的测试装置性能评估程序的过程。

下面将描述测试装置性能评估装置的硬件配置和功能配置。

<测试装置性能评估装置的硬件配置>

图35是示例测试装置性能评估装置100的硬件配置的实例的框图。

如图35所示，测试装置性能评估装置100包括CPU(中央处理单元)101、主存储装置102、辅存储装置103、输出装置104、输入装置105和通信接口(通信I/F)106。这些单元通过总线107彼此联接。

CPU 101是被配置以执行各种控制和操作的处理装置。CPU 101通过执行OS(操作系统)和例如存储在主存储装置102中的程序来实现各种功能。即，在本实例中，CPU 101通过执行测试装置性能评估程序来充当测试装置性能评估装置100的控制单元130。

CPU 101还总体上控制测试装置性能评估装置100的操作。在本实例中，CPU 101用作被配置以总体上控制测试装置性能评估装置100的操作的装置。然而，这是非限制性的。例如，可以使用FPGA(现场可编程门阵列)。

测试装置性能评估程序和各种数据库不需要存储在例如主存储装置102或辅存储装置103中。测试装置性能评估程序和各种数据库可以例如存储在通过例如因特网，LAN(局域网)和WAN(广域网)联接到测试装置性能评估装置100的任何其他信息处理装置中。测试装置性能评估装置100可以被配置以从这种其他信息处理装置接收测试装置性能评估程序和各种数据库，并执行测试装置性能评估程序和各种数据库。

主存储装置102被配置以存储各种程序和存储例如执行各种程序所需的数据。

主存储装置102包括未示出的ROM(只读存储器)和RAM(随机存取存储器)。

ROM存储例如各种程序，如BIOS(基本输入/输出系统)。

当由CPU 101执行ROM中存储的各种程序时，RAM用作要开发的工作区域。RAM没有具体限制，并且可以根据预期目的适当地选择。RAM的实例包括DRAM(动态随机存取存储器)和SRAM(静态随机存取存储器)。

辅存储装置103没有具体限制，并且可以根据预期目的适当地选择，只要辅存储装置103可以存储各种信息。辅存储装置103的实例包括固态驱动器和硬盘驱动器。作为辅存储装置103，例如，还可以使用诸如CD(压缩盘)驱动器、DVD(数字多功能光盘)驱动器和BD(蓝光(注册商标)盘)驱动器的便携式存储装置。

作为输出装置104，例如，可以使用显示器和扬声器。显示器没有具体限制，并且可以使用适当的已知显示器。显示器的实例包括液晶显示器和有机EL显示器。

输入装置105没有具体限制，并且可以使用适当的已知输入装置，只要该输入装置可以接收对测试装置性能评估装置100的各种请求。输入装置的实例包括键盘、鼠标和触摸板。

通信接口(通信I/F)106没有具体限制，并且可以使用适当的已知通信接口。通信接口的实例包括无线或有线通信装置。

上述硬件配置可以实现测试装置性能评估装置100的处理功能。

<测试装置性能评估装置的功能配置>

图36是示例测试装置性能评估装置100的功能配置的实例的图。

如图36所示，测试装置性能评估装置100包括输入单元110、输出单元120、控制单元130和存储单元140。

控制单元130包括Ct值信息获得单元131和性能评估单元132。控制单元130被配置以总体上控制测试装置性能评估装置100。

存储单元140包括Ct值信息数据库141和性能评估结果数据库142。在下文中，“数据库”也可以被称为“DB”。

Ct值信息获得单元131被配置以利用表示存储在存储单元140的Ct值信息DB 141中的关于Ct值的信息的数据来获得关于Ct值的信息。如上所述，Ct值信息DB 141存储例如表示先前通过实验获得的Ct值的数据。注意，关于与该装置相关联的Ct值的信息可以被存储在Ct值信息DB 141中。对DB的输入可以经由与测试装置性能评估装置100联接的其他信息处理装置来执行或者由操作者来执行。

性能评估单元132被配置以基于关于Ct值的信息来评估测试装置的性能。用于评估测试装置的性能的具体方法如上所述。

通过性能评估单元132评估测试装置的性能的结果被存储在存储单元140的性能评估结果DB 142中。

接下来，将描述本公开的测试装置性能评估程序的过程程序。图37是示例测试装置性能评估装置100的控制单元130中的测试装置性能评估程序的过程程序的流程图。

在步骤S110中，测试装置性能评估装置100的控制单元130的Ct值信息获得单元131获得表示与存储在存储单元140的Ct值信息DB 141中的Ct值有关的信息的数据，并且使过程移至步骤S111。

