JP2019092495A - 検査装置の性能評価用検査デバイス、検査装置の性能評価プログラム、検査装置の性能評価方法、及び検査装置の性能評価装置 - Google Patents
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
また最近では、特定の分子数のDNA断片を細胞に遺伝子組み換え技術により導入し、培養した細胞をマニュピレートで単離することにより、目的の塩基配列を有するDNAを1分子含む試料の調製方法が提案されている(例えば、特許文献2参照)。
本発明の検査デバイスは、複数のウェルを有し、特定分子数の増幅可能な試薬を含む試薬組成物を複数のウェルに配した検査デバイスであって、
複数のウェルに配される増幅可能な試薬は、特定分子数を互いに異ならせてなる2以上の群を構成してなる。
また、本発明の検査デバイスは、従来のマニュピレートを用いた方法では、試料溶液の調製方法に関する技術であって、検査装置の性能評価について記載も示唆もされておらず、更に、スループットの点で課題があるという知見に基づくものである。
ウェルは、その形状、数、容積、材質、色などについては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ウェルの形状としては、特定分子数の増幅可能な試薬を含む試薬組成物を配することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平底、丸底、U底、V底等の凹部、基板上の区画などが挙げられる。
ウェルの数は、2以上の複数であることが好ましく、5以上がより好ましく、50以上が更に好ましい。
ウェルの数が2以上であるマルチウェルプレートが好適に用いられる。
マルチウェルプレートとしては、例えば、24、48、96、384、又は1,536のウェルプレートが挙げられる。
ウェルの容積としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、一般的な核酸検査装置に用いられる試料量を考慮すると、10μL以上1,000μL以下が好ましい。
ウェルの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ふっ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。
ウェルの色としては、例えば、透明、半透明、着色、完全遮光などが挙げられる。
検査デバイスは、ウェルが基材に設けられたプレート状のものが好ましいが、8連チューブ等の連結タイプのウェルチューブであってもよい。
基材としては、その材質、形状、大きさ、構造などについて特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
基材の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、半導体、セラミックス、金属、ガラス、石英ガラス、プラスチックスなどが挙げられる。これらの中でも、プラスチックスが好ましい。
プラスチックスとしては、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ふっ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。
基材の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、板状、プレート状などが好ましい。
基材の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、単層構造であっても複数層構造であっても構わない。
検査デバイスは、増幅可能な試薬の特定分子数の情報を識別可能な識別手段を有することが好ましい。
識別手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メモリ、ICチップ、バーコード、QRコード(登録商標)、Radio Frequency Identifier(以下、「RFID」とも称することがある)、色分け、印刷などが挙げられる。
識別手段を設ける位置及び識別手段の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
識別手段に記憶させる情報としては、増幅可能な試薬の特定分子数の情報以外にも、例えば、分析結果(例えば、活性値、発光強度等)、増幅可能な試薬の数(例えば、細胞の数)、細胞の生死、特定塩基配列のコピー数、複数のウェルのうちどのウェルに増幅可能な試薬が充填されているのか、増幅可能な試薬の種類、測定日時、測定者の氏名などが挙げられる。
識別手段に記憶された情報は、各種読取手段を用いて読み取ることができ、例えば、識別手段がバーコードであれば読取手段としてバーコードリーダーが用いられる。
その他の部材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、密閉部材などが挙げられる。
検査デバイスは、ウェルへの異物混入は充填物の流出などを防ぐために、密閉部材を有することが好ましい。
密閉部材としては、少なくとも1つのウェルを密閉可能であり、1つ1つのウェルを個別に密閉乃至開封できるように、切り取り線により切り離し可能に構成することが好ましい。
密閉部材の形状としては、ウェル内壁径と一致するキャップ状、又はウェル開口部を被覆するフィルム状であることが好ましい。
密閉部材の材質としては、例えば、ポリオレフィン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアミド樹脂などが挙げられる。
密閉部材としては、全てのウェルを一度に密閉可能なフィルム状であることが好ましい。また、使用者の誤使用を低減化できるように再開封が必要なウェルと不必要なウェルとの接着強度が異なるように構成されていることが好ましい。
特定分子数とは、ウェルに含まれる増幅可能な試薬の分子数であり、具体的には、ウェル内に含まれる核酸のコピー数を意味する。
試薬組成物は、特定分子数の増幅可能な試薬以外にも、プライマー、増幅試薬などを含有する。
プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において、鋳型DNAに特異的な18塩基〜30塩基の相補的塩基配列を持つ合成オリゴヌクレオチドであり、増幅したい領域を挟むようにフォワードプライマーとリバースプライマーとの2か所(一対)設定される。
増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において、例えば、酵素としてDNAポリメラーゼ、基質として4種の塩基(dGTP、dCTP、dATP、dTTP)、Mg2+(2mMの塩化マグネシウム)、最適pH(pH7.5〜9.5)を保持するバッファーなどが挙げられる。
また、検査デバイスは、一のウェルにおける増幅可能な試薬の特定分子数が10N1であり、他のウェルにおける増幅可能な試薬の特定分子数が10N2である、(ただし、N1及びN2は互いに連続した整数である)ことが好ましく、例えば、1、10、100、1,000の場合、100、1,000、10,000、100,000、1,000,000の場合などが挙げられる。これにより、検査デバイスは、低分子数から高分子数までの広い範囲における検量線の作成が容易に行える。
これにより、検査デバイスは、例えば、再度リアルタイムPCRの校正を行うか、実際のサンプルでは適用除外とするかの判断ができる。また、検査デバイスを用いて、一定期間の計測を行うことにより、Ct値の経時変化を得ることができ、それによって、検査装置の面内特性を評価することができる。更に、同じ特定分子数を配置した検査デバイスを用いることにより、検査装置間の性能を比較することができる。
検出限界(Limit of Detection;LOD)とは、核酸を検出できる手法において、検出できる最少の核酸の分子数を表し、特に制限はなく、測定法に応じて適宜選択することができ、例えば、平均値+3σなどが挙げられる。
本明細書においては、特定の分子数のサンプル21個のサンプル中の未検出が1個の場合(95%の確率で判定した2σに相当)のうち、最小の分子数に相当数するものを検出限界として用いることができる。
検出限界付近とは、上記検出限界の分子数の±1までの範囲の分子数を意味する。
ネガティブコントロール群で、増幅可能な試薬の検出がなされたときは、検出系(試薬や装置)に異常があることが示唆される。検査デバイス内にネガティブコントロール群を設けておくことにより、問題が生じたときにユーザーは直ちに問題に気づくことができ、測定を中止して問題がどこにあるかの点検を行うことができる。
ポジティブコントロール群で増幅可能な試薬が不検出とされたときは、検出系(試薬や装置)に異常があることが示唆される。検査デバイス内にポジティブコントロール群を設けておくことにより、問題が生じたときにユーザーは直ちにそれに気づくことができ、測定を中止して問題がどこにあるかの点検を行うことができる。
増幅可能な試薬の特定分子数は、定量限界を超える分子数であることが好ましい。
定量限界(Limit of qualification;LOQ)とは、核酸の定量が可能な手法において、定量が可能な最小の核酸の分子数を表し、特に制限はなく、測定法に応じて適宜選択することができる。
本明細書においては、複数の分子種からなるサンプルより、検量線を作成し、その検量線の直線性から外れる分子数の値を定量限界としてもよい。もしくは検量線の不確かさをCVで表し、横軸に分子数をとり、縦軸にCt値をとってCVをプロットしたグラフにおいて、例えば、CV値が5%、又は10%を切る値を定量限界とすることができる。
核酸とは、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖、及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味し、核酸の断片、あるいはこれら核酸又はその断片のアナログなども含まれる。
核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、DNA、RNA、cDNAなどが挙げられる。また、核酸としては、プラスミドも使用することができる。核酸は修飾又は変異されていてもよい。
核酸又は核酸断片のアナログとしては、核酸又は核酸断片に非核酸成分を結合させたもの、核酸又は核酸断片を蛍光色素や同位元素等の標識剤で標識したもの(例えば、蛍光色素や放射線同位体で標識されたプライマーやプローブ)、核酸又は核酸断片を構成するヌクレオチドの一部の化学構造を変化させたもの(例えば、ペプチド核酸など)などが挙げられる。これらは、生物から得られる天然物であっても又はそれらの加工物であってもよく、或いは、遺伝子組換技術を利用して製造されたものでも、また化学的に合成されたものでもよい。
核酸としては、遺伝子導入を行うことができる核酸であれば特に制限はなく、目的応じて適宜選択することができ、前述の細胞種を問わず使用することができる。
核酸は、特定の塩基配列を有することが好ましい。特定とは、特に定められていることを意味する。
特定の塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、感染症検査に用いられる塩基配列、自然界には存在しない非天然の塩基配列、動物細胞由来の塩基配列、植物細胞由来の塩基配列などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
非天然の塩基配列を用いる場合、GC含量が一定であることが好ましい(例えば、配列番号1など参照)。
特定の塩基配列の塩基長としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、20以上10,000以下の塩基長など挙げられる。
感染症検査に用いられる塩基配列を用いる場合、その感染症特有の塩基配列を含んでいれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、公定法や通知法で指定されている塩基配列を含んでいることが好ましい(例えば、配列番号2及び3など参照)。
細胞は、核酸を有し、生物体を形成する構造的及び機能的単位を意味する。
