JP2021040499A - デバイス、キット、評価方法及び判定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価技術を提供する。【解決手段】リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応を評価する工程と、を含む、前記リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価方法。【選択図】なし
Description
本発明は、デバイス、キット及び方法に関する。より具体的には、本発明は、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価方法、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価用デバイス、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価用キット、増幅反応の反応条件の評価方法、増幅反応の反応条件の評価用デバイス、増幅反応の反応条件の評価用キット、非特異増幅のない検出下限を判定する方法、非特異増幅のない検出下限の判定用デバイス及び非特異増幅のない検出下限の判定用キットに関する。
近年、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）は、遺伝子検査の定性及び定量においてますます重要になってきている。このため、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価、特に装置間、施設間の性能評価は重要である。
また、近年では、リアルタイムＰＣＲは遺伝子組み換え作物・食品（ＧＭＯ）否定試験、ウイルス混入否定試験等にも利用されていることから、試験結果に対する信頼性を保証することが求められている。
例えば、特許文献１には、検査装置の面内均一性、検査装置間の性能及び検査施設間の性能を適正に評価する技術が記載されている。また、特許文献２には、試薬組成物を調製する調製者の技能を適正に評価する技術が記載されている。
本発明は、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価技術を提供することを目的とする。
本発明のリアルタイムＰＣＲ装置の性能評価方法は、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応を評価する工程とを含む。
本発明によると、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価技術を提供することができる。
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価方法］
１実施形態において、本発明は、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応を評価する工程と、を含む、前記リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応を評価する工程と、を含む、前記リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価方法を提供する。
実施例において後述するように、本実施形態の性能評価方法によれば、リアルタイムＰＣＲ装置の性能を精度よく評価することができる。このため、本実施形態の性能評価方法は、リアルタイムＰＣＲ装置の精度管理等に有用である。
リアルタイムＰＣＲとは、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）の一種であり、ＰＣＲによる増幅を経時的（リアルタイム）に測定することで、増幅率に基づいて鋳型核酸を定量するものである。定量は蛍光色素を用いて行われ、主に、インターカレーション法とハイブリダイゼーション法が存在する。
インターカレーション法では、二本鎖ＤＮＡに特異的に挿入（インターカレート）して蛍光を発するインターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う。インターカレーターとしては、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ＣＡＳ番号：１６３７９５−７５−３）又はその誘導体が挙げられる。一方、ハイブリダイゼーション法ではＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いる方法が最も一般的であり、対象核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドに蛍光物質及び消光物質を結合させたプローブが用いられる。
本実施形態の性能評価方法では、まず、評価対象であるリアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う。続いて、増幅反応を評価する。増幅反応の評価は、Ｃｑ値、Ｔｍ値、非特異増幅の有無等の値に基づいて行うことが好ましい。これらの値は１種を単独で評価に用いてもよいし、２種以上を組み合わせて評価に用いてもよい。実施例において後述するように、発明者らは、特に、Ｔｍ値のばらつきが、リアルタイムＰＣＲ装置の性能を精度よく評価する指標として有用であることを見出した。
Ｃｑ値とは、Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）と同義であり、一定の増幅産物量になるＰＣＲサイクル数を意味する。Ｃｑ値が小さいことは鋳型核酸量が多いことを示し、Ｃｑ値が大きいことは鋳型核酸量が少ないことを示す。本実施形態の性能評価方法において、Ｃｑ値のばらつきとは、複数の反応空間内で同条件の増幅反応を行った場合に、各反応空間で求められたＣｑ値同士のばらつきをいう。Ｃｑ値のばらつきが小さいことはリアルタイムＰＣＲ装置の性能が高いことを意味する。
Ｔｍ値としては、増幅産物の融解曲線から求められる値を用いることができる。融解曲線とは、インターカレーターが結合した増幅産物を加熱し、インターカレーターの蛍光を経時的に測定し、蛍光強度を温度に対してプロットして得られる曲線である。
インターカレーターが結合した増幅産物を加熱すると、融解点（Ｔｍ）に達した時点で二本鎖である増幅産物の解離及びそれに続くインターカレーターの放出により、急激な蛍光強度の減少が検出される。このため、蛍光強度を温度に対してプロットし、続いて、−ΔＦ／ΔＴを温度に対してプロットすることにより、−ΔＦ／ΔＴのピークとしてＴｍ値を求めることができる。ここで、ΔＦは蛍光強度の変化量を示し、ΔＴは温度の変化量を示す。
Ｔｍ値のばらつきとは、複数の反応空間内で同条件の増幅反応を行った後、各反応空間内で融解曲線をそれぞれ測定し、目的の増幅産物のＴｍ値を求めた場合に、各反応空間で求められた目的の増幅産物のＴｍ値同士のばらつきをいう。Ｔｍ値のばらつきが小さいことはリアルタイムＰＣＲ装置の性能が高いことを意味する。
非特異増幅の有無とは、目的の増幅産物以外の増幅が存在したか否かを意味する。上述した融解曲線において、急激な蛍光強度の減少が複数認められる場合がある。目的の増幅産物以外の増幅産物に由来する急激な蛍光強度の減少の存在は、非特異増幅が存在することを示す。また、−ΔＦ／ΔＴを温度に対してプロットした場合に複数のピークが認められた場合、目的の増幅産物以外の増幅産物に由来するピークの存在は、非特異増幅が存在することを示す。非特異増幅が存在しないことは、リアルタイムＰＣＲ装置の性能が高いことを意味する。
リアルタイムＰＣＲ装置の性能としては、各反応空間の温度制御性能、各反応空間の蛍光測定性能等が挙げられる。リアルタイムＰＣＲ装置の性能が高いとは、例えば、各反応空間の温度制御精度、蛍光測定精度にばらつきがないことであってもよい。
本実施形態の性能評価方法において、１反応空間あたりの鋳型核酸のコピー数が特定されており、コピー数が１００コピー以下である反応空間を少なくとも含むことが好ましい。本実施形態の性能評価方法においては、コピー数が１００コピー以下である反応空間と、コピー数が１００コピーを超える反応空間の双方が存在していてもよい。
実施例において後述するように、１反応空間あたりの鋳型核酸のコピー数が１００コピー以下、例えば８０コピー以下、例えば７０コピー以下、例えば６０コピー以下、例えば５０コピー以下、例えば４０コピー以下、例えば３０コピー以下、例えば２０コピー以下、例えば１０コピー以下、例えば５コピー以下、例えば１コピーであると、非特異増幅産物が増加する傾向にあるため、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価を高い精度で行うことができることが明らかとなった。
鋳型核酸とは、少なくともプライマー領域の塩基配列が決まっている核酸を指し、鋳型核酸の全長の塩基配列が決まっていることが好ましい。１反応空間あたりの鋳型核酸のコピー数とは、当該反応空間に含まれる鋳型核酸の数を意味する。
（特定コピー数）
本明細書において、１反応空間あたりの鋳型核酸のコピー数が特定されているとは、１反応空間あたりの鋳型核酸の数が一定以上の精度で特定されていることを意味する。すなわち、実際に反応空間に含まれている鋳型核酸の数が既知であるということができる。つまり、本明細書における特定コピー数は、従来の系列希釈により得られる所定のコピー数（算出推定値）よりも、数としての精度、信頼性が高く、特に、１，０００以下の低コピー数領域であってもポアソン分布によらない制御された値となる。
本明細書において、１反応空間あたりの鋳型核酸のコピー数が特定されているとは、１反応空間あたりの鋳型核酸の数が一定以上の精度で特定されていることを意味する。すなわち、実際に反応空間に含まれている鋳型核酸の数が既知であるということができる。つまり、本明細書における特定コピー数は、従来の系列希釈により得られる所定のコピー数（算出推定値）よりも、数としての精度、信頼性が高く、特に、１，０００以下の低コピー数領域であってもポアソン分布によらない制御された値となる。
制御された値は、概ね、不確かさを表す変動係数ＣＶが平均コピー数ｘに対し、ＣＶ＜１／√ｘ又はＣＶ≦２０％のどちらかの値の大きさの中に収まっていることが好ましい。
本実施形態の性能評価方法では、１反応空間あたりの鋳型核酸のコピー数が特定されていることにより、従来よりも正確にリアルタイムＰＣＲ装置の性能評価を行うことが可能となる。
ここで、鋳型核酸の「コピー数」と「分子数」が対応付けられる場合もある。具体的には、例えば、鋳型核酸の塩基配列をゲノム上の２箇所に導入したＧ１期の酵母菌の場合、酵母菌数＝１なら核酸分子数（同一の染色体数）＝１、鋳型核酸のコピー数＝２となる。本明細書においては、鋳型核酸の特定コピー数を鋳型核酸の絶対数という場合がある。
鋳型核酸を含むウェルが複数存在する場合、各ウェル内に含まれる鋳型核酸のコピー数が同一であるとは、増幅反応を行うための試薬を反応空間に充填する際に生じる、鋳型核酸の数のばらつきが許容範囲内であることを意味する。鋳型核酸の数のばらつきが許容範囲内にあるか否かについては、以下に示す不確かさの情報に基づいて判断することができる。
鋳型核酸の特定コピー数に関する情報としては、例えば、不確かさの情報、後述する担体の情報、鋳型核酸の情報等が挙げられる。
「不確かさ」とは、「測定の結果に付随した、合理的に測定量に結びつけられ得る値のばらつきを特徴づけるパラメータ」であるとＩＳＯ／ＩＥＣ Ｇｕｉｄｅ９９：２００７［国際計量計測用語−基本及び一般概念並びに関連用語（ＶＩＭ）］に定義されている。
ここで、「合理的に測定量に結びつけられ得る値」とは、測定量の真の値の候補を意味する。すなわち、不確かさとは、測定対象の製造に係る操作、機器等に起因する測定結果のばらつきの情報を意味する。不確かさが大きいほど、測定結果として予想されるばらつきが大きくなる。不確かさは、例えば、測定結果から得られる標準偏差であってもよく、真の値が所定の確率以上で含まれている値の幅として表す信頼水準の半分の値であってもよい。
不確かさは、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ ｉｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ（ＧＵＭ：ＩＳＯ／ＩＥＣ Ｇｕｉｄｅ９８−３）及びＪａｐａｎ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ Ｂｏａｒｄ Ｎｏｔｅ １０試験における測定の不確かさに関するガイドライン等に基づいて算出することができる。
不確かさを算出する方法としては、例えば、測定値等の統計を用いたタイプＡ評価法と、校正証明書、製造者の仕様書、公表されている情報等から得られる不確かさの情報を用いたタイプＢ評価法の２つの方法を適用することができる。
不確かさは、操作及び測定等の要因から得られる不確かさを全て標準不確かさに変換することにより、同じ信頼水準で表現することができる。標準不確かさとは、測定値から得られた平均値のばらつきを示す。
不確かさを算出する方法の一例としては、例えば、不確かさを引き起こす要因を抽出し、それぞれの要因の不確かさ（標準偏差）を算出する。続いて、算出したそれぞれの要因の不確かさを平方和法により合成し、合成標準不確かさを算出する。合成標準不確かさの算出において、平方和法を用いるため、不確かさを引き起こす要因の中で不確かさが十分に小さい要因については無視することができる。
不確かさの情報としては、反応空間に充填される試薬の変動係数を用いてもよい。変動係数とは、例えば、鋳型核酸を反応空間に充填する際に生じる各反応空間に充填される鋳型核酸の数のばらつきの相対値を意味する。すなわち、変動係数とは、反応空間に充填した鋳型核酸の数の充填精度を意味する。変動係数とは、標準偏差σを平均値ｘで除した値である。ここでは、標準偏差σを平均コピー数（平均充填コピー数）ｘで除した値を変動係数ＣＶとすると、下記式１の関係式になる。
一般的に、鋳型核酸は分散液中でポアソン分布のランダムな分布状態を取っている。そのため、段階希釈法、すなわち、ポアソン分布におけるランダムな分布状態では、標準偏差σは、平均コピー数ｘと下記式２の関係式を満たすとみなすことができる。これより、鋳型核酸の分散液を段階希釈法により希釈した場合、標準偏差σと平均コピー数ｘとから平均コピー数ｘの変動係数ＣＶ（ＣＶ値）を、上記式１及び式２から導出された下記式３を用いて求めると、表１及び図３４に示すようになる。ポアソン分布に基づくばらつきを持ったコピー数の変動係数のＣＶ値は図３４から求めることができる。
表１及び図３４の結果から、例えば、反応空間に１００コピー数の鋳型核酸を段階希釈法により充填する場合には、最終的に反応溶液中に充填される鋳型核酸のコピー数はその他の精度を無視しても、少なくとも１０％の変動係数（ＣＶ値）を持つことがわかる。
鋳型核酸のコピー数は、変動係数のＣＶ値と、鋳型核酸の平均特定コピー数ｘとが、次式、ＣＶ＜１／√ｘを満たすことが好ましく、ＣＶ＜１／２√ｘを満たすことがより好ましい。
不確かさの情報としては、鋳型核酸を含む反応空間が複数存在する場合、反応空間に含まれる鋳型核酸の特定コピー数に基づく、反応空間全体としての不確かさの情報を用いることが好ましい。
不確かさを引き起こす要因としてはいくつか考えられ、例えば、鋳型核酸を細胞に導入して当該細胞を反応空間に計数及び分注する場合には、細胞内の鋳型核酸の数（例えば、細胞の細胞周期等）、細胞を反応空間に配置する手段（インクジェット装置、インクジェット装置の動作のタイミングを制御する装置等の各部位の動作による結果を含む。例えば、細胞懸濁液を液滴化した時の液滴に含まれる細胞数等）、細胞が反応空間の適切な位置に配置された頻度（例えば、反応空間内に配置された細胞数等）、細胞が細胞懸濁液中で破壊されることにより鋳型核酸が細胞懸濁液中に混入することによるコンタミネーション（夾雑物の混入、以下、「コンタミ」という場合がある。）等が挙げられる。
鋳型核酸の情報としては、例えば、鋳型核酸の数に関する情報が挙げられる。鋳型核酸の数に関する情報としては、例えば、反応空間に含まれる鋳型核酸の数の不確かさの情報等が挙げられる。
［リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価用デバイス］
１実施形態において、本発明は、複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価用デバイスを提供する。
１実施形態において、本発明は、複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価用デバイスを提供する。
本実施形態のデバイスは、上述したリアルタイムＰＣＲ装置の性能評価の用途に特に適しており、上述したリアルタイムＰＣＲ装置の性能評価方法に好適に利用することができる。
本実施形態のデバイスは、複数の反応空間を有し、複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む。反応空間は、特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターの他にも、増幅反応を可能とする追加の試薬を含んでいてもよい。
追加の試薬としては、例えば、プライマー、増幅試薬等が挙げられる。プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、鋳型ＤＮＡに特異的な１８〜３０塩基の相補的塩基配列を持つ合成オリゴヌクレオチドであり、増幅対象領域を挟むようにフォワードプライマー（センスプライマー）とリバースプライマー（アンチセンスプライマー）の２か所（一対）設定される。
増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、例えば、酵素としてＤＮＡポリメラーゼ、基質として４種の塩基（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ）、Ｍｇ２＋（終濃度約２ｍＭの塩化マグネシウム）、最適ｐＨ（ｐＨ７．５〜９．５）を保持するバッファー等が挙げられる。
反応空間内の鋳型核酸及びインターカレーター、並びに、存在する場合、プライマー及び増幅試薬の状態は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、溶液又は固体のいずれかの状態であってもよい。
使用性の観点からは、特に、溶液状態であることが好ましい。溶液状態であると、使用者はすぐに試験に用いることができる。輸送上の観点からは、特に、固体状態であることが好ましく、固体乾燥状態がより好ましい。固体乾燥状態であると、分解酵素等による試薬の分解速度を低減化することができ、試薬の保存性を向上させることができる。
乾燥方法としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、凍結乾燥、加熱乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、蒸気乾燥、吸引乾燥、赤外線乾燥、バレル乾燥、スピン乾燥等が挙げられる。
反応空間は、デバイスの使用直前に、固体乾燥状態の試薬をバッファーや水に溶解させることで、すぐに反応液として用いることができるよう、適正量の試薬を含んでいることが好ましい。
本実施形態のデバイスは、複数の反応空間の全部に特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含んでいてもよいし、複数の反応空間の一部に特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含んでいてもよい。後者の場合、残部の反応空間は、例えば空であってもよいし、異なる組成の試薬を含んでいてもよい。特定されたコピー数については上述した通りである。
本実施形態のデバイスにおいて、反応空間の形態は特に限定されず、例えば、ウェル、液滴、基板上の区画等が挙げられる。例えば、反応空間がウェルである場合、本実施形態のデバイスはウェルプレートの形態であってもよい。
（ウェル）
ウェルは、その形状、数、容積、材質、色等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。ウェルの形状としては、特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーター、並びに、存在する場合、追加の試薬を含むことができれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平底、丸底、Ｕ底、Ｖ底等の凹部、等が挙げられる。
ウェルは、その形状、数、容積、材質、色等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。ウェルの形状としては、特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーター、並びに、存在する場合、追加の試薬を含むことができれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平底、丸底、Ｕ底、Ｖ底等の凹部、等が挙げられる。
ウェルの数は複数であり、５以上が好ましく、５０以上がより好ましい。ウェルの数が２以上であるマルチウェルプレートが好適に用いられる。マルチウェルプレートとしては、ウェル数が、例えば、２４、４８、９６、３８４、１,５３６等であるウェルプレートが挙げられる。
ウェルの容積は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができるが、一般的なリアルタイムＰＣＲ装置に用いられる試料量を考慮すると、１０μＬ以上１,０００μＬ以下が好ましい。
ウェルの材質は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート等が挙げられる。
ウェルの色は、例えば、透明、半透明、着色、完全遮光等であってよい。ウェルの濡れ性は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、撥水性であってもよい。ウェルの濡れ性が、撥水性であると、ウェル内壁への試薬の吸着を低減化することができる。また、ウェルの濡れ性が撥水性であると、ウェル内の試薬を溶液状態で移動することが容易である。
ウェル内壁の撥水化の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フッ素系樹脂被膜を形成する方法、フッ素プラズマ処理、エンボス加工等が挙げられる。特に、接触角が１００°以上となる撥水化処理を施すことで、液体の取りこぼしによる試薬の減少、不確かさ、変動係数の増大を抑えることができる。
（基材）
本実施形態のデバイスは、ウェルが基材に設けられたプレート状のものが好ましいが、８連チューブ等の連結タイプのウェルチューブであってもよい。基材としては、その材質、形状、大きさ、構造等について特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
本実施形態のデバイスは、ウェルが基材に設けられたプレート状のものが好ましいが、８連チューブ等の連結タイプのウェルチューブであってもよい。基材としては、その材質、形状、大きさ、構造等について特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
基材の材質は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、半導体、セラミックス、金属、ガラス、石英ガラス、プラスチックス等が挙げられる。これらの中でも、プラスチックスが好ましい。
プラスチックスとしては、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート等が挙げられる。
基材の形状は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、板状、プレート状等が挙げられる。基材の構造は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、単層構造であってもよいし、複数層構造であってもよい。
