JP2021145642A - 担体及び検査方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】正確な核酸の抽出効率が得られる担体を提供する。【解決手段】担体は、特定の数の細胞Ａが担持された担持部を有し、前記細胞Ａは、特定コピー数の核酸を含み、前記担持部は水解性材料からなる。【選択図】なし

Description

本発明は、担体及び検査方法に関する。具体的には、本発明は、担体、及び、細胞試料中の検出対象の遺伝子の遺伝子検査装置による測定値の正確度を検査する方法を提供する。
食品、環境検査、及び医療では、核酸を検出及び測定する遺伝子検査が行われており、近年、分析技術の高感度化により、測定対象の核酸をコピー数単位で測定することが可能になっている。測定対象の核酸は、食品、環境水、血液、尿、組織等から、対象となる核酸を抽出したものを用いる。
核酸の抽出としては、カラムや磁気ビーズに核酸を捕捉して、洗浄することで不純物等を除去してから、核酸を溶出する方法が用いられている。
測定対象の核酸のコピー数を測定する方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を応用した、リアルタイムＰＣＲやデジタルＰＣＲが用いられる。リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲによる増幅をリアルタイムに測定する方法で、蛍光色素を用いて、対象核酸のＤＮＡ配列の増幅量を測定する。プラスミドＤＮＡ等の既知コピー数の核酸の希釈系列を用いて行うことで、核酸のコピー数の定量を行うことが可能とされている。
しかし、今までの遺伝子検査は核酸の抽出効率が不明な状態で、リアルタイムＰＣＲで対象核酸のコピー数定量を行っており、実際のサンプル（食品、環境水、血液、尿、組織等）内に含まれていた対象核酸の正確なコピー数がわからないという問題がある。
核酸の抽出において、抽出方法、核酸の塩基配列、抽出対象となるサンプルの種類等により、抽出効率が異なることから、毎回の作業の参考として、内部標準を加えて抽出すること方法がある。しかし、内部標準に用いるプラスミドＤＮＡは細胞膜等に覆われておらず、抽出条件がサンプルとは異なること、また内部標準を加える際はマイクロピペット等を用いるため、実際に内部標準として分注できたコピー数のバラツキが大きいことが課題としてある。
また、実際のサンプルに近いものを内部標準に用いる場合に、がん細胞やウイルス等、身体に影響を及ぼすものを扱うことは望ましくない。
特許文献１には、生体試料、臨床試料、食品等の被検試料に含まれる特定遺伝子を検出方法であって、被検試料を担持した水解性担体を、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーを含む反応液に接触させ、光学的手段を用いて反応液中に特定遺伝子が含まれるか否かを検出することを含む方法が開示されている。特許文献１に記載の方法によれば、被検試料に含まれる核酸の分離及び精製等の前処理を必要とせず、被検試料に含まれる遺伝子を増幅することができ、被検試料に含まれる特定遺伝子を高感度に検出できる。
しかしながら、特許文献１に記載の方法では、内部標準となるものがないことから、抽出対象となる被検試料からの核酸の抽出効率は依然不明なままであり、検出された遺伝子の正確なコピー数を知ることができない。
本発明は、正確な核酸の抽出効率が得られる、新規の担体を提供する。
担体は、特定の数の細胞Ａが担持された担持部を有し、前記細胞Ａは、特定コピー数の核酸を含み、前記担持部は水解性材料からなる。
上記態様の担体によれば、正確な核酸の抽出効率が得られる担体を提供することができる。
本発明の一実施形態に係る担体を示す図である。 ポアソン分布に基づくばらつきを持った分子数と変動係数ＣＶとの関係を示すグラフである。 電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。 ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。 図４におけるピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例の模式図である。 （ａ）は、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。（ｂ）は、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。 （ａ）〜（ｃ）は、液滴の状態の一例を示す模式図である。 ウェル内に順次液滴を着弾させるための分注装置の一例を示す概略図である。 ＤＮＡ複製済みの細胞の頻度と、蛍光強度との関係の一例を示すグラフである。 液滴形成装置の一例を示す模式図である。 図１０の液滴形成装置の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。 図１０の液滴形成装置の制御手段の機能ブロックを例示する図である。 液滴形成装置の動作の一例を示すフローチャートである。 液滴形成装置の変形例を示す模式図である。 液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。 （ａ）及び（ｂ）は、飛翔する液滴に２個の蛍光粒子が含まれる場合を例示する図である。 粒子同士の重なりが生じない場合の輝度値Ｌｉと、実測される輝度値Ｌｅとの関係を例示する図である。 液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。 液滴形成装置の他の一例を示す模式図である。 マイクロ流路中を通過してきた細胞をカウントする方法の一例を示す模式図である。 吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法の一例を示す模式図である。 確率Ｐ（＞２）と平均細胞数の関係を表すグラフである。 実施例１における検量線を示すグラフである。 実施例２におけるコピー数毎の酵素濃度の違いによる核酸の抽出効率の変化を示すグラフである。 実施例２における１０、５０及び１００コピーのサンプルを用いて作成した検量線の酵素濃度の違いによる変化を示すグラフである。
以下、本発明の一実施形態に係る担体及び検査方法（以下、それぞれ単に「本実施形態の担体」、「本実施形態の検査方法」と称する場合がある）について、必要に応じて特定の実施形態及び図面を参照して説明する。かかる実施形態及び図面は、本発明の理解を容易にするための一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。すなわち、以下に説明する部材の形状、寸法、配置等については、本発明の趣旨を逸脱することなく、変更、改良され得るとともに、本発明にはその等価物が含まれる。
また、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、重複する説明は適宜省略する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
＜担体＞
図１は、本発明の一実施形態に係る担体を示す図である。
担体１は、特定の数の細胞Ａ（３）が担持された担持部２を有する基材５からなる。細胞Ａ（３）は、特定コピー数の核酸４を含む。担持部２は水解性材料からなる。
遺伝子検査装置による測定値は、上述した背景技術にも示したように、遺伝子の抽出効率の影響を受けるが、これまで遺伝子の抽出効率は不明であった。これに対して、本実施形態の担体を用いることで、後述するように、遺伝子の抽出効率を算出することができる。よって、本実施形態の担体は、細胞試料中の検出対象の遺伝子の遺伝子検査装置による測定値の正確度を検査するための担体ということができる。ここでいう細胞試料中の検出対象の遺伝子の遺伝子検査装置による測定値の正確度には、例えば、細胞試料中からの検出対象の遺伝子の抽出効率の正確度等が含まれる。
本明細書において、「遺伝子検査装置」としては、例えば、定量ＰＣＲ装置、定性ＰＣＲ装置、核酸配列決定装置（シーケンサー）（特に、次世代シーケンサー（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ：ＮＧＳ））等が挙げられる。なお、次世代シーケンサーは、近年開発の進められている一群の塩基配列解析装置であり、クローン的に増幅したＤＮＡテンプレートまたは単独ＤＮＡ分子をフローセル内で大量に並列処理を行うことによって、飛躍的に向上した解析能力を有している。
これらの中でも、遺伝子検査装置としては、定量ＰＣＲ装置が好ましい。
定量ＰＣＲ装置によって算出される検出対象の遺伝子の定量値（定量コピー数）は、以下の式で表すことができ、遺伝子の抽出効率及び増幅効率の影響を受ける。
（定量コピー数）＝［細胞試料中に存在する遺伝子のコピー数］×（抽出効率）×（増幅効率）
よって、細胞試料中の検出対象の遺伝子の定量ＰＣＲ装置による定量値の正確度には、例えば、細胞試料中からの検出対象の遺伝子の抽出効率の正確度、検出対象の遺伝子の増幅効率の正確度等が含まれる。
増幅効率は定量ＰＣＲ装置において作成される検量線から算出することができる。一方、抽出効率は、内部標準を用いることで確認することができる。
しかしながら、従来の方法では、核酸の抽出効率を確認する目的で内部標準となる核酸を用いる場合に、核酸を希釈し、マイクロピペット等を用いて核酸を分注することが一般的であった。当該方法では、希釈及び分注によるバラツキが生じるため、分注された核酸のコピー数は正確ではなかった。また、細胞に含まれた状態の核酸を用いていないことから、細胞からの核酸の抽出効率を求めることができなかった。
これに対して、担体１は、細胞Ａ（３）の細胞数は正確に計測された特定の細胞数であり、細胞Ａ（３）はそれぞれ特定コピー数の核酸４を含み、細胞Ａ（３）を担持している担持部２が水解性材料からなる。そのため、担体１を水溶液に添加した際に、水解性材料からなる担持部２は溶解又は分散し、担体に担持されている特定の細胞数の細胞Ａ（３）は水溶液中に全て分散される。よって、後述する実施例に示すように、担体１を用いる場合には、希釈及び分注によるバラツキが生じず、細胞Ａ（３）からの核酸４の抽出効率を正確に求めることができる。よって、本実施形態の担体は、細胞試料中の検出対象の遺伝子の抽出効率を算出するための担体ということもできる。
また、担体１を、細胞試料中の検出対象の遺伝子の定量ＰＣＲ装置による定量の内部標準として使用する場合に、担体１の細胞Ａ（３）からの核酸４の抽出効率を正確に把握できる。さらに、基材上に存在する核酸４の合計コピー数が異なる複数の担体１を用いて検量線を作成することで、核酸４の増幅効率を正確に把握できる。よって、本実施形態の担体を用いて算出されたこれらの抽出効率及び増幅効率を、上記検出対象の遺伝子の定量コピー数を表した式に代入することで、実際に細胞試料中に存在する検出対象の遺伝子の量を推定することができる。すなわち、本実施形態の担体を用いることで、細胞試料中の検出対象の遺伝子を正確に定量することができる。よって、本実施形態の担体は、細胞試料中の検出対象の遺伝子を正確に定量するための担体ということもできる。
細胞試料としては、検出対象の遺伝子を含む細胞を含有する試料であればよく、具体的には例えば、体液、細胞懸濁液等の各種液体が挙げられる。体液としては、全血、血清、血漿、尿、精液、母乳、汗、間質液、間質性リンパ液、骨髄液、組織液、唾液、胃液、関節液、胸水、胆汁、腹水、羊水等が挙げられる。
検出対象の遺伝子は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、例えば、生物種に特異的な配列、遺伝子多型（ＳＮＰ）等が挙げられる。
検出対象の遺伝子の長さとしては、特別な限定はなく、例えば、２０塩基以上数十万塩基以下とすることができる。
定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）としては、例えば、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ等が挙げられる。
リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲによる増幅を経時的（リアルタイム）に測定することで、増幅率に基づいて鋳型核酸を定量するものである。定量は蛍光色素を用いて行われ、主に、インターカレーション法とハイブリダイゼーション法が存在する。
インターカレーション法では、二本鎖ＤＮＡに特異的に挿入（インターカレート）して蛍光を発するインターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う。インターカレーターとしては、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ＣＡＳ番号：１６３７９５−７５−３）又はその誘導体が挙げられる。一方、ハイブリダイゼーション法ではＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いる方法が最も一般的であり、対象核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドに蛍光物質及び消光物質を結合させたプローブが用いられる。
デジタルＰＣＲは、限界希釈（各微小区画にターゲットＤＮＡが１又は０となるような希釈）したサンプルＤＮＡを微小区画内に分散させてＰＣＲ増幅を行い、微小区画ごとに増幅産物の有無を検出し、コピー数の絶対量を定量するものである。
［担持部］
担持部２は水解性材料からなる。なお、ここでいう「水解性」とは、水に溶解又は分散する性質を意味する。水解性材料としては、特別な限定はなく、０℃以上１０℃以下程度の冷水や２５℃±５℃程度の常温の水で熱をかけずに溶解又は分散するものであってもよく、５０℃以上１００℃以下程度の熱水で溶解又は分散するものであってもよい。
水解性材料としては、例えば、水解性紙、水解性フィルム等が挙げられる。市販の水解性材料としては、例えば、伊那食品工業製のクレール（８０℃以上の熱で溶解又は分散）、クレール５０（５０℃以上の熱で溶解又は分散）、クレール１００（冷水で溶解又は分散）；日本製紙パピリア製の水溶紙ＭＤＰ（例えば、１２０ＭＤＰ等）、水溶紙ＣＤ−２等が挙げられる。
担持部２の大きさは特別な限定はなく、核酸の抽出及び検出を行う反応空間及び反応液の量に合わせて適宜設定することができるが、例えば、１００μＬ程度の水溶液に対して溶解又は分散させる場合には、担持部２は１ｍｍ以上６ｍｍ以下程度の直径の円形状であることが好ましい。
本明細書において、「担持」とは、担持部２上に細胞Ａ（３）が間接的又は直接的に付着している状態を意味する。
本実施形態の担体では、担持部２に担持されている細胞Ａ（３）の細胞数が特定されており、且つ、細胞Ａ（３）中に含まれる核酸４のコピー数が特定されている。すなわち、担体１上に存在する核酸４のコピー数が特定されている。これにより、抽出前後での核酸４のコピー数を比較することができ、細胞からの核酸４の抽出効率を算出することができる。
［特定の細胞数］
本明細書において、担持部に担持されている細胞Ａの細胞数が特定されているとは、担持部に担持されている細胞Ａの細胞数が一定以上の精度で特定されていることを意味する。すなわち、実際に担持部に担持されている細胞Ａの細胞数が既知であるということができる。つまり、本明細書における特定の細胞数は、従来の系列希釈により得られる所定の細胞数（算出推定値）よりも、数としての精度、信頼性が高く、特に、１，０００以下の低細胞数領域であってもポアソン分布によらない制御された値となる。
制御された値は、概ね、不確かさを表す変動係数ＣＶが平均分子数ｘに対し、ＣＶ＜１／√ｘ又はＣＶ≦２０％のどちらかの値の大きさの中に収まっていることが好ましい。
細胞Ａの細胞数としては、特別な限定はないが、１以上５００以下が好ましく、１以上２００以下がより好ましく、１以上１００以下がさらに好ましく、１以上５０以下が特に好ましい。
［特定コピー数］
本明細書において、細胞Ａ中に含まれる核酸のコピー数が特定されているとは、細胞Ａ中に含まれる核酸の数が一定以上の精度で特定されていることを意味する。すなわち、実際に担持部に担持されている細胞中に含まれる核酸の数が既知であるということができる。