細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
細胞周期とは、細胞が増えるとき、細胞分裂が生じ、細胞分裂で生じた細胞(娘細胞)が再び細胞分裂を行う細胞(母細胞)となって新しい娘細胞を生み出す過程を意味する。
また、酵母菌としては、例えば、細胞周期をG1期に制御するフェロモン(性ホルモン)の感受性が増加したBar−1欠損酵母が好ましい。酵母菌がBar−1欠損酵母であると、細胞周期が制御できていない酵母菌の存在比率を低くすることができるため、ウェル内に収容された細胞の特定の核酸の数の増加等を防ぐことができる。
細胞としては、光を受光したときに発光可能な細胞であることが好ましい。光を受光したときに発光可能な細胞であると、細胞の数を高精度に制御してウェル内に着弾させることができる。
受光とは、光を受けることを意味する。
光学センサとは、人間の目で見ることができる可視光線と、それより波長の長い近赤外線や短波長赤外線、熱赤外線領域までの光のいずれかの光をレンズで集め、対象物である細胞の形状などを画像データとして取得する受動型センサを意味する。
光を受光したときに発光可能な細胞としては、光を受光したときに発光可能であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、蛍光色素によって染色された細胞、蛍光タンパク質を発現した細胞、蛍光標識抗体により標識された細胞などが挙げられる。
細胞における蛍光色素による染色部位、蛍光タンパク質の発現部位、又は蛍光標識抗体による標識部位としては、特に制限はなく、細胞全体、細胞核、細胞膜などが挙げられる。
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類が好ましく、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン6G、ローダミンB、ローダミン123がより好ましい。
蛍光タンパク質としては、例えば、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami−Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP−m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed−Express、DsRed2、TagRFP、DsRed−Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、mPlum、PS−CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、KikumeGRなどが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
蛍光標識抗体としては、蛍光標識されていれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、CD4−FITC、CD8−PEなどが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
作製した染色済み酵母分散液から10μL取り出してPMMA製プラスチックスライドに載せ、自動セルカウンター(商品名:Countess Automated Cell Counter、invitrogen社製)を用いることにより、体積平均粒径を測定することができる。なお、細胞数も同様の測定方法により求めることができる。
また、例えば、各ウェル3に充填する核酸4の特定分子数の情報、もしくはこれらの情報と関連付けられた情報を記憶するICチップまたはバーコード(識別手段6)が、密閉部材5と基材2との間で且つウェルの開口部以外の位置に配置されている。これは、識別手段の意図しない改変等を防止するのに好適である。
また、検査デバイスが識別手段を有することで、識別手段を有しない一般のウェルプレートとの区別可能である。このため、取り違えを防止することが可能である。
この図3の検査デバイスを用いて、リアルタイムPCRを行い、測定したCt(Threshold Cycle)値の結果を図4に示す。平均Ctは37.1、Ct値の標準偏差は1.00、CV値[(標準偏差/平均Ct)×100]は2.70である。なお、図3中「UD」はCt値を不検出である。
リアルタイムPCRは、例えば、まず、検査デバイス中の各サンプルに対して、マスターミックス(Thermo Fisher社製、TaqMan Universal PCR Master Mix)1μL、特定のDNA配列を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーをそれぞれ0.5nmol、プローブ0.4nmolを加える。その後、リアルタイムPCR装置(Thermo Fisher社製、QuantStudio 7 Flex)を用いて増幅及び検出を行うことができる。
Threshold Lineは、算出したベースラインシグナルに対して、統計学的に有意な増加が見られるシグナルレベルであり、リアルタイムPCR反応の閾値を意味する。
このように検査デバイスの面内特性は、平均Ct、Ct値の標準偏差、CV値[(標準偏差/平均Ct)×100]、[(Ct(Max)−Ct(min))/2平均Ct]×100などから評価することができる。
図5の検査デバイスを用い、リアルタイムPCRを行ってCt値を測定し、平均Ctを算出した。特定分子数(3分子)のウェルのCt値が平均Ctの10%以内であれば「○」、特定分子数(3分子)のウェルのCt値が平均Ctの10%より大きい場合を「×」で示した。結果を図6に示した。なお、図6中「UD」はCt値を不検出である。
その結果、96穴プレート中、外周の4箇所のウェルで、平均Ctの10%を超える値となった。これら外周の4箇所は低分子数での使用には不適であることがわかった。このため、再度リアルタイムPCRの校正を行うか、実際のサンプルではこれら外周の4箇所のウェルを使用しないとする判断が可能となる。