（識別手段）
本実施形態のデバイスは、鋳型核酸の特定コピー数の情報を識別可能な識別手段を有していてもよい。識別手段は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メモリ、ＩＣチップ、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、Ｒａｄｉｏ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（以下、「ＲＦＩＤ」とも称することがある）、色分け、印刷等が挙げられる。
本実施形態のデバイスは、鋳型核酸の特定コピー数の情報を識別可能な識別手段を有していてもよい。識別手段は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メモリ、ＩＣチップ、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、Ｒａｄｉｏ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（以下、「ＲＦＩＤ」とも称することがある）、色分け、印刷等が挙げられる。
識別手段を設ける位置及び識別手段の数は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
識別手段に記憶させる情報としては、鋳型核酸の特定コピー数の情報以外にも、例えば、分析結果（例えば、Ｃｑ値、Ｃｑ値のばらつき、Ｔｍ値、Ｔｍ値のばらつき、非特異増幅の有無等）、ウェルに配置した鋳型核酸の数（例えば、細胞の数）、細胞の生死、複数のウェルのうちどのウェルに鋳型核酸が充填されているのか、鋳型核酸の種類、測定日時、測定者の氏名等が挙げられる。
識別手段に記憶された情報は、各種読取手段を用いて読み取ることができ、例えば、識別手段がバーコードであれば読取手段としてバーコードリーダーが用いられる。
識別手段に情報を書き込む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、手入力、ウェルに鋳型核酸を分注する際に鋳型核酸の個数を計数する液滴形成装置から直接データを書き込む方法、サーバに保存されているデータの転送、クラウドに保存されているデータの転送等が挙げられる。
（密閉部材）
その他の部材は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、密閉部材等が挙げられる。
その他の部材は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、密閉部材等が挙げられる。
本実施形態のデバイスは、ウェルへの異物混入又は充填物の流出等を防ぐために、密閉部材を有することが好ましい。密閉部材としては、少なくとも１つのウェルを密閉可能であり、１つ１つのウェルを個別に密閉又は開封できるように、切り取り線により切り離し可能に構成してもよい。
密閉部材の形状としては、ウェル内壁径と一致するキャップ状、ウェル開口部を被覆するフィルム状等が挙げられる。
密閉部材の材質としては、例えば、ポリオレフィン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアミド樹脂等が挙げられる。密閉部材としては、全てのウェルを一度に密閉可能なフィルム状であることが好ましい。また、使用者の誤使用を低減化できるように再開封が必要なウェルと不必要なウェルとの接着強度が異なるように構成されていてもよい。
本実施形態のデバイスは、一のウェルにおける鋳型核酸の特定コピー数と、他のウェルにおける鋳型核酸の特定コピー数とが全て同一であってもよいし、互いに異なる２以上であってもよい。前者の場合、具体的なコピー数としては、例えば、全てのウェルのコピー数が１コピーの場合、５コピーの場合、１０コピーの場合、２０コピーの場合、４０コピーの場合、８０コピーの場合、１６０コピーの場合等が挙げられる。後者の場合、具体的なコピー数としては、例えば、１、５、２０、４０、８０、１６０の場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の場合、１、３、５、７、９の場合、２、４、６、８、１０の場合等が挙げられる。また、ウェルの一部に鋳型核酸を含有させず、ネガティブコントロールとして用いてもよい。
一のウェルにおける鋳型核酸の特定コピー数と、他のウェルにおける鋳型核酸の特定コピー数とが全て同一であるデバイスは、ウェル間の増幅反応の評価結果を比較しやすい。このため、上述した、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価方法に好適に用いることができる。
また、本実施形態のデバイスは、一のウェルにおける鋳型核酸の特定コピー数が１０Ｎ１であり、他のウェルにおける鋳型核酸の特定コピー数が１０Ｎ２であってもよい（ただし、Ｎ１及びＮ２は互いに連続した整数である）。具体的なコピー数としては、例えば、１、１０、１００、１,０００の場合、１００、１,０００、１０,０００、１００,０００、１,０００,０００の場合等が挙げられる。
本実施形態のデバイスは、鋳型核酸の特定コピー数が異なる２以上のウェルのグループ（群）を有していてもよい。例えば、デバイスの基材が、複数のウェルを有するプレートである場合には、プレート上で各グループにより各グループ「領域」が形成される。なお、鋳型核酸の特定コピー数が異なる２以上のグループで形成される「領域」は、ウェル同士が隣接していてもよく、また、離れていてもよい。
これにより、例えば、本実施形態のデバイスを用いてリアルタイムＰＣＲを行って得られた結果において、異なる位置の特定コピー数が同じウェルを比較し使用に適さないウェル（不適合ウェル）があった場合に、再度リアルタイムＰＣＲ装置の校正を行うか、実際のサンプルでは不適合ウェルにおけるサンプルを適用除外とするかの判断ができる。
（鋳型核酸）
核酸とは、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味し、核酸アナログ等も含まれる。核酸としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられる。鋳型核酸は核酸断片であってもよいし、細胞の核中に組み込まれていてもよいが、細胞の核中に組み込まれていることが好ましい。
核酸とは、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味し、核酸アナログ等も含まれる。核酸としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられる。鋳型核酸は核酸断片であってもよいし、細胞の核中に組み込まれていてもよいが、細胞の核中に組み込まれていることが好ましい。
鋳型核酸は、生物から得られる天然物であってもよいし、その加工物であってもよいし、遺伝子組換え技術を利用して製造されたものであってもよいし、化学的に合成された人工合成核酸であってもよい。これらは、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。人工合成核酸とすることにより、不純物が少なくなり、低分子化することが可能となるため、初期反応効率を向上させることができる。
人工合成核酸とは、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡと同様の構成成分（塩基、デオキシリボース、リン酸）からなる核酸を人工的に合成した核酸を意味する。人工合成核酸は、例えば、タンパク質をコードする塩基配列を有する核酸であってもよいし、任意の塩基配列を有する核酸であってもよい。
核酸又は核酸断片のアナログとしては、核酸又は核酸断片に非核酸成分を結合させたもの、核酸又は核酸断片を蛍光色素や同位元素等の標識剤で標識したもの（例えば、蛍光色素や放射線同位体で標識されたプライマーやプローブ）、核酸又は核酸断片を構成するヌクレオチドの一部の化学構造を変化させた人工核酸（例えば、ＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡ等）が挙げられる。
鋳型核酸の形態は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖核酸、一本鎖核酸、部分的に二本鎖又は一本鎖である核酸等が挙げられ、環状又は直鎖状のプラスミドであってもよい。また、核酸は修飾又は変異を有していてもよい。
鋳型核酸は、塩基配列が明らかな特定の塩基配列を有することが好ましい。特定の塩基配列は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、感染症検査に用いられる塩基配列、自然界には存在しない非天然の塩基配列、動物細胞由来の塩基配列、植物細胞由来の塩基配列、真菌細胞由来の塩基配列、細菌由来の塩基配列、ウイルス由来の塩基配列等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
非天然の塩基配列を用いる場合、塩基配列のＧＣ含有率が３０％以上７０％以下であることが好ましく、ＧＣ含量が一定であることが好ましい。鋳型核酸の塩基長は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２０塩基対（又はｍｅｒ）以上１０，０００塩基対（又はｍｅｒ）以下の塩基長等が挙げられる。
鋳型核酸として感染症検査に用いられる塩基配列を用いる場合、その感染症特有の塩基配列を含んでいれば、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができるが、公定法や通知法で指定されている塩基配列を含むことが好ましい。
鋳型核酸は、使用する細胞由来の核酸であってもよく、遺伝子導入により導入された核酸であってもよい。鋳型核酸の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。鋳型核酸として、細胞の核中に遺伝子導入により組み込まれた核酸を使用する場合には、１細胞に特定コピー数（例えば、１コピー）の鋳型核酸が導入されていることを確認することが好ましい。特定コピー数の鋳型核酸が導入されていることの確認方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シーケンス、ＰＣＲ法、サザンブロット法等が挙げられる。
細胞の核中に鋳型核酸を導入する場合、遺伝子導入の方法としては、特定の核酸配列が目的の場所に目的のコピー数導入できれば特に限定されず、例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ＴＡＬＥＮ、Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｆｌｉｐ−ｉｎ、Ｊｕｍｐ−ｉｎ等が挙げられる。あるいは、プラスミド、人工染色体等の形態で細胞の核中に鋳型核酸を導入してもよい。例えば、細胞として酵母菌（酵母細胞）を用いる場合、これらの中でも効率の高さ及び制御のしやすさの点から、相同組換えが好ましい。
（担体）
鋳型核酸は、担体に担持された状態で扱われることが好ましい。例えば、鋳型核酸が粒子形状の担体（担体粒子）に担持（より好ましくは内包）されている態様等が挙げられる。担体としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞、樹脂、リポソーム、マイクロカプセル等が挙げられる。
鋳型核酸は、担体に担持された状態で扱われることが好ましい。例えば、鋳型核酸が粒子形状の担体（担体粒子）に担持（より好ましくは内包）されている態様等が挙げられる。担体としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞、樹脂、リポソーム、マイクロカプセル等が挙げられる。
《細胞》
細胞は、生物体を形成する構造的及び機能的単位であり、核中の特定配列を鋳型核酸として用いることができる。鋳型核酸は、核中に本来存在する塩基配列であってもよいし、外部から導入されたものであってもよい。
細胞は、生物体を形成する構造的及び機能的単位であり、核中の特定配列を鋳型核酸として用いることができる。鋳型核酸は、核中に本来存在する塩基配列であってもよいし、外部から導入されたものであってもよい。
細胞としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞等が挙げられる。細胞は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
真核細胞としては、特に限定されず、目的応じて適宜選択することができ、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、藻類、原生動物等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞、真菌細胞が好ましい。
動物細胞は接着性細胞であってもよいし、浮遊性細胞であってもよい。接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞であってもよく、組織や器官から直接採取した初代細胞を何代か継代させたものであってもよく、分化した細胞であってもよく、未分化の細胞であってもよい。
分化した細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、星細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞、類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞、ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞、骨細胞等が挙げられる。
未分化の細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の全能性幹細胞；間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞等が挙げられる。
真菌細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カビ、酵母菌等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞周期を調節することができ、１倍体を使用することができる点から、酵母菌が好ましい。細胞周期とは、細胞が増えるとき、細胞分裂が生じ、細胞分裂で生じた細胞（娘細胞）が再び細胞分裂を行う細胞（母細胞）となって新しい娘細胞を生み出す過程を意味する。
酵母菌は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、Ｇ０／Ｇ１期に同調して同調培養され、Ｇ１期で固定されたものが好ましい。また、酵母菌としては、例えば、細胞周期をＧ１期に制御するフェロモン（性ホルモン）の感受性が増加したＢａｒ−１欠損酵母が好ましい。酵母菌がＢａｒ−１欠損酵母であると、細胞周期が制御できていない酵母菌の存在比率を低くすることができるため、ウェル内に収容された細胞中の鋳型核酸の数の増加等を防ぐことができる。
原核細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌等の真正細菌、古細菌等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
細胞は、死細胞であることが好ましい。死細胞であると、分取後に細胞分裂が起こることを防ぐことができる。細胞は、光を受光したときに発光可能であることが好ましい。光を受光したときに発光可能な細胞であると、細胞の数を高精度に制御してウェル内に着弾させることができる。
細胞は、光を受光した時に発光可能であることが好ましい。受光とは、光を受けることを意味する。細胞の発光は、光学センサで検出する。光学センサとは、人間の目で見ることができる可視光線と、それより波長の長い近赤外線や短波長赤外線、熱赤外線領域までの光のいずれかの光をレンズで集め、対象物である細胞の形状等を画像データとして取得する受動型センサを意味する。
光を受光したときに発光可能な細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光色素で染色された細胞、蛍光タンパク質を発現した細胞、蛍光標識抗体により標識された細胞等が挙げられる。細胞における蛍光色素による染色部位、蛍光タンパク質の発現部位、蛍光標識抗体による標識部位としては、特に制限はなく、細胞全体、細胞核、細胞膜等が挙げられる。
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類等が挙げられる。これらは１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、シアニン類が好ましく、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３、Ｃｙ３がより好ましい。
蛍光色素としては、市販品を用いることができ、市販品としては、例えば、商品名：ＥｏｓｉｎＹ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：エバンスブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：トリパンブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン６Ｇ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミンＢ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン１２３（和光純薬工業株式会社製）等が挙げられる。
蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ−ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲ等が挙げられる。これらは１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
蛍光標識抗体は、対象細胞に結合することができ、蛍光標識されていれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ８抗体等が挙げられる。これらは１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
細胞の体積平均粒径は、遊離状態において、３０μｍ以下が好ましく、１０μｍ以下がより好ましく、７μｍ以下が特に好ましい。体積平均粒径が、３０μｍ以下であれば、インクジェット法やセルソーター等の液滴吐出手段に好適に用いることができる。
細胞の体積平均粒径は、例えば、次のような測定方法で測定することができる。細胞として酵母を用いた場合、作製した染色済み酵母分散液から１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに載せ、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いること等により体積平均粒径を測定することができる。なお、細胞数も同様の測定方法により求めることができる。
細胞懸濁液における細胞の密度は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができるが、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下が好ましく、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０７個／ｍＬ以下がより好ましい。細胞密度が上記の範囲であると、吐出した液滴中に細胞を確実に含むことができる。細胞密度は、体積平均粒径の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いて測定することができる。
《樹脂》
樹脂としては、鋳型核酸を担持することができれば、その材質、形状、大きさ、構造については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
樹脂としては、鋳型核酸を担持することができれば、その材質、形状、大きさ、構造については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
《リポソーム》
リポソームとは、脂質分子を含む脂質二重層から形成される脂質小胞体であり、具体的には、脂質分子の疎水性基と親水性基の極性に基づいて生じる脂質二重層により外界から隔てられた空間を有する閉鎖された脂質を含む小胞体を意味する。
リポソームとは、脂質分子を含む脂質二重層から形成される脂質小胞体であり、具体的には、脂質分子の疎水性基と親水性基の極性に基づいて生じる脂質二重層により外界から隔てられた空間を有する閉鎖された脂質を含む小胞体を意味する。
リポソームは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームはシングルラメラ（単層ラメラ、ユニラメラ、二重層膜が一重）であっても、多層ラメラ（マルチラメラ、タマネギ状の構造をした多数の二重層膜で、個々の層は水様の層で仕切られている）であってもよい。
リポソームは、鋳型核酸を内包することができることが好ましく、その形態は特に限定されない。「内包」とは、リポソームに対して核酸が内水相又は膜自体に含まれる形態をとることを意味する。例えば、膜で形成された閉鎖空間内に鋳型核酸を封入する形態、膜自体に鋳型核酸を内包する形態等が挙げられ、これらの組合せでもよい。
リポソームの大きさ（平均粒子径）は、鋳型核酸を内包することができれば特に限定されない。また、形態は球状又はそれに近い形態が好ましい。
リポソームの脂質二重層を構成する成分（膜成分）は、脂質から選ばれる。脂質としては、水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒に溶解するものであれば任意に使用することができる。具体的な脂質としては、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類、それらの誘導体等が挙げられる。これらの成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
《マイクロカプセル》
マイクロカプセルとは、壁材と中空構造とを有する微小な粒体を意味し、中空構造に鋳型核酸を内包することができる。マイクロカプセルは、特に限定されず、適宜目的に応じて、壁材、大きさ等を選択することができる。
マイクロカプセルとは、壁材と中空構造とを有する微小な粒体を意味し、中空構造に鋳型核酸を内包することができる。マイクロカプセルは、特に限定されず、適宜目的に応じて、壁材、大きさ等を選択することができる。
マイクロカプセルの壁材としては、例えば、ポリウレタン樹脂、ポリ尿素、ポリ尿素−ポリウレタン樹脂、尿素−ホルムアルデヒド樹脂、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂、ポリアミド、ポリエステル、ポリスルホンアミド、ポリカーボネート、ポリスルフィネート、エポキシリ、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、酢酸ビニル、ゼラチン等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
マイクロカプセルの大きさは、鋳型核酸を内包することができれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。マイクロカプセルの製造方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｉｎ−ｓｉｔｕ法、界面重合法、コアセルベーション法等が挙げられる。