また、本明細書において、基材上に存在する核酸のコピー数が特定されているとは、基材上に存在する核酸の数が一定以上の精度で特定されていることを意味する。すなわち、実際に基材上に存在する核酸の数が既知であるということができる。
つまり、本明細書における特定コピー数は、従来の系列希釈により得られる所定のコピー数（算出推定値）よりも、数としての精度、信頼性が高く、特に、１，０００以下の低コピー数領域であってもポアソン分布によらない制御された値となる。
制御された値は、概ね、不確かさを表す変動係数ＣＶが平均分子数ｘに対し、ＣＶ＜１／√ｘ又はＣＶ≦２０％のどちらかの値の大きさの中に収まっていることが好ましい。
ここで、核酸の「コピー数」と「分子数」が対応付けられる場合もある。具体的には、例えば、核酸の塩基配列をゲノム上の２箇所に導入したＧ１期の酵母菌の場合、酵母菌数＝１なら核酸分子数（同一の染色体数）＝１、核酸のコピー数＝２となる。本明細書においては、核酸の特定コピー数を核酸の絶対数という場合がある。
本実施形態の担体を用いて、担持部に担持されている細胞Ａから核酸の抽出を行なう際に、担体を含む反応空間（以下、「ウェル」と称する場合もある）が複数存在する場合、各ウェル内に含まれる核酸のコピー数が同一であるとは、担体を反応空間に充填する際に生じる、核酸の数のばらつきが許容範囲内であることを意味する。核酸の数のばらつきが許容範囲内にあるか否かについては、以下に示す不確かさの情報に基づいて判断することができる。
核酸の特定コピー数に関する情報としては、例えば、不確かさの情報、核酸の情報等が挙げられる。
「不確かさ」とは、「測定の結果に付随した、合理的に測定量に結びつけられ得る値のばらつきを特徴づけるパラメータ」であるとＩＳＯ／ＩＥＣ Ｇｕｉｄｅ９９：２００７［国際計量計測用語−基本及び一般概念並びに関連用語（ＶＩＭ）］に定義されている。
ここで、「合理的に測定量に結びつけられ得る値」とは、測定量の真の値の候補を意味する。すなわち、不確かさとは、測定対象の製造に係る操作、機器等に起因する測定結果のばらつきの情報を意味する。不確かさが大きいほど、測定結果として予想されるばらつきが大きくなる。不確かさは、例えば、測定結果から得られる標準偏差であってもよく、真の値が所定の確率以上で含まれている値の幅として表す信頼水準の半分の値であってもよい。
不確かさは、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ ｉｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ（ＧＵＭ：ＩＳＯ／ＩＥＣ Ｇｕｉｄｅ９８−３）及びＪａｐａｎ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ Ｂｏａｒｄ Ｎｏｔｅ １０試験における測定の不確かさに関するガイドライン等に基づいて算出することができる。
不確かさを算出する方法としては、例えば、測定値等の統計を用いたタイプＡ評価法と、校正証明書、製造者の仕様書、公表されている情報等から得られる不確かさの情報を用いたタイプＢ評価法の２つの方法を適用することができる。
不確かさは、操作及び測定等の要因から得られる不確かさを全て標準不確かさに変換することにより、同じ信頼水準で表現することができる。標準不確かさとは、測定値から得られた平均値のばらつきを示す。
不確かさを算出する方法の一例としては、例えば、不確かさを引き起こす要因を抽出し、それぞれの要因の不確かさ（標準偏差）を算出する。続いて、算出したそれぞれの要因の不確かさを平方和法により合成し、合成標準不確かさを算出する。合成標準不確かさの算出において、平方和法を用いるため、不確かさを引き起こす要因の中で不確かさが十分に小さい要因については無視することができる。
不確かさの情報としては、基材上に存在する核酸の変動係数を用いてもよい。変動係数とは、例えば、核酸を含む細胞Ａを基材上に担持される際に生じる基材上に担持される細胞Ａの数（基材上に存在する核酸の合計コピー数）のばらつきの相対値を意味する。すなわち、変動係数とは、基材上に担持された細胞Ａの数（基材上に存在する核酸の合計コピー数）の担持精度を意味する。変動係数とは、標準偏差σを平均値ｘで除した値である。ここでは、標準偏差σを基材上に存在する核酸の平均コピー数（以下、単に「平均コピー数」という場合がある；基材上に担持された細胞Ａの平均細胞数、又は細胞Ａの平均担持細胞数若しくは核酸の平均担持コピー数ともいう）ｘで除した値を変動係数ＣＶとすると、下記式１の関係式になる。
Figure 2021145642
一般的に、核酸を含む細胞Ａは分散液中でポアソン分布のランダムな分布状態を取っている。そのため、段階希釈法、すなわち、ポアソン分布におけるランダムな分布状態では、標準偏差σは、平均コピー数ｘと下記式２の関係式を満たすとみなすことができる。これより、核酸を含む細胞Ａを段階希釈法により希釈した場合、標準偏差σと平均コピー数ｘとから平均コピー数ｘの変動係数ＣＶ（ＣＶ値）を、上記式１及び下記式２から導出された下記式３を用いて求めると、表１及び図２に示すようになる。ポアソン分布に基づくばらつきを持った分子数の変動係数のＣＶ値は図２から求めることができる。
Figure 2021145642
Figure 2021145642
Figure 2021145642
表１及び図２の結果から、例えば、１個当たり１コピーの核酸を含む細胞Ａを用いる場合に、基材上に１００個の細胞Ａ（すなわち、１００コピーの核酸）を段階希釈法により担持させる場合には、最終的に担体に担持される細胞Ａの細胞数（基材上に存在する核酸の合計コピー数）はその他の精度を無視しても、少なくとも１０％の変動係数（ＣＶ値）を持つことがわかる。
細胞Ａの細胞数は、変動係数のＣＶ値と、基材上に担持された細胞Ａの平均細胞ｘとが、次式、ＣＶ＜１／√ｘを満たすことが好ましく、ＣＶ＜１／２√ｘを満たすことがより好ましい。
基材上に存在する核酸の合計コピー数は、変動係数のＣＶ値と、基材上に存在する核酸の平均コピー数ｘとが、次式、ＣＶ＜１／√ｘを満たすことが好ましく、ＣＶ＜１／２√ｘを満たすことがより好ましい。
不確かさの情報としては、核酸を含む細胞Ａが担持された担体が複数存在する場合、担体に担持されている細胞の特定の細胞数（基材上に存在する核酸の特定のコピー数）に基づく、担体全体としての不確かさの情報を用いることが好ましい。
不確かさを引き起こす要因としてはいくつか考えられ、例えば、核酸が導入された細胞Ａを基材上に計数及び担持させる場合には、細胞内の核酸の数（例えば、細胞の細胞周期等）、細胞を基材上に配置する手段（インクジェット装置、インクジェット装置の動作のタイミングを制御する装置等の各部位の動作による結果を含む。例えば、細胞懸濁液を液滴化した時の液滴に含まれる細胞数等）、細胞が担体の適切な位置に配置された頻度（例えば、基材上に配置された細胞数等）、細胞が細胞懸濁液中で破壊されることにより核酸が細胞懸濁液中に混入することによるコンタミネーション（夾雑物の混入、以下、「コンタミ」という場合がある。）等が挙げられる。
核酸の情報としては、例えば、核酸の由来となる生物種や核酸の組成及び配列の情報や、核酸のコピー数に関する情報が挙げられる。核酸のコピー数に関する情報としては、例えば、細胞Ａに含まれる核酸のコピー数に関する情報や、基材上に存在する核酸のコピー数の不確かさの情報等が挙げられる。
［細胞Ａ］
細胞Ａは、生物体を形成する構造的及び機能的単位である。細胞Ａとしては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞等が挙げられる。細胞は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
真核細胞としては、特に限定されず、目的応じて適宜選択することができ、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、藻類、原生動物等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。中でも、動物細胞又は真菌細胞が好ましい。
動物細胞の由来となる動物としては、例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類等が挙げられるが、哺乳類であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マーモセット、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等が挙げられるが、ヒトが好ましい。
動物細胞は接着性細胞であってもよく、浮遊性細胞であってもよい。接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞であってもよく、組織や器官から直接採取した初代細胞を何代か継代させたものであってもよく、分化した細胞であってもよく、未分化の細胞であってもよい。
分化した細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、星細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞、類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞、ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞、骨細胞等が挙げられる。
未分化の細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の全能性幹細胞；間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞等が挙げられる。
真菌細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カビ、酵母菌等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。中でも、細胞周期を調節することができ、１倍体を使用することができる点から、酵母菌が好ましい。細胞周期とは、細胞が増えるとき、細胞分裂が生じ、細胞分裂で生じた細胞（娘細胞）が再び細胞分裂を行う細胞（母細胞）となって新しい娘細胞を生み出す過程を意味する。
酵母菌は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、Ｇ０／Ｇ１期に同調して同調培養され、Ｇ１期で固定されたものが好ましい。また、酵母菌としては、例えば、細胞周期をＧ１期に制御するフェロモン（性ホルモン）の感受性が増加したＢａｒ１遺伝子欠損酵母が好ましい。酵母菌がＢａｒ１遺伝子欠損酵母であると、細胞周期が制御できていない酵母菌の存在比率を低くすることができるため、細胞中の核酸のコピー数の増加等を防ぐことができる。
原核細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌等の真正細菌、古細菌等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
細胞Ａは、死細胞であることが好ましい。死細胞であると、分取後に細胞分裂が起こり、細胞内核酸量が変化することを防ぐことができる。細胞Ａは、光を受光したときに発光可能であることが好ましい。光を受光したときに発光可能な細胞であると、細胞の数を高精度に制御してウェル内に着弾させることができる。
細胞Ａは、光を受光した時に発光可能であることが好ましい。受光とは、光を受けることを意味する。細胞の発光は、光学センサで検出する。光学センサとは、人間の目で見ることができる可視光線と、それより波長の長い近赤外線や短波長赤外線、熱赤外線領域までの光のいずれかの光をレンズで集め、対象物である細胞の形状等を画像データとして取得する受動型センサを意味する。
光を受光したときに発光可能な細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光色素で染色された細胞、蛍光タンパク質を発現した細胞、蛍光標識抗体により標識された細胞等が挙げられる。細胞における蛍光色素による染色部位、蛍光タンパク質の発現部位、蛍光標識抗体による標識部位としては、特に制限はなく、細胞全体、細胞核、細胞膜等が挙げられる。
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類等が挙げられる。これらは１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。中でも、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、又はシアニン類が好ましく、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３、又はＣｙ３がより好ましい。
蛍光色素としては、市販品を用いることができ、市販品としては、例えば、商品名：ＥｏｓｉｎＹ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：エバンスブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：トリパンブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン６Ｇ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミンＢ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン１２３（和光純薬工業株式会社製）等が挙げられる。
蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ−ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲ等が挙げられる。これらは１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
蛍光標識抗体は、対象細胞に結合することができ、蛍光標識されていれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ８抗体等が挙げられる。これらは１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
細胞の体積平均粒径は、遊離状態において、３０μｍ以下が好ましく、１０μｍ以下がより好ましく、７μｍ以下が特に好ましい。体積平均粒径が、３０μｍ以下であれば、インクジェット法やセルソーター等の液滴吐出手段に好適に用いることができる。
細胞の体積平均粒径は、例えば、次のような測定方法で測定することができる。細胞として酵母を用いた場合、作製した染色済み酵母分散液から１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに載せ、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いること等により体積平均粒径を測定することができる。なお、細胞数も同様の測定方法により求めることができる。
細胞懸濁液における細胞の密度は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができるが、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下が好ましく、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０７個／ｍＬ以下がより好ましい。細胞密度が上記の範囲であると、吐出した液滴中に細胞を確実に含むことができる。細胞密度は、体積平均粒径の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いて測定することができる。
細胞Ａは、検出対象の遺伝子を含む細胞と、由来となる生物種又は細胞種が同一であることが好ましく、由来となる生物種及び細胞種が同一であることがより好ましい。これにより、検出対象の遺伝子により近しい条件で、細胞Ａから核酸を抽出することができ、より正確な抽出効率を把握することができる。