図7の検査デバイスを用いて、リアルタイムPCRを行ってCt値を測定した。これらのCt値を縦軸に、横軸に分子数をプロットした検量線を図8に示す。検査装置の性能を表す指標として、相関係数(R2)があり、この場合は0.99である。相関係数はデータがどの程度検量線に合致しているかを示す値であり、検量線の直線性を反映している。また、最低分子数(この場合は2分子)は最外周に配置されていることで、面内均一性の指標とすることができる。
以下、特定の核酸を有する細胞を用いた検査デバイスの製造方法について説明する。
本発明の検査デバイスの製造方法は、特定の核酸を有する複数の細胞、及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する細胞懸濁液生成工程と、細胞懸濁液を液滴として吐出することによりプレートのウェル内に液滴を順次着弾させる液滴着弾工程と、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する細胞数計数工程と、ウェル内の細胞から核酸を抽出する核酸抽出工程とを含み、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程、及び細胞数計数工程における推定する核酸の数の確からしさを算出する工程、出力工程、記録工程を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の工程を含む。
細胞懸濁液生成工程は、特定の核酸を有する複数の細胞、及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する工程である。
溶剤とは、細胞を分散させるために用いる液体を意味する。
細胞懸濁液における懸濁とは、細胞が溶剤中に分散して存在する状態を意味する。
生成とは、作り出すことを意味する。
細胞懸濁液は、特定の核酸を有する複数の細胞、及び溶剤を含み、添加剤を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の成分を含む。
特定の核酸を有する複数の細胞については、上述したとおりである。
溶剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、培養液、分離液、希釈液、緩衝液、有機物溶解液、有機溶剤、高分子ゲル溶液、コロイド分散液、電解質水溶液、無機塩水溶液、金属水溶液、又はこれらの混合液体などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、水、緩衝液が好ましく、水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、Tris−EDTA緩衝液(TE)がより好ましい。
添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤、核酸、樹脂などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
その他の材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、架橋剤、pH調整剤、防腐剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、分散剤などが挙げられる。
細胞を分散する方法としては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビーズミル等のメディア方式、超音波ホモジナイザー等の超音波方式、フレンチプレス等の圧力差を利用する方式などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから超音波方式がより好ましい。メディア方式では、解砕能力が強く、細胞膜や細胞壁を破壊する可能性やメディアがコンタミとして混入することがある。
細胞のスクリーニング方法としては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、湿式分級、セルソーター、フィルタによるスクリーニングなどが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから、セルソーター、フィルタによるスクリーニングが好ましい。
細胞周期を測定するとは、細胞分裂による細胞数を数値化することを意味する。
核酸の数を推定するとは、細胞数から、核酸のコピー数を求めることを意味する。
確からしさとは、いくつかの事象の生じる可能性がある時、特定の1つの事象が起こる可能性の程度を事前に予測して、その事象の起こる確率を意味する。
算出とは、計算して求める数値を出すことを意味する。
また、細胞懸濁液を作製する前に細胞周期を制御する処理を行うことが好ましく、前述のような複製が起きる前、又は後の状態に揃えることによって、特定の核酸の数を細胞数からより精度良く算出することが可能になる。
液滴着弾工程は、細胞懸濁液を液滴として吐出することによりプレートのウェル内に液滴を順次着弾させる工程である。
液滴とは、表面張力によりまとまった液体のかたまりを意味する。
吐出とは、細胞懸濁液を液滴として飛翔させることを意味する。
順次とは、次々に順序どおりにすることを意味する。
着弾とは、液滴をウェルに到達させることを意味する。
サーマル方式は、局所的な加熱が発生するため生体材料である細胞への影響や、ヒーター部への焦げ付き(コゲーション)が懸念される。熱による影響は、含有物やプレートの用途に依存するため、一概に除外する必要はないが、圧力印加方式は、サーマル方式よりヒーター部への焦げ付きの懸念がないという点から好ましい。
図15Aは、電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。電磁バルブ方式の吐出ヘッドは、電動機13a、電磁弁112、液室11a、細胞懸濁液300a、及びノズル111aを有する。
電磁バルブ方式の吐出ヘッドとしては、例えば、TechElan社のディスペンサなどを好適に用いることができる。
また、図15Bは、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。ピエゾ方式の吐出ヘッドは、圧電素子13b、液室11b、細胞懸濁液300b、及びノズル111bを有する。
