JP2003334078A

JP2003334078A - 核酸の測定方法に用いる核酸プローブおよびデータを解析する方法

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Publication number: JP2003334078A
Application number: JP2003081379A
Authority: JP
Inventors: Ryuichiro Kurane; 隆一郎倉根; Takahiro Kanekawa; 貴博金川; Yoichi Kamagata; 洋一鎌形; Shinya Kurata; 信也蔵田; Kazutaka Yamada; 一隆山田; Toyoichi Yokomaku; 豊一横幕; Osamu Koyama; 修小山; Kenta Kosho; 健太古庄
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Kankyo Engineering Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Kankyo Engineering Co Ltd
Priority date: 1999-04-20
Filing date: 2003-03-24
Publication date: 2003-11-25
Anticipated expiration: 2020-04-20
Also published as: JP3985959B2

Abstract

(57)【要約】【課題】蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる
核酸測定法、該法を利用するリアルタイム定量的ＰＣＲ
法、及び該リアルタイム定量的ＰＣＲ法により得られる
データを解析する方法において、短時間かつ正確に目的
が達成できる方法を提供する。【解決手段】蛍光色素で標識された核酸プローブを標
的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼ
ーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定す
る核酸の新規測定法、該法を用いたリアルタイム定量的
ＰＣＲ法、及び該ＰＣＲ法で得られるデーターの解析の
際、アニーリング反応時の蛍光強度値を、変性反応時の
もので補正する過程を有するデータ解析法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸の測定方法、
それに用いる核酸プローブ及びその方法によって得られ
るデータを解析する方法に関する。詳しくは蛍光色素で
標識された核酸プローブを用いる各種核酸の各種測定方
法に関し、蛍光色素で標識された核酸プローブを標的核
酸にハイブリダイゼーションさせたときに生ずる、ハイ
ブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少
量を測定するという原理に基づく各種核酸の各種新規測
定方法、それに用いる核酸プローブ及びデバイス（ｄｅ
ｖｉｃｅｓ）、それら測定方法の一つであるＰＣＲ方法
によって得られるデータを解析する方法、解析装置、解
析方法の各手段をプログラムとして記録したコンピュー
タ読み取り可能な記録媒体に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、蛍光色素で標識された核酸プロー
ブを用いて核酸量を測定する各種方法が知られている。
該方法には、以下のようなものがある。（１）ドットブロッテング法この方法は、標的核酸と当該核酸プローブをメンブラン
上でハイブリダイゼーションさせた後、未反応の核酸プ
ローブを洗い流し、標的核酸とハイブリダイゼーション
した核酸プローブに標識された蛍光色素分子のみの蛍光
強度を測定するものである。

【０００３】（２）インターカレーター方法(Glazer et
al., Nature 359:959,1992）：この方法は、インター
カレーターと称されるある種の蛍光色素が核酸の二重鎖
内にはまりこんだときに、強く発光するのでその発光の
増加量を測定する方法である。その蛍光色素として、例
えば、エチジウムブロマイド（実験医学、１５巻、７
号、４６〜５１ページ、１９９７年、羊土社）、SYBR R
グリーン(Green) I(LightCycler^TM System；１９９９
年４月５日、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社
発行のパンフレット）を挙げることができる。

【０００４】（３）FRET(fluorescence energy transfe
r)を利用する方法（Mergney et al.,Nucleic Acid Re
s., 22: 920-928,1994.):この方法は、標的核酸にハイ
ブリダイズする二つの核酸プローブからなる。二つの核
酸プローブは、各々異なった蛍光色素で標識されてい
る。二つのプローブの内の一方は、ＦＲＥＴ現象を通し
て、エネルギーを他方のプローブの蛍光色素に送りこれ
を発光させることができる蛍光色素で標識されている。
二つのプローブは、蛍光色素が向き合うように、かつ１
〜９塩基離れてハイブリダイズするように設計されてい
る。それで、二つの核酸プローブが標的核酸にハイブリ
ダイズすると蛍光色素の発光が起こり、発光の程度が標
的核酸の複製量に比例する。

【０００５】（４）分子ビーコン方法（Tyagi et al.,
Nature Biotech.,14:303-308,1996.) この方法で使用する核酸プローブは、核酸プローブの一
端にレポーター色素、他端にクエンチャー色素が標識さ
ている。そしてその両端部は塩基配列において互いに相
補性があるので、プローブ全体としてhairpin stemを形
成するように塩基配列が設計されている。その構造のた
めに液中に浮遊している状態では、Forster共鳴エネル
ギーのため、レポーター色素の発光は、クエンチャー色
素により抑制されている。しかし、標的核酸にハイブリ
ダイゼーションするとhairpin stem構造が壊れるため
に、レポーター色素とクエンチャー色素の距離が大きく
なるので、Forster共鳴エネルギーの移動が起こらなく
なる。そのために、レポーター色素の発光が起こるよう
になる。

【０００６】（５）デービスの方法（Davis et al.、Nu
cleic acids Res.24: 702-706、1996)デービスは、オリ
ゴヌクレオチドの３’末端に蛍光色素を、炭素原子１８
個を有するスペサーを介して結合したプローブを作成し
た。これをフローサイトメトリーに適用した。３’末端
に蛍光色素を直接に結合した場合より、ハイブリダイゼ
ーションした場合、１０倍の蛍光強度が得られることを
報告した。これらの方法は、核酸の各種測定方法、ＨＩ
ＳＨ方法（fluorescent in situhybridization assay
s)、ＰＣＲ方法、ＬＣＲ方法（ligase chain reactio
n)、SD方法( strand displacement assays)、競合的ハ
イブリダイゼーション方法(competitive hybridizatio
n)などに適用されてめざましい発展をとげている。