在步骤S111中，测试装置性能评估装置100的控制单元130的性能评估单元132基于所获得的关于Ct值的信息来评估测试装置的性能，并且使处理移至步骤S112。

在步骤S112中，测试装置性能评估装置100的控制单元130将获得的测试装置性能评估结果存储在存储单元140的性能评估结果DB 142中，并结束过程。

实施例

以下将通过实施例描述本公开。本公开不应解释为限于这些实施例。

<装置的制备>

装置以下述方式制备。

-基因重组酵母-

为制备重组体，芽生酵母YIL015W BY4741(可得自ATCC，ATCC4001408)用作一拷贝特定核酸序列的载体细胞。特定核酸序列是致密核酸样品DNA600-G(可获自NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology，NMIJ CRM 6205-a，参见SEQ ID NO.1)。以质粒形式——通过将特定核酸序列与作为选择标记的URA3串联排列而生成，通过同源重组将一拷贝的特定核酸序列引入酵母基因组DNA中，靶向载体细胞的BAR1区域，以产生基因重组酵母。

-培养和细胞周期控制-

在Erlenmeyer瓶中，将在50g/L YPD培养基(可从Takara Bio Inc.，CLN-630409获得)中培养的基因重组酵母的90mL部分与900微升α1-交配因子乙酸盐(可获自Sigma-AldrichCo.，LLC，T6901-5MG，以下称为“α因子”)——用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(可从ThermoFisher Scientific Inc.获得，14190-144，以下称为“DPBS”)制备成500微克/mL——混合。

接着，将所得物用生物振荡器(可获自Taitec Corporation，BR-23FH)在28℃的温度下以250rpm的振荡速度培育2小时，以使酵母在G0/G1期同步，从而酵母悬浮液。为了确认同步细胞的细胞周期，将细胞用SYTOX绿色核酸染料(装置名称：S7020，可从Thermo FisherScientific Inc.获得)染色，并在488nm的激发波长下经过流式细胞术(装置名称：SH800，可从Sony Corporation获得)。作为结果，证实了细胞种G0/G1期同步。G1期的细胞比例为99.5％，并且G2期的细胞比例为0.5％。

-固定-

将45毫升同步确认的酵母悬浮液转移至离心管(可从As One Corporation获得，VIO-50R)，并用离心分离器(可从Hitachi，Ltd.获得，F16RN)以3,000rpm的转速离心5分钟，随后除去上清液，以获得酵母团粒。将4毫升福尔马林(可获自Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.，062-01661)添加至获得的酵母团粒中，并将所得物静置5分钟，然后离心，随后去除上清液，并加入10mL乙醇使其悬浮，得到固定的酵母悬浮液。

-染色-

将500微升的固定酵母悬浮液转移至1.5mL的遮光管(可获自Watson，131-915BR)，用离心分离器以3,000rpm的转速离心5分钟，随后除去上清液，充分悬浮——通过移液并添加制备的400微升DPBS(1mM EDTA)至1mM EDTA(可获自Tocris Bioscience，200-449-4)，然后用离心分离机以3,000rpm的转速离心5分钟，随后去除上清液，以获得酵母团粒。将1毫升制备为1mg/mL的伊文思蓝水溶液(可获自Wako Pure Chemical Industries,Ltd.，054-04061)添加至所得的团粒中，并将所得物涡旋搅拌5分钟，然后用离心分离器以3,000rpm的转速离心5分钟，随后除去上清液，并加入DPBS(1mM EDTA)涡旋搅拌，以获得染色的酵母悬浮液。

-分散-

利用超声均化器(可从Yamato Scientific Co.，Ltd.购得，装置名称：LUH150)以30％的功率输出对染色的酵母悬浮液进行分散处理10秒钟，并用离心分离机以3,000rpm的转速离心5分钟，随后除去上清液，然后加入1mL DPBS洗涤。总共进行两次离心分离和上清液去除，并且将所得物再次悬浮在1mL的DPBS中，以获得酵母悬浮墨。