ピエゾ方式の吐出ヘッドとしては、Cytena社のシングルセルプリンターなどを好適に用いることができる。
これらの吐出ヘッドのいずれも用いることが可能であるが、電磁バルブによる圧力印加方式では高速に繰り返し液滴を形成することができないため、プレートの生成のスループットを上げるためにはピエゾ方式を用いることが好ましい。また、一般的な圧電素子13bを用いたピエゾ方式の吐出ヘッドでは、沈降によって細胞濃度のムラが発生することや、ノズル詰まりが生じることが問題として生じることがある。
このため、より好ましい構成として図16Cに示した構成などが挙げられる。図15Cは、図15Bにおける圧電素子を用いたピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例の模式図である。図15Cの吐出ヘッドは、圧電素子13c、液室11c、細胞懸濁液300c、及びノズル111cを有する。
図15Cの吐出ヘッドでは、図示していない制御装置からの圧電素子13cに対して電圧印加することにより、紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレンを紙面上下方向に変形させることができる。
吐出ヘッドは、圧電素子に形成された上下電極に、パルス状の電圧を印加することにより液滴を吐出することができる。図17A〜図17Cは、それぞれのタイミングにおける液滴の状態を示す模式図である。
図17Aは、まず、圧電素子13cに電圧を印加することにより、メンブレン12cが急激に変形することによって、液室11c内に保持された細胞懸濁液とメンブレン12cとの間に高い圧力が発生し、この圧力によってノズル部から液滴が外に押し出される。
次に、図17Bに示すように、圧力が上方に緩和するまでの時間、ノズル部からの液押し出しが続き液滴が成長する。
最後に、図17Cに示すように、メンブレン12cが元の状態に戻る際に細胞懸濁液とメンブレン12cとの界面近傍の液圧力が低下し、液滴310’が形成される。
プレートにおけるウェルの数は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単数であってもよく、複数であってもよい。
図18に示すように、液滴を着弾させるための分注装置400は、液滴形成装置401と、プレート700と、ステージ800と、制御装置900とを有している。
複数の水準とは、標準となる複数の基準を意味する。
複数の水準としては、ウェル内に特定の核酸を有する複数の細胞が所定の濃度勾配を有することが好ましい。濃度勾配を有することにより、検量線用試薬として好適に使用することができる。複数の水準は、センサによって計数される値を用いて制御することができる。
細胞数計数工程は、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する工程である。
センサとは、自然現象や人工物の機械的・電磁気的、熱的、音響的、又は化学的性質、或いはそれらにより示される空間情報・時間情報を、何らかの科学的原理を応用して、人間や機械が扱い易い別媒体の信号に置き換える装置を意味する。
計数とは、数を数えることを意味する。
図19、図23、及び図24を用いて、光学的に検出する方法に関して以下に述べる。
図19は、液滴形成装置401の一例を示す模式図である。図23、及び図24は、液滴形成装置401A、401Bの他の一例を示す模式図である。図19に示すように、液滴形成装置401は、吐出ヘッド(液滴吐出手段)10と、駆動手段20と、光源30と、受光素子60と、制御手段70とを有する。
光を照射とは、光をあてることを意味する。
まず、ステップS11において、制御手段70の吐出制御手段701は、駆動手段20に吐出の指令を出す。吐出制御手段701から吐出の指令を受けた駆動手段20は、駆動素子13に駆動信号を供給してメンブレン12を振動させる。メンブレン12の振動により、蛍光染色細胞350を含有する液滴310が、ノズル111から吐出される。
蛍光タンパク質としては、例えば、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami−Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP−m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed−Express、DsRed2、TagRFP、DsRed−Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、mPlum、PS−CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、KikumeGRなどが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
このように、液滴形成装置401Bでは、蛍光染色細胞350が異なる方向に発した蛍光を受光する複数の受光素子を有しているため、蛍光染色細胞350の個数の誤計数の発生頻度を更に低減できる。
電気的又は磁気的な検出する方法としては、図28に示すように、液室11’から細胞懸濁液を液滴310’としてプレート700’に吐出する吐出ヘッドの直下に、細胞計数のためのコイル200がセンサとして設置されている。細胞は特定のタンパク質によって修飾され細胞に接着することが可能な磁気ビーズによって覆うことにより、磁気ビーズが付着した細胞がコイル中を通過する際に発生する誘導電流によって、飛翔液滴中の細胞の有無を検出することが可能である。一般的に、細胞はその表面に細胞特有のタンパク質を有しており、このタンパク質に接着することが可能な抗体を磁気ビーズに修飾することによって、細胞に磁気ビーズを付着させることが可能である。このような磁気ビーズとしては既製品を用いることが可能であり、例えば、株式会社ベリタス製のDynabeads(商標登録)が利用可能である。