【０００７】これらの方法は、現在一般的に使用されい
るが、蛍光色素で標識した核酸プローブと標的核酸のハ
イブリダイゼーション反応を行った後、ハイブリダイゼ
ーションしなかった当該核酸プローブを反応系から洗い
流す必要があるという好ましくない手順を有している。
このような手順を除くと測定時間の短縮、測定の簡便
性、測定の正確性をもたらすことは明らかである。そこ
で、このような手順を有さない核酸測定方法の開発が望
まれていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、前記
の状況に鑑み、蛍光色素で標識された核酸プローブを用
いる核酸測定方法において、より短時間に、より簡便、
より正確に目的の核酸量を測定できる方法を提供するこ
とである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するにあたり、核酸プローブを用いた核酸測定方
法について検討を重ねた。その結果、蛍光色素で標識さ
れた核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーション
したときに、蛍光色素の発光が減少するという現象（蛍
光消光現象）があり、特定の色素においてはその減少が
顕著であり、かつその減少の程度は、蛍光色素が結合し
た部分の塩基の種類又は塩基配列に依存するということ
を発見した。本発明はかかる発見に基づいて完成された
ものである。

【００１０】即ち、本発明は、１）蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測
定方法において、上記核酸プローブが標的核酸にハイブ
リダイゼーションしたときに、蛍光色素が、その発光を
減少させる核酸プローブであり、上記核酸プローブを標
的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼ
ーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定す
ることを特徴とする核酸の測定方法、また、２）蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハ
イブリダイゼーションしたときに、上記蛍光色素が、そ
の発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、当該プ
ローブは、その末端部において蛍光色素で標識されてお
り、当該核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーシ
ョンしたとき、当該末端部において、当該プローブと標
的核酸とがハイブリダイゼーションした末端塩基から１
ないし３塩基離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グアニ
ン）が少なくとも１塩基以上存在するように、当該プロ
ーブの塩基配列が設計されていることを特徴とする核酸
測定用核酸プローブ、または、蛍光色素で標識された
核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションした
ときに、上記蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プ
ローブであり、かつ、当該プローブは、その末端部にお
いて蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが、
標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端
部分においてハイブリダイゼーションの塩基対がＧ（グ
アニン）とＣ（シトシン）のペアーを少なくも一対以上
形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されて
いることを特徴とする核酸測定用核酸プローブ、また、
それらのプローブを用いる核酸測定方法、また、

【００１１】３）標的核酸若しくは遺伝子の多型（poly
morphism）または／および変異（mutation）を解析若し
くは測定する方法において、前記２）に記載の核酸プロ
ーブを標的核酸若しくは遺伝子にハイブリダイゼーショ
ンさせ、蛍光強度の変化量を測定することを特徴とする
標的核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異を解
析若しくは測定する方法、また、４）標的核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異
を解析若しくは測定する測定キットにおいて、前記２）
に記載の核酸プローブを含有することを特徴とする標的
核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異を解析若
しくは測定する測定キット、また、

【００１２】５）前記３）に記載の方法により得られる
データを解析する方法において、標的核酸若しくは遺伝
子が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイ
ズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダ
イズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正処
理する過程を有することを特徴とする標的核酸若しくは
遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定す
る方法のためのデータ解析方法、また、

【００１３】６）標的核酸若しくは遺伝子の多型または
／および変異を解析若しくは測定する測定装置におい
て、前記５）に記載のデータ解析方法を実施するための
手段を有することを特徴とする標的核酸若しくは遺伝子
の多型または／および変異を解析若しくは測定する測定
装置、また、７）前記５）に記載の補正処理過程をコンピュータに実
行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読取
可能な記録媒体、また、

【００１４】８）前記１）、２）に記載の核酸プローブ
を固体表面に結合せしめたプローブを用いる核酸測定方
法、及び該方法の核酸測定用デバイス、また、９）前記１）、２）、８）に記載の核酸測定方法を用い
るＨＩＳＨ（fluorescent in situ hybridization assa
ys）方法、また、

【００１５】１０）前記１）、２）、９）に記載の核酸
測定方法によって得られるデータの解析方法、また、１１）前記１）、２）に記載の核酸測定方法を用いるＰ
ＣＲ方法、また、１２）前記１１）に記載のＰＣＲ方法によって得られる
データ解析方法、また、１３）前記１１）に記載のＰＣＲ方法を用いる核酸の融
解曲線解析方法、また、１４）前記１２）と１３）を融合させた解析方法、ま
た、１５）前記１１）、１２）、１３）又は１４）に記載の
解析方法により解析する手段を有するＰＣＲの測定及び
／又は解析装置、また、

【００１６】１６）前記１１）、１２）、１３）又は１
４）に記載の解析方法により解析する手順をプログラム
として記録したコンピュータ読取可能な記録媒体、ま
た、１７）前記１２）、又は１４）に記載のデータ解析方法
を利用することを特徴とする核酸の定量方法、また、１８）前記１５）に記載のＰＣＲの測定及び／又は解析
装置を用いる核酸の測定方法、また、１９）前記１６）に記載の記録媒体を用いることを特徴
とする核酸の測定方法、を提供する。