-分配和细胞计数-

通过以下述方式计数液滴中的酵母细胞数以排出每孔10个细胞中的任一者作为特定拷贝数来制备具有已知细胞数的平板。具体地，通过使用图24所示的液滴形成装置，利用压电施加型排出头(内置可得)作为10Hz的液滴排出单元，将酵母悬浮墨顺序地排出到96孔板(产品名称：MICROAMP 96孔反应板，可从Thermo Fisher Scientific Inc.获得)的各孔中。

利用高灵敏度照相机(可获自Tokyo Instruments Inc.，SCMOS PCO.EDGE)作为光接收单元，并且利用YAG激光器(可获自Spectra-Physics,Inc.，EXPLORER ONE-532-200-KE)作为光源，来捕获被排出液滴中的酵母细胞的图像，并且使用图像处理软件IMAGE J作为被捕获图像的粒子数计数单元通过图像处理对细胞数计数。以这种方式，制备具有已知细胞数1的平板。

-核酸的提取-

用Tris-EDTA(TE)缓冲剂和ColE1 DNA(可从Wako Pure Chemical Industries,Ltd.获得，312-00434)，制备5ng/微升的ColE1/TE。用ColE1/TE，制备1mg/mL的Zymolyase^(R)100T(可从NacalaiTesque Inc.获得，07665-55)的Zymolyase溶液。

将4微升的Zymolyase溶液添加到制备的具有已知细胞数的平板的各孔中，在37.2℃下培育30分钟，以溶解细胞壁(提取核酸)，然后在95℃下热处理2分钟，以制备平板。

接下来，为了考虑从具有已知细胞数的平板获得的结果的可靠性，通过在孔中分配特定拷贝数的细胞来制备具有已知细胞数的平板，并计算细胞数为1的不肯定性。注意，通过利用以下针对各特定拷贝数所述的方法，可以计算各种拷贝数的不肯定性。

-不肯定性的计算-

在本实施例中，液滴中的细胞数、细胞中可扩增试剂的拷贝数、孔中的细胞数和污染用作不肯定性的因素。

作为液滴中的细胞数，采用基于对排出单元排出的液滴的图像分析而计数的液滴中的细胞数，以及基于对排出单元排出以着落在载玻片上的液滴中的着落在载玻片上的各液滴的显微镜观察而获得的细胞数量。

利用处于细胞周期G1期的细胞比例(99.5％)和处于G2期的细胞比例(0.5％)，计算细胞(细胞周期)中的核酸拷贝数。

作为孔中的细胞数，计数落在孔中的被排出液滴的数量。但是，在共计96个样品中，所有样品都以液滴的形式落入孔中。因此，作为一个因子，孔中的细胞数被排除在不肯定性的计算之外。

为了确认污染，对墨滤液(4微升)进行实时PCR，以观察该墨液中是否混合有细胞中的可扩增试剂之外的任何其他核酸。对此尝试三次。结果是所有三次尝试中的检测极限值。因此，作为一个因子，污染也被排除在不肯定性的计算之外。

对于不肯定性，标准偏差由各因子的测量值计算，并乘以灵敏度系数，以获得以测量量为单位统一的标准不肯定性。基于这种标准不肯定性，按照平方和方法计算合成的标准不肯定性。合成的标准不肯定性仅覆盖正态分布的大约68％范围内的值。因此，通过将合成的标准不肯定性翻倍，可以获得扩展的不肯定性，即考虑正态分布的大约95％范围的不肯定性。结果展示在下表2的预算表中。

表2

在表2中，“符号”表示不肯定性因子相关的任意符号。

在表2中，“值(±)”表示平均值的实验标准偏差，通过计算的实验标准偏差除以数据数的平方根而获得。

在表2中，“概率分布”是不肯定性因子的概率分布。对于A型不肯定性评估的区域留空，而B型不肯定性评估的区域填有正态分布或矩形分布。在本实施例中，仅进行了A型不肯定性评估。因此，概率分布区域留空。

在表2中，“除数”是指使各因子的不肯定性标准化的数值。

在表2中，“标准不肯定性”是通过“数值(±)”除以“除数”而获得的值。

在表2中，“灵敏度系数”是指用于统一为测量量单位的值。

接下来，计算填充在孔中的核酸样品的平均特定拷贝数和不肯定性。结果列于表3。通过不肯定性值除以平均特定拷贝数，计算变异系数CV。

表3

根据喷墨法，发现分配特定拷贝数为1的核酸样品，即每孔1拷贝的核酸样品(一个酵母细胞)的准确度为±0.1281拷贝。在每孔填充一个或多个拷贝的情况下，将通过累加该准确度来确定特定拷贝数的核酸样品的填充准确度。