本実施形態のデバイスは、バイオ関連産業、ライフサイエンス産業及び医療産業等において幅広く使用することができ、例えば、リアルタイムＰＣＲ装置装置の性能評価、精度管理等に好適に用いることができる。また、感染症検査等において、公定法や通知法等に定められている方法に適用することができる。
図１（ａ）は、本実施形態のデバイスの一例を示す斜視図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）のｂ−ｂ’線における矢視断面図である。
デバイス１は、基材２と、基材２に形成された複数の反応空間３を有しており、反応空間３に特定コピー数の鋳型核酸４及びインターカレーターが充填されている。図１（ａ）及び図１（ｂ）の例では、反応空間はウェルであり、ウェルの開口部が密閉部材５で覆われている。
また、例えば、各反応空間３に充填する鋳型核酸４の特定コピー数の情報、その他の情報を記憶するＩＣチップ又はバーコード（識別手段６）が、密閉部材５と基材２との間で且つウェルの開口部以外の位置に配置されている。識別手段６がこの位置に配置されていることにより、例えば識別手段６の意図しない改変等を防止することができる。また、デバイス１が識別手段６を有することにより、識別手段６を有しない一般のウェルプレートとの区別はが可能である。このため、デバイスの取り違えを防止することができる。
［デバイスの製造方法］
ここで、複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸を含むデバイスの製造方法について説明する。
ここで、複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸を含むデバイスの製造方法について説明する。
本実施形態の製造方法は、核中に鋳型核酸を有する複数の細胞及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する細胞懸濁液生成工程と、細胞懸濁液を液滴として吐出することによりプレートのウェル内に液滴を順次着弾させる液滴着弾工程と、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する細胞数計数工程と、ウェル内の細胞から核酸を抽出する核酸抽出工程とを含み、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程及び細胞数計数工程において推定した鋳型核酸の数の確からしさを算出する工程、出力工程、記録工程を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の工程を含む。
（細胞懸濁液生成工程）
細胞懸濁液生成工程は、核中に鋳型核酸を有する複数の細胞及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する工程である。溶剤とは、細胞を分散させるために用いる液体を意味する。細胞懸濁液における懸濁とは、細胞が溶剤中に分散して存在する状態を意味する。生成とは、作り出すことを意味する。
細胞懸濁液生成工程は、核中に鋳型核酸を有する複数の細胞及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する工程である。溶剤とは、細胞を分散させるために用いる液体を意味する。細胞懸濁液における懸濁とは、細胞が溶剤中に分散して存在する状態を意味する。生成とは、作り出すことを意味する。
《細胞懸濁液》
細胞懸濁液は、核中に鋳型核酸を有する複数の細胞及び溶剤を含み、添加剤を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の成分を含む。核中に鋳型核酸を有する複数の細胞については、上述した通りである。
細胞懸濁液は、核中に鋳型核酸を有する複数の細胞及び溶剤を含み、添加剤を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の成分を含む。核中に鋳型核酸を有する複数の細胞については、上述した通りである。
《溶剤》
溶剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、培養液、分離液、希釈液、緩衝液、有機物溶解液、有機溶剤、高分子ゲル溶液、コロイド分散液、電解質水溶液、無機塩水溶液、金属水溶液又はこれらの混合液体等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、水、緩衝液が好ましく、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）がより好ましい。
溶剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、培養液、分離液、希釈液、緩衝液、有機物溶解液、有機溶剤、高分子ゲル溶液、コロイド分散液、電解質水溶液、無機塩水溶液、金属水溶液又はこれらの混合液体等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、水、緩衝液が好ましく、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）がより好ましい。
《添加剤》
添加剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤、核酸、樹脂等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
添加剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤、核酸、樹脂等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
界面活性剤は、細胞同士の凝集を防止し、連続吐出安定性を向上することができる。界面活性剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、添加量にもよるが、タンパク質を変性及び失活させない点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、脂肪酸ナトリウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がより好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ等）、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘシリーズ、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡシリーズ、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐシリーズ、Ｎｉｋｋｏｌ ＯＰシリーズ等）、ポリソルベート類（Ｔｗｅｅｎ２０等のＴｗｅｅｎシリーズ等）、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリド等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ポリソルベート類が好ましい。
界面活性剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞懸濁液全量に対して、０．００１質量％以上３０質量％以下が好ましい。含有量が、０．００１質量％以上であると、界面活性剤の添加による効果を得ることができ、３０質量％以下であると、細胞の凝集を抑制することができるため、細胞懸濁液中の核酸のコピー数を厳密に制御することができる。
核酸としては、検査対象の核酸の検出に影響しないものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣｏｌＥ１ ＤＮＡ等が挙げられる。核酸を添加すると、鋳型核酸が、ウェルの壁面等に付着することを防ぐことができる。
樹脂としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンイミド等が挙げられる。
《その他の成分》
その他の成分としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、分散剤等が挙げられる。
その他の成分としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、分散剤等が挙げられる。
細胞を分散する方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビーズミル等のメディア方式、超音波ホモジナイザー等の超音波方式、フレンチプレス等の圧力差を利用する方式等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから超音波方式が好ましい。メディア方式では、解砕能力が強いため、細胞膜や細胞壁を破壊することや、メディアがコンタミとして混入することがある。
細胞のスクリーニング方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、湿式分級、セルソーター、フィルタによるスクリーニング等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから、セルソーター、フィルタによるスクリーニングが好ましい。
細胞は、細胞の細胞周期を測定することにより、細胞懸濁液に含まれる細胞数から鋳型核酸の数を推定することが好ましい。細胞周期を測定するとは、細胞分裂による細胞数を数値化することを意味する。鋳型核酸の数を推定するとは、細胞数から、鋳型核酸のコピー数を求めることを意味する。
計数対象が細胞数ではなく鋳型核酸が何個入っているかであってもよい。通常は、細胞１個につき鋳型核酸が１コピー導入されたものを選択するか、又は、遺伝子組換えにより鋳型核酸を細胞に導入するため、鋳型核酸の数は細胞数と等しいと考えてよい。ただし、細胞は特定の周期で細胞分裂を起こすため、細胞内で核酸の複製が行われる。細胞周期は細胞の種類によって異なるが、細胞懸濁液から所定量の溶液を抜き取り複数細胞の周期を測定することによって、細胞１個中に含まれる鋳型核酸の数に対する期待値及びその確からしさを算出することが可能である。これは、例えば、核染色した細胞をフローサイトメーターによって観測することによって可能である。
確からしさとは、いくつかの事象の生じる可能性がある場合に、特定の１つの事象が起こる可能性の程度を事前に予測して、その事象の起こる確率を意味する。算出とは、計算して求める数値を出すことを意味する。
図２は、ＤＮＡ複製済みの細胞の頻度と、蛍光強度との関係の一例を示すグラフである。図２に示すように、ヒストグラム上でＤＮＡの複製有無により２つのピークが現れるため、ＤＮＡ複製済みの細胞がどの程度の割合で存在するかを算出することが可能である。この算出結果から１細胞中に含まれる平均的な鋳型核酸の数を算出することが可能であり、前述の細胞数計数結果に乗じることにより、鋳型核酸の推定数を算出することが可能である。
また、細胞懸濁液を作製する前に細胞周期を制御する処理を行うことが好ましく、上述したような複製が起きる前又は後の状態に揃えることによって、鋳型核酸の数を細胞数からより精度良く算出することが可能になる。
推定する特定コピー数は、確からしさ（確率）を算出することが好ましい。確からしさ（確率）を算出することにより、これらの数値に基づき確からしさを分散又は標準偏差として表現して出力することが可能である。複数因子の影響を合算する場合には、一般的に用いられる標準偏差の二乗和平方根を用いることが可能である。例えば、因子として吐出した細胞数の正答率、細胞内のＤＮＡ数、吐出された細胞がウェル内に着弾する着弾率等を用いることができる。これらの中で影響の大きい項目を選択して算出することもできる。
（液滴着弾工程）
液滴着弾工程は、細胞懸濁液を液滴として吐出することによりプレートのウェル内に液滴を順次着弾させる工程である。液滴とは、表面張力によりまとまった液体のかたまりを意味する。吐出とは、細胞懸濁液を液滴として飛翔させることを意味する。順次とは、次々に順序どおりにすることを意味する。着弾とは、液滴をウェルに到達させることを意味する。
液滴着弾工程は、細胞懸濁液を液滴として吐出することによりプレートのウェル内に液滴を順次着弾させる工程である。液滴とは、表面張力によりまとまった液体のかたまりを意味する。吐出とは、細胞懸濁液を液滴として飛翔させることを意味する。順次とは、次々に順序どおりにすることを意味する。着弾とは、液滴をウェルに到達させることを意味する。
吐出手段としては、細胞懸濁液を液滴として吐出する手段（以下、「吐出ヘッド」とも称することがある）を好適に用いることができる。
細胞懸濁液を液滴として吐出する方式としては、例えば、インクジェット法におけるオンデマンド方式、コンティニュアス方式等が挙げられる。これらの中でもコンティニュアス方式の場合、安定的な吐出状態に至るまでの空吐出、液滴量の調整、ウェル間を移動する際にも連続的に液滴形成を行い続ける等の理由から、用いる細胞懸濁液のデッドボリュームが多くなる傾向にある。本実施形態では細胞数を調整する観点からデッドボリュームによる影響を低減させることが好ましく、そのため、上記２つの方式では、オンデマンド方式の方がより好適である。
オンデマンド方式としては、例えば、液体に圧力を加えることによって液体を吐出する圧力印加方式、加熱による膜沸騰によって液体を吐出するサーマル方式、静電引力によって液滴を引っ張ることによって液滴を形成する静電方式等の既知の複数の方式等が挙げられる。これらの中でも、以下の理由から、圧力印加方式が好ましい。
静電方式は、細胞懸濁液を保持して液滴を形成する吐出部に対向して電極を設置する必要がある。本実施形態の製造方法では、液滴を受けるためのプレートが対向して配置されており、プレート構成の自由度を上げるため電極の配置は無いことが好ましい。サーマル方式は、局所的な加熱が発生するため生体材料である細胞への影響や、ヒーター部への焦げ付き（コゲーション）が懸念される。熱による影響は、含有物やプレートの用途に依存するため、一概に除外する必要はないが、圧力印加方式は、サーマル方式よりヒーター部への焦げ付きの懸念がないという点から好ましい。
圧力印加方式としては、ピエゾ素子を用いて液体に圧力を加える方式、電磁バルブ等のバルブによって圧力を加える方式等が挙げられる。細胞懸濁液の液滴吐出に使用可能な液滴生成デバイスの構成例を図３〜５に示す。
図３は、電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。電磁バルブ方式の吐出ヘッドは、電動機１３ａ、電磁弁１１２、液室１１ａ、細胞懸濁液３００ａ及びノズル１１１ａを有する。電磁バルブ方式の吐出ヘッドとしては、例えば、ＴｅｃｈＥｌａｎ社のディスペンサ等を好適に用いることができる。
図４は、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。ピエゾ方式の吐出ヘッドは、圧電素子１３ｂ、液室１１ｂ、細胞懸濁液３００ｂ及びノズル１１１ｂを有する。ピエゾ方式の吐出ヘッドとしては、Ｃｙｔｅｎａ社のシングルセルプリンター等を好適に用いることができる。
これらの吐出ヘッドのいずれも用いることが可能であるが、電磁バルブによる圧力印加方式では高速に繰り返し液滴を形成することができないため、プレートの生成のスループットを上げるためにはピエゾ方式を用いることが好ましい。また、一般的な圧電素子１３ｂを用いたピエゾ方式の吐出ヘッドでは、沈降によって細胞濃度のムラが発生することや、ノズル詰まりが生じることが問題として生じることがある。
このため、より好ましい構成として図５に示した構成等が挙げられる。図５は、図４における圧電素子を用いたピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例の模式図である。図５の吐出ヘッドは、圧電素子１３ｃ、液室１１ｃ、細胞懸濁液３００ｃ及びノズル１１１ｃを有する。
図５の吐出ヘッドでは、図示していない制御装置から圧電素子１３ｃに対して電圧印加することにより、紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレン１２ｃを紙面上下方向に変形させることができる。
オンデマンド方式以外の方式としては、例えば、連続的に液滴を形成させるコンティニュアス方式等が挙げられる。コンティニュアス方式では、液滴を加圧してノズルから押し出す際に圧電素子やヒーターによって定期的なゆらぎを与え、それによって微小な液滴を連続的に作り出すことができる。更に、飛翔中の液滴の吐出方向を、電圧を印加することによって制御することにより、ウェルに着弾させるか、回収部に回収するかを選ぶことも可能である。このような方式は、セルソーター又はフローサイトメーターで用いられており、例えば、ソニー株式会社製の装置名：セルソーターＳＨ８００Ｚを用いることができる。
図６（ａ）は、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。また、図６（ｂ）は、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。図６（ａ）は、液滴を形成するための駆動電圧を示す。電圧（ＶＡ、ＶＢ、ＶＣ）の強弱により、液滴を形成することができる。図（ｂ）は、液滴の吐出を行わずに細胞懸濁液を撹拌するための電圧を示している。
液滴を吐出しない期間中に、液滴を吐出するほどには強くない複数のパルスを入力することによって、液質内の細胞懸濁液を撹拌することが可能であり、細胞沈降による濃度分布の発生を抑制することができる。
本実施形態において使用することができる吐出ヘッドの液滴形成動作に関して、以下に説明する。吐出ヘッドは、圧電素子に形成された上下電極に、パルス状の電圧を印加することにより液滴を吐出することができる。図７（ａ）〜（ｃ）は、それぞれのタイミングにおける液滴の状態を示す模式図である。
まず、図７（ａ）に示すように、圧電素子１３ｃに電圧を印加することにより、メンブレン１２ｃが急激に変形し、それにより、液室１１ｃ内に保持された細胞懸濁液とメンブレン１２ｃとの間に高い圧力が発生し、この圧力によってノズル部から液滴が外に押し出される。
次に、図７（ｂ）に示すように、圧力が上方に緩和するまでの時間、ノズル部からの液押し出しが続き液滴が成長する。最後に、図７（ｃ）に示すように、メンブレン１２ｃが元の状態に戻る際に細胞懸濁液とメンブレン１２ｃとの界面近傍の液圧力が低下し、液滴３１０’が形成される。
本実施形態の製造方法では、ウェルが形成されたプレートを移動可能なステージ上に固定し、ステージの駆動と吐出ヘッドとからの液滴形成を組み合わせることにより、ウェルに順次液滴を着弾させる。ここで、ステージの移動としてプレートを移動させる方法を示したが、当然のことながら吐出ヘッドを移動させてもよい。
プレートとしては、特に制限はなく、バイオ分野において一般的に用いられるウェルが形成されたものを用いることができる。プレートにおけるウェルの数は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単数であってもよく、複数であってもよい。
図８は、プレートのウェル内に順次液滴を着弾させるための分注装置４００の一例を示す概略図である。図８に示すように、液滴を着弾させるための分注装置４００は、液滴形成装置４０１と、プレート７００と、ステージ８００と、制御装置９００とを有している。
分注装置４００において、プレート７００は、移動可能に構成されたステージ８００上に配置されている。プレート７００には液滴形成装置４０１の吐出ヘッドから吐出された液滴３１０が着滴する複数のウェル７１０（凹部）が形成されている。制御装置９００は、ステージ８００を移動させ、液滴形成装置４０１の吐出ヘッドとそれぞれのウェル７１０との相対的な位置関係を制御する。これにより、液滴形成装置４０１の吐出ヘッドからそれぞれのウェル７１０中に順次、蛍光染色細胞３５０を含む液滴３１０を吐出することができる。
制御装置９００は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、制御装置９００の各種機能は、ＲＯＭ等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてＣＰＵにより実行されることによって実現できる。ただし、制御装置９００の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。また、制御装置９００は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。
吐出する液滴としては、ウェル内に細胞懸濁液を着弾させる際に、複数の水準を得るように液滴をウェル内に着弾させることが好ましい。複数の水準とは、標準となる複数の基準を意味する。複数の水準としては、例えば、ウェル内に鋳型核酸を有する複数の細胞が所定の濃度勾配が挙げられる。複数の水準は、センサによって計数される値を用いて制御することができる。
プレートとしては、１穴マイクロチューブ、８連チューブ、９６穴、３８４穴のウェルプレート等を用いることが好ましいが、ウェルが複数である場合には、これらのプレートにおけるウェルには同じ個数の細胞を分注することも可能であるし、異なる水準の個数の細胞を入れることも可能である。また、細胞が含まれないウェルが存在していてもよい。
（細胞数計数工程）
細胞数計数工程は、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する工程である。センサとは、自然現象や人工物の機械的・電磁気的、熱的、音響的又は化学的性質、あるいはそれらにより示される空間情報・時間情報を、何らかの科学的原理を応用して、人間や機械が扱い易い別媒体の信号に置き換える装置を意味する。計数とは、数を数えることを意味する。
細胞数計数工程は、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する工程である。センサとは、自然現象や人工物の機械的・電磁気的、熱的、音響的又は化学的性質、あるいはそれらにより示される空間情報・時間情報を、何らかの科学的原理を応用して、人間や機械が扱い易い別媒体の信号に置き換える装置を意味する。計数とは、数を数えることを意味する。
細胞数計数工程としては、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数すれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を含んでいてもよい。
液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数の計数としては、液滴がプレートのウェルに確実に入ることが予測されるウェル開口部の直上の位置にあるタイミングにて液滴中の細胞を観測することが好ましい。
液滴中の細胞を観測する方法としては、例えば、光学的に検出する方法、電気的又は磁気的に検出方法等が挙げられる。
《光学的に検出する方法》
図９、図１３及び図１４を用いて、光学的に検出する方法に関して以下に述べる。図９は、液滴形成装置４０１の一例を示す模式図である。図１３及び図１４は、液滴形成装置の他の一例（４０１Ａ、４０１Ｂ）を示す模式図である。図９に示すように、液滴形成装置４０１は、吐出ヘッド（液滴吐出手段）１０と、駆動手段２０と、光源３０と、受光素子６０と、制御手段７０とを有する。
図９、図１３及び図１４を用いて、光学的に検出する方法に関して以下に述べる。図９は、液滴形成装置４０１の一例を示す模式図である。図１３及び図１４は、液滴形成装置の他の一例（４０１Ａ、４０１Ｂ）を示す模式図である。図９に示すように、液滴形成装置４０１は、吐出ヘッド（液滴吐出手段）１０と、駆動手段２０と、光源３０と、受光素子６０と、制御手段７０とを有する。