【００１７】

【発明の実施の形態】次に好ましい実施の形態を挙げて
本発明を更に詳細に説明する。本発明において、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＸＴＰ
ｓ、ｄＸＴＰｓ、ＮＴＰｓ、ｄＮＴＰｓ、核酸プロー
ブ、ヘルパー核酸プローブ（又は核酸ヘルパープロー
ブ、又は単にヘルパープローブ）、ハイブリダイズ、ハ
イブリダイゼーション、インターカレーター、プライマ
ー、アニーリング、伸長反応、熱変性反応、核酸融解曲
線、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−primed ＰＣＲ、S
tretch ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、Ａｌｕ配列を利用したＰＣ
Ｒ、多重ＰＣＲ、混合プライマーを用いたＰＣＲ、ＰＮ
Ａを用いたＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション方法（hy
bridization assays)、ＨＩＳＨ(fluorescent in situ
hybridization assays)方法、ＰＣＲ方法(polymerase c
hain assays ）、ＬＣＲ方法（ligase chain reactio
n)、ＳＤ方法(strand displacement assays)、競合的
ハイブリダイゼーション方法( competitive hybridizat
ion)、ＤＮＡチップ、核酸検出用（遺伝子検出用）デバ
イス，ＳＮＰ（スニップ：一塩基置換多型）、複合微生
物系等の用語は、現在、分子生物学、遺伝子工学、微生
物工学等で一般的に使用されている用語と同じ意味であ
る。本発明の第一の特徴は、蛍光色素で標識された核酸
プローブを用いる標的核酸の測定方法において、当該核
酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたと
きに生ずる、ハイブリダイゼーション前後における蛍光
色素の発光の減少量を測定することにある。

【００１８】本発明において標的核酸の測定とは、定量
若しくは定量的検出、または単なる検出のことを云う。
蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測定方
法とは、ハイブリダイゼーション方法(hybridization a
ssays)、ＨＩＳＨ方法(fluorescent in situhybridiza
tion assays)、ＰＣＲ方法(polymerase chain assay
s）、ＬＣＲ方法(ligase chain reaction)、SD方法(str
and displacement assays)、競合的ハイブリダイゼー
ション方法(competitive hybridization)などのことを
いう。これらの方法では、蛍光色素で標識された核酸プ
ローブを加えた後、標的核酸にハイブリダイゼーション
しなかった未反応の当該核酸プローブの蛍光色素を測定
系から洗浄等の方法で除去し、標的核酸にハイブリダイ
ゼーションした当該核酸プローブに標識された蛍光色素
を当該プローブから直接的に、又は当該プローブに間接
的な手段を施して（例えば、酵素を作用させたりし
て）、発光させて、その発光量を測定する方法である。
本発明はこのような複雑な操作をしないで目的核酸を測
定することに特徴がある。

【００１９】本発明において標的核酸とは、定量若しく
は定量的検出、または単なる検出を目的とする核酸のこ
とを云う。精製の有無を問わない。また、濃度の大小も
問わない。各種の核酸が混在していてもよい。例えば、
複合微生物系（複数微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮ
Ａの混在系）又は共生微生物系（複数の動植物及び／又
は複数の微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在
系）における定量若しくは定量的検出、または単なる検
出を目的とする特定核酸である。尚、標的核酸の精製が
必要な場合は従来公知の方法で行うことができる。例え
ば、市販されている精製キット等を使用して行うことが
できる。上記の核酸の具体例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、
ＰＮＡ、２−Ｏ−メチル（Ｍｅ）ＲＮＡ、デオキシリボ
オリゴヌクレオチド（deoxyribo-oligonucleotides)、
リボキシオリゴヌクレオチド(riboxy-origonucleotide
s）等を挙げることができる。

【００２０】本発明において蛍光色素は、一般に核酸プ
ローブに標識して、核酸の測定・検出に用いられるもの
が便利に使用できるが、蛍光色素で標識された核酸プロ
ーブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、
プローブに標識した当該蛍光色素が、その発光を減少さ
せるものが好適に用いられる。例えば、フルオレセイン
（fluorescein）又はその誘導体類｛例えば、フルオレ
セインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyana
te）（FITC）若しくはその誘導体等、Alexa 488、Alexa
532、cy3、cy5、EDANS（5-(2'-aminoethyl)amino-1-na
phthalene sulfonic acid）｝、ローダミン（rhodamin
e）6G（R6G）又はその誘導体（例えば、テトラメチルロ
ーダミン（teramethylrhodamine）（TMR）、テトラメチ
ルローダミンイソチオシアネート（tetramethylrhodami
ne isothiocyanate)(TMRITC)、ｘ−ローダミン（x-rhod
amine)、テキサスレッド(Texas red)、ボデピー(BODIP
Y)FL(商標名;モレキュラー・プローブ(Molecular Probe
s)社製、米国）、ボデピー(BODIPY)FL/C3（商標名；モ
レキュラー・プローブ（Molecular Probes)社製、米
国）、ボデピー(BODIPY)FL/C6（商標名；モレキュラー
・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピ
ー(BODIPY)5-FAM（商標名；モレキュラー・プローブ（M
olecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）T
MR（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Prob
es）社製、米国）、又はその誘導体（例えば、ボデピー
（BODIPY）TR（商標名；モレキュラー・プローブ（Mole
cular Probes）社製、米国）、デピー（BODIPY）R6G
（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probe
s）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）564（商標名；モ
レキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米
国）、デピー（BODIPY）581（商標名；モレキュラー・
プローブ（Molecular Probes）社製、米国）等を挙げる
ことができる。これらの中でも、FITC、EDANS、6-joe、
TMR、Alexa 488、Alexa 532、ボデピー（BODIPY） FL/C
3（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probe
s）社製、米国）、ボデピー（BODIPY） FL/C6（商標
名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社
製、米国）等を好適なものとして、また、FITC、TMR、6
-jeo、ボデピー（BODIPY） FL/C3（商標名；モレキュラ
ー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデ
ピー（BODIPY） FL/C6（商標名；モレキュラー・プロー
ブ（Molecular Probes）社製、米国）をより好適なもの
として挙げることができる。