在本公开中，不仅可以通过上述喷墨方法而且可以通过下述使用细胞分选仪的方法将核酸以特定拷贝数分配到孔中。下面将描述使用细胞分选仪的情况。在酵母悬浮液固定之前，使用与上述相同的方法。因此，将省略关于固定之前的程序的描述。

-核染色-

将200微升的固定酵母悬浮液分级，用DPBS洗涤一次，并重悬于480微升DPBS中。

接下来，向所得物添加20微升的20mg/mL RNA酶A(可从Nippon Gene Co.，Ltd.获得，318-06391)，然后在37℃下用生物振荡器一起培育2小时。

接下来，向所得物添加25微升的20mg/mL蛋白酶K(可获自Takara Bio Inc.，TKR-9034)，然后用PETIT COOL(可获自Waken B Tech Co.，Ltd.，PETIT COOL MINI TC)在50℃的温度下培育2小时。

最后，向所得物加入6微升的5mM SYTOX绿色核酸染料(可从Thermo FisherScientific Inc.获得，S7020)，然后在遮光环境中染色30分钟。

-分散-

使用超声均质器(可获自Yamato Scientific Co.，Ltd.，LUH150，)以30％的功率输出对染色的酵母悬浮液进行分散处理10秒，以获得酵母悬浮墨。

<核酸样品的填充>

--分配酵母悬浮液并计数--

在填充容器(96孔平底板(可获自Watson Co.，Ltd.，4846-96-FS))中以每孔4微升的量预先填充用于溶解细胞壁的溶解液后，利用细胞分选仪(可从Sony Corporation获得，SH800Z)，以每孔一个细胞分配核酸样品系列。

接着，使用Tris-EDTA(TE)缓冲剂(可获自Thermo Fisher Scientific Inc.，AM9861)作为细胞壁溶解液的和ColE1 DNA(可获自Nippon Gene Co.，Ltd.，312-00434)，制备5ng/微升的ColE1/TE。用ColE1/TE，以1mg/mL制备

100T(可得自Nacalai TesqueInc.，07665-55)的Zymolyase溶液。

接下来，在通过细胞分选仪分配期间，在488nm的激发波长下分析细胞周期，以仅选择其中存在G0/G1期细胞的区域，并通过单细胞模式分配规定数量的酵母细胞。

-从分配的酵母细胞提取核酸-

为了从酵母细胞提取核酸，将填充容器在37℃下培育30分钟，以溶解细胞壁(核酸的提取)，然后在95℃下热处理2分钟。

<核酸样品系列的不肯定性计算>

由于以下不肯定性因素，所填充的核酸样品系列具有各个特定拷贝数水平的一定不肯定性。

因素i：关于各排出液滴中的酵母细胞数匹配百分比的不肯定性

关于因素i的不肯定性是基于在与填充方法相同的条件下排放到另一个容器中的着落液滴中的酵母细胞数量与酵母细胞的预期数量相匹配的百分比来计算的。

在本实验系统中，细胞分选仪对于每孔分配一个酵母细胞(特定拷贝数为1)的准确性为99.2％。在分配更多数量的酵母细胞(更大拷贝数)的情况下，考虑分配特定拷贝数的酵母细胞的准确度将通过一个细胞的准确度累加来确定是安全可靠的。

以上述方式，计算各填充核酸样品的平均特定拷贝数和不肯定性。结果显示在表4中。变异系数CV通过不肯定性除以平均特定拷贝数来计算。

[表4]

-不肯定性与各填充部分的关联-

将计算出的不确定度与各孔关联。

以这种方式，可以计算核酸样品系列的核酸平均拷贝数和平均拷贝数的不肯定性，并且将平均拷贝数和不肯定性与各孔关联。

接下来，除了将每孔分配的细胞数变为10个细胞以外，按照与上述相同的方式制备具有已知细胞数的装置(平板)。

在制备的平板上，根据图38所示的方案进行通过实时PCR的扩增和检测。首先，为了通过实时PCR进行测量，通过手动操作添加引物和扩增剂中的至少任一者，以获得(1)添加完成组(图39的第1列至第4列，组成：核酸、引物和扩增剂)，(2)用于引物添加的组(图39的第5列至第8列，组成：核酸和扩增剂)，和(3)用于引物和扩增剂添加的组(图39的第9列至第12列，组成：核酸)。注意，图39中的“0”表示阴性对照，即其中不包含核酸的孔。