図９では、細胞懸濁液として細胞を特定の色素によって蛍光染色した後に所定の溶液に分散した液を用いており、吐出ヘッドから形成した液滴に光源から発せられる特定の波長を有する光を照射し細胞から発せられる蛍光を受光素子によって検出することによって計数を行う。このとき、蛍光色素によって細胞を染色する方法に加え、細胞中に元々含まれる分子が発する自家蛍光を利用してもよいし、細胞に蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ））をコードする遺伝子を予め導入しておき細胞が蛍光を発するようにしておいてもよい。光を照射するとは、光をあてることを意味する。
吐出ヘッド１０は、液室１１と、メンブレン１２と、駆動素子１３とを有しており、蛍光染色細胞３５０を懸濁した細胞懸濁液３００を液滴として吐出することができる。
液室１１は、蛍光染色細胞３５０を懸濁した細胞懸濁液３００を保持する液体保持部であり、下面側には貫通孔であるノズル１１１が形成されている。液室１１は、例えば、金属やシリコン、セラミック等から形成することができる。蛍光染色細胞３５０としては、蛍光色素によって染色された無機微粒子や有機ポリマー粒子等が挙げられる。
メンブレン１２は、液室１１の上端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２の平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
駆動素子１３は、メンブレン１２の上面側に設けられている。駆動素子１３の形状は、メンブレン１２の形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２の平面形状が円形である場合には、円形の駆動素子１３を設けることが好ましい。
駆動素子１３に駆動手段２０から駆動信号を供給することにより、メンブレン１２を振動させることができる。メンブレン１２の振動により、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０を、ノズル１１１から吐出させることができる。
駆動素子１３として圧電素子を用いる場合には、例えば、圧電材料の上面及び下面に電圧を印加するための電極を設けた構造とすることができる。この場合、駆動手段２０から圧電素子の上下電極間に電圧を印加することによって紙面横方向に圧縮応力が加わり、メンブレン１２を紙面上下方向に振動させることができる。圧電材料としては、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）を用いることができる。この他にも、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、或いはこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたもの等、様々な圧電材料を用いることができる。
光源３０は、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。なお、飛翔中とは、液滴３１０が液滴吐出手段１０から吐出されてから、着滴対象物に着滴するまでの状態を意味する。飛翔中の液滴３１０は、光Ｌが照射される位置では略球状となっている。又、光Ｌのビーム形状は略円形状である。
ここで、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１０倍〜１００倍程度であることが好ましい。これは、液滴３１０の位置ばらつきが存在する場合においても、光源３０からの光Ｌを確実に液滴３１０に照射するためである。
ただし、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１００倍を大きく超えることは好ましくない。これは、液滴３１０に照射される光のエネルギー密度が下がるため、光Ｌを励起光として発する蛍光Ｌｆの光量が低下し、受光素子６０で検出し難くなるからである。
光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましく、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザー等が好適に用いられる。光Ｌがパルス光である場合のパルス幅は１０μｓ以下が好ましく、１μｓ以下がより好ましい。単位パルス当たりのエネルギーとしては、集光の有無等、光学系に大きく依存するが、概ね０．１μＪ以上が好ましく、１μＪ以上がより好ましい。
受光素子６０は、飛翔中の液滴３１０に蛍光染色細胞３５０が含有されていた場合に、蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として吸収して発する蛍光Ｌｆを受光する。蛍光Ｌｆは、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられるため、受光素子６０は蛍光Ｌｆを受光可能な任意の位置に配置することができる。この際、コントラストを向上するため、光源３０から出射される光Ｌが直接入射しない位置に受光素子６０を配置することが好ましい。
受光素子６０は、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆを受光できる素子であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、液滴に特定の波長を有する光を照射して液滴内の細胞からの蛍光を受光する光学センサが好ましい。受光素子６０としては、例えば、フォトダイオード、フォトセンサ等の１次元素子が挙げられるが、高感度な測定が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードを用いることが好ましい。受光素子６０として、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤ等の２次元素子を用いてもよい。
なお、光源３０が発する光Ｌと比較して蛍光染色細胞３５０の発する蛍光Ｌｆが弱いため、受光素子６０の前段（受光面側）に光Ｌの波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。これにより、受光素子６０において、非常にコントラストの高い蛍光染色細胞３５０の画像を得ることができる。フィルタとしては、例えば、光Ｌの波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタ等を用いることができる。
また、前述のように、光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましいが、光源３０から発せられる光Ｌを連続発振の光としてもよい。この場合には、連続発振の光が飛翔中の液滴３１０に照射されるタイミングで受光素子６０が光を取り込み可能となるように制御し、受光素子６０に蛍光Ｌｆを受光させることが好ましい。
制御手段７０は、駆動手段２０及び光源３０を制御する機能を有している。また、制御手段７０は、受光素子６０が受光した光量に基づく情報を入手し、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する機能を有している。以下、図１０〜図１２を参照し、制御手段７０の動作を含む液滴形成装置４０１の動作について説明する。
図１０は、図９の液滴形成装置の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。図１１は、図９の液滴形成装置の制御手段の機能ブロックを例示する図である。図１２は、液滴形成装置の動作の一例を示すフローチャートである。
図１０に示すように、制御手段７０は、ＣＰＵ７１と、ＲＯＭ７２と、ＲＡＭ７３と、通信インターフェイス（通信Ｉ／Ｆ）７４と、バスライン７５とを有している。ＣＰＵ７１、ＲＯＭ７２、ＲＡＭ７３及びＩ／Ｆ７４は、バスライン７５を介して相互に接続されている。
ＣＰＵ７１は、制御手段７０の各機能を制御する。記憶手段であるＲＯＭ７２は、ＣＰＵ７１が制御手段７０の各機能を制御するために実行するプログラムや、各種情報を記憶している。記憶手段であるＲＡＭ７３は、ＣＰＵ７１のワークエリア等として使用される。また、ＲＡＭ７３は、所定の情報を一時的に記憶することができる。Ｉ／Ｆ７４は、液滴形成装置４０１を他の機器等と接続するためのインターフェイスである。液滴形成装置４０１は、Ｉ／Ｆ７４を介して、外部ネットワーク等と接続されてもよい。
図１１に示すように、制御手段７０は、機能ブロックとして、吐出制御手段７０１と、光源制御手段７０２と、細胞数計数手段（細胞数検知手段）７０３とを有している。
図１１及び図１２を参照しながら、液滴形成装置４０１の細胞数計数について説明する。まず、ステップＳ１１において、制御手段７０の吐出制御手段７０１は、駆動手段２０に吐出の指令を出す。吐出制御手段７０１から吐出の指令を受けた駆動手段２０は、駆動素子１３に駆動信号を供給してメンブレン１２を振動させる。メンブレン１２の振動により、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０が、ノズル１１１から吐出される。
次に、ステップＳ１２において、制御手段７０の光源制御手段７０２は、液滴３１０の吐出に同期して（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号に同期して）光源３０に点灯の指令を出す。これにより、光源３０が点灯し、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。
なお、ここで、同期するとは、液滴吐出手段１０による液滴３１０の吐出と同時に（駆動手段２０が液滴吐出手段１０に駆動信号を供給するのと同時に）発光することではなく、液滴３１０が飛翔して所定位置に達したときに液滴３１０に光Ｌが照射されるタイミングで、光源３０が発光することを意味する。つまり、光源制御手段７０２は、液滴吐出手段１０による液滴３１０の吐出（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号）に対して、所定時間だけ遅延して発光するように光源３０を制御する。
例えば、液滴吐出手段１０に駆動信号を供給した際に吐出する液滴３１０の速度ｖを予め測定しておく。そして、測定した速度ｖに基づいて液滴３１０が吐出されてから所定位置まで到達する時間ｔを算出し、液滴吐出手段１０に駆動信号を供給するタイミングに対して、光源３０が光を照射するタイミングをｔだけ遅延させる。これにより、良好な発光制御が可能となり、光源３０からの光を確実に液滴３１０に照射することができる。
次に、ステップＳ１３において、制御手段７０の細胞数計数手段７０３は、受光素子６０からの情報に基づいて、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する。ここで、受光素子６０からの情報とは、蛍光染色細胞３５０の輝度値（光量）や面積値である。
細胞数計数手段７０３は、例えば、受光素子６０が受光した光量と予め設定された閾値とを比較して、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。この場合には、受光素子６０として１次元素子を用いても２次元素子を用いても構わない。
受光素子６０として２次元素子を用いる場合は、細胞数計数手段７０３は、受光素子６０から得られた２次元画像に基づいて、蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積を算出するための画像処理を行う手法を用いてもよい。この場合、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。
なお、蛍光染色細胞３５０は、細胞や染色細胞であってもよい。染色細胞とは、蛍光色素によって染色された細胞、又は、蛍光タンパク質を発現可能な細胞を意味する。染色細胞において、蛍光色素としては、上述したものを用いることができる。また、蛍光タンパク質としては、上述したものを用いることができる。
このように、液滴形成装置４０１では、蛍光染色細胞３５０を縣濁した細胞懸濁液３００を保持する液滴吐出手段１０に、駆動手段２０から駆動信号を供給して、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０を吐出させ、飛翔中の液滴３１０に光源３０から光Ｌを照射する。そして、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として蛍光Ｌｆを発し、蛍光Ｌｆを受光素子６０が受光する。更に、受光素子６０からの情報に基づいて、細胞数計数手段７０３が、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を計数（カウント）する。
つまり、液滴形成装置４０１では、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を実際にその場で観察するため、蛍光染色細胞３５０の個数の計数精度を従来よりも向上することが可能となる。又、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０に光Ｌを照射して蛍光Ｌｆを発光させて蛍光Ｌｆを受光素子６０で受光するため、高いコントラストで蛍光染色細胞３５０の画像を得ることが可能となり、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を低減できる。
図１３は、図９の液滴形成装置４０１の変形例を示す模式図である。図１３に示すように、液滴形成装置４０１Ａは、受光素子６０の前段にミラー４０を配置した点が、液滴形成装置４０１（図９参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
このように、液滴形成装置４０１Ａでは、受光素子６０の前段にミラー４０を配置したことにより、受光素子６０のレイアウトの自由度を向上することができる。
例えば、ノズル１１１と着滴対象物を近づけた際に、図９のレイアウトでは着滴対象物と液滴形成装置４０１の光学系（特に受光素子６０）との干渉が発生するおそれがあるが、図１３のレイアウトにすることで、干渉の発生を回避することができる。
図１３に示すように、受光素子６０のレイアウトを変更することにより、液滴３１０が着滴する着滴対象物とノズル１１１との距離（ギャップ）を縮めることが可能となり、着滴位置のばらつきを抑制することができる。その結果、分注の精度を向上することが可能となる。
図１４は、図９の液滴形成装置４０１の他の変形例を示す模式図である。図１４に示すように、液滴形成装置４０１Ｂは、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ１を受光する受光素子６０に加え、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ２を受光する受光素子６１を設けた点が、液滴形成装置４０１（図９参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
ここで、蛍光Ｌｆ１及びＬｆ２は、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられる蛍光の一部を示している。受光素子６０及び６１は、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる任意の位置に配置することができる。なお、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる位置に３つ以上の受光素子を配置してもよい。又、各受光素子は同一仕様としてもよいし、異なる仕様としてもよい。
受光素子が１つであると、飛翔する液滴３１０に複数個の蛍光染色細胞３５０が含まれる場合に、蛍光染色細胞３５０同士が重なることに起因して、細胞数計数手段７０３が液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を誤計数する（カウントエラーが発生する）おそれがある。
図１５（ａ）及び図１５（ｂ）は、飛翔する液滴に２個の蛍光染色細胞が含まれる場合を例示する図である。例えば、図１５（ａ）に示すように、蛍光染色細胞３５０１と３５０２とに重なりが発生する場合や、図１５（ｂ）に示すように、蛍光染色細胞３５０１と３５０２とに重なりが発生しない場合があり得る。受光素子を２つ以上設けることで、蛍光染色細胞が重なる影響を低減することが可能である。
前述のように、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光粒子の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光粒子の個数を計数することができる。
受光素子を２つ以上設置する場合，それぞれの受光素子から得られる輝度値或いは面積値のうち、最大値を示すデータを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能である。これに関して、図１６を参照して、より詳しく説明する。
図１６は、粒子同士の重なりが生じない場合の輝度値Ｌｉと、実測される輝度値Ｌｅとの関係を例示する図である。図１６に示すように、液滴内の粒子同士の重なりがない場合には、Ｌｅ＝Ｌｉとなる。例えば、細胞１個の輝度値をＬｕとすると、細胞数／滴＝１個の場合はＬｅ＝Ｌｕであり、細胞数／滴＝ｎ個の場合はＬｅ＝ｎＬｕである（ｎ：自然数）。
しかし、実際には、ｎが２以上の場合には粒子同士の重なりが発生し得るため、実測される輝度値はＬｕ≦Ｌｅ≦ｎＬｕ（図１６の網掛部分）となる。そこで、細胞数／滴＝ｎ個の場合、例えば、閾値を（ｎＬｕ−Ｌｕ／２）≦閾値＜（ｎＬｕ＋Ｌｕ／２）と設定することができる。そして、複数の受光素子を設置する場合、それぞれの受光素子から得られたデータのうち最大値を示すものを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能となる。なお、輝度値に代えて面積値を用いてもよい。
また、受光素子を複数設置する場合、得られる複数の形状データを基に、細胞数を推定するアルゴリズムにより細胞数を決定づけてもよい。このように、液滴形成装置４０１Ｂでは、蛍光染色細胞３５０が異なる方向に発した蛍光を受光する複数の受光素子を有しているため、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を更に低減できる。
図１７は、図９の液滴形成装置４０１の他の変形例を示す模式図である。図１７に示すように、液滴形成装置４０１Ｃは、液滴吐出手段１０が液滴吐出手段１０Ｃに置換された点が、液滴形成装置４０１（図９参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
液滴吐出手段１０Ｃは、液室１１Ｃと、メンブレン１２Ｃと、駆動素子１３Ｃとを有している。液室１１Ｃは、液室１１Ｃ内を大気に開放する大気開放部１１５を上部に有しており、細胞懸濁液３００中に混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能に構成されている。
メンブレン１２Ｃは、液室１１Ｃの下端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２Ｃの略中心には貫通孔であるノズル１２１が形成されており、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００はメンブレン１２Ｃの振動によりノズル１２１から液滴３１０として吐出される。メンブレン１２Ｃの振動の慣性により液滴３１０を形成するため、高表面張力（高粘度）の細胞懸濁液３００でも吐出が可能である。メンブレン１２Ｃの平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
メンブレン１２Ｃの材質としては特に限定はないが、柔らか過ぎるとメンブレン１２Ｃが簡単に振動し、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難であるため、ある程度の硬さがある材質を用いることが好ましい。メンブレン１２Ｃの材質としては、例えば、金属材料やセラミック材料、ある程度硬さのある高分子材料等を用いることができる。
特に、蛍光染色細胞３５０として細胞を用いる際には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料であることが好ましい。細胞の付着性は一般的に材質の水との接触角に依存性があるといわれており、材質の親水性が高い又は疎水性が高いときには細胞の付着性が低い。親水性の高い材料としては各種金属材料やセラミック（金属酸化物）を用いることが可能であり、疎水性が高い材料としてはフッ素樹脂等を用いることが可能である。
このような材料の他の例としては、ステンレス鋼やニッケル、アルミニウム等や、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニア等を挙げることができる。これ以外にも、材料表面をコーティングすることで細胞接着性を低下させることも考えられる。例えば、材料表面を前述の金属又は金属酸化物材料でコーティングすることや、細胞膜を模した合成リン脂質ポリマー（例えば、日油株式会社製、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ）によってコーティングすることが可能である。
ノズル１２１は、メンブレン１２Ｃの略中心に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。この場合、ノズル１２１の径としては特に限定はないが、蛍光染色細胞３５０がノズル１２１に詰まることを避けるため、蛍光染色細胞３５０の大きさの２倍以上とすることが好ましい。蛍光染色細胞３５０が例えば、動物細胞、特にヒトの細胞である場合、ヒトの細胞の大きさは一般的に５μｍ〜５０μｍ程度であるため、ノズル１２１の径を、使用する細胞に合わせて１０μｍ以上が好ましく、１００μｍ以上がより好ましい。
一方で、液滴が大きくなり過ぎると微小液滴を形成するという目的の達成が困難となるため、ノズル１２１の径は２００μｍ以下であることが好ましい。つまり、液滴吐出手段１０Ｃにおいては、ノズル１２１の径は、典型的には１０μｍ〜２００μｍの範囲となる。
駆動素子１３Ｃは、メンブレン１２Ｃの下面側に形成されている。駆動素子１３Ｃの形状は、メンブレン１２Ｃの形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２Ｃの平面形状が円形である場合には、ノズル１２１の周囲に平面形状が円環状（リング状）の駆動素子１３Ｃを形成することが好ましい。駆動素子１３Ｃの駆動方式は、駆動素子１３と同様とすることができる。
駆動手段２０は、メンブレン１２Ｃを振動させて液滴３１０を形成する吐出波形と、液滴３１０を形成しない範囲でメンブレン１２Ｃを振動させる撹拌波形とを駆動素子１３Ｃに選択的に（例えば、交互に）付与することができる。
例えば、吐出波形及び撹拌波形をいずれも矩形波とし、吐出波形の駆動電圧よりも撹拌波形の駆動電圧を低くすることで、撹拌波形の印加により液滴３１０が形成されないようにすることができる。つまり、駆動電圧の高低により、メンブレン１２Ｃの振動状態（振動の程度）を制御することができる。
液滴吐出手段１０Ｃでは、駆動素子１３Ｃがメンブレン１２Ｃの下面側に形成されているため、駆動素子１３Ｃによりメンブレン１２が振動すると、液室１１Ｃの下部方向から上部方向への流れを生じさせることが可能である。
この時、蛍光染色細胞３５０の動きは下から上への運動となり、液室１１Ｃ内で対流が発生して蛍光染色細胞３５０を含有する細胞懸濁液３００の撹拌が起きる。液室１１Ｃの下部方向から上部方向への流れにより、沈降、凝集した蛍光染色細胞３５０が液室１１Ｃの内部に均一に分散する。
つまり、駆動手段２０は、吐出波形を駆動素子１３Ｃに加え、メンブレン１２Ｃの振動状態を制御することにより、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００をノズル１２１から液滴３１０として吐出させることができる。又、駆動手段２０は、撹拌波形を駆動素子１３Ｃに加え、メンブレン１２Ｃの振動状態を制御することにより、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００を撹拌することができる。なお、撹拌時には、ノズル１２１から液滴３１０は吐出されない。