【００２１】標的核酸にハイブリダイゼーションさせる
核酸プローブは、オリゴデオキシリボヌクレオチドで構
成されていてもよいし、オリゴリボヌクレオチドで構成
されていてもよい。また、それらの双方が介在している
キメリックオリゴヌクレオチド（chemiric oligonucleo
dite）でもよい。また、２−ｏ−メチルオリゴリボヌク
レオチド(2'-o-Methyl oligoribonucleotideｓ）（olig
oribonucleotideの５’末端のヌククレオサイド(nucleo
side）部がシチジンで、そのシチジンの２’位のＯＨ基
がメチル（methyl)基で修飾されているもの）を使用し
てもよい。又はＲＮＡとの親和性を高めるために、当該
２’−ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドをオリゴデオ
キシヌクレオチド（oligodeoxynuclueotide）の中に介
在させていてもよい。

【００２２】尚、２’−ｏ−メチルオリゴリボヌクレオ
チドのような修飾されたＲＮＡをオリゴデオキシヌクレ
オチドの中に介在させた核酸プローブは主にＲＮＡの測
定に用いるものである。当該プローブを使用してＲＮＡ
を測定する場合、試料であるＲＮＡ溶液を、当該プロー
ブとハイブリダイゼーションさせる前に、８０〜１００
℃、好ましくは９０〜１００℃、最適には９３〜９７℃
で、１〜１５分間、好ましくは２〜１０分間、最適には
３〜７分間加熱処理してＲＮＡの高次構造を破壊するこ
とが好適である。また、当該核酸プローブの塩基鎖が３
５塩基以下の場合、配列領域へのハイブリダイゼーショ
ン効率を上げるためにヘルパープローブ、例えば、(5')
AGGCCGGCCCTTGACTTTCC T(3')なる塩基配列のオリヌクレ
オチドを反応溶液に添加することが好適である。この場
合、ヘルパープローブはオリゴデオキシヌクレオチド体
でも、また、２−ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド体
でもよい。ただし、３５塩基鎖を超える核酸プローブを
使用する場合は、標的のＲＮＡを熱変性するだけでよ
い。このような本発明の核酸プローブをＲＮＡにハイブ
リダイゼーションさせると、反応液中のＲＮＡの量に応
じて蛍光強度が減少し、最終ＲＮＡ濃度が約１５０ｐＭ
までＲＮＡを測定できる。

【００２３】核酸プローブを用いる従来のハイブリダイ
ゼーション方法によるＲＮＡの測定において、核酸プロ
ーブとしてオリゴデオキシヌクレオチド体又はオリゴリ
ボヌクレオチド体が用いられてきた。ＲＮＡはそれ自体
が強固な高次構造をとるため、プローブと標的ＲＮＡと
のハイブリダイゼーション効率が悪く、定量性に乏しか
った。そのために、ＲＮＡを変性させた後、メンブラン
に固定してからハイブリダイゼーション反応を行うとい
う繁雑性を従来方法は有していた。これに対して、前記
の本発明方法は、ＲＮＡの特定構造部と高い親和性を有
するリボース部修飾核酸プローブを用いているので、従
来方法に較べて高い温度でハイブリダイゼーション反応
を行うことができる。それで、ＲＮＡの高次構造の前記
悪影響は、前処理としての加熱変性処理、ヘルパープロ
ーブの併用だけで克服可能である。これにより本発明方
法においてハイブリダイゼーション効率は実質的に１０
０％になり、定量性が向上する。また、従来方法に較べ
て格段に簡便になる。

【００２４】本発明のプローブの塩基数は５〜５０であ
り、好ましくは１０〜２５、特に好ましくは１５〜２０
である。５０を超える場合は、ＨＩＳＨ方法に用いたと
き細胞膜の透過性が悪くなり、本発明の適用範囲を狭め
ることになる。５未満の場合は、非特異的ハイブリダイ
ゼーションが惹起し易くなり、測定誤差が大きくなる。

【００２５】そのプローブの塩基配列は、標的核酸に特
異的にハイブリダイゼーションするものであればよく、
特に限定されない。好ましくは、蛍光色素で標識された
核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションした
とき、（１）当該プローブにハイブリダイゼーションし
た標的核酸の末端塩基部から１ないし３塩基離れて、標
的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）がすくなとも１塩基
以上存在するように、当該プローブの塩基配列が設計さ
れいる塩基配列、（２）プローブの末端部分においてプ
ローブ−核酸ハイブリッド複合体の塩基対がＧ（グアニ
ン）とＣ（シトシン）のペアーを少なくとも一対以上形
成するように、当該プローブの塩基配列が設計されてい
る塩基配列、が好ましい。