吐出前に細胞を観測する処理としては、図29に示すマイクロ流路250中を通過してきた細胞350’をカウントする方法や、図30に示す吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法などが挙げられる。図29はセルソーター装置において用いられている方法であり、例えば、ソニー株式会社製のセルソーターSH800Zを用いることができる。図29では、マイクロ流路250中に光源260からレーザー光を照射して散乱光や蛍光を、集光レンズ265を用いて検出器255により検出することによって細胞の有無や、細胞の種類を識別しながら液滴を形成することが可能である。本方法を用いることによって、マイクロ流路250中に通過した細胞の数から所定のウェル中に着弾した細胞の数を推測することが可能である。
また、図30に示す吐出ヘッド10’としては、Cytena社製のシングルセルプリンターを用いることが可能である。図30では、吐出前において、ノズル部近傍をレンズ265’を介して、画像取得部255’において画像取得した結果からノズル部近傍の細胞350”が吐出されたと推定することや、吐出前後の画像から差分により吐出されたと考えられる細胞の数を推定することによって、所定のウェル中に着弾した細胞の数を推測することができる。図29に示すマイクロ流路中を通過してきた細胞をカウントする方法では、液滴が連続的に生成されるのに対して、図30は、オンデマンドで液滴形成が可能であるため、より好ましい。
着弾後の細胞をカウントする処理としては、プレートにおけるウェルを蛍光顕微鏡などにより観測することにより、蛍光染色した細胞を検出する方法を取ることが可能である。この方法は、例えば、Sangjun et al.,PLoS One,Volume 6(3),e17455などに記載されている。
また、着弾後のプレート上の細胞を検出する手法においても問題がある。まず、プレートとして顕微鏡観察が可能であるものを準備する必要がある。観測可能なプレートとして、一般的に底面が透明かつ平坦なプレート、特に底面がガラス製となっているプレートが用いられるが、特殊なプレートとなってしまうため、一般的なウェルを使用することができなくなる問題がある。また、細胞数が数十個など多いときには、細胞の重なりが発生するため正確な計数ができなくなる問題もある。そのため、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサ及び細胞数計数手段によって計数することに加えて、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を行うことが好ましい。
1又は少数の受光部を有する受光素子を用いる際には、蛍光強度から細胞が何個入っているかを予め用意された検量線を用いて決定することも考えられるが、主として飛翔液滴中の細胞有無を二値的に検出することが行われる。細胞懸濁液の細胞濃度が十分に低く、液滴中に細胞が1個又は0個しかほぼ入らない状態で吐出を行う際には、二値的な検出で十分精度よく計数を行うことが可能である。細胞懸濁液中で細胞はランダムに配置していることを前提とすれば、飛翔液滴中の細胞数はポアソン分布に従うと考えられ、液滴中に細胞数が2個以上入る確率P(>2)は下記式(1)で表される。図31は、確率P(>2)と平均細胞数の関係を表すグラフである。ここで、λは液滴中の平均細胞数であり、細胞懸濁液中の細胞濃度に吐出液滴の体積を乗じたものになる。
P(>2)=1−(1+λ)×e−λ ・・・ 式(1)
細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程、及び細胞数計数工程における推定する核酸の数の確からしさを算出する工程は、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程、及び細胞数計数工程それぞれの工程における確からしさを算出する工程である。
当該推定する核酸の数の確からしさの算出は、細胞懸濁液生成工程における確からしさと同様に算出することができる。
なお、確からしさの算出タイミングは、細胞数計数工程の次工程で、纏めて算出してもよいし、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程、及び細胞数計数工程の各工程の最後に算出し、細胞数計数工程の次工程で各不確かさを合成して算出してもよい。言い換えれば、上記各工程での確からしさは、合成算出までに適宜算出しておけばよい。
出力工程は、ウェル内に着弾した細胞懸濁液に含まれる細胞数を、センサにより測定された検出結果に基づいて細胞数計数手段にて計数された値を出力する工程である。
計数された値とは、センサにより測定された検出結果から、細胞数計数手段にて当該ウェルに含まれる細胞数を意味する。
出力とは、原動機、通信機、計算機などの装置が入力を受けて計数された値を外部の計数結果記憶手段としてのサーバに電子情報として送信することや、計数された値を印刷物として印刷することを意味する。
出力は、細胞数計数工程と同時に行ってもよく、細胞数計数工程の後に行ってもよい。
記録工程は、出力工程において、出力された観測値又は推測値を記録する工程である。
記録工程は、記録部において好適に実施することができる。
記録は、出力工程と同時に行ってもよく、出力工程の後に行ってもよい。
記録とは、記録媒体に情報を付与することだけでなく、記録部に情報を保存することも含む意味である。
核酸抽出工程は、ウェル内の細胞から核酸を抽出する工程である。
抽出とは、細胞膜や細胞壁などを破壊し、核酸をぬき出すことを意味する。
細胞壁を保有している細胞に関しては、上記の方法で十分にDNA抽出されないことがある。その場合、例えば、浸透圧ショック法、凍結融解法、酵素消化法、DNA抽出用キットの使用、超音波処理法、フレンチプレス法、ホモジナイザーなどの方式などが挙げられる。これらの中でも、抽出DNAのロスが少ないことから、酵素消化法が好ましい。
その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵素失活工程などが挙げられる。
酵素失活工程は、酵素を失活させる工程である。