扩增剂的组成如下。

-主混合物(可获自Thermo Fisher Scientific Inc.,TAQMAN通用PCR主混合物)：1微升

-用于扩增特定碱基序列的正向引物和反向引物(10微摩尔)：0.5nmol

-TaqMan探针(可获自Thermo Fisher Scientific Inc.,产品名称：TAQMAN通用PCR主混合物)：0.4nmol

-酵母细胞壁消化酶(可获自MC Food Specialties Inc.,产品名称：ZYMOLYASE)：4微升

-NFW(可获自Thermo Fisher Scientific Inc.,产品名称：超纯无DNA酶/RNA酶蒸馏水)：2微升

制备板后，使用实时PCR装置(可获自Thermo Fisher Scientific Inc.,QUANTSTUDIO7FLEX)进行扩增和检测。结果显示在图40至图42中。

图40是表示图39所示的板的各孔中的Ct值的信息的图。图41是表示从图40得到的(1)至(3)的组成的Ct值的平均值和标准偏差的图。图42是对基于从图62获得的关于Ct值的信息生成的Ct值的正态分布曲线作图的图。从图40至图42所示的结果发现，与组成(1)和(2)相比，由制备者添加了引物和扩增剂的组成(3)获得了更大的平均值和更大的Ct值标准偏差。结果是，发现可以通过使用本公开的装置来评估制备试剂组合物的制备者的技能。