また、本実施形態の担体において、細胞Ａとしては、細胞と同一条件を再現できるものであれば、上述した細胞の代わりに、細胞以外のものを利用することもできる。細胞以外のものとしては、例えば、リポソーム、マイクロカプセル、ウイルス、ドロップレット、エマルジョン等の形態が挙げられる。
（リポソーム）
リポソームとは、脂質分子を含む脂質二重層から形成される脂質小胞体であり、具体的には、脂質分子の疎水性基と親水性基の極性に基づいて生じる脂質二重層により外界から隔てられた空間を有する閉鎖された脂質を含む小胞体を意味する。
リポソームは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームはシングルラメラ（単層ラメラ、ユニラメラ、二重層膜が一重）であっても、多層ラメラ（マルチラメラ、タマネギ状の構造をした多数の二重層膜で、個々の層は水様の層で仕切られている）であってもよい。
リポソームは、核酸を内包することができるものであればよく、その形態は特に限定されない。「内包」とは、リポソームに対して核酸が内水相又は膜自体に含まれる形態をとることを意味する。例えば、膜で形成された閉鎖空間内に核酸を封入する形態、膜自体に核酸を内包する形態等が挙げられ、これらの組合せでもよい。
リポソームの大きさ（平均粒子径）は、核酸を内包することができ、検出対象の遺伝子を含む細胞と同程度の大きさであれば特に限定されない。また、形態は球状又はそれに近い形態が好ましい。
リポソームの脂質二重層を構成する成分（膜成分）は、脂質から選ばれる。脂質としては、水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒に溶解するものであれば任意に使用することができる。具体的な脂質としては、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類、それらの誘導体等が挙げられる。これらの成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
（マイクロカプセル）
マイクロカプセルとは、壁材と中空構造とを有する微小な粒体を意味し、中空構造に核酸を内包することができる。マイクロカプセルは、特に限定されず、適宜目的に応じて、壁材、大きさ等を選択することができる。
マイクロカプセルの壁材としては、例えば、ポリウレタン樹脂、ポリ尿素、ポリ尿素−ポリウレタン樹脂、尿素−ホルムアルデヒド樹脂、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂、ポリアミド、ポリエステル、ポリスルホンアミド、ポリカーボネート、ポリスルフィネート、エポキシリ、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、酢酸ビニル、ゼラチン等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
マイクロカプセルの大きさは、核酸を内包することができ、検出対象の遺伝子を含む細胞と同程度の大きさであれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。マイクロカプセルの製造方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｉｎ−ｓｉｔｕ法、界面重合法、コアセルベーション法等が挙げられる。
［核酸］
一般に、核酸とは、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味し、核酸アナログ等も含まれる。核酸としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられる。核酸は核酸断片であってもよいし、細胞Ａの核中の核酸ａに組み込まれていてもよいが、細胞Ａの核中の核酸ａに組み込まれていることが好ましい。
核酸の配列は、真核生物、原核生物、多細胞生物、単細胞生物のいずれの生物に由来する配列であってもよい。真核生物としては、例えば、動物、昆虫、植物、真菌、藻類、原生動物等が挙げられる。動物としては、上記「細胞Ａ」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。
人工合成核酸とは、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡと同様の構成成分（塩基、デオキシリボース、リン酸）からなる核酸を人工的に合成した核酸を意味する。人工合成核酸は、例えば、タンパク質をコードする塩基配列を有する核酸であってもよく、任意の塩基配列を有する核酸であってもよい。
核酸又は核酸断片のアナログとしては、核酸又は核酸断片に非核酸成分を結合させたもの、核酸又は核酸断片を蛍光色素や同位元素等の標識剤で標識したもの（例えば、蛍光色素や放射線同位体で標識されたプライマーやプローブ）、核酸又は核酸断片を構成するヌクレオチドの一部の化学構造を変化させた人工核酸（例えば、ＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡ等）が挙げられる。
核酸の形態は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖核酸、一本鎖核酸、部分的に二本鎖又は一本鎖である核酸等が挙げられ、環状又は直鎖状のプラスミドであってもよい。また、核酸は修飾又は変異を有していてもよい。
核酸は、塩基配列が明らかな特定の塩基配列を有することが好ましい。特定の塩基配列は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遺伝子疾患検査に用いられる塩基配列、自然界には存在しない非天然の塩基配列、動物細胞由来の塩基配列、植物細胞由来の塩基配列、真菌細胞由来の塩基配列、細菌由来の塩基配列、ウイルス由来の塩基配列等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
核酸は、使用する細胞由来の核酸であってもよく、遺伝子導入により導入された核酸であってもよい。細胞Ａに含まれる核酸の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよいが、１種類であることが好ましい。
細胞Ａに含まれる核酸のコピー数は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０、１００コピーとすることができる。また、基材上に細胞Ａが２個以上の複数担持されている場合に、細胞Ａに含まれる核酸のコピー数は同一であってもよく、異なっていてもよいが、効率よく担体を製造できることから、同一であることが好ましい。
中でも、１個の細胞Ａに１コピーの核酸が含まれることが好ましい。この場合、「細胞Ａの細胞数」＝「基材上に存在する核酸の合計コピー数」とすることができ、より簡便に基材上に存在する核酸の合計コピー数を把握することができる。
核酸として、細胞の核中に遺伝子導入により組み込まれた核酸を使用する場合には、１細胞に特定コピー数（例えば、１コピー）の核酸が導入されていることを確認することが好ましい。特定コピー数の核酸が導入されていることの確認方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シーケンス、ＰＣＲ法、サザンブロット法等が挙げられる。
細胞の核中に核酸を導入する場合、遺伝子導入の方法としては、特定の核酸配列が目的の場所に目的のコピー数導入できれば特に限定されず、例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ＴＡＬＥＮ、Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｆｌｉｐ−ｉｎ、Ｊｕｍｐ−ｉｎ等が挙げられる。あるいは、プラスミド、人工染色体等の形態で細胞の核中に核酸を導入してもよい。例えば、細胞として酵母菌（酵母細胞）を用いる場合、これらの中でも効率の高さ及び制御のしやすさの点から、相同組換えが好ましい。
核酸は、検出対象の遺伝子と同一の配列からなってもよく、異なる配列からなってもよい。本実施形態の担体を、検出対象の遺伝子が含まれる細胞試料と別の反応空間で細胞Ａから核酸の抽出及び核酸の検出を行う場合には、検出対象の遺伝子により近い条件で核酸の抽出及び検出を行えることから、核酸は、検出対象の遺伝子と同一の配列からなることが好ましい。一方、本実施形態の担体を、検出対象の遺伝子が含まれる細胞試料と同じ反応空間で、細胞Ａから核酸の抽出及び核酸の検出を行う場合には、核酸は検出対象の遺伝子と異なる配列からなることが好ましい。核酸が検出対象の遺伝子と異なる配列からなる場合に、検出対象の遺伝子により近い条件で核酸の抽出及び検出を行うために、核酸の長さは検出対象の遺伝子の長さと同一、又は、検出対象の遺伝子よりも１塩基以上１０塩基以下程度、好ましくは、１塩基以上５塩基以下程度の長い若しくは短い塩基数が好ましい。また、塩基長と同様の理由から、核酸のＧＣ含量は、検出対象の遺伝子と同一、又は、検出対象の遺伝子よりも１％以上５％以下程度、好ましくは１％以上３％以下程度高い若しくは低い値であることが好ましい。
［基材］
基材５は担持部２を有する。基材５は、担持部２を含む全体が水解性材料からなってもよく、担持部２のみが水解性材料からなり、その他の部分は水解性を有しない（非水解性）材料からなってもよい。基材に用いられ得る非水解性材料としては、細胞毒性を有しない又は細胞毒性が比較的低い材料であることが好ましく、具体的には、例えば、ポリホスファゼン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド（例えば、ナイロン等）、ポリエステルアミド、ポリ（アミノ酸）、ポリ無水物、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート（アクリル樹脂）、ポリアルキレン（例えば、ポリエチレン等）、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール等）、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド等）、ポリアルキレンテレフタレート（例えば、ポリエチレンテレフタレート等）、ポリオルトエステル、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリエステル、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド等）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリ［ラクチド−ｃｏ−（ε−カプロラクトン）］、ポリ［グリコリド−ｃｏ−（ε−カプロラクトン）］等）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、及びこれらのコポリマー等が挙げられ、これらに限定されない。
基材の形状は、特別な限定はなく、シート状であってもよく、球状であってもよい。大きさについても、特別な限定はなく、核酸の抽出及び検査を行う反応空間の大きさに合わせて、適宜設定することができる。
＜担体の製造方法＞
本実施形態の担体の製造方法（以下、単に「本実施形態の製造方法」と称する場合がある）について、以下に説明する。
本実施形態の製造方法は、特定コピー数の核酸を細胞Ａの核中の核酸ａに組み込む組み込み工程と、特定コピー数の核酸が核中の核酸ａに組み込まれた細胞を１つ含む液滴を作製し、当該液滴の個数を制御することにより基材上に特定の個数の細胞を担持させる核酸担持工程と、を含む。本実施形態の製造方法は、細胞懸濁液精製工程及び細胞数計数工程を更に含むことが好ましく、細胞懸濁液生成工程、核酸担持工程及び細胞数計数工程において推定した基材上に存在する核酸のコピー数の確からしさを算出する工程、出力工程及び記録工程を更に含むことがより好ましく、更に必要に応じてその他の工程を含む。
［組み込み工程］
組み込み工程では、特定コピー数の核酸を細胞Ａの核中の核酸ａに組み込む。
細胞Ａの核中の核酸ａに組み込まれる核酸のコピー数は、特定のコピー数であれば、特に限定はないが、導入効率の観点から、１コピーであることが好ましい。
核酸の細胞Ａの核中の核酸ａへの組み込み方法としては、上記「核酸」において「遺伝子導入の方法」として例示された方法と同様の方法が挙げられる。
［核酸担持工程］
核酸担持工程では、核中の核酸ａに核酸が組み込まれた細胞Ａを１つ含む液滴を作製し、当該液滴の個数を制御することにより特定の個数の細胞Ａを基材上に担持させる。なお、液滴とは、表面張力によりまとまった液体のかたまりを意味する。
液滴の作製及び充填は、例えば、核中の核酸ａに核酸が組み込まれた細胞Ａを含む細胞懸濁液を液滴として吐出することにより基材上に液滴を順次着弾させることで達成できる。吐出とは、細胞懸濁液を液滴として飛翔させることを意味する。順次とは、次々に順序どおりにすることを意味する。着弾とは、液滴を基材上に到達させることを意味する。
基材としては、水解性材料からなる担持部を有するものであればよく、具体的には、上記「基材」において説明したものと同様のものが挙げられる。
吐出手段としては、細胞懸濁液を液滴として吐出する手段（以下、「吐出ヘッド」とも称することがある）を好適に用いることができる。
細胞懸濁液を液滴として吐出する方式としては、例えば、インクジェット法におけるオンデマンド方式、コンティニュアス方式等が挙げられる。これらの中でもコンティニュアス方式の場合、安定的な吐出状態に至るまでの空吐出、液滴量の調整、ウェル間を移動する際にも連続的に液滴形成を行い続ける等の理由から、用いる細胞懸濁液のデッドボリュームが多くなる傾向にある。本実施形態では細胞数を調整する観点からデッドボリュームによる影響を低減させることが好ましく、そのため、上記２つの方式では、オンデマンド方式の方がより好適である。
オンデマンド方式としては、例えば、液体に圧力を加えることによって液体を吐出する圧力印加方式、加熱による膜沸騰によって液体を吐出するサーマル方式、静電引力によって液滴を引っ張ることによって液滴を形成する静電方式等の既知の複数の方式等が挙げられる。これらの中でも、以下の理由から、圧力印加方式が好ましい。
静電方式は、細胞懸濁液を保持して液滴を形成する吐出部に対向して電極を設置する必要がある。本実施形態の製造方法では、液滴を受けるためのプレートが対向して配置されており、プレート構成の自由度を上げるため電極の配置は無いことが好ましい。サーマル方式は、局所的な加熱が発生するため生体材料である細胞への影響や、ヒーター部への焦げ付き（コゲーション）が懸念される。熱による影響は、含有物やプレートの用途に依存するため、一概に除外する必要はないが、圧力印加方式は、サーマル方式よりヒーター部への焦げ付きの懸念がないという点から好ましい。
圧力印加方式としては、ピエゾ素子を用いて液体に圧力を加える方式、電磁バルブ等のバルブによって圧力を加える方式等が挙げられる。細胞懸濁液の液滴吐出に使用可能な液滴生成デバイスの構成例を図３〜５に示す。
図３は、電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。電磁バルブ方式の吐出ヘッドは、電動機１３ａ、電磁弁１１２、液室１１ａ、細胞懸濁液３００ａ及びノズル１１１ａを有する。電磁バルブ方式の吐出ヘッドとしては、例えば、ＴｅｃｈＥｌａｎ社のディスペンサ等を好適に用いることができる。
図４は、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。ピエゾ方式の吐出ヘッドは、圧電素子１３ｂ、液室１１ｂ、細胞懸濁液３００ｂ及びノズル１１１ｂを有する。ピエゾ方式の吐出ヘッドとしては、Ｃｙｔｅｎａ社のシングルセルプリンター等を好適に用いることができる。
これらの吐出ヘッドのいずれも用いることが可能であるが、電磁バルブによる圧力印加方式では高速に繰り返し液滴を形成することができないため、プレートの生成のスループットを上げるためにはピエゾ方式を用いることが好ましい。また、一般的な圧電素子１３ｂを用いたピエゾ方式の吐出ヘッドでは、沈降によって細胞濃度のムラが発生すること
や、ノズル詰まりが生じることが問題として生じることがある。