【００２６】本発明における核酸プローブのオリゴヌク
レオチドは、通常の一般的オリゴヌクレオチドの製造方
法で製造できる。例えば、化学合成法、プラスミドベク
ター、ファージベクター等を使用する微生物法等で製造
できる（Tetrahedron letters、 22巻、 1859〜1862
頁、 1981年; Nucleic acids Research、 14巻、6227〜
6245頁、1986年）。尚、現在、市販されている核酸合成
機を使用するのが好適である（例えば、ABI394(Perkin
Elmer社製、USA)）。

【００２７】オリゴヌクレオチドに蛍光色素を標識する
には、従来公知の標識法のうちの所望のものを利用する
ことができる（Nature Biotechnology、 14巻、 303〜3
08頁、 1996年; Applied and Environmental Microbiol
ogy、 63巻、 1143〜 1147頁、 1997年; Nucleic acids
Research、 24巻、 4532〜4535頁、 1996年）。例え
ば、５´末端に蛍光色素分子を結合させる場合は、先
ず、常法に従って５´末端のリン酸基にスペーサーとし
て、例えば、-(CH₂)_n-SHを導入する。これらの導入体は
市販されているので市販品を購入してもよい（メドラン
ド・サーテイファイド・レージント・カンパニー（Midl
and Certified Reagent Company））。この場合、ｎは
３〜８、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基
反応性を有する蛍光色素又はその誘導体を結合させるこ
とにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。こ
のようにして合成された蛍光色素で標識されたオリゴヌ
クレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製し
て本発明で使用する核酸プローブとすることができる。

【００２８】また、オリゴヌクレオチドの３’末端に蛍
光色素を結合させることもできる。この場合は、リボー
ス又はデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基にスペーサ
ーとして、例えば、-(CH₂)_n-NH₂を導入する。これらの
導入体も前記と同様にして市販されているので市販品を
購入してもよい（メドランド・サーテイファイフド・レ
ージント・カンパニー（Midland Certified Reagent Co
mpany））。また、リン酸基を導入して、リン酸基のＯ
Ｈ基にスペサーとして、例えば、-(CH₂)_n-SHを導入す
る。これらの場合、ｎは３〜８、好ましくは４〜７であ
る。このスペーサーにアミノ基、ＳＨ基に反応性を有す
る蛍光色素又はその誘導体を結合させることにより標識
したオリゴヌクレオチドを合成できる。このようにして
合成された蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド
は、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明で
使用する核酸プローブとすることができる。このアミノ
基を導入する場合、キット試薬（例えば、Uni-link am
inomodifier（CLONTECH社製、米国）、フルオ・リポタ
ーキット（FluoReporter Kits) F-6082、 F-6083、 F-6
084、 F-10220（いずれもモレクキュラー・プローベ（M
olecular Probes）社製、米国））を用いるのが便利で
ある。そして、常法に従って当該オリゴリボヌクレオチ
ドに蛍光色素分子を結合させることができる。また、プ
ローブ核酸の鎖内に蛍光色素分子を導入することも可能
である（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 225, 32-38頁（1998
年））。以上のようにして本発明の核酸プローブが調製
できるが、好ましいプローブの形態は、３’又は５’末
端が蛍光色素が標識されたものであり、その標識されて
いる末端の塩基がＧ又はＣであるものである。５’末端
が標識され、３’末端が標識されていない場合、３’末
端のリボース又はデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基
をリン酸基等、また３’末端のリボースの２’位ＣのＯ
Ｈ基をリン酸基等で修飾してもよく何ら制限されない。

【００２９】本発明の核酸プローブは、単に核酸測定だ
けでなく、標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphi
sm）または／および変異（mutation）を解析若しくは測
定する方法に好適に利用できる。特に下記に述べるＤＮ
Ａチップと併用することによりより便利な方法を提供す
る。すなわち、本発明の核酸プローブと標的核酸若しく
は遺伝子とのハイブリダイゼーションにおいて、ＧＣペ
アーを形成するかどうかにより、蛍光強度が変化する。
それで、本発明の核酸プローブを標的核酸若しくは遺伝
子にハイブリダイゼーションさせ、発光強度を測定する
ことにより、標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorp
hism）または／および変異（mutation）を解析若しくは
測定することができる。具体的方法は、実施例に記し
た。この場合、標的核酸若しくは遺伝子は各種の核酸若
しくは遺伝子の増幅方法のうちの一つの方法により増幅
された増幅物でもよし、抽出されたものでもよい。また
標的核酸はその種類を問わない。本発明を適用しうる標
的核酸の例としてＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、人工修飾核
酸などを挙げることができる。ただ、鎖中または末端に
グアニン塩基が存在しておればよい。鎖中または末端に
グアニン塩基が存在しないと蛍光強度が減少しない。よ
って、本発明方法により、Ｇ→Ａ、Ｇ←Ａ、Ｃ→Ｔ、Ｃ
←Ｔ、Ｇ→Ｃ、Ｇ←Ｃの変異、または置換、すなわち、
１塩基多型（single nucleotide polymorphism (SNP)）
などの多型（polymorphism analysis）等を解析若しく
は測定することができる。なお、現在、多型分析は、マ
キサム・ギルバート（Maxam-Gilbert)法、ジデオキシ
（dideoxy）法を用いて核酸若しくは遺伝子の塩基配列
を決定することにより行われているのが現状である。