本公开的方面例如如下。

<1>装置，包括：

多个孔；和

所述孔划分成的两组或更多组，所述两组或更多组的孔中的组成不同。

<2>装置，包括：

多个孔；

布置在各孔中并且包含特定拷贝数的可扩增试剂的试剂组合物；和

所述孔划分成的两组或更多组，所述两组或更多组具有相同特定拷贝数的可扩增试剂，但所述试剂组合物的除所述特定拷贝数外的组成不同。

<3>根据<2>的装置，包括

特定拷贝数不同的组。

<4>装置，包括：

多个孔；

以特定拷贝数布置在各孔中的可扩增试剂；和

所述孔划分成的两组或更多组，所述两组或更多组的可扩增试剂的特定拷贝数不同。

<5>根据<2>至<4>中任一项的装置，

其中所述孔划分成的组中的至少一组是其中所述可扩增试剂的特定拷贝数接近检测极限的组。

<6>根据<2>至<4>中任一项的装置，

其中所述孔划分成的组中的至少一组是其中所述可扩增试剂的特定拷贝数是大于定量极限的拷贝数的组。

<7>根据<2>至<6>中任一项的装置，

其中所述孔划分成的组中的至少一组是其中所述可扩增试剂的特定拷贝数为0的阴性对照组。

<8>根据<2>至<7>中任一项的装置，

其中所述孔划分成的组中的至少一组是其中所述可扩增试剂的特定拷贝数为100以上的阳性对照组。

<9>根据<2>至<8>中任一项的装置，

其中所述孔划分成的组中的至少一组是除阴性对照组外具有最少拷贝数的组，所述至少一个组至少位于近乎所述装置外围的孔处。

<10>根据<2>至<9>中任一项的装置，

其中各孔含有引物和扩增剂中的至少任一者。

<11>根据<2>至<10>中任一项的装置，包括

识别单元，所述识别单元被配置以能够识别关于所述孔中所述可扩增试剂的特定拷贝数的信息。

<12>根据<2>至<11>中任一项的装置，

其中所述可扩增试剂是核酸。

<13>根据<12>的装置，

其中所述核酸被引入细胞核的核酸中。

<14>根据<13>的装置，

其中所述细胞是酵母细胞。

<15>根据<2>至<14>中任一项的装置，

其中所述特定拷贝数是所述可扩增试剂的计数拷贝数。

<16>根据<13>至<15>中任一项的装置，

其中所述细胞通过喷墨方法被排出。

<17>用于评估制备试剂组合物的制备者的技能的制备者技能评估方法，所述制备者技能评估方法包括：

获得关于根据<1>至<16>中任一项的装置中的Ct值的值息；和

基于获得的关于Ct值的信息评估所述制备者的技能。

<18>用于评估制备试剂组合物的制备者的技能的制备者技能评估程序，所述制备者技能评估程序使计算机执行包括以下的过程：

获得关于根据<1>至<16>中任一项的装置中的Ct值的值息；和

基于获得的关于Ct值的信息评估所述制备者的技能。

<19>制备者技能评估装置，其被配置以评估制备试剂组合物的制备者的技能，所述制备者技能评估装置包括：

Ct值信息获得单元，所述Ct值信息获得单元被配置以获得关于根据<1>至<16>中任一项的装置中的Ct值的信息；和

技能评估单元，所述技能评估单元被配置以基于所获得的关于Ct值的信息来评估所述制备者的技能。

<20>用于评估测试装置的性能的测试装置性能评估方法，所述测试装置被配置以对测试目标进行测试，所述测试装置性能评估方法包括：

获得关于根据<1>至<16>中任一项的装置中的Ct值的值息；和

基于关于Ct值的信息评估所述测试装置的性能。

<21>用于评估测试装置的性能的测试装置性能评估程序，所述测试装置被配置以对测试目标进行测试，所述测试装置性能评估程序使计算机执行包括以下的过程：

获得关于根据<1>至<16>中任一项的装置中的Ct值的值息；和

基于关于Ct值的信息评估所述测试装置的性能。

<22>测试装置性能评估装置，其被配置以评估测试装置的性能，所述测试装置被配置以对测试目标进行测试，所述测试装置性能评估装置包括：

Ct值信息获得单元，所述Ct值信息获得单元被配置以获得关于根据<1>至<16>中任一项的装置中的Ct值的值息；和

性能评估单元，所述性能评估单元被配置以基于关于Ct值的信息评估所述测试装置的性能。

根据<1>至<16>中任一项的装置、根据<17>的制备者技能评估方法、根据<18>的制备者技能评估程序、根据<19>的制备者技能评估装置、根据<20>的测试装置性能评估方法、根据<21>的测试装置性能评估程序和根据<22>的测试装置性能评估装置可以解决相关技术中的各种问题，并且可以实现本公开的目的。

参考编号列表

1：装置

2：基材

3：孔

4：可扩增试剂

5：密封构件

序列表

<110> 株式会社理光

<120> 装置，制备者技能评估方法、程序和装置，以及测试装置性能评估方法、程序和装置

<130> N-RC011-18P

<150> JP 2017-226081

<151> 2017-11-24

<150> JP 2017-226082

<151> 2017-11-24

<150> JP 2018-073410

<151> 2018-4-5

<150> JP 2018-187453

<151> 2018-10-2

<150> JP 2018-216110

<151> 2018-11-19

<150> JP 2018-218612

<151> 2018-11-21

<160> 3

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

attcgaaggg tgattggatc ggagatagga tgggtcaatc gtagggacaa tcgaagccag 60

aatgcaaggg tcaatggtac gcagaatgga tggcacttag ctagccagtt aggatccgac 120

tatccaagcg tgtatcgtac ggtgtatgct tcggagtaac gatcgcacta agcatggctc 180

aatcctaggc tgataggttc gcacatagca tgccacatac gatccgtgat tgctagcgtg 240

attcgtaccg agaactcacg ccttatgact gcccttatgt caccgcttat gtctcccgag 300

atcacacccg ttatctcagc cctaatctct gcggtttagt ctggccttaa tccatgcctc 360

atagctaccc tcataccatc gctcatacct tccgacattg catccgtcat tccaaccctg 420

attcctacgg tctaacctag cctctatcct acccagttag gttgcctctt agcatccctg 480

ttacgtacgc tcttaccatg cgtcttacct tggcactatc gatgggagta tggtagcgag 540

tatggaacgg actaacgtag gcagtaagct agggtgtaag gttgggacta aggatgccag 600

<210> 2

<211> 85

<212> DNA

<213> 诺如病毒(GI)

<400> 2

cgctggatgc gcttccatga cctcggattg tggacaggag atcgcgatct tctgcccgaa 60

ttcgtaaatg atgatggcgt ctaag 85

<210> 3

<211> 98

<212> DNA

<213> 诺如病毒(GII)

<400> 3

caagagccaa tgttcagatg gatgagattc tcagatctga gcacgtggga gggcgatcgc 60

aatctggctc ccagctttgt gaatgaagat ggcgtcga 98

Claims (22)