このため、より好ましい構成として図５に示した構成等が挙げられる。図５は、図４における圧電素子を用いたピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例の模式図である。図５の吐出ヘッドは、圧電素子１３ｃ、液室１１ｃ、細胞懸濁液３００ｃ及びノズル１１１ｃを有する。
図５の吐出ヘッドでは、図示していない制御装置から圧電素子１３ｃに対して電圧印加することにより、紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレン１２ｃを紙面上下方向に変形させることができる。
オンデマンド方式以外の方式としては、例えば、連続的に液滴を形成させるコンティニュアス方式等が挙げられる。コンティニュアス方式では、液滴を加圧してノズルから押し出す際に圧電素子やヒーターによって定期的なゆらぎを与え、それによって微小な液滴を連続的に作り出すことができる。更に、飛翔中の液滴の吐出方向を、電圧を印加することによって制御することにより、ウェルに着弾させるか、回収部に回収するかを選ぶことも可能である。このような方式は、セルソーター又はフローサイトメーターで用いられており、例えば、ソニー株式会社製の装置名：セルソーターＳＨ８００Ｚを用いることができる。
図６（ａ）は、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。また、図６（ｂ）は、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。図６（ａ）は、液滴を形成するための駆動電圧を示す。電圧（ＶＡ、ＶＢ、ＶＣ）の強弱により、液滴を形成することができる。図（ｂ）は、液滴の吐出を行わずに細胞懸濁液を撹拌するための電圧を示している。
液滴を吐出しない期間中に、液滴を吐出するほどには強くない複数のパルスを入力することによって、液質内の細胞懸濁液を撹拌することが可能であり、細胞沈降による濃度分布の発生を抑制することができる。
本実施形態において使用することができる吐出ヘッドの液滴形成動作に関して、以下に説明する。吐出ヘッドは、圧電素子に形成された上下電極に、パルス状の電圧を印加することにより液滴を吐出することができる。図７（ａ）〜（ｃ）は、それぞれのタイミングにおける液滴の状態を示す模式図である。
まず、図７（ａ）に示すように、圧電素子１３ｃに電圧を印加することにより、メンブレン１２ｃが急激に変形し、それにより、液室１１ｃ内に保持された細胞懸濁液とメンブレン１２ｃとの間に高い圧力が発生し、この圧力によってノズル部から液滴が外に押し出される。
次に、図７（ｂ）に示すように、圧力が上方に緩和するまでの時間、ノズル部からの液押し出しが続き液滴が成長する。最後に、図７（ｃ）に示すように、メンブレン１２ｃが元の状態に戻る際に細胞懸濁液とメンブレン１２ｃとの界面近傍の液圧力が低下し、液滴３１０’が形成される。
本実施形態の製造方法では、基材を移動可能なステージ上に固定し、ステージの駆動と吐出ヘッドとからの液滴形成を組み合わせることにより、基材上の水解性材料からなる担持部に順次液滴を着弾させてもよい。ここで、ステージの移動として基材を移動させる方法を示したが、当然のことながら吐出ヘッドを移動させてもよい。
図８は、基材上の水解性材料からなる担持部に順次液滴を着弾させるための分注装置４００の一例を示す概略図である。図８に示すように、液滴を着弾させるための分注装置４００は、液滴形成装置４０１と、基材７００と、ステージ８００と、制御装置９００とを有している。
分注装置４００において、基材７００は、移動可能に構成されたステージ８００上に配置されている。基材７００には液滴形成装置４０１の吐出ヘッドから吐出された液滴３１０が着滴する水解性材料からなる担持部７１０が形成されている。制御装置９００は、ステージ８００を移動させ、液滴形成装置４０１の吐出ヘッドと担持部７１０との相対的な位置関係を制御する。これにより、液滴形成装置４０１の吐出ヘッドから担持部７１０上に順次、蛍光染色細胞３５０を含む液滴３１０を吐出することができる。
制御装置９００は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、制御装置９００の各種機能は、ＲＯＭ等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてＣＰＵにより実行されることによって実現できる。ただし、制御装置９００の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。また、制御装置９００は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。
吐出する液滴としては、基材上に細胞懸濁液を着弾させる際に、複数の水準を得るように液滴を基材上に着弾させることが好ましい。複数の水準とは、標準となる複数の基準を意味する。複数の水準としては、例えば、基材上に核酸を有する複数の細胞Ａが所定の濃度勾配が挙げられる。複数の水準は、センサによって計数される値を用いて制御することができる。
［細胞懸濁液生成工程］
細胞懸濁液生成工程は、核中の核酸ａに上記核酸が導入された複数の細胞Ａ及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する工程である。溶剤とは、細胞を分散させるために用いる液体を意味する。細胞懸濁液における懸濁とは、細胞が溶剤中に分散して存在する状態を意味する。生成とは、作り出すことを意味する。
（細胞懸濁液）
細胞懸濁液は、核中の核酸ａに上記核酸が導入された複数の細胞Ａ及び溶剤を含み、添加剤を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の成分を含む。核中の核酸ａに上記核酸が導入された複数の細胞については、上記「細胞Ａ」において説明したとおりである。
（溶剤）
溶剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、培養液、分離液、希釈液、緩衝液、有機物溶解液、有機溶剤、高分子ゲル溶液、コロイド分散液、電解質水溶液、無機塩水溶液、金属水溶液又はこれらの混合液体等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。中でも、水、緩衝液が好ましく、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）がより好ましい。
（添加剤）
添加剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤、核酸、樹脂等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
界面活性剤は、細胞同士の凝集を防止し、連続吐出安定性を向上することができる。界面活性剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、添加量にもよるが、タンパク質を変性及び失活させない点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。中でも、脂肪酸ナトリウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がより好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ等）、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘシリーズ、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡシリーズ、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐシリーズ、Ｎｉｋｋｏｌ ＯＰシリーズ等）、ポリソルベート類（Ｔｗｅｅｎ２０等のＴｗｅｅｎシリーズ等）、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリド等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。中でも、ポリソルベート類が好ましい。
界面活性剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞懸濁液全量に対して、０．００１質量％以上３０質量％以下が好ましい。含有量が、０．００１質量％以上であると、界面活性剤の添加による効果を得ることができ、３０質量％以下であると、細胞Ａの凝集を抑制することができるため、細胞懸濁液中の核酸のコピー数を厳密に制御することができる。
核酸としては、細胞Ａに含まれる核酸又は検査対象の遺伝子の検出に影響しないものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣｏｌＥ１ ＤＮＡ等が挙げられる。核酸を添加すると、細胞Ａに含まれる核酸又は検査対象の遺伝子の抽出及び検出を行う際に用いられるウェルの壁面等に付着することを防ぐことができる。
樹脂としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンイミド等が挙げられる。
（その他の成分）
その他の成分としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、分散剤等が挙げられる。
細胞Ａを分散する方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビーズミル等のメディア方式、超音波ホモジナイザー等の超音波方式、フレンチプレス等の圧力差を利用する方式等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから超音波方式が好ましい。メディア方式では、解砕能力が強いため、細胞膜や細胞壁を破壊することや、メディアがコンタミとして混入することがある。
細胞Ａのスクリーニング方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、湿式分級、セルソーター、フィルタによるスクリーニング等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。中でも、細胞へのダメージが少ないことから、セルソーター、フィルタによるスクリーニングが好ましい。
細胞Ａは、細胞の細胞周期を測定することにより、細胞懸濁液に含まれる細胞数から核酸のコピー数を推定することが好ましい。細胞周期を測定するとは、細胞分裂による細胞数を数値化することを意味する。核酸のコピー数を推定するとは、細胞数から、核酸のコピー数を求めることを意味する。
計数対象が細胞数ではなく核酸が何個入っているかであってもよい。通常は、細胞Ａ １個につき核酸が１コピー導入されたものを選択するか、又は、遺伝子組換えにより核酸を細胞Ａに導入するため、核酸の数は細胞数と等しいと考えてよい。ただし、細胞Ａは特定の周期で細胞分裂を起こすため、細胞Ａ内で核酸の複製が行われる。細胞周期は細胞Ａの種類によって異なるが、細胞懸濁液から所定量の溶液を抜き取り複数細胞の周期を測定することによって、細胞１個中に含まれる核酸の数に対する期待値及びその確からしさを算出することが可能である。これは、例えば、核染色した細胞Ａをフローサイトメーターによって観測することによって可能である。
確からしさとは、いくつかの事象の生じる可能性がある場合に、特定の１つの事象が起こる可能性の程度を事前に予測して、その事象の起こる確率を意味する。算出とは、計算して求める数値を出すことを意味する。
図９は、ＤＮＡ複製済みの細胞の頻度と、蛍光強度との関係の一例を示すグラフである。図９に示すように、ヒストグラム上でＤＮＡの複製有無により２つのピークが現れるため、ＤＮＡ複製済みの細胞がどの程度の割合で存在するかを算出することが可能である。この算出結果から１細胞中に含まれる平均的な核酸のコピー数を算出することが可能であり、前述の細胞数計数結果に乗じることにより、核酸の推定コピー数を算出することが可能である。
また、細胞懸濁液を作製する前に細胞周期を制御する処理を行うことが好ましく、上述したような複製が起きる前又は後の状態に揃えることによって、核酸のコピー数を細胞数からより精度良く算出することが可能になる。
推定する特定のコピー数は、確からしさ（確率）を算出することが好ましい。確からしさ（確率）を算出することにより、これらの数値に基づき確からしさを分散又は標準偏差として表現して出力することが可能である。複数因子の影響を合算する場合には、一般的に用いられる標準偏差の二乗和平方根を用いることが可能である。例えば、因子として吐出した細胞数の正答率、細胞内のＤＮＡ数、吐出された細胞がウェル内に着弾する着弾率等を用いることができる。これらの中で影響の大きい項目を選択して算出することもできる。
［細胞数計数工程］
細胞数計数工程は、液滴の作製後、かつ液滴の基材への着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する工程である。センサとは、自然現象や人工物の機械的・電磁気的、熱的、音響的又は化学的性質、あるいはそれらにより示される空間情報・時間情報を、何らかの科学的原理を応用して、人間や機械が扱い易い別媒体の信号に置き換える装置を意味する。計数とは、数を数えることを意味する。
細胞数計数工程としては、液滴の吐出後、かつ液滴の担持部への着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数すれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を含んでいてもよい。
液滴の吐出後、かつ液滴の担持部への着弾前に、液滴に含まれる細胞数の計数としては、液滴が基材の担持部に確実に接触することが予測される担持部の直上の位置にあるタイミングにて液滴中の細胞を観測することが好ましい。
液滴中の細胞を観測する方法としては、例えば、光学的に検出する方法、電気的又は磁気的に検出方法等が挙げられる。
（光学的に検出する方法）
図１０、図１４及び図１５を用いて、光学的に検出する方法に関して以下に述べる。図１０は、液滴形成装置４０１の一例を示す模式図である。図１４及び図１５は、液滴形成装置の他の一例（４０１Ａ、４０１Ｂ）を示す模式図である。図１０に示すように、液滴形成装置４０１は、吐出ヘッド（液滴吐出手段）１０と、駆動手段２０と、光源３０と、受光素子６０と、制御手段７０とを有する。
図１０では、細胞懸濁液として細胞を特定の色素によって蛍光染色した後に所定の溶液に分散した液を用いており、吐出ヘッドから形成した液滴に光源から発せられる特定の波長を有する光を照射し細胞から発せられる蛍光を受光素子によって検出することによって計数を行う。このとき、蛍光色素によって細胞を染色する方法に加え、細胞中に元々含まれる分子が発する自家蛍光を利用してもよいし、細胞に蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ））をコードする遺伝子を予め導入しておき細胞が蛍光を発するようにしておいてもよい。光を照射するとは、光をあてることを意味する。
吐出ヘッド１０は、液室１１と、メンブレン１２と、駆動素子１３とを有しており、蛍光染色細胞３５０を懸濁した細胞懸濁液３００を液滴として吐出することができる。
液室１１は、蛍光染色細胞３５０を懸濁した細胞懸濁液３００を保持する液体保持部であり、下面側には貫通孔であるノズル１１１が形成されている。液室１１は、例えば、金属やシリコン、セラミックス等から形成することができる。蛍光染色細胞３５０としては、蛍光色素によって染色された無機微粒子や有機ポリマー粒子等が挙げられる。
メンブレン１２は、液室１１の上端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２の平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
駆動素子１３は、メンブレン１２の上面側に設けられている。駆動素子１３の形状は、メンブレン１２の形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２の平面形状が円形である場合には、円形の駆動素子１３を設けることが好ましい。