このように、液滴３１０を形成していない間に細胞懸濁液３００を撹拌することにより、蛍光染色細胞３５０がメンブレン１２Ｃ上に沈降、凝集することを防ぐと共に、蛍光染色細胞３５０を細胞懸濁液３００中にムラなく分散させることができる。これにより、ノズル１２１の詰まり及び吐出する液滴３１０中の蛍光染色細胞３５０の個数のばらつきを抑えることが可能となる。その結果、蛍光染色細胞３５０を含有する細胞懸濁液３００を、長時間連続して安定的に液滴３１０として吐出することができる。
また、液滴形成装置４０１Ｃにおいて、液室１１Ｃ内の細胞懸濁液３００中に気泡が混入する場合がある。この場合でも、液滴形成装置４０１Ｃでは、液室１１Ｃの上部に大気開放部１１５が設けられているため、細胞懸濁液３００中に混入した気泡を、大気開放部１１５を通じて外気に排出できる。これによって、気泡排出のために大量の液を捨てることなく、連続して安定的に液滴３１０を形成することが可能となる。
即ち、ノズル１２１の近傍に気泡が混入した場合や、メンブレン１２Ｃ上に多数の気泡が混入した場合には吐出状態に影響を及ぼすため、長い時間安定的に液滴の形成を行うためには、混入した気泡を排出する必要がある。通常、メンブレン１２Ｃ上に混入した気泡は、自然に若しくはメンブレン１２Ｃの振動によって上方に移動するが、液室１１Ｃには大気開放部１１５が設けられているため、混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能となる。そのため、液室１１Ｃに気泡が混入しても不吐出が発生することを防止可能となり、連続して安定的に液滴３１０を形成することができる。
なお、液滴を形成しないタイミングで、液滴を形成しない範囲でメンブレン１２Ｃを振動させ、積極的に気泡を液室１１Ｃの上方に移動させてもよい。
《電気的又は磁気的に検出する方法》
電気的又は磁気的に検出する方法としては、図１８に示すように、液室１１’から細胞懸濁液を液滴３１０’としてプレート７００’に吐出する吐出ヘッドの直下に、細胞計数のためのコイル２００がセンサとして設置されている。細胞は特定のタンパク質によって修飾され細胞に接着することが可能な磁気ビーズによって覆うことにより、磁気ビーズが付着した細胞がコイル中を通過する際に発生する誘導電流によって、飛翔液滴中の細胞の有無を検出することが可能である。一般的に、細胞はその表面に細胞特有のタンパク質を有しており、このタンパク質に接着することが可能な抗体を磁気ビーズに修飾することによって、細胞に磁気ビーズを付着させることが可能である。このような磁気ビーズとしては既製品を用いることが可能であり、例えば、株式会社ベリタス製のＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標登録）が利用可能である。
電気的又は磁気的に検出する方法としては、図１８に示すように、液室１１’から細胞懸濁液を液滴３１０’としてプレート７００’に吐出する吐出ヘッドの直下に、細胞計数のためのコイル２００がセンサとして設置されている。細胞は特定のタンパク質によって修飾され細胞に接着することが可能な磁気ビーズによって覆うことにより、磁気ビーズが付着した細胞がコイル中を通過する際に発生する誘導電流によって、飛翔液滴中の細胞の有無を検出することが可能である。一般的に、細胞はその表面に細胞特有のタンパク質を有しており、このタンパク質に接着することが可能な抗体を磁気ビーズに修飾することによって、細胞に磁気ビーズを付着させることが可能である。このような磁気ビーズとしては既製品を用いることが可能であり、例えば、株式会社ベリタス製のＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標登録）が利用可能である。
《吐出前に細胞を観測する処理》
吐出前に細胞を観測する処理としては、図１９に示すマイクロ流路２５０中を通過してきた細胞３５０’をカウントする方法や、図２０に示す吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法等が挙げられる。
吐出前に細胞を観測する処理としては、図１９に示すマイクロ流路２５０中を通過してきた細胞３５０’をカウントする方法や、図２０に示す吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法等が挙げられる。
図１９に示す方法は、セルソーター装置において用いられている方法であり、例えば、ソニー株式会社製のセルソーターＳＨ８００Ｚを用いることができる。図１９では、マイクロ流路２５０中に光源２６０からレーザー光を照射して散乱光や蛍光を、集光レンズ２６５を用いて検出器２５５により検出することによって細胞の有無や、細胞の種類を識別しながら液滴を形成することが可能である。本方法を用いることによって、マイクロ流路２５０中に通過した細胞の数から所定のウェル中に着弾した細胞の数を推測することが可能である。
また、図２０に示す吐出ヘッド１０’としては、Ｃｙｔｅｎａ社製のシングルセルプリンターを用いることが可能である。図２０では、吐出前において、ノズル部近傍をレンズ２６５’を介して、画像取得部２５５’において画像取得した結果からノズル部近傍の細胞３５０”が吐出されたと推定することや、吐出前後の画像から差分により吐出されたと考えられる細胞の数を推定することによって、所定のウェル中に着弾した細胞の数を推測することができる。図１９に示すマイクロ流路中を通過してきた細胞をカウントする方法では、液滴が連続的に生成されるのに対して、図２０は、オンデマンドで液滴形成が可能であるため、より好ましい。
《着弾後の細胞をカウントする処理》
着弾後の細胞をカウントする処理としては、プレートにおけるウェルを蛍光顕微鏡等により観測することにより、蛍光染色した細胞を検出する方法を取ることが可能である。この方法は、例えば、Moon S., et al., Drop-on-demand single cell isolation and total RNA analysis, PLoS One, 6 (3), e17455, 2011等に記載されている。
着弾後の細胞をカウントする処理としては、プレートにおけるウェルを蛍光顕微鏡等により観測することにより、蛍光染色した細胞を検出する方法を取ることが可能である。この方法は、例えば、Moon S., et al., Drop-on-demand single cell isolation and total RNA analysis, PLoS One, 6 (3), e17455, 2011等に記載されている。
液滴の吐出前及び着弾後に細胞を観測する方法では、以下に述べる問題があり、生成するプレートの種類によっては吐出中の液滴内の細胞を観測することが最も好ましい。
吐出前に細胞を観測する手法においては、流路中を通過した細胞数や吐出前（及び吐出後）の画像観測から、着弾したと思われる細胞数を計数するため、実際にその細胞が吐出されたのかどうかの確認は行われておらず、思いがけないエラーが発生することがある。例えば、ノズル部が汚れていることにより液滴が正しく吐出せず、ノズルプレートに付着し、それに伴い液滴中の細胞も着弾しない、といったケースが発生する。他にも、ノズル部の狭い領域に細胞が残留することや、細胞が吐出動作によって想定以上に移動し観測範囲外に出てしまうといった問題の発生も起こりうる。
また、着弾後のプレート上の細胞を検出する手法においても問題がある。まず、プレートとして顕微鏡観察が可能であるものを準備する必要がある。観測可能なプレートとして、一般的に底面が透明かつ平坦なプレート、特に底面がガラス製となっているプレートが用いられるが、特殊なプレートとなってしまうため、一般的なウェルを使用することができなくなる問題がある。また、細胞数が数十個等多いときには、細胞の重なりが発生するため正確な計数ができなくなる問題もある。
そのため、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサ及び細胞数計数手段によって計数することに加えて、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を行うことが好ましい。
受光素子としては１又は少数の受光部を有する受光素子、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管を用いることが可能であるし、その他に２次元アレイ状に受光素子が設けられたＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｐｕｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤ等二次元センサを用いることも可能である。
１又は少数の受光部を有する受光素子を用いる際には、蛍光強度から細胞が何個入っているかを予め用意された検量線を用いて決定することも考えられるが、主として飛翔液滴中の細胞有無を二値的に検出することが行われる。細胞懸濁液の細胞濃度が十分に低く、液滴中に細胞が１個又は０個しかほぼ入らない状態で吐出を行う際には、二値的な検出で十分精度よく計数を行うことが可能である。
細胞懸濁液中で細胞はランダムに配置していることを前提とすれば、飛翔液滴中の細胞数はポアソン分布にしたがうと考えられ、液滴中に細胞数が２個以上入る確率Ｐ（＞２）は下記式４で表される。
Ｐ（＞２）＝１−（１＋λ）×ｅ−λ …式４
Ｐ（＞２）＝１−（１＋λ）×ｅ−λ …式４
図２１は、確率Ｐ（＞２）と平均細胞数の関係を表すグラフである。ここで、λは液滴中の平均細胞数であり、細胞懸濁液中の細胞濃度に吐出液滴の体積を乗じたものになる。
二値的な検出で細胞計数を行う場合には、確率Ｐ（＞２）が十分小さい値であることが精度を確保する上では好ましく、確率Ｐ（＞２）が１％以下となるλ＜０．１５であることが好ましい。光源としては、細胞の蛍光を励起できるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、水銀ランプやハロゲンランプ等の一般的なランプに特定の波長を照射するようにフィルタをかけたものや、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）、レーザー等を用いることが可能である。ただし、特に１ｎＬ以下の微小な液滴を形成するときには、狭い領域に高い光強度を照射する必要があるため、レーザーを用いるのが好ましい。レーザー光源としては、固体レーザーやガスレーザー、半導体レーザー等一般的に知られている多種のレーザーを用いることが可能である。また、励起光源としては、液滴が通過する領域を連続的に照射したものであってもよいし、液滴の吐出に同期して液滴吐出動作に対して所定時間遅延を付けたタイミングでパルス的に照射するものであってもよい。
（細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程及び細胞数計数工程における推定する核酸の数の確からしさを算出する工程）
本工程は、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程及び細胞数計数工程それぞれの工程における確からしさを算出する工程である。推定する核酸の数の確からしさの算出は、細胞懸濁液生成工程における確からしさと同様に算出することができる。
本工程は、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程及び細胞数計数工程それぞれの工程における確からしさを算出する工程である。推定する核酸の数の確からしさの算出は、細胞懸濁液生成工程における確からしさと同様に算出することができる。
なお、確からしさの算出タイミングは、細胞数計数工程の次工程で、まとめて算出してもよいし、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程及び細胞数計数工程の各工程の最後に算出し、細胞数計数工程の次工程で各不確かさを合成して算出してもよい。いいかえれば、上記各工程での確からしさは、合成算出までに適宜算出しておけばよい。
（出力工程）
出力工程は、ウェル内に着弾した細胞懸濁液に含まれる細胞数として、センサにより測定された検出結果に基づいて細胞数計数手段にて計数された値を出力する工程である。計数された値とは、センサにより測定された検出結果から、細胞数計数手段にて当該ウェルに含まれる細胞数を意味する。
出力工程は、ウェル内に着弾した細胞懸濁液に含まれる細胞数として、センサにより測定された検出結果に基づいて細胞数計数手段にて計数された値を出力する工程である。計数された値とは、センサにより測定された検出結果から、細胞数計数手段にて当該ウェルに含まれる細胞数を意味する。
出力とは、原動機、通信機、計算機等の装置が入力を受けて計数された値を外部の計数結果記憶手段としてのサーバに電子情報として送信することや、計数された値を印刷物として印刷することを意味する。
出力工程は、プレートの生成時に、プレートにおける各ウェルの細胞数又は標的核酸数を観察又は推測し、観測値又は推測値を外部の記憶部に出力する。出力は、細胞数計数工程と同時に行ってもよく、細胞数計数工程の後に行ってもよい。
（記録工程）
記録工程は、出力工程において、出力された観測値又は推測値を記録する工程である。記録工程は、記録部において好適に実施することができる。記録は、出力工程と同時に行ってもよく、出力工程の後に行ってもよい。記録とは、記録媒体に情報を付与することだけでなく、記録部に情報を保存することも含む。
記録工程は、出力工程において、出力された観測値又は推測値を記録する工程である。記録工程は、記録部において好適に実施することができる。記録は、出力工程と同時に行ってもよく、出力工程の後に行ってもよい。記録とは、記録媒体に情報を付与することだけでなく、記録部に情報を保存することも含む。
（核酸抽出工程）
核酸抽出工程は、ウェル内の細胞から核酸を抽出する工程である。抽出とは、細胞膜や細胞壁等を破壊し、核酸をぬき出すことを意味する。細胞から核酸を抽出する方法としては、９０℃〜１００℃で熱処置する方法が知られている。９０℃以下で熱処理するとＤＮＡが抽出されない可能性があり、１００℃以上で熱処理するとＤＮＡが分解される可能性がある。界面活性剤を添加して熱処理することが好ましい。
核酸抽出工程は、ウェル内の細胞から核酸を抽出する工程である。抽出とは、細胞膜や細胞壁等を破壊し、核酸をぬき出すことを意味する。細胞から核酸を抽出する方法としては、９０℃〜１００℃で熱処置する方法が知られている。９０℃以下で熱処理するとＤＮＡが抽出されない可能性があり、１００℃以上で熱処理するとＤＮＡが分解される可能性がある。界面活性剤を添加して熱処理することが好ましい。
界面活性剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、添加量にもよるが、タンパク質を変性・失活させない点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、脂肪酸ナトリウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がより好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ等）、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｏｔｉｔｏｎ Ｘシリーズ、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡシリーズ、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐシリーズ、Ｎｉｋｋｏｌ ＯＰシリーズ等）、ポリソルベート類（Ｔｗｅｅｎ２０等のＴｗｅｅｎシリーズ等）、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリド等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ポリソルベート類が好ましい。
界面活性剤の含有量としては、ウェル中の細胞懸濁液全量に対して、０．０１質量％以上５．００質量％以下が好ましい。含有量が、０．０１質量％以上であると、ＤＮＡ抽出に対して効果を発揮でき、５．００質量％以下であると、ＰＣＲの際に増幅の阻害を防止することができるため、両方の効果を得られる数値範囲として上記０．０１質量％以上５．００質量％以下が好適である。
細胞壁を保有している細胞に関しては、上記の方法で十分にＤＮＡ抽出されないことがある。その場合、例えば、浸透圧ショック法、凍結融解法、酵素消化法、ＤＮＡ抽出用キットの使用、超音波処理法、フレンチプレス法、ホモジナイザー等の方式等が挙げられる。これらの中でも、抽出ＤＮＡのロスが少ないことから、酵素消化法が好ましい。
（その他の工程）
その他の工程は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵素失活工程、追加の試薬を添加する工程等が挙げられる。
その他の工程は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵素失活工程、追加の試薬を添加する工程等が挙げられる。
酵素失活工程は、酵素を失活させる工程である。酵素としては、例えば、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、核酸抽出工程において核酸を抽出するために使用した酵素等が挙げられる。酵素を失活させる方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、公知の方法を好適に用いることができる。
追加の試薬としては、例えば、インターカレーター、プライマー、増幅試薬等が挙げられる。増幅試薬については上述したものと同様である。
［リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価用キット］
１実施形態において、本発明は、複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸を含むデバイスと、インターカレーターと、を含む、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価用キットを提供する。
１実施形態において、本発明は、複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸を含むデバイスと、インターカレーターと、を含む、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価用キットを提供する。
本実施形態のキットは、上述したリアルタイムＰＣＲ装置の性能評価の用途に特に適しており、上述したリアルタイムＰＣＲ装置の性能評価方法に好適に利用することができる。本実施形態のキットにおいて、反応空間、特定されたコピー数、鋳型核酸、デバイス、インターカレーター等については上述したものと同様である。
［リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価装置及び性能評価プログラム］
１実施形態において、本発明は、上述したデバイスを用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行い、前記増幅反応の情報を取得する情報取得部と、情報取得部の情報に基づき、リアルタイムＰＣＲ装置の性能を評価する評価部とを有し、更に必要に応じてその他の手段を有する、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価装置を提供する。
１実施形態において、本発明は、上述したデバイスを用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行い、前記増幅反応の情報を取得する情報取得部と、情報取得部の情報に基づき、リアルタイムＰＣＲ装置の性能を評価する評価部とを有し、更に必要に応じてその他の手段を有する、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価装置を提供する。
１実施形態において、本発明は、上述したデバイスを用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行い、増幅反応の情報に基づいてリアルタイムＰＣＲ装置の性能を評価する処理をコンピュータに実行させる、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価プログラムを提供する。
本実施形態の性能評価装置における制御部等が行う制御は、上述したリアルタイムＰＣＲ装置の性能評価方法を実施することと同義であるので、本実施形態の性能評価装置の説明を通じてリアルタイムＰＣＲ装置の性能評価方法の詳細についても明らかにする。また、本実施形態の性能評価プログラムは、ハードウェア資源としてのコンピュータ等を用いることにより、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価装置が実現することから、本実施形態の性能評価装置の説明を通じて本実施形態の性能評価プログラムの詳細についても明らかにする。
（増幅反応情報取得工程及び情報取得部）
増幅反応を評価する工程は、上述したデバイスを用いた増幅反応の情報を取得する工程であり、情報取得部により実施される。増幅反応の情報は、上述したデバイスを用い、リアルタイムＰＣＲを行うことにより求めることができる。
増幅反応を評価する工程は、上述したデバイスを用いた増幅反応の情報を取得する工程であり、情報取得部により実施される。増幅反応の情報は、上述したデバイスを用い、リアルタイムＰＣＲを行うことにより求めることができる。
増幅反応の情報としては、Ｃｑ値、Ｃｑ値のばらつき、Ｔｍ値、Ｔｍ値のばらつき、非特異増幅の有無等が挙げられる。これらの情報は１種を単独で評価に用いてもよいし、２種以上を組み合わせて評価に用いてもよい。Ｃｑ値のばらつき、Ｔｍ値のばらつき、非特異増幅の有無については上述したものと同様である。Ｃｑ値のばらつき、Ｔｍ値のばらつきとしては、例えば標準偏差、ＣＶ値等が挙げられる。
（評価工程及び評価部）
評価工程は、増幅反応の情報に基づきリアルタイムＰＣＲ装置の性能を評価する工程であり、評価部により実施される。
評価工程は、増幅反応の情報に基づきリアルタイムＰＣＲ装置の性能を評価する工程であり、評価部により実施される。
例えば、定性的な評価では、上述したデバイスを用い、リアルタイムＰＣＲを行ってＣｑ値を測定し、平均Ｃｑ値を算出してもよい。各ウェルのＣｑ値が平均Ｃｑ値の１０％以内であれば「○」、各ウェルのＣｑ値が平均Ｃｑ値の１０％より大きい場合を「×」として、面内特性を評価することができる。
リアルタイムＰＣＲを行ってＴｍ値を測定し、平均Ｔｍ値を算出してもよい。各ウェルのＴｍ値が平均Ｃｑ値の１０％以内であれば「○」、各ウェルのＣｑ値が平均Ｃｑ値の１０％より大きい場合を「×」として、面内特性を評価することができる。
リアルタイムＰＣＲにおける非特異増幅の有無を検出してもよい。各ウェルについて、非特異増幅がなければ「○」、非特異増幅があれば「×」として、面内特性を評価することができる。
また、本実施形態のデバイスを用い、一定期間の計測を行うことにより、増幅反応の情報の経時変化を得ることができる。それによって、面内特性と同様に、例えば、各ウェルのＣｑ値が平均Ｃｑ値の１０％を超える場合は、検査装置の校正を行うか、その計測場所を使用しないという対応をとることができる。また、配置された特定コピー数が絶対値であることから、同じ特定コピー数を配置したデバイスを用いることにより、検査装置間の性能を比較することができる。