酵素としては、例えば、DNase、RNase、核酸抽出工程において核酸を抽出するために使用した酵素などが挙げられる。
酵素を失活させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の方法を好適に用いることができる。
検査デバイスとしては、感染症に対して実施する場合は公定法や通知法などに定められている方法に適用することができる。
本発明の検査装置の性能評価方法は、検査対象を検査する検査装置の性能を評価する検査装置の性能評価方法であって、
本発明の検査デバイスを用い、検査デバイスにおけるCt値の情報を取得するCt値情報取得工程と、
Ct値の情報に基づき検査装置の性能を評価する性能評価工程と、含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
本発明の検査デバイスを用い、検査デバイスにおけるCt値の情報を取得するCt値情報取得部と、
Ct値の情報に基づき検査装置の性能を評価する性能評価部と、を有し、更に必要に応じてその他の手段を有する。
本発明の検査デバイスを用い、検査デバイスにおけるCt値の情報を取得し、
Ct値の情報に基づき検査装置の性能を評価する処理をコンピュータに実行させる。
Ct値情報取得工程は、本発明の検査デバイスを用い、検査デバイスにおけるCt値の情報を取得する工程であり、Ct値情報取得部により実施される。
Ct値は、本発明の検査デバイスを用い、リアルタイムPCRを行うことにより求めることができる。
Ct値の情報としては、例えば、平均Ct、Ct値の標準偏差、CV値[(標準偏差/平均Ct)×100]、[(Ct(Max)−Ct(min))/2平均Ct]×100などが挙げられる。
Ct値の情報は、検査デバイスの増幅可能な試薬の特定分子数が異なる2以上の群毎に求めることができる。
性能評価工程は、Ct値の情報に基づき検査装置の性能を評価する工程であり、性能評価部により実施される。
また、本発明の検査デバイスを用い、一定期間の計測を行うことにより、Ct値の経時変化を得ることができる。それによって、面内特性と同様に、各ウェルのCt値が平均Ctの10%を超える場合は、検査装置の校正を行うか、その計測場所を使用しないという対応をとることができる。また、配置された特定分子数が絶対値であることから、同じ特定分子数を配置した検査デバイスを用いることにより、検査装置間の性能を比較することができる。
その他の工程及びその他の部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、表示工程及び表示部などが挙げられる。
以下、検査装置の性能評価装置のハードウェア構成、及び機能構成について説明する。
図32は、検査装置の性能評価装置100のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。
図32で示すように、検査装置の性能評価装置100は、CPU(Central Processing Unit)101、主記憶装置102、補助記憶装置103、出力装置104、入力装置105、通信インターフェイス(通信I/F)106の各部を有する。これらの各部は、バス107を介してそれぞれ接続されている。
CPU101は、種々の制御や演算を行う処理装置である。CPU101は、主記憶装置102などが記憶するOS(Operating System)やプログラムを実行することにより、種々の機能を実現する。即ち、CPU101は、本実施例では、検査装置の性能評価プログラムを実行することにより、検査装置の性能評価装置100の制御部130として機能する。
また、CPU101は、検査装置の性能評価装置100全体の動作を制御する。なお、本実施例では、検査装置の性能評価装置100全体の動作を制御する装置をCPU101としたが、これに限ることなく、例えば、FPGA(Field Programmable Gate Array)などとしてもよい。
主記憶装置102は、各種プログラムを記憶し、各種プログラムを実行するために必要なデータ等を記憶する。
主記憶装置102は、図示しない、ROM(Reed Only Memory)と、RAM(Random Access Memory)と、を有する。
ROMは、BIOS(Basic Input/Output System)等の各種プログラムなどを記憶している。
RAMは、ROMに記憶された各種プログラムがCPU101により実行される際に展開される作業範囲として機能する。RAMとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。RAMとしては、例えば、DRAM(Dynamic Random Access Memory)、SRAM(Static Random Access Memory)などが挙げられる。
補助記憶装置103としては、各種情報を記憶できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ソリッドステートドライブ、ハードディスクドライブなどが挙げられる。また、補助記憶装置103は、例えば、CD(Compact Disc)ドライブ、DVD(Digital Versatile Disc)ドライブ、BD(Blu−ray(登録商標) Disc)ドライブなどの可搬記憶装置としてもよい。
入力装置105は、検査装置の性能評価装置100に対する各種要求を受け付けることができれば、特に制限はなく、適宜公知のものを用いることができ、例えば、キーボード、マウス、タッチパネルなどが挙げられる。
通信インターフェイス(通信I/F)106は、特に制限はなく、適宜公知のものを用いることができ、例えば、無線又は有線を用いた通信デバイスなどが挙げられる。
以上のようなハードウェア構成によって、検査装置の性能評価装置100の処理機能を実現することができる。
図33は、検査装置の性能評価装置100の機能構成の一例を示す図である。
この図33に示すように、検査装置の性能評価装置100は、入力部110、出力部120、制御部130、記憶部140を有する。
制御部130は、Ct値情報取得部131と、性能評価部132とを有する。制御部130は、検査装置の性能評価装置100全体を制御する。