駆動素子１３に駆動手段２０から駆動信号を供給することにより、メンブレン１２を振動させることができる。メンブレン１２の振動により、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０を、ノズル１１１から吐出させることができる。
駆動素子１３として圧電素子を用いる場合には、例えば、圧電材料の上面及び下面に電圧を印加するための電極を設けた構造とすることができる。この場合、駆動手段２０から圧電素子の上下電極間に電圧を印加することによって紙面横方向に圧縮応力が加わり、メンブレン１２を紙面上下方向に振動させることができる。圧電材料としては、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）を用いることができる。この他にも、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、或いはこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたもの等、様々な圧電材料を用いることができる。
光源３０は、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。なお、飛翔中とは、液滴３１０が液滴吐出手段１０から吐出されてから、着滴対象物に着滴するまでの状態を意味する。飛翔中の液滴３１０は、光Ｌが照射される位置では略球状となっている。又、光Ｌのビーム形状は略円形状である。
ここで、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１０倍〜１００倍程度であることが好ましい。これは、液滴３１０の位置ばらつきが存在する場合においても、光源３０からの光Ｌを確実に液滴３１０に照射するためである。
ただし、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１００倍を大きく超えることは好ましくない。これは、液滴３１０に照射される光のエネルギー密度が下がるため、光Ｌを励起光として発する蛍光Ｌｆの光量が低下し、受光素子６０で検出し難くなるからである。
光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましく、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザー等が好適に用いられる。光Ｌがパルス光である場合のパルス幅は１０μｓ以下が好ましく、１μｓ以下がより好ましい。単位パルス当たりのエネルギーとしては、集光の有無等、光学系に大きく依存するが、概ね０．１μＪ以上が好ましく、１μＪ以上がより好ましい。
受光素子６０は、飛翔中の液滴３１０に蛍光染色細胞３５０が含有されていた場合に、蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として吸収して発する蛍光Ｌｆを受光する。蛍光Ｌｆは、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられるため、受光素子６０は蛍光Ｌｆを受光可能な任意の位置に配置することができる。この際、コントラストを向上するため、光源３０から出射される光Ｌが直接入射しない位置に受光素子６０を配置することが好ましい。
受光素子６０は、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆを受光できる素子であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、液滴に特定の波長を有する光を照射して液滴内の細胞からの蛍光を受光する光学センサが好ましい。受光素子６０としては、例えば、フォトダイオード、フォトセンサ等の１次元素子が挙げられるが、高感度な測定が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードを用いることが好ましい。受光素子６０として、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤ等の２次元素子を用いてもよい。
なお、光源３０が発する光Ｌと比較して蛍光染色細胞３５０の発する蛍光Ｌｆが弱いため、受光素子６０の前段（受光面側）に光Ｌの波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。これにより、受光素子６０において、非常にコントラストの高い蛍光染色細胞３５０の画像を得ることができる。フィルタとしては、例えば、光Ｌの波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタ等を用いることができる。
また、前述のように、光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましいが、光源３０から発せられる光Ｌを連続発振の光としてもよい。この場合には、連続発振の光が飛翔中の液滴３１０に照射されるタイミングで受光素子６０が光を取り込み可能となるように制御し、受光素子６０に蛍光Ｌｆを受光させることが好ましい。
制御手段７０は、駆動手段２０及び光源３０を制御する機能を有している。また、制御手段７０は、受光素子６０が受光した光量に基づく情報を入手し、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する機能を有している。以下、図１１〜図１３を参照し、制御手段７０の動作を含む液滴形成装置４０１の動作について説明する。
図１１は、図１０の液滴形成装置の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。図１２は、図１０の液滴形成装置の制御手段の機能ブロックを例示する図である。図１３は、液滴形成装置の動作の一例を示すフローチャートである。
図１１に示すように、制御手段７０は、ＣＰＵ７１と、ＲＯＭ７２と、ＲＡＭ７３と、通信インターフェイス（通信Ｉ／Ｆ）７４と、バスライン７５とを有している。ＣＰＵ７１、ＲＯＭ７２、ＲＡＭ７３及びＩ／Ｆ７４は、バスライン７５を介して相互に接続されている。
ＣＰＵ７１は、制御手段７０の各機能を制御する。記憶手段であるＲＯＭ７２は、ＣＰＵ７１が制御手段７０の各機能を制御するために実行するプログラムや、各種情報を記憶している。記憶手段であるＲＡＭ７３は、ＣＰＵ７１のワークエリア等として使用される。また、ＲＡＭ７３は、所定の情報を一時的に記憶することができる。Ｉ／Ｆ７４は、液滴形成装置４０１を他の機器等と接続するためのインターフェイスである。液滴形成装置４０１は、Ｉ／Ｆ７４を介して、外部ネットワーク等と接続されてもよい。
図１２に示すように、制御手段７０は、機能ブロックとして、吐出制御手段７０１と、光源制御手段７０２と、細胞数計数手段（細胞数検知手段）７０３とを有している。
図１２及び図１３を参照しながら、液滴形成装置４０１の細胞数計数について説明する。まず、ステップＳ１１において、制御手段７０の吐出制御手段７０１は、駆動手段２０に吐出の指令を出す。吐出制御手段７０１から吐出の指令を受けた駆動手段２０は、駆動素子１３に駆動信号を供給してメンブレン１２を振動させる。メンブレン１２の振動により、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０が、ノズル１１１から吐出される。
次に、ステップＳ１２において、制御手段７０の光源制御手段７０２は、液滴３１０の吐出に同期して（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号に同期して）光源３０に点灯の指令を出す。これにより、光源３０が点灯し、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。
なお、ここで、同期するとは、液滴吐出手段１０による液滴３１０の吐出と同時に（駆動手段２０が液滴吐出手段１０に駆動信号を供給するのと同時に）発光することではなく、液滴３１０が飛翔して所定位置に達したときに液滴３１０に光Ｌが照射されるタイミングで、光源３０が発光することを意味する。つまり、光源制御手段７０２は、液滴吐出手段１０による液滴３１０の吐出（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号）に対して、所定時間だけ遅延して発光するように光源３０を制御する。
例えば、液滴吐出手段１０に駆動信号を供給した際に吐出する液滴３１０の速度ｖを予め測定しておく。そして、測定した速度ｖに基づいて液滴３１０が吐出されてから所定位置まで到達する時間ｔを算出し、液滴吐出手段１０に駆動信号を供給するタイミングに対して、光源３０が光を照射するタイミングをｔだけ遅延させる。これにより、良好な発光制御が可能となり、光源３０からの光を確実に液滴３１０に照射することができる。
次に、ステップＳ１３において、制御手段７０の細胞数計数手段７０３は、受光素子６０からの情報に基づいて、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する。ここで、受光素子６０からの情報とは、蛍光染色細胞３５０の輝度値（光量）や面積値である。
細胞数計数手段７０３は、例えば、受光素子６０が受光した光量と予め設定された閾値とを比較して、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。この場合には、受光素子６０として１次元素子を用いても２次元素子を用いても構わない。
受光素子６０として２次元素子を用いる場合は、細胞数計数手段７０３は、受光素子６０から得られた２次元画像に基づいて、蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積を算出するための画像処理を行う手法を用いてもよい。この場合、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。
なお、蛍光染色細胞３５０は、細胞や染色細胞であってもよい。染色細胞とは、蛍光色素によって染色された細胞、又は、蛍光タンパク質を発現可能な細胞を意味する。染色細胞において、蛍光色素としては、上述したものを用いることができる。また、蛍光タンパク質としては、上述したものを用いることができる。
このように、液滴形成装置４０１では、蛍光染色細胞３５０を縣濁した細胞懸濁液３００を保持する液滴吐出手段１０に、駆動手段２０から駆動信号を供給して、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０を吐出させ、飛翔中の液滴３１０に光源３０から光Ｌを照射する。そして、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として蛍光Ｌｆを発し、蛍光Ｌｆを受光素子６０が受光する。更に、受光素子６０からの情報に基づいて、細胞数計数手段７０３が、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を計数（カウント）する。
つまり、液滴形成装置４０１では、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を実際にその場で観察するため、蛍光染色細胞３５０の個数の計数精度を従来よりも向上することが可能となる。又、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０に光Ｌを照射して蛍光Ｌｆを発光させて蛍光Ｌｆを受光素子６０で受光するため、高いコントラストで蛍光染色細胞３５０の画像を得ることが可能となり、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を低減できる。
図１４は、図１０の液滴形成装置４０１の変形例を示す模式図である。図１４に示すように、液滴形成装置４０１Ａは、受光素子６０の前段にミラー４０を配置した点が、液滴形成装置４０１（図１０参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
このように、液滴形成装置４０１Ａでは、受光素子６０の前段にミラー４０を配置したことにより、受光素子６０のレイアウトの自由度を向上することができる。
例えば、ノズル１１１と着滴対象物を近づけた際に、図１０のレイアウトでは着滴対象物と液滴形成装置４０１の光学系（特に受光素子６０）との干渉が発生するおそれがあるが、図１４のレイアウトにすることで、干渉の発生を回避することができる。
図１４に示すように、受光素子６０のレイアウトを変更することにより、液滴３１０が着滴する着滴対象物とノズル１１１との距離（ギャップ）を縮めることが可能となり、着滴位置のばらつきを抑制することができる。その結果、分注の精度を向上することが可能となる。
図１５は、図１０の液滴形成装置４０１の他の変形例を示す模式図である。図１５に示すように、液滴形成装置４０１Ｂは、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ１を受光する受光素子６０に加え、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ２を受光する受光素子６１を設けた点が、液滴形成装置４０１（図１０参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
ここで、蛍光Ｌｆ１及びＬｆ２は、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられる蛍光の一部を示している。受光素子６０及び６１は、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる任意の位置に配置することができる。なお、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる位置に３つ以上の受光素子を配置してもよい。又、各受光素子は同一仕様としてもよいし、異なる仕様としてもよい。
受光素子が１つであると、飛翔する液滴３１０に複数個の蛍光染色細胞３５０が含まれる場合に、蛍光染色細胞３５０同士が重なることに起因して、細胞数計数手段７０３が液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を誤計数する（カウントエラーが発生する）おそれがある。
図１６（ａ）及び図１６」（ｂ）は、飛翔する液滴に２個の蛍光染色細胞が含まれる場合を例示する図である。例えば、図１６（ａ）に示すように、蛍光染色細胞３５０ａと３５０ｂとに重なりが発生する場合や、図１６（ｂ）に示すように、蛍光染色細胞３５０ａと３５０ｂとに重なりが発生しない場合があり得る。受光素子を２つ以上設けることで、蛍光染色細胞が重なる影響を低減することが可能である。
前述のように、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光粒子の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光粒子の個数を計数することができる。
受光素子を２つ以上設置する場合，それぞれの受光素子から得られる輝度値或いは面積値のうち、最大値を示すデータを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能である。これに関して、図１７を参照して、より詳しく説明する。
図１７は、粒子同士の重なりが生じない場合の輝度値Ｌｉと、実測される輝度値Ｌｅとの関係を例示する図である。図１７に示すように、液滴内の粒子同士の重なりがない場合には、Ｌｅ＝Ｌｉとなる。例えば、細胞１個の輝度値をＬｕとすると、細胞数／滴＝１個の場合はＬｅ＝Ｌｕであり、細胞数／滴＝ｎ個の場合はＬｅ＝ｎＬｕである（ｎ：自然数）。
しかし、実際には、ｎが２以上の場合には粒子同士の重なりが発生し得るため、実測される輝度値はＬｕ≦Ｌｅ≦ｎＬｕ（図１６の網掛部分）となる。そこで、細胞数／滴＝ｎ個の場合、例えば、閾値を（ｎＬｕ−Ｌｕ／２）≦閾値＜（ｎＬｕ＋Ｌｕ／２）と設定することができる。そして、複数の受光素子を設置する場合、それぞれの受光素子から得られたデータのうち最大値を示すものを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能となる。なお、輝度値に代えて面積値を用いてもよい。