【００３０】それで、本発明の核酸プローブを標的核酸
または／および遺伝子の多型（polymorphism）及び変異
（mutation）を解析若しくは測定する測定キットに含有
させることにより、標的核酸若しくは遺伝子の多型（po
lymorphism）または／および変異（mutation）を解析若
しくは測定する測定キットとして好適に使用することが
できる。

【００３１】本発明の標的遺伝子の多型（polymorphis
m）または／および変異（mutation）を解析若しくは測
定する方法により得られるデータを解析する場合に、標
的核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリ
ダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のものが
ハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値に
より補正する処理過程を設けると、処理されたデータは
信頼性の高いものになる。それで本発明は、標的核酸若
しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変
異（mutation)を解析若しくは測定する方法のためのデ
ータ解析方法を提供する。

【００３２】また、本発明の特徴は、標的核酸若しくは
遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mu
tation）を解析若しくは測定する測定装置において、標
的核酸若しくは遺伝子が蛍光色素で標識された核酸プロ
ーブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値
を、前記のものがハイブリダイズしていないときの反応
系の蛍光強度値により補正する処理手段を有することを
特徴とする標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphi
sm）または／および変異（mutation）を解析若しくは測
定する測定装置である。

【００３３】また、本発明の特徴は、標的核酸若しくは
遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mu
tation）を解析若しくは測定する方法により得られるデ
ータを解析する場合に、標的核酸若しくは遺伝子が蛍光
色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたと
きの反応系の蛍光強度値を、前記のものがハイブリダイ
ズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正する
処理過程をコンピュータに実行させるためのプログラム
を記録したコンピュータ読取可能な記録媒体である。

【００３４】本発明のプローブは固体（支持層）表面、
例えばスライドガラスの表面に固定されていてもよい。
この場合、蛍光色素で標識されていない端が固定されて
いるのが好ましい。この形式は現在ＤＮＡチップと言わ
れる。遺伝子発現（gene expression）のモニタリン
グ、塩基配列（base sequence）の決定，変異解析（mu
tation analysis），１塩基多型（single nucleotide p
olymorphism (SNP)）などの多型解析（polymorphism an
alysis）等に使用できる。勿論、核酸測定用デバイス
（チップ）として使用することができる。

【００３５】本発明のプローブを例えばスライドガラス
の表面に結合させるには、ポリリジン、ポリエチレンイ
ミン、ポリアルキルアミンなどのポリ陽イオンをコート
したスライドガラス、アルデヒド基を導入したスライド
ガラス、アミノ基を導入したスライドガラスを先ず用意
する。そして、i)ポリ陽イオンをコートしたスライドガ
ラスには、プローブのリン酸基を反応させる、ii)アル
デヒド基を導入したスライドガラスには、アミノ基を導
入したプローブを反応させる、iii)アミノ基を導入した
スライドガラスには、ＰＤＣ（pyridinium dichromat
e）導入、アミノ基又はアルデヒド基導入したプローブ
を反応させる、などにより達成できる(Fodor,P.A.,et a
l.,Science,251,767-773(1991); Schena,M.,et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,93,10614-10619(1996);McGa
l,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,93,13555-13
560(1996);Blanchad,A.P.,et al.,Biosens.Bioelectro
n.,11,687-690(1996))。

【００３６】核酸プローブを固体表面にアレー状に配
列、結合させたデバイスは核酸測定用がより便利にな
る。この場合、塩基配列の異なる多くの本発明のプロー
ブを、個別に同一固体表面上に結合していデバイスをつ
くることにより、同時に多種遺伝子を検出定量できる。
このデバイスにおいては、プローブ毎に、前記固体のプ
ローブを結合したと反対側の面に少なくとも一つの温度
センサーとヒーターが設け、そのプローブを結合した前
記固体の領域が最適温度条件になるように温度調節され
得るように設計されているのが好適である。

【００３７】このデバイスにおいては、本発明のプロー
ブ以外のプローブ、例えば、一つの分子内に二つの異な
った蛍光色素を有し、標的核酸にハイブリダイゼーショ
ンしていないときは、二つの蛍光色素の相互作用によ
り、消光若しくは発光しているが、標的核酸にハイブリ
ダイゼーションすると蛍光若しくは消光するように設計
された構造をもつ核酸プローブ、即ち、前記の分子ビー
コン(Tyagi et al., Nature Biotech.,14:303-308,199
6)等を結合したものも好適に使用できる。それで、この
ようなデバイスも本発明の技術的範囲内に含まれる。

【００３８】本発明のデバイスを用いる測定方法の基本
的操作は、核酸プローブを結合した固体表面上にｍＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ等の標的核酸を含む溶液をの
せ、ハイブリダイゼーションさせるだけである。これに
より、標的核酸量に応じて蛍光量の変化がおこり、その
蛍光変化量から標的核酸の検出定量が可能となる。ま
た、一つの固体表面上に塩基配列の異なる核酸プローブ
を多数種結合させることにより、一度に多くの核酸を検
出定量することができる。それで、ＤＮＡチップと全く
同じ用途で使用できるので新規のＤＮＡチップである。
最適の反応条件では標的核酸以外の核酸は蛍光の発光量
を変化させないために、未反応な核酸を洗浄する操作は
必要がない。更に、微小ヒーターにて核酸プローブの種
類毎に温度コントロールすることにより、当該プローブ
毎に最適反応条件にコントロールできるために正確な定
量が可能となる。また、微小ヒーターにて温度を連続的
に変化させ、その間、蛍光量を測定することにより、核
酸プローブと標的核酸との解離曲線を解析することがで
きる。その解離曲線の違いからハイブリダイゼーション
した核酸の性質の判定や、ＳＮＰの検出ができる。