定量的な評価では、本実施形態のデバイスを用い、一定期間の計測を行うことにより、増幅反応の情報の経時変化を得ることができる。それによって、面内特性と同様に、品質管理値から逸脱した数値が得られた場合は、検査装置の校正を行うか、その計測場所を使用しないという対応をとることができる。また、配置されたコピー数が絶対値であることから、同じコピー数を配置したデバイスを用いることにより、検査装置間の性能を比較することができる。
また、定量的な評価の場合には、例えば、Ｃｑ値そのものではなく、校正曲線及びＰＣＲ効率からＣｑ値に対応したコピー数（コピー数又は濃度）を求めることができるため、コピー数（コピー数又は濃度）、又はコピー数（コピー数又は濃度）に換算したＣＶ値、コピー数（コピー数又は濃度換算）の（Ｍａｘ−Ｍｉｎ）／２平均値×１００等の数値を用いて検査装置間の性能を評価してもよい。
（その他の工程及びその他の部）
その他の工程及びその他の部は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、表示工程及び表示部等が挙げられる。
その他の工程及びその他の部は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、表示工程及び表示部等が挙げられる。
本実施形態の性能評価プログラムによる処理は、性能評価装置を構成する制御部を有するコンピュータを用いて実行することができる。以下、性能評価装置のハードウェア構成及び機能構成について説明する。
（性能評価装置のハードウェア構成）
図２２は、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価装置１００のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。図２２に示すように、性能評価装置１００は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）１０１、主記憶装置１０２、補助記憶装置１０３、出力装置１０４、入力装置１０５、通信インターフェイス（通信Ｉ／Ｆ）１０６の各部を有する。これらの各部は、バス１０７を介してそれぞれ接続されている。
図２２は、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価装置１００のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。図２２に示すように、性能評価装置１００は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）１０１、主記憶装置１０２、補助記憶装置１０３、出力装置１０４、入力装置１０５、通信インターフェイス（通信Ｉ／Ｆ）１０６の各部を有する。これらの各部は、バス１０７を介してそれぞれ接続されている。
ＣＰＵ１０１は、種々の制御や演算を行う処理装置である。ＣＰＵ１０１は、主記憶装置１０２等が記憶するＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）やプログラムを実行することにより、種々の機能を実現する。すなわち、ＣＰＵ１０１は、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価プログラムを実行することにより、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価装置１００の制御部１３０として機能する。
また、ＣＰＵ１０１は、検査装置の性能評価装置１００全体の動作を制御する。なお、ここでは、性能評価装置１００全体の動作を制御する装置をＣＰＵ１０１としたが、これに限ることなく、例えば、ＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｇａｔｅ Ａｒｒａｙ）等としてもよい。
検査装置の性能評価プログラムや各種データベースは、必ずしも主記憶装置１０２や、補助記憶装置１０３等に記憶されていなくともよい。インターネット、ＬＡＮ（Ｌｏｃａｌ Ａｒｅａ Ｎｅｔｗｏｒｋ）、ＷＡＮ（Ｗｉｄｅ Ａｒｅａ Ｎｅｔｗｏｒｋ）等を介して、検査装置の性能評価装置１００に接続される他の情報処理装置等に検査装置の性能評価プログラムや各種データベースを記憶させてもよい。検査装置の性能評価装置１００がこれら他の情報処理装置から検査装置の性能評価プログラムや各種データベースを取得して実行するようにしてもよい。
主記憶装置１０２は、各種プログラムを記憶し、各種プログラムを実行するために必要なデータ等を記憶する。主記憶装置１０２は、図示しない、ＲＯＭ（Ｒｅｅｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）と、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）と、を有する。
ＲＯＭは、ＢＩＯＳ（Ｂａｓｉｃ Ｉｎｐｕｔ／Ｏｕｔｐｕｔ Ｓｙｓｔｅｍ）等の各種プログラム等を記憶している。ＲＡＭは、ＲＯＭに記憶された各種プログラムがＣＰＵ１０１により実行される際に展開される作業範囲として機能する。ＲＡＭとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。ＲＡＭとしては、例えば、ＤＲＡＭ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＳＲＡＭ（Ｓｔａｔｉｃ Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）等が挙げられる。
補助記憶装置１０３としては、各種情報を記憶できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ソリッドステートドライブ、ハードディスクドライブ等が挙げられる。また、補助記憶装置１０３は、例えば、ＣＤ（Ｃｏｍｐａｃｔ Ｄｉｓｃ）ドライブ、ＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｄｉｓｃ）ドライブ、ＢＤ（Ｂｌｕ−ｒａｙ（登録商標） Ｄｉｓｃ）ドライブ等の可搬記憶装置としてもよい。
出力装置１０４としては、ディスプレイやスピーカー等を用いることができる。ディスプレイは、特に限定されず、適宜公知のものを用いることができ、例えば、液晶ディスプレイ、有機ＥＬディスプレイが挙げられる。
入力装置１０５は、検査装置の性能評価装置１００に対する各種要求を受け付けることができれば、特に限定されず、適宜公知のものを用いることができ、例えば、キーボード、マウス、タッチパネル等が挙げられる。
通信インターフェイス（通信Ｉ／Ｆ）１０６は、特に限定されず、適宜公知のものを用いることができ、例えば、無線又は有線を用いた通信デバイス等が挙げられる。
以上のようなハードウェア構成によって、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価装置１００の処理機能を実現することができる。
（性能評価装置の機能構成）
図２３は、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価装置１００の機能構成の一例を示す図である。図２３に示すように、性能評価装置１００は、入力部１１０、出力部１２０、制御部１３０、記憶部１４０を有する。
図２３は、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価装置１００の機能構成の一例を示す図である。図２３に示すように、性能評価装置１００は、入力部１１０、出力部１２０、制御部１３０、記憶部１４０を有する。
制御部１３０は、情報取得部１３１と、評価部１３２とを有する。制御部１３０は、性能評価装置１００全体を制御する。記憶部１４０は、情報データベース１４１、評価結果データベース１４２を有する。以下、「データベース」を「ＤＢ」という場合がある。情報取得部１３１は、記憶部１４０の情報ＤＢ１４１で記憶されているデータを用い、増幅反応の情報を取得する。情報ＤＢ１４１には、例えば、上述したように予め実験により得られたＣｑ値、Ｔｍ値、非特異増幅の有無等のデータが記憶されている。
なお、デバイスに紐付けられている情報が、情報ＤＢ１４１に記憶されていてもよい。ＤＢへの入力は、性能評価装置１００に接続される他の情報処理装置から行ってもよいし、作業者が行ってもよい。
評価部１３２は、増幅反応の情報に基づき、リアルタイムＰＣＲ装置の性能を評価する。リアルタイムＰＣＲ装置の性能を評価する具体的な手法は、上述した通りである。評価部１３２で求められた、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価結果は、記憶部１４０の評価結果ＤＢ１４２に記憶される。
続いて、本実施形態の性能評価プログラムの処理手順を示す。図２４は、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価装置１００の制御部１３０における性能評価プログラムの処理手順を示すフローチャートである。
ステップＳ１１０では、性能評価装置１００の制御部１３０の情報取得部１３１は、記憶部１４０の情報ＤＢ１４１に記憶された増幅反応の情報データを取得し、処理をＳ１１１に移行する。
ステップＳ１１１では、性能評価装置１００の制御部１３０の評価部１３２は、取得した情報に基づきリアルタイムＰＣＲ装置の性能を評価し、処理をＳ１１２に移行する。
ステップＳ１１２では、性能評価装置１００の制御部１３０は、得られたリアルタイムＰＣＲ装置の性能評価結果を記憶部１４０の評価結果ＤＢ１４２へ保存し、本処理を終了する。
［反応条件の評価方法］
１実施形態において、本発明は、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応を評価する工程と、を含む、前記増幅反応の反応条件の評価方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応を評価する工程と、を含む、前記増幅反応の反応条件の評価方法を提供する。
リアルタイムＰＣＲの反応条件の評価には、インターカレーター法とＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いて行われる方法がある。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いて反応条件を評価する場合、例えば非特異増幅を検出することはできない。
これに対し、実施例において後述するように、発明者らは、インターカレーターの存在下でリアルタイムＰＣＲを行うことにより、より高い精度でリアルタイムＰＣＲの反応条件を精度よく評価することができることを明らかにした。
本実施形態の評価方法では、まず、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う。鋳型核酸、インターカレーター等については上述したものと同様である。続いて、増幅反応を評価する。増幅反応の評価は、Ｃｑ値、Ｔｍ値、非特異増幅の有無等の値に基づいて行うことが好ましい。これらの値は１種を単独で評価に用いてもよいし、２種以上を組み合わせて評価に用いてもよい。Ｃｑ値、Ｃｑ値のばらつき、Ｔｍ値、Ｔｍ値のばらつき、非特異増幅の有無については上述したものと同様である。
本実施形態の評価方法において、リアルタイムＰＣＲの反応条件の評価が高いとは、例えば、複数の反応空間内で同条件の増幅反応を行った場合に、各反応空間で求められたＣｑ値のばらつきが小さいこと、Ｔｍ値のばらつきが小さいこと、非特異増幅が少ないこと等であることができる。
本実施形態の評価方法で増幅反応の反応条件を評価し、必要に応じて反応条件を変更し、再度評価することを繰り返すことにより、増幅反応の反応条件の最適化を行うこともできる。
増幅反応の反応条件としては、例えば、プライマーの塩基配列、プライマーの濃度、ＤＮＡポリメラーゼの種類、ＤＮＡポリメラーゼの濃度、基質である塩基の濃度、Ｍｇ２＋等の金属イオンの濃度、塩濃度、ｐＨ等が挙げられる。
本実施形態の評価方法において、１反応空間あたりの鋳型核酸のコピー数が特定されており、コピー数が１００コピー以下である反応空間を少なくとも含むことが好ましい。ここで、コピー数が特定されているとは、上述した通りである。本実施形態の評価方法においては、コピー数が１００コピー以下である反応空間と、コピー数が１００コピーを超える反応空間の双方が存在していてもよい。
実施例において後述するように、１反応空間あたりの鋳型核酸のコピー数が１００コピー以下、例えば８０コピー以下、例えば７０コピー以下、例えば６０コピー以下、例えば５０コピー以下、例えば４０コピー以下、例えば３０コピー以下、例えば２０コピー以下、例えば１０コピー以下、例えば５コピー以下、例えば１コピーであると、非特異増幅産物が増加する傾向にあるため、増幅反応の反応条件を高い精度で行うことができることが明らかとなった。
［反応条件の評価用デバイス］
１実施形態において、本発明は、複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む、増幅反応の反応条件の評価用デバイスを提供する。
１実施形態において、本発明は、複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む、増幅反応の反応条件の評価用デバイスを提供する。
本実施形態のデバイスは、リアルタイムＰＣＲによる増幅反応の反応条件の評価の用途に特に適しており、上述した増幅反応の反応条件の評価方法に好適に利用することができる。
本実施形態のデバイスにおいて、１反応空間あたりの鋳型核酸のコピー数が特定されており、コピー数が１００コピー以下である反応空間を少なくとも含むことが好ましい。ここで、コピー数が特定されているとは、上述した通りである。本実施形態のデバイスは、コピー数が１００コピー以下である反応空間と、コピー数が１００コピーを超える反応空間の双方を有していてもよく、反応空間の一部に鋳型核酸を含有させず、ネガティブコントロール用としてもよい。
実施例において後述するように、１反応空間あたりの鋳型核酸のコピー数が１００コピー以下、例えば８０コピー以下、例えば７０コピー以下、例えば６０コピー以下、例えば５０コピー以下、例えば４０コピー以下、例えば３０コピー以下、例えば２０コピー以下、例えば１０コピー以下、例えば５コピー以下、例えば１コピーであると、非特異増幅産物が増加する傾向にあり、増幅反応の反応条件を高い精度で行うことができる。
本実施形態のデバイスにおいて、反応空間、特定されたコピー数、鋳型核酸、インターカレーター等については上述したものと同様である。また、本実施形態のデバイスは、上述したデバイスの製造方法と同様にして製造することができる。
［反応条件の評価用キット］
１実施形態において、本発明は、複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸を含むデバイスと、インターカレーターと、を含む、増幅反応の反応条件の評価用キットを提供する。
１実施形態において、本発明は、複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸を含むデバイスと、インターカレーターと、を含む、増幅反応の反応条件の評価用キットを提供する。
本実施形態のキットは、リアルタイムＰＣＲによる増幅反応の反応条件の評価の用途に特に適しており、上述した増幅反応の反応条件の評価方法に好適に利用することができる。本実施形態のキットにおいて、反応空間、特定されたコピー数、鋳型核酸、デバイス、インターカレーター等については上述したものと同様である。
［非特異増幅のない検出下限又は定量下限を判定する方法］
１実施形態において、本発明は、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応により得られた増幅産物の融解曲線をそれぞれ測定する工程と、前記融解曲線に基づいて、非特異増幅のない検出下限又は定量下限のコピー数を判定する工程と、を含む、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限の判定方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応により得られた増幅産物の融解曲線をそれぞれ測定する工程と、前記融解曲線に基づいて、非特異増幅のない検出下限又は定量下限のコピー数を判定する工程と、を含む、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限の判定方法を提供する。
実施例において後述するように、本実施形態の方法によれば、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限を正確に判定することができる。
本明細書は、「非特異増幅のない検出下限」、「非特異増幅のない定量下限」という指標をリアルタイムＰＣＲの増幅反応の評価に適用することを提唱する。従来このような指標は利用されていなかった。「非特異増幅のない検出下限」及び「非特異増幅のない定量下限」を指標とすることにより、より精度の高い評価を行うことができる。
本実施形態の方法では、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸の増幅反応を行う。
検出下限（検出限界、Ｌｉｍｉｔ ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＬＯＤ）とは、鋳型核酸を検出する手法において、検出可能な最少の鋳型核酸のコピー数をいう。検出下限は特に限定されず、測定法に応じて適宜選択するができ、例えば、９５％以上が検出される最低濃度（最低コピー数）等が挙げられる。
検出下限付近とは、上記検出下限のコピー数の±１までの範囲のコピー数を意味する。例えば、反応空間に含まれる鋳型核酸の特定コピー数が、１、２、３、４、５であるデバイスを用いて、あるリアルタイムＰＣＲ装置の性能評価を行った場合、当該リアルタイムＰＣＲ装置では鋳型核酸の特定コピー数が３以上の反応空間では鋳型核酸を増幅可能であるが、２以下の反応空間では鋳型核酸を増幅できない場合、当該リアルタイムＰＣＲ装置における鋳型核酸のコピー数についての検出下限値が３であることを明らかにすることができる。
また、別のリアルタイムＰＣＲ装置について性能評価を行い、当該リアルタイムＰＣＲ装置では鋳型核酸の特定コピー数が４以上の反応空間では鋳型核酸を増幅可能であるが、３以下の反応空間では鋳型核酸を増幅できない場合、当該リアルタイムＰＣＲ装置における鋳型核酸のコピー数についての検出下限値が４であることを明らかにすることができる。
本実施形態の方法において、増幅反応を行う段階的なコピー数の鋳型核酸の少なくとも１つのコピー数は検出下限を超えるコピー数であることが好ましい。
定量下限（Ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＬＯＱ）とは、鋳型核酸の定量が可能な手法において、定量が可能な最少の鋳型核酸のコピー数を表し、特に限定されず、測定法に応じて適宜選択することができる。
本実施形態の方法においては、複数の分子種からなるサンプル（例えば、特定コピー数が異なる複数の鋳型核酸）より、検量線を作成し、その検量線の直線性から外れるコピー数の値を定量下限としてもよい。あるいは、検量線の不確かさをＣＶ値で表し、横軸にコピー数をとり、縦軸にＣｑ値をとってＣＶ値をプロットしたグラフにおいて、例えば、ＣＶ値が５％又は１０％を切る値（コピー数）を定量下限としてもよい。
また、定量的な評価の場合には、Ｃｑ値そのものではなく、校正曲線及びＰＣＲ効率からＣｑ値に対応したコピー数（コピー数又は濃度）を求めることができるため、コピー数（コピー数又は濃度）に換算したＣＶ値から定量下限を設定してもよい。
定量下限付近とは、例えば、上記定量下限のコピー数の±１、±５、±１０等の範囲のコピー数とすることができる。
デバイスが、定量下限を超える特定コピー数の鋳型核酸を含む反応空間を少なくとも有する場合、例えば、あるリアルタイムＰＣＲ装置では鋳型核酸の特定コピー数が１０以上であれば定量的な検出を保証できることがわかり、別のリアルタイムＰＣＲ装置では鋳型核酸の特定コピー数が２０以上であれば定量的な検出を保証できることがわかるといったように、リアルタイムＰＣＲ装置の定量的な検出を保証できる最少の鋳型核酸の特定コピー数を判断することができる。
［非特異増幅のない検出下限又は定量下限の判定用デバイス］
１実施形態において、本発明は、複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部は、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限の判定用デバイスを提供する。
１実施形態において、本発明は、複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部は、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限の判定用デバイスを提供する。
本実施形態のデバイスは、リアルタイムＰＣＲによる鋳型核酸の検出又は定量において、非特異増幅のない検出下限又は定量下限を判定する用途に特に適しており、上述した、非特異増幅のない検出下限の判定方法又は非特異増幅のない定量下限の判定方法に好適に利用することができる。
本実施形態のデバイスにおいて、反応空間、検出下限、定量下限、検出下限付近、定量下限付近、特定されたコピー数、鋳型核酸、インターカレーター等については上述したものと同様である。また、本実施形態のデバイスは、上述したデバイスの製造方法と同様にして製造することができる。
本実施形態のデバイスは、反応空間の一部を、鋳型核酸の特定コピー数が０であるネガティブコントロール群としてもよい。デバイスにネガティブコントロール群が存在することにより、ネガティブコントロール群で鋳型核酸の増幅が検出された場合には、検出系（試薬や装置）に異常があることが示唆される。デバイス内にネガティブコントロール群を設けておくことにより、問題が生じたときにユーザーは直ちにそれに気づくことができ、測定を中止して問題がどこにあるかの点検を行うことができる。
また、本実施形態のデバイスは、反応空間の一部を、特定コピー数が１００以上である鋳型核酸を含むポジティブコントロール群としてもよい。デバイスにポジティブコントロール群が存在することにより、ポジティブコントロール群で鋳型核酸の増幅が検出されなかった場合には、検出系（試薬や装置）に異常があることが示唆される。デバイス内にポジティブコントロール群を設けておくことにより、問題が生じたときにユーザーは直ちにそれに気づくことができ、測定を中止して問題がどこにあるかの点検を行うことができる。
本実施形態のデバイスは、ウェルの群の内の少なくとも１つの群が、ネガティブコントロール群を除いて最も少ないコピー数を持つ群（最少コピー数の群）であり、この最少コピー数群が、少なくともデバイスの略外周のウェルに配置されていることがさらに好ましい。
ここで、略外周とは、デバイス上に２次元的に配列されたウェルの少なくとも最外周を含む内側の数列を意味する。最外周を含む内側の数列としては、例えば、１列以上４７列以下等が挙げられる。
デバイスの最外周に位置するウェルは、デバイスの中心付近に位置するウェルとは異なり、外側にはウェルが存在せず、デバイスとデバイスの外部との境界となっているため、熱伝導に対してデバイス上物理的に不均等になっていること、リアルタイムＰＣＲ装置の構成要素である温度制御部材の外周に配置されることから、装置の温度変動要因の影響を受けやすい。
そのため、本実施形態のデバイスにおいて、ウェルの群の内の少なくとも１つの群が、ネガティブコントロール群を除いて最も少ないコピー数を持つ群（最少コピー数の群）であり、この最少コピー数の群が、少なくともデバイスの略外周のウェルに配置されていることにより、装置の不具合をより高感度に検出することができる。
本実施形態のデバイスは、一のウェルにおける鋳型核酸の特定コピー数と、他のウェルにおける鋳型核酸の特定コピー数とが互いに異なる段階的なコピー数である。具体的なコピー数としては、例えば、１、５、１０、２０、４０、８０、１６０の場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の場合、１、３、５、７、９の場合、２、４、６、８、１０の場合等が挙げられる。