また、受光素子を複数設置する場合、得られる複数の形状データを基に、細胞数を推定するアルゴリズムにより細胞数を決定づけてもよい。このように、液滴形成装置４０１Ｂでは、蛍光染色細胞３５０が異なる方向に発した蛍光を受光する複数の受光素子を有しているため、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を更に低減できる。
図１８は、図１０の液滴形成装置４０１の他の変形例を示す模式図である。図１８に示すように、液滴形成装置４０１Ｃは、液滴吐出手段１０が液滴吐出手段１０Ｃに置換された点が、液滴形成装置４０１（図１０参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
液滴吐出手段１０Ｃは、液室１１Ｃと、メンブレン１２Ｃと、駆動素子１３Ｃとを有している。液室１１Ｃは、液室１１Ｃ内を大気に開放する大気開放部１１５を上部に有しており、細胞懸濁液３００中に混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能に構成されている。
メンブレン１２Ｃは、液室１１Ｃの下端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２Ｃの略中心には貫通孔であるノズル１２１が形成されており、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００はメンブレン１２Ｃの振動によりノズル１２１から液滴３１０として吐出される。メンブレン１２Ｃの振動の慣性により液滴３１０を形成するため、高表面張力（高粘度）の細胞懸濁液３００でも吐出が可能である。メンブレン１２Ｃの平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
メンブレン１２Ｃの材質としては特に限定はないが、柔らか過ぎるとメンブレン１２Ｃが簡単に振動し、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難であるため、ある程度の硬さがある材質を用いることが好ましい。メンブレン１２Ｃの材質としては、例えば、金属材料やセラミック材料、ある程度硬さのある高分子材料等を用いることができる。
特に、蛍光染色細胞３５０として細胞を用いる際には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料であることが好ましい。細胞の付着性は一般的に材質の水との接触角に依存性があるといわれており、材質の親水性が高い又は疎水性が高いときには細胞の付着性が低い。親水性の高い材料としては各種金属材料やセラミック（金属酸化物）を用いることが可能であり、疎水性が高い材料としてはフッ素樹脂等を用いることが可能である。
このような材料の他の例としては、ステンレス鋼やニッケル、アルミニウム等や、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニア等を挙げることができる。これ以外にも、材料表面をコーティングすることで細胞接着性を低下させることも考えられる。例えば、材料表面を前述の金属又は金属酸化物材料でコーティングすることや、細胞膜を模した合成リン脂質ポリマー（例えば、日油株式会社製、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ）によってコーティングすることが可能である。
ノズル１２１は、メンブレン１２Ｃの略中心に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。この場合、ノズル１２１の径としては特に限定はないが、蛍光染色細胞３５０がノズル１２１に詰まることを避けるため、蛍光染色細胞３５０の大きさの２倍以上とすることが好ましい。蛍光染色細胞３５０が例えば、動物細胞、特にヒトの細胞である場合、ヒトの細胞の大きさは一般的に５μｍ〜５０μｍ程度であるため、ノズル１２１の径を、使用する細胞に合わせて１０μｍ以上が好ましく、１００μｍ以上がより好ましい。
一方で、液滴が大きくなり過ぎると微小液滴を形成するという目的の達成が困難となるため、ノズル１２１の径は２００μｍ以下であることが好ましい。つまり、液滴吐出手段１０Ｃにおいては、ノズル１２１の径は、典型的には１０μｍ以上２００μｍ以下の範囲となる。
駆動素子１３Ｃは、メンブレン１２Ｃの下面側に形成されている。駆動素子１３Ｃの形状は、メンブレン１２Ｃの形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２Ｃの平面形状が円形である場合には、ノズル１２１の周囲に平面形状が円環状（リング状）の駆動素子１３Ｃを形成することが好ましい。駆動素子１３Ｃの駆動方式は、駆動素子１３と同様とすることができる。
駆動手段２０は、メンブレン１２Ｃを振動させて液滴３１０を形成する吐出波形と、液滴３１０を形成しない範囲でメンブレン１２Ｃを振動させる撹拌波形とを駆動素子１３Ｃに選択的に（例えば、交互に）付与することができる。
例えば、吐出波形及び撹拌波形をいずれも矩形波とし、吐出波形の駆動電圧よりも撹拌波形の駆動電圧を低くすることで、撹拌波形の印加により液滴３１０が形成されないようにすることができる。つまり、駆動電圧の高低により、メンブレン１２Ｃの振動状態（振動の程度）を制御することができる。
液滴吐出手段１０Ｃでは、駆動素子１３Ｃがメンブレン１２Ｃの下面側に形成されているため、駆動素子１３Ｃによりメンブレン１２が振動すると、液室１１Ｃの下部方向から上部方向への流れを生じさせることが可能である。
この時、蛍光染色細胞３５０の動きは下から上への運動となり、液室１１Ｃ内で対流が発生して蛍光染色細胞３５０を含有する細胞懸濁液３００の撹拌が起きる。液室１１Ｃの下部方向から上部方向への流れにより、沈降、凝集した蛍光染色細胞３５０が液室１１Ｃの内部に均一に分散する。
つまり、駆動手段２０は、吐出波形を駆動素子１３Ｃに加え、メンブレン１２Ｃの振動状態を制御することにより、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００をノズル１２１から液滴３１０として吐出させることができる。又、駆動手段２０は、撹拌波形を駆動素子１３Ｃに加え、メンブレン１２Ｃの振動状態を制御することにより、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００を撹拌することができる。なお、撹拌時には、ノズル１２１から液滴３１０は吐出されない。
このように、液滴３１０を形成していない間に細胞懸濁液３００を撹拌することにより、蛍光染色細胞３５０がメンブレン１２Ｃ上に沈降、凝集することを防ぐと共に、蛍光染色細胞３５０を細胞懸濁液３００中にムラなく分散させることができる。これにより、ノズル１２１の詰まり及び吐出する液滴３１０中の蛍光染色細胞３５０の個数のばらつきを抑えることが可能となる。その結果、蛍光染色細胞３５０を含有する細胞懸濁液３００を、長時間連続して安定的に液滴３１０として吐出することができる。
また、液滴形成装置４０１Ｃにおいて、液室１１Ｃ内の細胞懸濁液３００中に気泡が混入する場合がある。この場合でも、液滴形成装置４０１Ｃでは、液室１１Ｃの上部に大気開放部１１５が設けられているため、細胞懸濁液３００中に混入した気泡を、大気開放部１１５を通じて外気に排出できる。これによって、気泡排出のために大量の液を捨てることなく、連続して安定的に液滴３１０を形成することが可能となる。
即ち、ノズル１２１の近傍に気泡が混入した場合や、メンブレン１２Ｃ上に多数の気泡が混入した場合には吐出状態に影響を及ぼすため、長い時間安定的に液滴の形成を行うためには、混入した気泡を排出する必要がある。通常、メンブレン１２Ｃ上に混入した気泡は、自然に若しくはメンブレン１２Ｃの振動によって上方に移動するが、液室１１Ｃには大気開放部１１５が設けられているため、混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能となる。そのため、液室１１Ｃに気泡が混入しても不吐出が発生することを防止可能となり、連続して安定的に液滴３１０を形成することができる。
なお、液滴を形成しないタイミングで、液滴を形成しない範囲でメンブレン１２Ｃを振動させ、積極的に気泡を液室１１Ｃの上方に移動させてもよい。
（電気的又は磁気的に検出する方法）
電気的又は磁気的に検出する方法としては、図１９に示すように、液室１１’から細胞懸濁液を液滴３１０’として基材７００’に吐出する吐出ヘッドの直下に、細胞数計数のためのコイル２００がセンサとして設置されている。細胞は特定のタンパク質によって修飾され細胞に接着することが可能な磁気ビーズによって覆うことにより、磁気ビーズが付着した細胞がコイル中を通過する際に発生する誘導電流によって、飛翔液滴中の細胞の有無を検出することが可能である。一般的に、細胞はその表面に細胞特有のタンパク質を有しており、このタンパク質に接着することが可能な抗体を磁気ビーズに修飾することによって、細胞に磁気ビーズを付着させることが可能である。このような磁気ビーズとしては既製品を用いることが可能であり、例えば、株式会社ベリタス製のＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標登録）が利用可能である。
（吐出前に細胞を観測する処理）
吐出前に細胞を観測する処理としては、図２０に示すマイクロ流路２５０中を通過してきた細胞３５０’をカウントする方法や、図２１に示す吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法等が挙げられる。
図２０に示す方法は、セルソーター装置において用いられている方法であり、例えば、ソニー株式会社製のセルソーターＳＨ８００Ｚを用いることができる。図２０では、マイクロ流路２５０中に光源２６０からレーザー光を照射して散乱光や蛍光を、集光レンズ２６５を用いて検出器２５５により検出することによって細胞の有無や、細胞の種類を識別しながら液滴を形成することが可能である。本方法を用いることによって、マイクロ流路２５０中に通過した細胞の数から所定のウェル中に着弾した細胞の数を推測することが可能である。
また、図２１に示す吐出ヘッド１０’としては、Ｃｙｔｅｎａ社製のシングルセルプリンターを用いることが可能である。図２１では、吐出前において、ノズル部近傍をレンズ２６５’を介して、画像取得部２５５’において画像取得した結果からノズル部近傍の細胞３５０”が吐出されたと推定することや、吐出前後の画像から差分により吐出されたと考えられる細胞の数を推定することによって、所定のウェル中に着弾した細胞の数を推測することができる。図２０に示すマイクロ流路中を通過してきた細胞をカウントする方法では、液滴が連続的に生成されるのに対して、図２１は、オンデマンドで液滴形成が可能であるため、より好ましい。
（着弾後の細胞をカウントする処理）
着弾後の細胞をカウントする処理としては、プレートにおけるウェルを蛍光顕微鏡等により観測することにより、蛍光染色した細胞を検出する方法を取ることが可能である。この方法は、例えば、参考文献１（Moon S., et al., Drop-on-demand single cell isolation andtotal RNA analysis, PLoS One, Vol. 6, Issue 3, e17455, 2011）等に記載されている。
液滴の吐出前及び着弾後に細胞を観測する方法では、以下に述べる問題があり、生成する基材の種類によっては吐出中の液滴内の細胞を観測することが最も好ましい。
吐出前に細胞を観測する手法においては、流路中を通過した細胞数や吐出前（及び吐出後）の画像観測から、着弾したと思われる細胞数を計数するため、実際にその細胞が吐出されたのかどうかの確認は行われておらず、思いがけないエラーが発生することがある。例えば、ノズル部が汚れていることにより液滴が正しく吐出せず、ノズルプレートに付着し、それに伴い液滴中の細胞も着弾しない、といったケースが発生する。他にも、ノズル部の狭い領域に細胞が残留することや、細胞が吐出動作によって想定以上に移動し観測範囲外に出てしまうといった問題の発生も起こりうる。
また、着弾後の基材上の細胞を検出する手法においても問題がある。まず、基材として顕微鏡観察が可能であるものを準備する必要がある。観測可能な基材として、一般的に底面が透明かつ平坦な基材、特に底面がガラス製となっている基材が用いられるが、特殊な基材となってしまうため、一般的な水解性材料からなる担持部を使用することができなくなる問題がある。また、細胞数が数十個等多いときには、細胞の重なりが発生するため正確な計数ができなくなる問題もある。
そのため、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサ及び細胞数計数手段によって計数することに加えて、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を行うことが好ましい。
受光素子としては１又は少数の受光部を有する受光素子、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管を用いることが可能であるし、その他に２次元アレイ状に受光素子が設けられたＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｐｕｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤ等二次元センサを用いることも可能である。
１又は少数の受光部を有する受光素子を用いる際には、蛍光強度から細胞が何個入っているかを予め用意された検量線を用いて決定することも考えられるが、主として飛翔液滴中の細胞有無を二値的に検出することが行われる。細胞懸濁液の細胞濃度が十分に低く、液滴中に細胞が１個又は０個しかほぼ入らない状態で吐出を行う際には、二値的な検出で十分精度よく計数を行うことが可能である。
細胞懸濁液中で細胞はランダムに配置していることを前提とすれば、飛翔液滴中の細胞数はポアソン分布にしたがうと考えられ、液滴中に細胞数が２個以上入る確率Ｐ（＞２）は下記式４で表される。
Figure 2021145642
図２２は、確率Ｐ（＞２）と平均細胞数の関係を表すグラフである。ここで、λは液滴中の平均細胞数であり、細胞懸濁液中の細胞濃度に吐出液滴の体積を乗じたものになる。
二値的な検出で細胞数計数を行う場合には、確率Ｐ（＞２）が十分小さい値であることが精度を確保する上では好ましく、確率Ｐ（＞２）が１％以下となるλ＜０．１５であることが好ましい。光源としては、細胞の蛍光を励起できるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、水銀ランプやハロゲンランプ等の一般的なランプに特定の波長を照射するようにフィルタをかけたものや、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）、レーザー等を用いることが可能である。ただし、特に１ｎＬ以下の微小な液滴を形成するときには、狭い領域に高い光強度を照射する必要があるため、レーザーを用いるのが好ましい。レーザー光源としては、固体レーザーやガスレーザー、半導体レーザー等一般的に知られている多種のレーザーを用いることが可能である。また、励起光源としては、液滴が通過する領域を連続的に照射したものであってもよいし、液滴の吐出に同期して液滴吐出動作に対して所定時間遅延を付けたタイミングでパルス的に照射するものであってもよい。
［細胞懸濁液生成工程、核酸充填工程及び細胞数計数工程において推定した核酸の分子数の確からしさを算出する工程］
本工程は、核酸担持工程及び細胞数計数工程それぞれの工程における確からしさを算出する工程である。推定する核酸のコピー数の確からしさの算出は、細胞懸濁液生成工程における確からしさと同様に算出することができる。
なお、確からしさの算出タイミングは、細胞数計数工程の次工程で、まとめて算出してもよいし、細胞懸濁液生成工程、核酸担持工程及び細胞数計数工程の各工程の最後に算出し、細胞数計数工程の次工程で各不確かさを合成して算出してもよい。いいかえれば、上記各工程での確からしさは、合成算出までに適宜算出しておけばよい。