【００３９】従来の標的核酸測定用デバイスは、蛍光色
素で修飾されていない核酸プローブを固体表面に結合
（固定：fix）し、それに蛍光色素で標識した標的核酸
をハイブリダイゼーションさせた後、ハイブリダイゼー
ションしていない標的核酸を洗い流して、残存している
蛍光色素の蛍光強度を測定していた。蛍光色素で標的核
酸を標識するには、例えば、特定ｍＲＮＡを標的とした
場合、次のstepsを取る：（１）細胞から抽出されたｍ
ＲＮＡ全部を抽出する。（２）それから、逆転写酵素
（reverse transcriptase）を用いて、蛍光色素で修飾
されヌクレオサイドをとり込ませながらｃＤＮＡを合成
する。本発明ではこのような操作は必要がない。

【００４０】当該デバイスには各種のプローブが多数ス
ポットしてあるが、その各々のプローブにハイブリダイ
ゼーションする核酸の最適ハイブリダイゼーション条
件、例えば、温度等は各々異なる。よって本来であれ
ば、プローブ毎（スポット毎）に、ハイブリダイゼーシ
ョン反応、洗浄操作を最適な条件で行う必要がある。し
かし、それは物理的に不可能であるので、すべてのプロ
ーブ毎に同一の温度でハイブリダイゼーションを行い、
また、洗浄も同一温度で同一洗浄液で行われている。そ
れで、ハイブリダイゼーションが期待されている核酸が
ハイブリダイゼーションしなかったり、ハイブリダイゼ
ーションしてもハイブリダイゼーションが強固でないの
で容易に洗い流されてしまう等の欠点を有していた。そ
のような原因で核酸の定量性が低いものであった。本発
明ではこの洗浄操作が必要がないのでこのような欠点を
有しない。また、スポットの底に微小ヒータを設け、ハ
イブリダイゼーション温度をコントロールすることで、
プローブ毎に最適温度でハイブリダイゼーション反応を
行わせることができる。それで、本発明は定量性が格段
に向上したものである。

【００４１】本発明においては、前記した核酸プローブ
又はデバイスを使用することで、標的核酸を短時間で、
簡便かつ特異的に測定することができる。以下に測定法
を述べる。本発明の測定方法において、先ず、測定系に
前記の核酸プローブを添加し、標的核酸にハイブリダイ
ゼーションさせる。その方法は、通常の既知方法で行な
うことができる（Analytical Biochemistry、 183巻、
231〜244頁、 1989年; Nature Biotechnology、 14巻、
303〜308頁、 1996年; Applied and Environmental Mi
crobiology、 63巻、 1143-1147頁、 1997年）。例え
ば、ハイブリダイゼーションの条件は、塩濃度が０〜２
モル濃度、好ましくは０．１〜１．０モル濃度、ｐＨは
６〜８、好ましくは６．５〜７．５である。

【００４２】反応温度は、前記核酸プローブが標的核酸
の特異的部位にハイブリダイゼーションして得られるハ
イブリド複合物のＴｍ値±１０℃の範囲内であるのが好
ましい。このようにすることにより非特異的なハイブリ
ダイゼーションを防止することができる。Ｔｍ−１０℃
未満のときは、非特異的ハイブリダイゼーション起こ
り、Ｔｍ＋１０℃を越えるときは、ハイブリダイゼーシ
ョンが起こらない。尚、Ｔｍ値は本発明で用いる核酸プ
ローブを設計するのに必要な実験と同様にして求めるこ
とができる。すなわち、当該核酸プローブとハイブリダ
イゼーションする相補塩基配列のオリゴヌクレオチドを
前記の核酸合成機等で化学合成し、当該核酸プローブと
のハイブリダイゼーション物のＴｍ値を通常の方法で測
定する。

【００４３】また、その反応時間は１秒間〜１８０分
間、好ましくは５秒間〜９０分間である。１秒間未満の
ときは、ハイブリダイゼーションにおいて未反応の本発
明の核酸プローブが多くなる。また、反応時間を余り長
くしても特に意味がない。なお、反応時間は核酸種、す
なわち、核酸の長さ、あるいは塩基配列によって大きく
影響を受ける。前記のようにして、本発明において核酸
プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせる。
そして、ハイブリダイゼーションの前後で、蛍光色素の
発光量を蛍光光度計で測定し、発光の減少量を計算す
る。その減少量の大きさは標的核酸量と比例するので、
標的核酸の量を求めることができる。

【００４４】反応液中の標的核酸の濃度：０．１〜１
０．０ｎＭであるのが好ましい。反応液中のプローブの
濃度：１．０〜２５．０ｎＭであるが好ましい。検量線
を作成する場合は、標的核酸に対して、プローブを１．
０〜２．５の比率で用いるのが望ましい。

【００４５】実際、試料中の未知濃度の標的核酸を測定
する場合、上記の条件で先ず、検量線を作成する。そし
て、複数の濃度のプローブを添加して、蛍光強度値の減
少を測定する。そして、測定された蛍光強度の減少値を
最大にするプローブ濃度を好ましいプローブ濃度とす
る。好ましい濃度のプローブで測定された蛍光強度の減
少値もって、検量線から標的核酸の定量値を求めること
になる。