記憶部140は、Ct値情報データベース141、性能評価結果データベース142を有する。以下、「データベース」を「DB」と称することもある。
性能評価部132は、Ct値の情報に基づき、検査装置の性能を評価する。なお、検査装置の性能を評価する具体的な手法は、上述したとおりである。
性能評価部132において求められた検査装置の性能評価結果は、記憶部140の性能評価結果DB142へ記憶される。
ステップS111では、検査装置の性能評価装置100の制御部130の性能評価部132は、取得したCt値情報に基づき検査装置の性能を評価し、処理をS112に移行する。
ステップS112では、検査装置の性能評価装置100の制御部130は、得られた検査装置の性能評価結果を記憶部140の性能評価結果DB142へ保存し、本処理を終了する。
<1> 複数のウェルを有し、
特定分子数の増幅可能な試薬を含む試薬組成物を前記複数のウェルに配した検査デバイスであって、
前記複数のウェルに配される前記増幅可能な試薬は、特定分子数を互いに異ならせてなる2以上の群を構成してなることを特徴とする検査デバイスである。
<2> 前記増幅可能な試薬の特定分子数が異なる2以上の群は、前記増幅可能な試薬の特定分子数が0であるネガティブコントロール群と、前記増幅可能な試薬の特定分子数が検出限界付近である群と、を含む前記<1>に記載の検査デバイスである。
<3> 前記増幅可能な試薬の特定分子数が異なる2以上の群は、前記増幅可能な試薬の特定分子数が100以上であるポジティブコントロール群を更に含む前記<2>に記載の検査デバイスである。
<4> 前記増幅可能な試薬の特定分子数が、定量限界を超える分子数である前記<1>から<3>のいずれかに記載の検査デバイスである。
<5> 前記増幅可能な試薬の特定分子数の情報を識別可能な識別手段を有する前記<1>から<4>のいずれかに記載の検査デバイスである。
<6> 前記増幅可能な試薬が核酸である前記<1>から<5>のいずれかに記載の検査デバイスである。
<7> 前記核酸が細胞の核中の核酸に組み込まれた前記<6>に記載の検査デバイスである。
<8> 前記細胞が酵母である前記<7>に記載の検査デバイスである。
<9> 前記試薬組成物がプライマー及び増幅試薬の少なくともいずれかを有する前記<1>から<8>のいずれかに記載の検査デバイスである。
<10> 検査対象を検査する検査装置の性能を評価する検査装置の性能評価プログラムであって、
前記<1>から<9>のいずれかに記載の検査デバイスを用い、前記検査デバイスにおけるCt値の情報を取得し、
前記Ct値の情報に基づき前記検査装置の性能を評価する
処理をコンピュータに実行させることを特徴とする検査装置の性能評価プログラムである。
<11> 検査対象を検査する検査装置の性能を評価する検査装置の性能評価方法であって、
前記<1>から<9>のいずれかに記載の検査デバイスを用い、前記検査デバイスにおけるCt値の情報を取得するCt値情報取得工程と、
前記Ct値の情報に基づき前記検査装置の性能を評価する性能評価工程と、
を含むことを特徴とする検査装置の性能評価方法である。
<12> 検査対象を検査する検査装置の性能を評価する検査装置の性能評価装置であって、
前記<1>から<9>のいずれかに記載の検査デバイスを用い、前記検査デバイスにおけるCt値の情報を取得するCt値情報取得部と、
前記Ct値の情報に基づき前記検査装置の性能を評価する性能評価部と、
を有することを特徴とする検査装置の性能評価装置である。
2 基材
3 ウェル
4 増幅可能な試薬
5 密閉部材
Claims (12)
- 複数のウェルを有し、
特定分子数の増幅可能な試薬を含む試薬組成物を前記複数のウェルに配した検査デバイスであって、
前記複数のウェルに配される前記増幅可能な試薬は、特定分子数を互いに異ならせてなる2以上の群を構成してなることを特徴とする検査デバイス。 - 前記増幅可能な試薬の特定分子数が異なる2以上の群は、前記増幅可能な試薬の特定分子数が0であるネガティブコントロール群と、前記増幅可能な試薬の特定分子数が検出限界付近である群と、を含む請求項1に記載の検査デバイス。
- 前記増幅可能な試薬の特定分子数が異なる2以上の群は、前記増幅可能な試薬の特定分子数が100以上であるポジティブコントロール群を更に含む請求項2に記載の検査デバイス。
- 前記増幅可能な試薬の特定分子数が、定量限界を超える分子数である請求項1から3のいずれかに記載の検査デバイス。
- 前記増幅可能な試薬の特定分子数の情報を識別可能な識別手段を有する請求項1から4のいずれかに記載の検査デバイス。
- 前記増幅可能な試薬が核酸である請求項1から5のいずれかに記載の検査デバイス。
- 前記核酸が細胞の核中の核酸に組み込まれた請求項6に記載の検査デバイス。
- 前記細胞が酵母である請求項7に記載の検査デバイス。
- 前記試薬組成物がプライマー及び増幅試薬の少なくともいずれかを有する請求項1から8のいずれかに記載の検査デバイス。
- 検査対象を検査する検査装置の性能を評価する検査装置の性能評価プログラムであって、請求項1から9のいずれかに記載の検査デバイスを用い、前記検査デバイスにおけるCt値の情報を取得し、
前記Ct値の情報に基づき前記検査装置の性能を評価する
処理をコンピュータに実行させることを特徴とする検査装置の性能評価プログラム。 - 検査対象を検査する検査装置の性能を評価する検査装置の性能評価方法であって、
請求項1から9のいずれかに記載の検査デバイスを用い、前記検査デバイスにおけるCt値の情報を取得するCt値情報取得工程と、
前記Ct値の情報に基づき前記検査装置の性能を評価する性能評価工程と、
を含むことを特徴とする検査装置の性能評価方法。 - 検査対象を検査する検査装置の性能を評価する検査装置の性能評価装置であって、
請求項1から9のいずれかに記載の検査デバイスを用い、前記検査デバイスにおけるCt値の情報を取得するCt値情報取得部と、
前記Ct値の情報に基づき前記検査装置の性能を評価する性能評価部と、
を有することを特徴とする検査装置の性能評価装置。
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