1.装置，包括：

多个孔；和

所述孔划分成的两组或更多组，所述两组或更多组的孔中的组成不同。

2.装置，包括：

多个孔；

布置在各孔中并且包含特定拷贝数的可扩增试剂的试剂组合物；和

所述孔划分成的两组或更多组，所述两组或更多组具有以相同特定拷贝数布置的可扩增试剂，但所述试剂组合物的除所述特定拷贝数外的组成不同。

3.根据权利要求2所述的装置，包括

特定拷贝数不同的组。

4.装置，包括：

多个孔；

以特定拷贝数布置在各孔中的可扩增试剂；和

所述孔划分成的两组或更多组，所述两组或更多组的可扩增试剂的特定拷贝数不同。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的装置，

其中所述孔划分成的组中的至少一组是其中所述可扩增试剂的特定拷贝数接近检测极限的组。

6.根据权利要求2-4中任一项所述的装置，

其中所述孔划分成的组中的至少一组是其中所述可扩增试剂的特定拷贝数是大于定量极限的拷贝数的组。

7.根据权利要求2-6中任一项所述的装置，

其中所述孔划分成的组中的至少一组是其中所述可扩增试剂的特定拷贝数为0的阴性对照组。

8.根据权利要求2-7中任一项所述的装置，

其中所述孔划分成的组中的至少一组是其中所述可扩增试剂的特定拷贝数为100以上的阳性对照组。

9.根据权利要求2-8中任一项所述的装置，

其中所述孔划分成的组中的至少一组是除阴性对照组外具有最少拷贝数的组，所述至少一个组至少位于近乎所述装置外围的孔处。

10.根据权利要求2-9中任一项所述的装置，

其中各孔包含引物和扩增剂中的至少任一者。

11.根据权利要求2-10中任一项所述的装置，包括

识别单元，所述识别单元被配置以能够识别关于所述孔中所述可扩增试剂的特定拷贝数的信息。

12.根据权利要求2-11中任一项所述的装置，

其中所述可扩增试剂是核酸。

13.根据权利要求12所述的装置，

其中所述核酸被引入细胞核的核酸中。

14.根据权利要求13所述的装置，

其中所述细胞是酵母细胞。

15.根据权利要求2-14中任一项所述的装置，

其中所述特定拷贝数是所述可扩增试剂的计数拷贝数。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的装置，

其中所述细胞通过喷墨方法被排出。

17.用于评估制备试剂组合物的制备者的技能的制备者技能评估方法，所述制备者技能评估方法包括：

获得关于根据权利要求1-16中任一项所述的装置中的Ct值的值息；和

基于获得的关于Ct值的信息评估所述制备者的技能。

18.用于评估制备试剂组合物的制备者的技能的制备者技能评估程序，所述制备者技能评估程序使计算机执行包括以下的过程：

获得关于根据权利要求1-16中任一项所述的装置中的Ct值的值息；和

基于获得的关于Ct值的信息评估所述制备者的技能。

19.制备者技能评估装置，其被配置以评估制备试剂组合物的制备者的技能，所述制备者技能评估装置包括：

Ct值信息获得单元，所述Ct值信息获得单元被配置以获得关于根据权利要求1-16中任一项所述的装置中的Ct值的信息；和

技能评估单元，所述技能评估单元被配置以基于所获得的关于Ct值的信息来评估所述制备者的技能。

20.用于评估测试装置的性能的测试装置性能评估方法，所述测试装置被配置以对测试目标进行测试，所述测试装置性能评估方法包括：

获得关于根据权利要求1-16中任一项所述的装置中的Ct值的值息；和

基于关于Ct值的信息评估所述测试装置的性能。

21.用于评估测试装置的性能的测试装置性能评估程序，所述测试装置被配置以对测试目标进行测试，所述测试装置性能评估程序使计算机执行包括以下的过程：

获得关于根据权利要求1-16中任一项所述的装置中的Ct值的值息；和

基于关于Ct值的信息评估所述测试装置的性能。

22.测试装置性能评估装置，其被配置以评估测试装置的性能，所述测试装置被配置以对测试目标进行测试，所述测试装置性能评估装置包括：

Ct值信息获得单元，所述Ct值信息获得单元被配置以获得关于根据权利要求1-16中任一项所述的装置中的Ct值的值息；和

性能评估单元，所述性能评估单元被配置以基于关于Ct值的信息评估所述测试装置的性能。

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