また、本実施形態のデバイスは、一のウェルにおける鋳型核酸の特定コピー数が１０Ｎ１であり、他のウェルにおける鋳型核酸の特定コピー数が１０Ｎ２であってもよい（ただし、Ｎ１及びＮ２は互いに連続した整数である）。具体的なコピー数としては、例えば、１、１０、１００、１,０００の場合、１００、１,０００、１０,０００、１００,０００、１,０００,０００の場合等が挙げられる。
［非特異増幅のない検出下限又は定量下限の判定用キット］
１実施形態において、本発明は、複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部は、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含むデバイスと、インターカレーターと、を含む、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限の判定用キットを提供する。
１実施形態において、本発明は、複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部は、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含むデバイスと、インターカレーターと、を含む、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限の判定用キットを提供する。
本実施形態のキットは、リアルタイムＰＣＲによる鋳型核酸の検出又は定量において、非特異増幅のない検出下限又は定量下限を判定する用途に特に適しており、上述した、非特異増幅のない検出下限の判定方法又は非特異増幅のない定量下限の判定方法に好適に利用することができる。
本実施形態のキットにおいて、反応空間、検出下限、定量下限、検出下限付近、定量下限付近、特定されたコピー数、鋳型核酸、インターカレーター等については上述したものと同様である。また、本実施形態のデバイスは、上述したデバイスの製造方法と同様にして製造することができる。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（デバイスの作製１）
インクジェット方式により、ウェルに特定コピー数の鋳型核酸が充填されたデバイスを製造した。
（デバイスの作製１）
インクジェット方式により、ウェルに特定コピー数の鋳型核酸が充填されたデバイスを製造した。
《遺伝子組換え酵母の作製》
出芽酵母ＹＩＬ０１５Ｗ ＢＹ４７４１（ＡＴＣＣ社製、ＡＴＣＣ４００１４０８）をキャリア細胞として、１コピーの鋳型核酸を有する遺伝子組換え酵母を作製した。鋳型核酸として、濃厚核酸試料 ＤＮＡ６００−Ｇ（国立研究開発法人産業技術総合研究所製、ＮＭＩＪ ＣＲＭ ６２０５−ａ、配列番号１）を用いた。鋳型核酸と選択マーカーに用いたＵＲＡ３遺伝子がタンデムに並ぶように作製したプラスミドをキャリア細胞に導入し、ＢＡＲ１領域を対象とした相同組換えにより、ゲノムＤＮＡ中に１コピーの鋳型核酸を有する遺伝子組換え酵母を作製した。
出芽酵母ＹＩＬ０１５Ｗ ＢＹ４７４１（ＡＴＣＣ社製、ＡＴＣＣ４００１４０８）をキャリア細胞として、１コピーの鋳型核酸を有する遺伝子組換え酵母を作製した。鋳型核酸として、濃厚核酸試料 ＤＮＡ６００−Ｇ（国立研究開発法人産業技術総合研究所製、ＮＭＩＪ ＣＲＭ ６２０５−ａ、配列番号１）を用いた。鋳型核酸と選択マーカーに用いたＵＲＡ３遺伝子がタンデムに並ぶように作製したプラスミドをキャリア細胞に導入し、ＢＡＲ１領域を対象とした相同組換えにより、ゲノムＤＮＡ中に１コピーの鋳型核酸を有する遺伝子組換え酵母を作製した。
《細胞周期の同調》
続いて、遺伝子組換え酵母を５０ｇ／ＬのＹＰＤ培地（タカラバイオ株式会社製、ＣＬＮ−６３０４０９）で培養し、三角フラスコに９０ｍＬ分取した。続いて、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、１４１９０−１４４、以下、「ＤＰＢＳ」と称する）を用いて５００μｇ／ｍＬとなるように調製したα１−Ｍａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ ａｃｅｔａｔｅ ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｔ６９０１−５ＭＧ、以下、「αファクター」という）を９００μＬ添加した。
続いて、遺伝子組換え酵母を５０ｇ／ＬのＹＰＤ培地（タカラバイオ株式会社製、ＣＬＮ−６３０４０９）で培養し、三角フラスコに９０ｍＬ分取した。続いて、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、１４１９０−１４４、以下、「ＤＰＢＳ」と称する）を用いて５００μｇ／ｍＬとなるように調製したα１−Ｍａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ ａｃｅｔａｔｅ ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｔ６９０１−５ＭＧ、以下、「αファクター」という）を９００μＬ添加した。
続いて、バイオシェイカー（タイテック株式会社製、ＢＲ−２３ＦＨ）を用いて、振盪速度２５０ｒｐｍ、温度２８℃にて２時間インキュベートし、酵母をＧ０／Ｇ１期に同調させた。
同調細胞の細胞周期の確認は、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ（カタログ番号「Ｓ７０２０」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて染色し、フローサイトメーター（装置名：ＳＨ８００、ソニー株式会社製）を用いたフローサイトメトリーにて、励起波長４８８ｎｍで、Ｇ０／Ｇ１期に同調していることを確認した。Ｇ１期の割合は９９．５％、Ｇ２期の割合は０．５％であった。
《固定》
続いて、細胞周期が同調したことを確認済みの酵母懸濁液を遠心管（アズワン株式会社製、ＶＩＯ−５０Ｒ）に４５ｍＬ移し、遠心分離機（株式会社日立製作所製、Ｆ１６ＲＮ）を用いて、回転速度３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去して酵母ペレットを得た。
続いて、細胞周期が同調したことを確認済みの酵母懸濁液を遠心管（アズワン株式会社製、ＶＩＯ−５０Ｒ）に４５ｍＬ移し、遠心分離機（株式会社日立製作所製、Ｆ１６ＲＮ）を用いて、回転速度３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去して酵母ペレットを得た。
続いて、得られた酵母ペレットにホルマリン（和光純薬工業株式会社製、０６２−０１６６１）を４ｍＬ添加し、５分間静置後、遠心して上澄み液を除去し、エタノールを１０ｍＬ添加して懸濁させることにより固定化済みの酵母懸濁液を得た。
《染色》
続いて、固定化済みの酵母懸濁液を１．５ｍＬ遮光チューブ（ワトソン株式会社製、１３１−９１５ＢＲ）に５００μＬ移し、遠心分離機を用いて回転速度３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去した。続いて、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴＯＣＲＩＳ社製、２００−４４９−４）となるように調製したＤＰＢＳ（１ｍＭ ＥＤＴＡ）を４００μＬ添加し、ピペッティングでよく懸濁した後、遠心分離機を用いて回転速度３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去することにより酵母ペレットを得た。
続いて、固定化済みの酵母懸濁液を１．５ｍＬ遮光チューブ（ワトソン株式会社製、１３１−９１５ＢＲ）に５００μＬ移し、遠心分離機を用いて回転速度３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去した。続いて、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴＯＣＲＩＳ社製、２００−４４９−４）となるように調製したＤＰＢＳ（１ｍＭ ＥＤＴＡ）を４００μＬ添加し、ピペッティングでよく懸濁した後、遠心分離機を用いて回転速度３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去することにより酵母ペレットを得た。
続いて、得られたペレットに１ｍｇ／ｍＬに調製したエバンスブルー水溶液（和光純薬工業株式会社製、０５４−０４０６１）を１ｍＬ添加し、ボルテックスを用いて５分間撹拌後、遠心分離機を用いて回転速度３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去した。続いて、ＤＰＢＳ（１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、ボルテックスで撹拌することにより、染色済み酵母懸濁液を得た。
《分散》
続いて、染色済みの酵母懸濁液を超音波ホモジナイザー（ヤマト科学株式会社製、ＬＵＨ１５０）を用いて、出力３０％で１０秒間分散処理し、遠心分離機を用いて回転速度３，０００ｒｐｍで５分間遠心した。続いて、上澄み液を除去し、ＤＰＢＳを１ｍＬ添加して洗浄した。遠心分離、上澄み液の除去を計２回実施し、再度ＤＰＢＳ １ｍＬに懸濁して酵母懸濁インクを得た。
続いて、染色済みの酵母懸濁液を超音波ホモジナイザー（ヤマト科学株式会社製、ＬＵＨ１５０）を用いて、出力３０％で１０秒間分散処理し、遠心分離機を用いて回転速度３，０００ｒｐｍで５分間遠心した。続いて、上澄み液を除去し、ＤＰＢＳを１ｍＬ添加して洗浄した。遠心分離、上澄み液の除去を計２回実施し、再度ＤＰＢＳ １ｍＬに懸濁して酵母懸濁インクを得た。
《分注及び細胞数計測》
以下のようにして、液滴中の酵母菌の数を計数（カウント）し、９６ウェルプレートの各ウェルに既知の細胞数ずつ吐出して細胞数が既知であるプレートを作製した。具体的には、図１４に示す液滴形成装置を用いて、９６プレート（商品名「ＭｉｃｒｏＡｍｐ ９６−ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｅ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）の各ウェルに、液滴吐出手段として圧電印加方式の吐出ヘッド（社内製）を用いて１０Ｈｚにて酵母懸濁インクを順次吐出した。
以下のようにして、液滴中の酵母菌の数を計数（カウント）し、９６ウェルプレートの各ウェルに既知の細胞数ずつ吐出して細胞数が既知であるプレートを作製した。具体的には、図１４に示す液滴形成装置を用いて、９６プレート（商品名「ＭｉｃｒｏＡｍｐ ９６−ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｅ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）の各ウェルに、液滴吐出手段として圧電印加方式の吐出ヘッド（社内製）を用いて１０Ｈｚにて酵母懸濁インクを順次吐出した。
吐出された液滴中の酵母の受光手段としては、高感度カメラ（東京インスツルメンツ株式会社製、ｓＣＭＯＳ ｐｃｏ．ｅｄｇｅ）を用いて撮影した。光源としてはＹＡＧレーザー（スペクトラ・フィジックス社製、Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＯＮＥ−５３２−２００−ＫＥ）を用い、撮影した画像の粒子計数手段として画像処理ソフトウェアであるＩｍａｇｅ Ｊを用いて画像処理して細胞数を計数し、細胞数が既知であるプレートを作製した。
《核酸抽出》
Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ） Ｂｕｆｆｅｒを用いてＣｏｌＥ１ ＤＮＡ（和光純薬工業株式会社製、３１２−００４３４）が５ｎｇ／μＬとなるようにＣｏｌＥ１／ＴＥを調製した。続いて、ＣｏｌＥ１／ＴＥを用いてＺｙｍｏｌｙａｓｅ（Ｒ） １００Ｔ（ナカライテスク株式会社製、０７６６５−５５）が１ｍｇ／ｍＬとなるようにＺｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を調製した。
Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ） Ｂｕｆｆｅｒを用いてＣｏｌＥ１ ＤＮＡ（和光純薬工業株式会社製、３１２−００４３４）が５ｎｇ／μＬとなるようにＣｏｌＥ１／ＴＥを調製した。続いて、ＣｏｌＥ１／ＴＥを用いてＺｙｍｏｌｙａｓｅ（Ｒ） １００Ｔ（ナカライテスク株式会社製、０７６６５−５５）が１ｍｇ／ｍＬとなるようにＺｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を調製した。
続いて、作製した細胞数既知プレートの各ウェルにＺｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を４μＬ添加し、３７℃で３０分間インキュベートすることにより、細胞壁を溶解して核酸を抽出した。続いて、９５℃で２分間熱処理した。
続いて、細胞数既知プレートから得られる結果の信頼性を考慮するために、特定コピー数の細胞をウェルに分注した細胞数既知プレートを製造し、１細胞数における不確かさを算出した。なお、所定数毎に以下に示す方法を用いることにより、様々なコピー数における不確かさを算出することができる。
《不確かさの算出》
不確かさの要因として、液滴中の細胞数、細胞中の鋳型核酸のコピー数、ウェル内の細胞数、コンタミネーションを用いた。
不確かさの要因として、液滴中の細胞数、細胞中の鋳型核酸のコピー数、ウェル内の細胞数、コンタミネーションを用いた。
液滴中の細胞数は、吐出手段より吐出された液滴の画像を解析し計数した液滴中の細胞数と、吐出手段で吐出した液滴をスライドガラスに着弾させ着弾した液滴毎に顕微鏡観察し得られた細胞数とを用いた。
細胞中の核酸コピー数（細胞周期）は、細胞周期のＧ１期に該当する細胞の割合（９９．５％）、Ｇ２期に該当する細胞の割合（０．５％）とを用いて算出した。ウェル内の細胞数は、吐出した液滴がウェル内に着弾する数を計数したが、９６サンプルの計数においてすべての液滴がウェル内に着弾していたため、ウェル内の細胞数の要因は不確かさの計算から除外した。
コンタミネーションは、インクのろ液４μＬをリアルタイムＰＣＲで増幅し、細胞中の鋳型核酸以外の鋳型核酸がインク液中に混入していないか３回の試験を行い確認した。その結果、３回すべてにおいて検出下限値となったため、コンタミネーションの要因についても不確かさの計算から除外した。
不確かさは各要因の測定値から標準偏差を求め、感度係数を乗じて測定量の単位に統一した標準不確かさを平方和法により合成標準不確かさを求めた。合成標準不確かさでは、正規分布の約６８％の範囲の値しか含まれないため、合成標準不確かさを２倍した拡張不確かさとすることにより正規分布の約９５％の範囲を考慮した不確かさを得ることができる。下記表２のバジェットシートに結果を示す。
表２中、「記号」とは、不確かさの要因に対応付けた任意の記号を意味し、「値（±）」とは、平均値の実験標準偏差であり、算出した実験標準偏差をデータの数の平方根の値で除したものであり、「確率分布」とは、不確かさの要因がもつ確率分布であり、Ａタイプの不確かさ評価の場合には空欄とし、Ｂタイプの不確かさ評価には、正規分布又は矩形分布のいずれかを記入した。本実施例においてはＡタイプの不確かさ評価のみを行ったため、確率分布の欄は空欄とした。また、「除数」とは、それぞれ要因から得られる不確かさを正規化する数を意味し、「標準不確かさ」とは「値（±）」を「除数」で除した値である。また、「感度係数」とは、測定量の単位に統一するために用いられる値を意味する。
続いて、ウェルに充填した鋳型核酸の平均特定コピー数及び不確かさを算出した。結果を下記表３に示す。変動係数ＣＶ値は、不確かさの値を平均特定コピー数で除することにより算出した。
その結果、インクジェット方式において、特定コピー数が１、すなわち、１コピーの鋳型核酸（１つの酵母）をウェルに分注する精度は、±０．１２８１コピーであることが明らかとなった。ウェルに１コピー以上の鋳型核酸を充填する場合に、特定コピー数の鋳型核酸が充填される精度は、この精度の積み重ねにより決定される。
［実験例２］
（デバイスの作製２）
セルソーターを使用してウェルに特定コピー数の鋳型核酸が充填されたデバイスを製造した。まず、実験例１と同様の手順により、固定化済みの酵母懸濁液を得た。
（デバイスの作製２）
セルソーターを使用してウェルに特定コピー数の鋳型核酸が充填されたデバイスを製造した。まず、実験例１と同様の手順により、固定化済みの酵母懸濁液を得た。
《核染色》
続いて、固定化済みの酵母懸濁液を２００μＬ分取し、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、４８０μＬのＤＰＢＳに再懸濁した。続いて、２０μＬの２０ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ（株式会社ニッポンジーン製、３１８−０６３９１）を添加後、バイオシェイカーを用いて３７℃で２時間インキュベートした。
続いて、固定化済みの酵母懸濁液を２００μＬ分取し、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、４８０μＬのＤＰＢＳに再懸濁した。続いて、２０μＬの２０ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ（株式会社ニッポンジーン製、３１８−０６３９１）を添加後、バイオシェイカーを用いて３７℃で２時間インキュベートした。
続いて、２５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（タカラバイオ株式会社製、ＴＫＲ−９０３４）を添加し、プチクール（ワケンビーテック株式会社製、プチクール ＭｉｎｉＴ−Ｃ）を用いて、５０℃で２時間インキュベートした。
続いて、６μＬの５ｍＭ ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、Ｓ７０２０）を加えて、遮光下で３０分間染色した。
《分散》
続いて、染色済みの酵母懸濁液を超音波ホモジナイザー（ヤマト科学株式会社製、ＬＵＨ１５０）を用いて、出力３０％、１０秒間分散処理して、酵母懸濁インクを得た。
続いて、染色済みの酵母懸濁液を超音波ホモジナイザー（ヤマト科学株式会社製、ＬＵＨ１５０）を用いて、出力３０％、１０秒間分散処理して、酵母懸濁インクを得た。
《酵母懸濁液の個数計測分注》
細胞壁溶解液を調製した。具体的には、まず、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ） Ｂｕｆｆｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、ＡＭ９８６１）を用いて、ＣｏｌＥ１ ＤＮＡ（株式会社ニッポンジーン製、３１２−００４３４）が５ｎｇ／μＬとなるようにＣｏｌＥ１／ＴＥを調製した。続いて、このＣｏｌＥ１／ＴＥを用いて、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ（Ｒ） １００Ｔ（ナカライテスク株式会社製、０７６６５−５５）が１ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、細胞壁溶解液を得た。
細胞壁溶解液を調製した。具体的には、まず、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ） Ｂｕｆｆｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、ＡＭ９８６１）を用いて、ＣｏｌＥ１ ＤＮＡ（株式会社ニッポンジーン製、３１２−００４３４）が５ｎｇ／μＬとなるようにＣｏｌＥ１／ＴＥを調製した。続いて、このＣｏｌＥ１／ＴＥを用いて、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ（Ｒ） １００Ｔ（ナカライテスク株式会社製、０７６６５−５５）が１ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、細胞壁溶解液を得た。
続いて、９６穴平底プレート（ワトソン株式会社製、４８４６−９６−ＦＳ）の各ウェルに細胞壁溶解液を４μＬずつ充填した。続いて、セルソーター（ソニー株式会社製、ＳＨ８００Ｚ）を用いて各ウェルに既知の細胞数ずつ細胞を分注した。セルソーターによる分注では、励起波長４８８ｎｍで細胞周期の分析を行い、Ｇ０／Ｇ１期の領域のみを選択して、シングルセルモードにより規定の酵母数を分注した。
《核酸抽出》
続いて、作製した細胞数既知プレートを３７℃にて３０分間インキュベートすることにより、細胞壁を溶解して核酸を抽出した。続いて、９５℃で２分間熱処理した。
続いて、作製した細胞数既知プレートを３７℃にて３０分間インキュベートすることにより、細胞壁を溶解して核酸を抽出した。続いて、９５℃で２分間熱処理した。
《不確かさの算出》
不確かさの要因として、吐出液滴毎の酵母数一致率に関する不確かさを用いた。吐出液滴毎の酵母数一致率に関する不確かさは、細胞の分注と同条件で別容器に吐出した着弾液滴内の酵母数と狙いの酵母数の一致率に基づいて算出した。
不確かさの要因として、吐出液滴毎の酵母数一致率に関する不確かさを用いた。吐出液滴毎の酵母数一致率に関する不確かさは、細胞の分注と同条件で別容器に吐出した着弾液滴内の酵母数と狙いの酵母数の一致率に基づいて算出した。
その結果、セルソーターによって１ウェルあたりに１細胞（特定コピー数＝１）の酵母を分注する精度は、９９．２％であった。なお、これ以上の細胞数（コピー数）の酵母を分注する場合には、特定コピー数の酵母を分注する精度は、この１細胞あたりの精度の積み重ねによって決定されるといえる。
以上のことから、鋳型核酸の平均特定コピー数及び不確かさを算出した。結果を下記表４に示した。変動係数ＣＶ値は、不確かさを平均特定コピー数で除することにより求めた。
［実験例３］
（試薬の性能評価）
増幅試薬として、市販の５種類の試薬を用意した。具体的には、ＧｅｎｅＡｃｅ ＳＹＢＲ（Ｒ） ｑＰＣＲ Ｍｉｘ α（カタログ番号「３１９−０７６８３」、ニッポンジーン社、以下「試薬Ａ」という場合がある。）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ Ｕｌｔｒａ−Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（Ｒ） Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＳＹＢＲ（Ｒ）用ＲＯＸ Ｐｌｕｓ（カタログ番号「６００８８９」、アジレント・テクノロジー社、以下「試薬Ｂ」という場合がある。）、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（カタログ番号「２０４１４３」、キアゲン社、以下「試薬Ｃ」という場合がある。）、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（ＴＭ） Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号「４３８５６１７」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、以下「試薬Ｄ」という場合がある。）、ＫＯＤ ＳＹＢＲ（Ｒ） ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（カタログ番号「ＱＫＤ−２０１」、東洋紡社、以下「試薬Ｅ」という場合がある。）を使用した。
（試薬の性能評価）