［出力工程］
出力工程は、基材上に着弾した細胞懸濁液に含まれる細胞数として、センサにより測定された検出結果に基づいて細胞数計数手段にて計数された値を出力する工程である。計数された値とは、センサにより測定された検出結果から、細胞数計数手段にて当該容器に含まれる細胞数を意味する。
出力とは、原動機、通信機、計算機等の装置が入力を受けて計数された値を外部の計数結果記憶手段としてのサーバに電子情報として送信することや、計数された値を印刷物として印刷することを意味する。
出力工程は、基材の生成時に、基材における担持部の細胞数又は核酸数を観察又は推測し、観測値又は推測値を外部の記憶部に出力する。出力は、細胞数計数工程と同時に行ってもよく、細胞数計数工程の後に行ってもよい。
［記録工程］
記録工程は、出力工程において、出力された観測値又は推測値を記録する工程である。記録工程は、記録部において好適に実施することができる。記録は、出力工程と同時に行ってもよく、出力工程の後に行ってもよい。記録とは、記録媒体に情報を付与することだけでなく、記録部に情報を保存することも含む。この場合、記録部は記憶部ともいえる。
［その他工程］
その他の工程は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵素失活工程等が挙げられる。
酵素失活工程は、酵素を失活させる工程である。酵素としては、例えば、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等が挙げられる。酵素を失活させる方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、公知の方法を好適に用いることができる。
＜検査方法＞
本実施形態の検査方法は、特定の数の細胞Ａが担持された担持部を有し、前記細胞Ａは、特定コピー数の核酸を含む担体を用いる、細胞試料中の検出対象の遺伝子の遺伝子検査装置による測定値の正確度を検査する方法である。
本実施形態の検査方法で用いられる担体としては、上記＜担体＞において例示されたものと同様のものに加えて、特定コピー数の核酸を含む細胞Ａが特定の数担持された担持部を有するプレートを用いることができる。
プレートとしては、特に制限はなく、バイオ分野において一般的に用いられるウェルが形成されたものを用いることができる。すなわち、プレートにおける担持部はウェルと言い換えることができる。プレートにおけるウェルの数は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単数であってもよく、複数であってもよい。プレートとして具体的には、１穴マイクロチューブ、８連チューブ、９６穴、３８４穴のウェルプレート等を用いることが好ましいが、ウェルが複数である場合には、これらのプレートにおけるウェルには同じ個数の細胞を分注することも可能であり、異なる水準の個数の細胞を入れることも可能である。また、細胞が含まれないウェルが存在していてもよい。
プレートへの細胞の担持方法、すなわち、プレートへの細胞の分注方法としては、公知のインクジェット技術を用いた方法で担持させることができ、具体的には、例えば、特許第６４４６１５１号公報に記載の方法等を用いることができる。
本実施形態の検査方法の詳細について以下に説明する。
≪第１実施形態≫
本実施形態の検査方法は、前記担体を用いて、前記細胞Ａからの前記核酸の抽出効率を算出する工程（抽出効率算出工程）を含む。
本実施形態の検査方法は、上記工程に加えて、前記抽出効率から、前記遺伝子の遺伝子検査装置による測定値の正確度を判定する工程（判定工程Ａ）を更に含むことが好ましい。
［抽出効率算出工程］
抽出効率算出工程では、まず担体を用いて、細胞Ａから核酸を抽出する。その後、得られた核酸を用いて定量ＰＣＲを行い、核酸のコピー数を定量する。次いで、定量された値を、基材上に存在する核酸の既知のコピー数で除した値の百分率を核酸の抽出効率として算出する。
抽出とは、細胞膜や細胞壁等を破壊し、核酸をぬき出すことを意味する。細胞Ａから核酸を抽出する方法としては、９０℃以上１００℃以下で熱処置する方法が知られている。９０℃以下で熱処理するとＤＮＡが抽出されない可能性があり、１００℃以上で熱処理するとＤＮＡが分解される可能性がある。界面活性剤を添加して熱処理することが好ましい。
界面活性剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、添加量にもよるが、タンパク質を変性及び失活させない点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。中でも、脂肪酸ナトリウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がより好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ等）、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｏｔｉｔｏｎ Ｘシリーズ、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡシリーズ、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐシリーズ、Ｎｉｋｋｏｌ ＯＰシリーズ等）、ポリソルベート類（Ｔｗｅｅｎ２０等のＴｗｅｅｎシリーズ等）、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリド等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。中でも、ポリソルベート類が好ましい。
界面活性剤の含有量としては、ウェル中の細胞懸濁液全量に対して、０．０１質量％以上５．００質量％以下が好ましい。含有量が、０．０１質量％以上であると、ＤＮＡ抽出に対して効果を発揮でき、５．００質量％以下であると、ＰＣＲの際に増幅の阻害を防止することができるため、両方の効果を得られる数値範囲として上記０．０１質量％以上５．００質量％以下が好適である。
細胞壁を保有している細胞に関しては、上記の方法で十分にＤＮＡ抽出されないことがある。その場合、例えば、浸透圧ショック法、凍結融解法、酵素消化法、ＤＮＡ抽出用キットの使用、超音波処理法、フレンチプレス法、ホモジナイザー等の方式等が挙げられる。中でも、抽出ＤＮＡのロスが少ないことから、酵素消化法が好ましい。
上述した方法を用いて、細胞膜や細胞壁等を破壊した後に、当該溶液から公知の方法を用いて、核酸を精製することができる。核酸の精製は、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動、密度に依存した遠心分離、磁気ビーズによる捕捉、シリカメンブレン法等により行うことができる。
［判定工程Ａ］
判定工程Ａでは、抽出効率算出工程で算出された抽出効率から、細胞試料中の検出対象の遺伝子の遺伝子検査装置による測定値の正確度を判定する。
具体的には、担体における核酸の抽出効率が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である場合には、検出対象の遺伝子の遺伝子検査装置による測定値は正確である可能性があると判定する。一方で、担体における核酸の抽出効率が８０％未満である場合には、検出対象の遺伝子の遺伝子検査装置による測定値は正確ではない可能性があると判定する。
また、判定工程Ａにおいて、担体における核酸の抽出効率を、検出対象の遺伝子の抽出効率の推定値とすることができる。
≪第２実施形態≫
遺伝子検査装置が定量ＰＣＲ装置である場合に、本実施形態の検査方法は、前記担体を用いて、前記細胞Ａからの前記核酸の抽出効率を算出する工程（抽出効率算出工程）と、前記担体に含まれる前記核酸の合計コピー数が互いに異なる２以上の前記担体を用いて、定量ＰＣＲ装置により前記核酸を増幅し、検量線を作成して増幅効率を算出する工程（増幅効率算出工程）と、前記抽出効率及び前記増幅効率から、前記遺伝子の定量ＰＣＲ装置による定量値の正確度を判定する工程（判定工程Ｂ）と、を含む。
本実施形態の検査方法は、上記工程に加えて、細胞試料中の検出対象の遺伝子の定量ＰＣＲ装置による定量値を得る工程（遺伝子定量工程）を更に含むことが好ましい。
定量ＰＣＲ装置としては、上記＜担体＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。定量ＰＣＲの条件は、増幅対象となる核酸に応じて適宜設定することができる。
抽出効率算出工程は、上記≪第１実施形態≫において記載の工程と同様であるため説明を省略する。
［増幅効率算出工程］
増幅効率算出工程では、担体を用いて、担体の担持部に担持されている細胞から核酸をそれぞれ抽出する。抽出された核酸を含む抽出液を用いて定量ＰＣＲにより核酸を増幅する。増幅した結果から、検量線を作成し、以下の式を用いて増幅効率を算出する。
Figure 2021145642
増幅効率算出工程で用いられる担体は、抽出効率算出工程で用いた担体と同じ形態のものであってもよく、異なる形態のものであってもよい。例えば、いずれの工程においても、担体が有する細胞Ａの種類及び核酸の種類は同一であって、抽出工程算出工程では、担持部が水解性材料からなる担体を用いて、増幅効率算出工程では、細胞が担持されたプレートの形態の担体を用いてもよい。
また、増幅効率算出工程で用いられる担体は、基材上に存在する核酸の特定コピー数が、検出対象の遺伝子のコピー数と同じである担体、又は、検出対象の遺伝子のコピー数以上である担体１種以上を用いることが好ましい。また、より正確な検量線を作成するために、前記担体に含まれる前記核酸の合計コピー数（基材上に存在する核酸の特定コピー数）が互いに異なる２以上の担体を用いることが好ましく、基材上に存在する核酸の特定コピー数が、検出対象の遺伝子のコピー数と同じである担体、又は、検出対象の遺伝子のコピー数以上である担体１種以上と、基材上に存在する核酸の特定コピー数が、検出対象の遺伝子のコピー数未満である担体１種以上と、を用いることがさらに好ましい。また、基材上に存在する核酸の特定コピー数が基材上に存在する核酸の特定コピー数が検出対象の遺伝子のコピー数以上である担体２種以上と、基材上に存在する核酸の特定コピー数が、検出対象の遺伝子のコピー数未満である担体１種以上と、を用いることが特に好ましい。基材上に存在する核酸の特定コピー数が上記条件である担体を用いることで、より正確な検量線を作成することができ、より正確な増幅効率を算出することができる。ここでいう「検出対象の遺伝子のコピー数」は、後述する遺伝子定量工程を行なうことで、その推定値を得ることができ、当該値を元に基材上に存在する核酸の特定コピー数の値を設定することができる。
［遺伝子定量工程］
上記抽出効率算出工程及び上記増幅効率算出工程と並行して、又はそれら工程の前に、遺伝子定量工程を行なうことができ、上記抽出効率算出工程及び上記増幅効率算出工程と並行して遺伝子定量工程を行なうことが好ましい。
遺伝子定量工程では、細胞試料中から検出対象の遺伝子を抽出し、抽出された遺伝子を用いて定量ＰＣＲを行う。細胞試料中から抽出対象の遺伝子を抽出する方法は、上記「抽出効率算出工程」において例示された方法と同様である。また、定量ＰＣＲとしては、上記＜担体＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。定量ＰＣＲの条件は、増幅対象となる遺伝子に応じて適宜設定することができる。
［判定工程Ｂ］
判定工程Ｂでは、上記抽出効率算出工程で算出された抽出効率及び上記増幅効率算出工程で算出された増幅効率から、検出対象の遺伝子の定量ＰＣＲ装置による定量値の正確度を判定する。具体的には、内部標準として用いられた担体における核酸の抽出効率及び増幅効率がそれぞれ８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である場合には、検出対象の遺伝子の定量ＰＣＲによる定量値は正確である可能性があると判定する。一方で、内部標準として用いられた担体における核酸の抽出効率及び増幅効率がそれぞれ８０％未満である場合には、検出対象の遺伝子の定量ＰＣＲ装置による定量値は正確ではない可能性があると判定する。
また、判定工程において、内部標準として用いられた担体における核酸の抽出効率及び増幅効率を、検出対象の遺伝子の抽出効率及び増幅効率として用いることで、細胞試料中に含まれる検出対象の遺伝子のコピー数の絶対数を推定することができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（水解性担体からの核酸の抽出効率の確認試験）
１．サンプルの作製
サンプルは、インクジェット技術を用いて、核酸（6203-a-G (GenBank accession number：AB610938.1)）を１コピー含む酵母細胞５００個を水解性担体（日本製紙パピリア製、商品名「１２０ＭＤＰ」）上に分注して、作製した。
２．核酸の抽出
次いで、０．４Ｕ／４μＬの酵母細胞壁溶解酵素（商品名「Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ−１００Ｔ」、ナカライテスク製）を水解性材料からなる基材上に滴下して、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞が担持された部分を生検トレパンで６ｍｍ径に切り抜いた。切り抜いた水解性担体を１．５ｍＬマイクロチューブにピンセットで入れ、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）１５０μＬを添加し、ボルテックスにて混合して、核酸を溶液中に分散させた。その後、９５℃で６０分間加熱処理した。
３．核酸の検出
リアルタイムＰＣＲ装置ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いて、核酸を増幅させた。リアルタイムＰＣＲの反応液の組成を以下に示す。
（反応液の組成）
ＧｅｎＣｈｅｃｋ ｑＰＣＲ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ（ｄＵＴＰ）（ファスマック製） ２５μＬ；
１００μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１：５’−ＴＣＧＡＡＧＧＧＴＧＡＴＴＧＧＡＴＣＧＧ−３’） ０．２５μＬ；
１００μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２：５’−ＴＧＧＣＴＡＧＣＴＡＡＧＴＧＣＣＡＴＣＣ−３’） ０．２５μＬ；
１００μＭ Ｐｒｏｂ（配列番号３：ＦＡＭ−ＴＧＣＡＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＧＡＴＴＧＴＣＣＣＴＡＣ−ＴＡＭＲＡ） ０．１０μＬ；
ＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製） ６．４μＬ；
「２．」で調製した核酸含有溶液 １８μＬ（溶液中の核酸の理論コピー数：６０コピー）
上記組成の反応液を用いて表２に示す反応条件でＰＣＲを実施した。コピー数を定量するために、インクジェット技術を用いて核酸（6203-a-G (GenBank accession number：AB610938.1)）を１コピー含む酵母細胞１、１０、６０、２００又は５００個を直接ＰＣＲ用の９６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック製、商品名「MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate」）に分注したサンプルも０．４Ｕ／４μＬの酵母細胞壁溶解酵素を用いた処理を行った後、同時にＰＣＲ増幅した。検出結果を表３に示す。表３において、「抽出した核酸」は３回独立して同様の試験を実施した結果である。また、「定量コピー数」は、図に示すインクジェット技術を用いて核酸を１コピー含む酵母細胞１、１０、６０、２００又は５００個を直接ＰＣＲ用の９６ウェルプレートに分注したサンプルを用いたリアルタイムＰＣＲにおけるコピー数とＣｑ値の検量線（図２３参照）を用いて、Ｃｑ値から算出した値である。抽出効率は、定量コピー数を理論コピー数で除した値である。
Figure 2021145642
Figure 2021145642
表３に示すように、核酸を含む細胞が担持された水解性担体を用いた場合に、核酸の抽出効率は８０％以上９７．６％以下程度であることが確認された。
［実施例２］
（異なる酵母細胞壁溶解酵素処理の条件による核酸の抽出効率の確認試験）
１．サンプルの作製
サンプルは、インクジェット技術を用いて、核酸（6203-a-G (GenBank accession number：AB610938.1)）を１コピー含む酵母細胞１０、５０又は１００個を９６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック製、商品名「MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate」）に分注した。
２．核酸の抽出
次いで、表４に示す各濃度の酵母細胞壁溶解酵素（商品名「Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ−１００Ｔ」、ナカライテスク製）を添加した。酵母細胞壁溶解酵素の希釈系列は、ＣｏｌＥ１ １／２ＴＥ溶液を用いて作製した。ＣｏｌＥ１ １／２ＴＥ溶液は、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）溶液とＤｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒを半量ずつ混合した溶液に、ＣｏｌＥ１ ＤＮＡを６ｎｇ／μＬの濃度となるように添加して調製した。酵母細胞壁の溶解は、３７℃で３０分間インキュベートにより実施した。その後、９５℃で２分間インキュベートして、酵素を失活させた。なお、表３において、「Ｎｅｇａ」とは、ネガティブコントロールの略称であり、酵母細胞を含まないサンプルである。
Figure 2021145642
３．核酸の検出
「２．」で調製した核酸含有溶液４μＬを用いた以外は、実施例１と同様の組成の反応液を用いて、上記表１に示す反応条件でＰＣＲを実施した。ＰＣＲ時は、インクジェット技術を用いて細胞１、５、１０、２５０、５０、又は１００個を９６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック製、商品名「MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate」）に分注し、酵素処理したサンプル（上記表３の条件３）を同時に増幅して、検量線を作成し、当該検量線を用いて、細胞１０、５０又は１００個を分注し、酵素の濃度が異なるサンプルにおける核酸のコピー数を定量した。また、定量されたコピー数を理論コピー数（１０、５０又は１００コピー）で除することで、酵素濃度毎の核酸の抽出効率を算出した。結果を表５に示す。表４において「ＵＤ（Ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｄ）数」とは核酸が増幅しなかったウェル数である。また、コピー数毎の酵素濃度の違いによる核酸の抽出効率の変化を示すグラフを図２４に、１０、５０及び１００コピーのサンプルを用いて作成した検量線の酵素濃度の違いによる変化を示すグラフを図２５に示す。
Figure 2021145642
表５、並びに、図２４及び図２５から、１０又は５０コピーの核酸を含有するサンプルでは、酵素濃度が少なくなるほど、核酸の抽出効率が低下する傾向が確認された。１００コピーの核酸を含有するサンプルでは、０．００４Ｕ／４μＬ以下の酵素濃度において、酵素濃度の減少による核酸の抽出効率の低下が顕著であった。
いずれのコピー数のサンプルにおいても、酵素濃度の減少によって核酸の抽出効率が低下する傾向が確認された。
本発明は以下の態様を含む。
（１） 細胞試料中の検出対象の遺伝子の遺伝子検査装置による測定値の正確度を検査するための担体であって、
特定の数の細胞Ａが担持された担持部を有し、
前記細胞Ａは、特定コピー数の核酸を含み、
前記担持部は水解性材料からなる、担体。
（２） 前記核酸は、前記細胞Ａの核中の核酸に組み込まれている、（１）に記載の担体。
（３） 前記核酸のコピー数が１コピーである、（１）又は（２）のいずれか一つに記載の担体。
（４） 前記細胞Ａの数が１個以上５００個以下である、（３）に記載の担体。
（５） 細胞試料中の検出対象の遺伝子の遺伝子検査装置による測定値の正確度を検査するための担体である、（１）〜（４）のいずれか一つに記載の担体。
（６） 前記核酸と前記遺伝子は互いに異なる配列からなる、（５）に記載の担体。
（７） 前記細胞Ａは、前記遺伝子を含む細胞と、由来となる生物種及び細胞種が同一である、（５）又は（６）に記載の担体。
（８） 前記遺伝子検査装置が定量ＰＣＲ装置である、（５）〜（７）のいずれか一つに記載の担体。
（９） 特定の数の細胞Ａが担持された担持部を有し、前記細胞Ａは、特定コピー数の核酸を含む担体を用いる、細胞試料中の検出対象の遺伝子の遺伝子検査装置による測定値の正確度を検査する方法。
（１０） 前記担持部は水解性材料からなる、（９）に記載の方法。
（１１） 前記担体を用いて、前記細胞Ａからの前記核酸の抽出効率を算出する工程を含む、（９）又は（１０）に記載の方法。
（１２） 前記遺伝子検査装置が定量ＰＣＲ装置である、（９）又は（１０）に記載の方法。
（１３） 前記担体を用いて、前記細胞Ａからの前記核酸の抽出効率を算出する工程と、
前記担体を用いて、定量ＰＣＲ装置により前記核酸を増幅し、検量線を作成して増幅効率を算出する工程と、
前記抽出効率及び前記増幅効率から、前記遺伝子の定量ＰＣＲ装置による定量値の正確度を判定する工程と、
を含む、（１２）に記載の方法。
１…担体、２…担持部、３…細胞Ａ、４…核酸、５…基材、１０，１０’，１０Ｃ…吐出ヘッド（液滴吐出手段）、１１，１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１Ｃ，１１’…液室、１２，１２Ｃ…メンブレン、１３，１３Ｃ…駆動素子、１３ａ…電動機、１３ｂ，１３ｃ…圧電素子、２０…駆動手段、３０，２６０…光源、４０…ミラー、６０，６１…受光素子、７０…制御手段、７１，１０１…ＣＰＵ、７２…ＲＯＭ、７３…ＲＡＭ、７４，１０６…Ｉ／Ｆ、７５…バスライン、１００…性能評価装置、１０２…主記憶装置、１０３…補助記憶装置、１０４…出力装置、１０５…入力装置、１０７…バス、１１１，１１１ａ，１１１ｂ，１１１ｃ，１２１…ノズル、１１２…電磁弁、１１５…大気開放部、２００…コイル、２５０…マイクロ流路、２５５…検出器、２５５’…画像取得部、２６５，２６５’…レンズ、３００，３００ａ，３００ｂ，３００ｃ…細胞懸濁液、３１０，３１０’…液滴、３５０，３５０ａ，３５０ｂ，３５０’，３５０”…細胞、４００…分注装置、４０１，４０１Ａ，４０１Ｂ，４０１Ｃ…液滴形成装置、７００，７００’…基材、７１０…担持部、８００…ステージ、９００…制御装置、Ｌ…光、Ｌｆ，Ｌｆ１，Ｌｆ２…蛍光。
特許第５８７５２３０号公報

Claims (13)

  1. 特定の数の細胞Ａが担持された担持部を有し、
    前記細胞Ａは、特定コピー数の核酸を含み、
    前記担持部は水解性材料からなる、担体。
  2. 前記核酸は、前記細胞Ａの核中の核酸に組み込まれている、請求項１に記載の担体。
  3. 前記核酸のコピー数が１コピーである、請求項１又は２に記載の担体。
  4. 前記細胞Ａの数が１個以上５００個以下である、請求項３に記載の担体。
  5. 細胞試料中の検出対象の遺伝子の遺伝子検査装置による測定値の正確度を検査するための担体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の担体。
  6. 前記核酸と前記遺伝子は互いに異なる配列からなる、請求項５に記載の担体。
  7. 前記細胞Ａは、前記遺伝子を含む細胞と、由来となる生物種及び細胞種が同一である、請求項５又は６に記載の担体。
  8. 前記遺伝子検査装置が定量ＰＣＲ装置である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の担体。
  9. 特定の数の細胞Ａが担持された担持部を有し、前記細胞Ａは、特定コピー数の核酸を含む担体を用いる、細胞試料中の検出対象の遺伝子の遺伝子検査装置による測定値の正確度を検査する方法。
  10. 前記担持部は水解性材料からなる、請求項９に記載の方法。
  11. 前記担体を用いて、前記細胞Ａからの前記核酸の抽出効率を算出する工程を含む、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 前記遺伝子検査装置が定量ＰＣＲ装置である、請求項９又は１０に記載の方法。
  13. 前記担体を用いて、前記細胞Ａからの前記核酸の抽出効率を算出する工程と、
    前記担体を用いて、定量ＰＣＲ装置により前記核酸を増幅し、検量線を作成して増幅効率を算出する工程と、
    前記抽出効率及び前記増幅効率から、前記遺伝子の定量ＰＣＲ装置による定量値の正確度を判定する工程と、
    を含む、請求項１２に記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023181694A1 (ja) * 2022-03-23 2023-09-28 株式会社リコー 核酸処理効率算出方法及びそれを用いた核酸定量値補正方法、並びに標的ｒｎａ測定デバイス

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5164050U (ja) 1974-11-15 1976-05-20
JPS56132955A (en) 1980-03-24 1981-10-17 Yamanouchi Pharma Co Ltd Powder extractor for tablet
JPS5875230A (ja) 1981-10-28 1983-05-06 Nec Corp 入出力制御回路
JPS5875230U (ja) 1981-11-10 1983-05-21 日立造船株式会社 大形貯槽等の貯蔵物排出装置
JPS5899118U (ja) 1981-12-28 1983-07-06 日産車体株式会社 自動車用接着式ウインドガラス取付部構造
US7122304B2 (en) 1997-05-12 2006-10-17 Whatman, Inc. Methods for the storage and synthesis of nucleic acids using a solid support
AUPR750501A0 (en) 2001-09-05 2001-09-27 Gauci, Mark Products comprising quantum of bioparticles and method for production thereof
CA2785913C (en) 2009-12-29 2019-05-21 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Improvements to nucleic acid elution
JP5875230B2 (ja) * 2011-02-01 2016-03-02 健司 木下 遺伝子の増幅方法、特定遺伝子の検出方法
JP7336091B2 (ja) * 2016-08-02 2023-08-31 一般社団法人生命科学教育研究所 簡便な遺伝子検査法およびコピー数計測法ならびにその支援技術
WO2019093528A1 (en) 2017-11-13 2019-05-16 Ricoh Company, Ltd. Device with specific number of cell(s) and nucleic acids in the wells and testing/calibration method using the device
WO2019093530A1 (ja) 2017-11-13 2019-05-16 株式会社リコー 検出判定用デバイス
EP3710598A1 (en) 2017-11-13 2020-09-23 Ricoh Company, Ltd. Device with specific number of cell(s) and nucleic acids in the wells and testing/calibration method using the device
JP6446151B1 (ja) 2017-11-13 2018-12-26 株式会社リコー 検査デバイス及びデバイス
EP3486330A1 (en) 2017-11-21 2019-05-22 Ricoh Company, Ltd. Device for measuring ranges of copy numbers
JP2019216704A (ja) 2017-11-21 2019-12-26 株式会社リコー デバイス
JP6447765B1 (ja) 2017-11-21 2019-01-09 株式会社リコー 検査デバイス及びデバイス
JP6454434B1 (ja) 2017-11-24 2019-01-16 株式会社リコー 検査装置の性能評価用検査デバイス、検査装置の性能評価プログラム、検査装置の性能評価方法、及び検査装置の性能評価装置
JP7259279B2 (ja) 2017-11-24 2023-04-18 株式会社リコー デバイス、検査装置の性能評価プログラム、検査装置の性能評価方法、及び検査装置の性能評価装置
EP3714063A1 (en) 2017-11-24 2020-09-30 Ricoh Company, Ltd. Device, preparator's skill evaluating method, program, and device, and testing device performance evaluating method, program, and device
EP3543351B1 (en) 2018-03-19 2022-08-10 Ricoh Company, Ltd. Nucleic acid sample-contained container, method for producing nucleic acid sample-contained container, and nucleic acid sample
JP7326778B2 (ja) 2018-03-19 2023-08-16 株式会社リコー 核酸試料含有容器、核酸試料含有容器の製造方法、核酸試料含有容器の製造装置及び核酸試料含有容器の製造プログラム、並びに、核酸試料
JP2020051158A (ja) 2018-09-27 2020-04-02 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 建物制御システム、建物制御方法、及びプログラム
JP7317311B2 (ja) 2018-12-18 2023-07-31 株式会社リコー ライブラリー調製用デバイス
EP3670670A1 (en) 2018-12-18 2020-06-24 Ricoh Company, Ltd. Nucleic acid analysis method, nucleic acid analysis program, and device for library preparation
JP2020108358A (ja) 2019-01-07 2020-07-16 株式会社リコー 標的対象を高感度に検出するための方法
EP3750673B1 (en) 2019-06-10 2021-09-29 Nanjing Chervon Industry Co., Ltd. Power tool

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023181694A1 (ja) * 2022-03-23 2023-09-28 株式会社リコー 核酸処理効率算出方法及びそれを用いた核酸定量値補正方法、並びに標的ｒｎａ測定デバイス

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