増幅試薬として、市販の５種類の試薬を用意した。具体的には、ＧｅｎｅＡｃｅ ＳＹＢＲ（Ｒ） ｑＰＣＲ Ｍｉｘ α（カタログ番号「３１９−０７６８３」、ニッポンジーン社、以下「試薬Ａ」という場合がある。）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ Ｕｌｔｒａ−Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（Ｒ） Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＳＹＢＲ（Ｒ）用ＲＯＸ Ｐｌｕｓ（カタログ番号「６００８８９」、アジレント・テクノロジー社、以下「試薬Ｂ」という場合がある。）、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（カタログ番号「２０４１４３」、キアゲン社、以下「試薬Ｃ」という場合がある。）、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（ＴＭ） Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号「４３８５６１７」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、以下「試薬Ｄ」という場合がある。）、ＫＯＤ ＳＹＢＲ（Ｒ） ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（カタログ番号「ＱＫＤ−２０１」、東洋紡社、以下「試薬Ｅ」という場合がある。）を使用した。
鋳型核酸として、ＤＮＡ６００−Ｇ（配列番号１）を使用した。実験例１と同様に、ゲノムＤＮＡ中に１コピーの鋳型核酸を有する遺伝子組換え酵母を使用した。
プライマーとして、フォワードプライマー（配列番号２）及びリバースプライマー（配列番号３）を使用した。
まず、実験例１と同様にして、５枚の９６ウェルプレートに鋳型核酸を分注した。図２５は、９６ウェルプレートに分注した鋳型核酸のコピー数を示す図である。図２５中、一番左の列の「Ａ」〜「Ｈ」は９６ウェルプレートの行記号を示し、一番上の行の「１」〜「１２」は９６ウェルプレートの列番号を示す。また、「Ｎ」は鋳型核酸を分注しなかったネガティブコントロールであることを示し、一番左の列及び一番上の行を除く領域の「１０」は、鋳型核酸を１０コピーずつ分注したことを示す。
続いて、実験例１と同様にして核酸抽出を行った。続いて、９６ウェルプレートの各ウェルにプライマー及び試薬Ａ〜Ｅのいずれかの増幅試薬を添加し、リアルタイムＰＣＲ装置（製品名「ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（ＴＭ）１２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ」、アプライドバイオシステムズ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。プライマーの濃度は、フォワードプライマー（配列番号２）０．５μＭ、リバースプライマー（配列番号３）０．５μＭとした。
増幅反応後、融解曲線を計測し、下記式５により増幅反応の特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を算出した。
特異性（％）＝鋳型核酸の増幅のみが検出されたウェル数／（増幅反応を行ったウェル数−ネガティブコントロールのウェル数）×１００ …式５
特異性（％）＝鋳型核酸の増幅のみが検出されたウェル数／（増幅反応を行ったウェル数−ネガティブコントロールのウェル数）×１００ …式５
図２６（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ、試薬Ａ〜Ｅを用いた場合の融解曲線及び算出した増幅反応の特異性（％）を示すグラフである。グラフの縦軸は−ΔＦ／ΔＴを示し、グラフの横軸は温度を示す。ここで、ΔＦは蛍光強度の変化量を示し、ΔＴは温度の変化量を示す。
その結果、本実験例の反応条件では、試薬Ｃの特異性が最も高く、増幅反応において非特異増幅が認められない結果となった。既知コピー数の鋳型核酸が分注されたプレートを用いることにより、各増幅試薬の増幅特異性の差を明らかにすることができた。
図２７（ａ）は、試薬Ｃを用いた場合の、目的の増幅産物のＴｍ値の面内分布を示す図である。また、図２７（ｂ）は、試薬Ｃを用いた場合の、Ｃｑ値の面内分布を示す図である。図２７（ｂ）中、「ＵＤ」は検出されなかったことを意味する。１列目はネガティブコントロールのウェルのみに、非特異産物の増幅が確認されたため、２〜１２列目での面内分布を示している。
その結果、Ｃｑ値の面内分布と比較して、Ｔｍ値の面内分布のほうが、増幅反応における各ウェルの温度むら又は計測むらの差が出やすく、リアルタイムＰＣＲ装置の精度を把握しやすいことが明らかとなった。
［実験例４］
（非特異増幅のない検出下限の判定）
鋳型核酸のコピー数を図２８に示すパターンにした以外は実験例３と同様にして、９６ウェルプレートに鋳型核酸を分注した。図２８中、一番左の列の「Ａ」〜「Ｈ」は９６ウェルプレートの行記号を示し、一番上の行の「１」〜「１２」は９６ウェルプレートの列番号を示す。また、「Ｎ」は鋳型核酸を分注しなかったネガティブコントロールであることを示し、一番左の列及び一番上の行を除く領域の数字は、分注した鋳型核酸のコピー数を示す。
（非特異増幅のない検出下限の判定）
鋳型核酸のコピー数を図２８に示すパターンにした以外は実験例３と同様にして、９６ウェルプレートに鋳型核酸を分注した。図２８中、一番左の列の「Ａ」〜「Ｈ」は９６ウェルプレートの行記号を示し、一番上の行の「１」〜「１２」は９６ウェルプレートの列番号を示す。また、「Ｎ」は鋳型核酸を分注しなかったネガティブコントロールであることを示し、一番左の列及び一番上の行を除く領域の数字は、分注した鋳型核酸のコピー数を示す。
続いて、実験例１と同様にして核酸抽出を行った。続いて、９６ウェルプレートの各ウェルにプライマー及び試薬Ｃの増幅試薬を添加し、リアルタイムＰＣＲ装置（製品名「ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（ＴＭ）１２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ」、アプライドバイオシステムズ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。プライマーの濃度は、フォワードプライマー（配列番号２）０．５μＭ、リバースプライマー（配列番号３）０．５μＭとした。
図２９（ａ）は、目的の増幅産物のＣｑ値の面内分布を示す図である。また、図２９（ｂ）は、増幅反応の評価結果を示す図である。図２９（ｂ）中、「Ｃｑ Ａｖｅ」はＣｑ値の平均値を示し、「Ｃｑ σ」はＣｑ値の標準偏差を示し、「Ｃｑ ＣＶ％」はＣｑ値のＣＶ値を示し、「ΔＣｑ」はＣｑ値の面内差（Ｃｑ ｍａｘ−Ｃｑ ｍｉｎ）を示し、「Ｃｑ ｍａｘ」はＣｑ値の最大値を示し、「Ｃｑ ｍｉｎ」はＣｑ値の最小値を示し、「ＵＤ数」はネガティブコントロール以外のウェルで増幅が認められなかったウェルの数を示し、「検出率」は下記式６により算出された値を示す。
検出率（％）＝鋳型核酸の増幅が検出されたウェル数／（増幅反応を行ったウェル数−ネガティブコントロールのウェル数）×１００ …式６
検出率（％）＝鋳型核酸の増幅が検出されたウェル数／（増幅反応を行ったウェル数−ネガティブコントロールのウェル数）×１００ …式６
図３０（ａ）は、鋳型核酸の検量線及び融解曲線を示すグラフである。図３０（ａ）中、グラフの縦軸はＣｑ値を示し、グラフの横軸は鋳型核酸のコピー数を示す。吹き出しの中に融解曲線を示す。融解曲線のグラフの縦軸は−ΔＦ／ΔＴを示し、グラフの横軸は温度を示す。ここで、ΔＦは蛍光強度の変化量を示し、ΔＴは温度の変化量を示す。
図３０（ｂ）は、非特異増幅の有無をまとめた結果である。図３０（ｂ）中、「Ｎｅｇａ」はネガティブコントロールの結果を示す。コピー数１０の結果には、実験例３の結果を使用した。
その結果、インターカレーター法による増幅反応による非特異増幅は、特に鋳型核酸が低コピーである場合に発生しやすいことが明らかとなった。また、本実験例の条件では、非特異増幅のない検出下限は１０コピーであることが明らかとなった。なお、非特異増幅を許容すれば検出下限は５コピーであった。
［実験例５］
（増幅反応の反応条件の評価）
実験例３と同様にして、９６ウェルプレートに鋳型核酸を分注した。鋳型核酸のコピー数は１コピー／ウェル又は５コピー／ウェルとした。
（増幅反応の反応条件の評価）
実験例３と同様にして、９６ウェルプレートに鋳型核酸を分注した。鋳型核酸のコピー数は１コピー／ウェル又は５コピー／ウェルとした。
続いて、実験例１と同様にして核酸抽出を行った。続いて、９６ウェルプレートの各ウェルにプライマー及び試薬Ｃの増幅試薬を添加し、リアルタイムＰＣＲ装置（製品名「ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（ＴＭ）１２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ」、アプライドバイオシステムズ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。
プライマーの濃度は図３１に示すパターンにし、最適なプライマー濃度を検討した。図３１中、一番左の列の「Ａ」〜「Ｈ」は９６ウェルプレートの行記号を示し、一番上の行の「１」〜「１２」は９６ウェルプレートの列番号を示す。また、「０．２μＭ」は、プライマー濃度を、フォワードプライマー（配列番号２）０．２μＭ、リバースプライマー（配列番号３）０．２μＭとしたことを示し、以下同様である。
図３２（ａ）〜（ｃ）は、鋳型核酸を１コピー／ウェルとした増幅反応における融解曲線を示すグラフである。図３２（ｄ）〜（ｆ）は、鋳型核酸を５コピー／ウェルとした増幅反応における融解曲線を示すグラフである。図３２（ａ）及び（ｄ）は、プライマー濃度を０．２μＭとした場合の結果であり、図３２（ｂ）及び（ｅ）は、プライマー濃度を０．５μＭとした場合の結果であり、図３２（ｃ）及び（ｆ）は、プライマー濃度を１．０μＭとした場合の結果である。図３２（ａ）〜（ｆ）中、グラフの縦軸は−ΔＦ／ΔＴを示し、グラフの横軸は温度を示す。ここで、ΔＦは蛍光強度の変化量を示し、ΔＴは温度の変化量を示す。
図３３（ａ）は、非特異増幅の有無をまとめた結果である。図３３（ａ）中、「Ｎｅｇａ」はネガティブコントロールの結果を示す。図３３（ｂ）は、増幅反応の評価結果を示す図である。図３３（ｂ）中、「Ｃｑ Ａｖｅ」はＣｑ値の平均値を示し、「Ｃｑ σ」はＣｑ値の標準偏差を示し、「Ｃｑ ＣＶ％」はＣｑ値のＣＶ値を示し、「ΔＣｑ」はＣｑ値の面内差（Ｃｑ ｍａｘ−Ｃｑ ｍｉｎ）を示し、「Ｃｑ ｍａｘ」はＣｑ値の最大値を示し、「Ｃｑ ｍｉｎ」はＣｑ値の最小値を示し、「ＵＤ数」は、ネガティブコントロール以外の増幅が認められなかったウェルの数を示し、「検出率」は下記式６により算出された値を示す。
検出率（％）＝鋳型核酸の増幅が検出されたウェル数／（増幅反応を行ったウェル数−ネガティブコントロールのウェル数）×１００ …式６
検出率（％）＝鋳型核酸の増幅が検出されたウェル数／（増幅反応を行ったウェル数−ネガティブコントロールのウェル数）×１００ …式６
その結果、鋳型核酸が低コピー数である場合には、プライマー濃度が低いほうが非特異増幅が減少し、増幅反応の特異性が高くなることが明らかとなった。また、インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲの反応条件を設定する場合には、低コピー領域で反応条件の最適化を行うことにより、非特異増幅を回避できる条件を設定することができることが明らかとなった。
本発明は、以下の態様を含む。
［１］リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応を評価する工程と、を含む、前記リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価方法。
［２］前記評価が、Ｃｑ値、Ｔｍ値及び非特異増幅の有無からなる群より選択される１つ以上の値に基づいて行われる、［１］に記載の性能評価方法。
［３］１反応空間あたりの前記鋳型核酸のコピー数が特定されており、前記コピー数が１００コピー以下である反応空間を少なくとも含む、［１］又は［２］に記載の性能評価方法。
［４］複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価用デバイス。
［５］複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸を含むデバイスと、インターカレーターと、を含む、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価用キット。
［６］リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応を評価する工程と、を含む、前記増幅反応の反応条件の評価方法。
［７］前記評価が、Ｃｑ値、Ｔｍ値及び非特異増幅の有無からなる群より選択される１つ以上の値に基づいて行われる、［６］に記載の反応条件の評価方法。
［８］１反応空間あたりの前記鋳型核酸のコピー数が特定されており、前記コピー数が１００コピー以下である反応空間を少なくとも含む、［６］に記載の反応条件の評価方法。
［９］複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む、増幅反応の反応条件の評価用デバイス。
［１０］複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸を含むデバイスと、インターカレーターと、を含む、増幅反応の反応条件の評価用キット。
［１１］リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応により得られた増幅産物の融解曲線をそれぞれ測定する工程と、前記融解曲線に基づいて、非特異増幅のない検出下限又は定量下限のコピー数を判定する工程と、を含む、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限の判定方法。
［１２］複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部は、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限の判定用デバイス。
［１３］複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部は、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含むデバイスと、インターカレーターと、を含む、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限の判定用キット。
［１］リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応を評価する工程と、を含む、前記リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価方法。
［２］前記評価が、Ｃｑ値、Ｔｍ値及び非特異増幅の有無からなる群より選択される１つ以上の値に基づいて行われる、［１］に記載の性能評価方法。
［３］１反応空間あたりの前記鋳型核酸のコピー数が特定されており、前記コピー数が１００コピー以下である反応空間を少なくとも含む、［１］又は［２］に記載の性能評価方法。
［４］複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価用デバイス。
［５］複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸を含むデバイスと、インターカレーターと、を含む、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価用キット。
［６］リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応を評価する工程と、を含む、前記増幅反応の反応条件の評価方法。
［７］前記評価が、Ｃｑ値、Ｔｍ値及び非特異増幅の有無からなる群より選択される１つ以上の値に基づいて行われる、［６］に記載の反応条件の評価方法。
［８］１反応空間あたりの前記鋳型核酸のコピー数が特定されており、前記コピー数が１００コピー以下である反応空間を少なくとも含む、［６］に記載の反応条件の評価方法。
［９］複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む、増幅反応の反応条件の評価用デバイス。
［１０］複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸を含むデバイスと、インターカレーターと、を含む、増幅反応の反応条件の評価用キット。
［１１］リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応により得られた増幅産物の融解曲線をそれぞれ測定する工程と、前記融解曲線に基づいて、非特異増幅のない検出下限又は定量下限のコピー数を判定する工程と、を含む、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限の判定方法。
［１２］複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部は、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限の判定用デバイス。
［１３］複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部は、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含むデバイスと、インターカレーターと、を含む、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限の判定用キット。
１…デバイス、２…基材、３…反応空間（ウェル）、４…鋳型核酸、５…密閉部材、６…識別手段、１０，１０’，１０Ｃ…吐出ヘッド（液滴吐出手段）、１１，１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１Ｃ，１１’…液室、１２，１２Ｃ…メンブレン、１３，１３Ｃ…駆動素子、１３ａ…電動機、１３ｂ，１３ｃ…圧電素子、２０…駆動手段、３０，２６０…光源、４０…ミラー、６０，６１…受光素子、７０…制御手段、７１，１０１…ＣＰＵ、７２…ＲＯＭ、７３…ＲＡＭ、７４，１０６…Ｉ／Ｆ、７５…バスライン、１００…性能評価装置、１０２…主記憶装置、１０３…補助記憶装置、１０４…出力装置、１０５…入力装置、１０７…バス、１１１，１１１ａ，１１１ｂ，１１１ｃ，１２１…ノズル、１１２…電磁弁、１１５…大気開放部、２００…コイル、２５０…マイクロ流路、２５５…検出器、２５５’…画像取得部、２６５，２６５’…レンズ、３００，３００ａ，３００ｂ，３００ｃ…細胞懸濁液、３１０，３１０’…液滴、３５０，３５０１，３５０２，３５０’，３５０”…細胞、４００…分注装置、４０１，４０１Ａ，４０１Ｂ，４０１Ｃ…液滴形成装置、７００，７００’…プレート、７１０…ウェル、８００…ステージ、９００…制御装置、Ｌ…光、Ｌｆ，Ｌｆ１，Ｌｆ２…蛍光。
Claims (13)
- リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応を評価する工程と、
を含む、前記リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価方法。 - 前記評価が、Ｃｑ値、Ｔｍ値及び非特異増幅の有無からなる群より選択される１つ以上の値に基づいて行われる、請求項１に記載の性能評価方法。
- １反応空間あたりの前記鋳型核酸のコピー数が特定されており、前記コピー数が１００コピー以下である反応空間を少なくとも含む、請求項１又は２に記載の性能評価方法。
- 複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価用デバイス。
- 複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸を含むデバイスと、
インターカレーターと、
を含む、リアルタイムＰＣＲ装置の性能評価用キット。 - リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応を評価する工程と、
を含む、前記増幅反応の反応条件の評価方法。 - 前記評価が、Ｃｑ値、Ｔｍ値及び非特異増幅の有無からなる群より選択される１つ以上の値に基づいて行われる、請求項６に記載の反応条件の評価方法。
- １反応空間あたりの前記鋳型核酸のコピー数が特定されており、前記コピー数が１００コピー以下である反応空間を少なくとも含む、請求項６に記載の反応条件の評価方法。
- 複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む、増幅反応の反応条件の評価用デバイス。
- 複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部に、特定されたコピー数の鋳型核酸を含むデバイスと、
インターカレーターと、
を含む、増幅反応の反応条件の評価用キット。 - リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、インターカレーターの存在下で、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸の増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応により得られた増幅産物の融解曲線をそれぞれ測定する工程と、
前記融解曲線に基づいて、非特異増幅のない検出下限又は定量下限のコピー数を判定する工程と、
を含む、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限の判定方法。 - 複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部は、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含む、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限の判定用デバイス。
- 複数の反応空間を有し、前記複数の反応空間の少なくとも一部は、検出下限付近又は定量下限付近のコピー数を含む特定された段階的なコピー数の鋳型核酸及びインターカレーターを含むデバイスと、
インターカレーターと、
を含む、非特異増幅のない検出下限又は非特異増幅のない定量下限の判定用キット。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023037986A1 (ja) * | 2021-09-13 | 2023-03-16 | 公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団 | 多能性幹細胞の製造方法 |
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| JP2013169532A (ja) * | 2012-02-22 | 2013-09-02 | Panasonic Corp | 光触媒性能評価方法 |
| JP2019092495A (ja) * | 2017-11-24 | 2019-06-20 | 株式会社リコー | 検査装置の性能評価用検査デバイス、検査装置の性能評価プログラム、検査装置の性能評価方法、及び検査装置の性能評価装置 |
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