【００４６】本発明の核酸測定法の原理は、前記のごと
くであるが、各種の核酸測定方法、例えば、ＦＩＳＨ方
法、ＰＣＲ方法、ＬＣＲ方法、ＳＤ方法, 競合的ハイブ
リダイゼーション方法、ＴＡＳ方法、などに適用でき
る。

【００４７】以下にその例を記す。ａ）ＦＩＳＨ方法に適用した場合即ち、本発明は色々の種類の微生物若しくは他の動物や
植物が混在していて、相互に単離できない微生物系（複
合微生物系、共生微生物系）の細胞内若しくは細胞のホ
モジネート等の核酸測定に好適に適用できる。ここでい
う微生物とは一般的にいう微生物のことで、特に限定さ
れるものではない。例えば、真核微生物、原核微生物、
その他、マイコプラズマ、ウイルス、リッケチャ等を挙
げることができる。そして、特定配列を有する核酸と
は、これらの微生物系において、例えば、どのように活
躍しているのか調べたい菌株の細胞に特異性を有する塩
基配列をもつ核酸のことである。例えば、特定菌株の５
ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又
はそれらの遺伝子ＤＮＡの特定配列である。

【００４８】本発明において核酸プローブを複合微生物
系又は共生微生物系に添加し、特定菌株の５ＳｒＲＮ
Ａ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれら
の遺伝子ＤＮＡの量を測定することにより、当該系にお
ける特定菌株の存在量を測定することできる。尚、複合
微生物系又は共生微生物系のホモジネートに前記核酸プ
ローブを添加して、ハイブリダイゼーション前後におけ
る蛍光色素の発光の減少量を測定して特定菌株の存在量
を測定する方法も、本発明の技術的範囲内とする。

【００４９】前記の測定方法は、例えば、以下の如くで
ある。即ち、核酸プローブを添加する前に、複合微生物
系又は共生微生物系の温度、塩濃度、ｐＨを前記の条件
に調整する。複合微生物系又は共生微生物系における特
定菌株は、細胞数として１０ ⁷〜１０¹²個／ｍｌ、好ま
しくは１０⁹〜１０¹⁰個／ｍｌに調整することが好適で
ある。それは希釈、又は遠心分離等による濃縮等で行う
ことができる。細胞数が１０⁷個／ｍｌ未満のときは、
蛍光強度が弱く、測定誤差が大きくなる。１０¹²個／ｍ
ｌを超えるときは、複合微生物系又は共生微生物系の蛍
光強度が強すぎるため、特定微生物の存在量を定量的に
測定することができなくなる。

【００５０】添加する核酸プローブの濃度は、複合微生
物系又は共生微生物系における特定菌株の細胞数に依存
する。細胞数１×１０⁸／ｍｌに対して０．１〜１０．
０ｎＭ濃度、好ましくは０．５〜５ｎＭ濃度、より好ま
しくは１．０ｎＭ濃度である。０．１ｎＭ未満のとき
は、特定微生物の存在量を正確に反映したデータになら
ない。しかし、最適な核酸プローブの量は、細胞内の標
的核酸量に依存するために一概にはいえない。

【００５１】次に本発明において前記核酸プローブと特
定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３Ｓ
ｒＲＮＡ又はその遺伝子ＤＮＡにハイブリダイゼーショ
ンさせるときの反応温度は、前記した条件と同様であ
る。また、その反応の時間も前記の条件と同様である。
前記のような条件で核酸プローブを特定菌株の５ＳｒＲ
ＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれ
の遺伝子ＤＮＡにハイブリダイゼーションさせ、ハイブ
リダイゼーション前後の複合微生物系又は共生微生物系
の蛍光色素の発光の減少量を測定する。

【００５２】前記のようにして測定された蛍光色素の発
光の減少量は、複合微生物系又は共生微生物系における
特定菌株の存在量と比例する。それは５ＳｒＲＮＡ、１
６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝
子ＤＮＡの量と特定菌株の存在量とが比例するからであ
る。

【００５３】尚、本発明において、複合微生物系又は共
生微生物系における微生物以外の成分は、本発明の核酸
プローブと特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若
しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡとのハ
イブリダイゼーションを阻害しない限り、また、核酸プ
ローブの蛍光色素の発光を阻害をしない限り、特に限定
されない。例えば、KH₂PO₄、K₂HPO₄、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄
等のリン酸塩、硫安、硝安、尿素等の無機窒素類、マグ
ネシウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムイオン等
の金属イオンの各種塩類、マンガン、亜鉛、鉄、コバル
トイオン等の微量金属イオンの硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩
等の各種塩類、更にビタミン類等が適当に含まれていて
もよい。もし、上記の阻害が観察される場合は、遠心分
離等の操作で複数の微生物が混在する菌体系から菌体を
分離し、再び緩衝液系等に懸濁すればよい。

【００５４】上記の緩衝液としては、リン酸緩衝液、炭
酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、トリス・グリシン緩衝
液、クエン酸緩衝液、グット緩衝液等の各種緩衝液をも
用いることができる。緩衝液の濃度は、ハイブリダイゼ
ーション、ＦＲＥＴ現象、蛍光色素の発光を阻害しない
濃度である。その濃度は緩衝液の種類に依存する。緩衝
液のｐＨは４〜１２、好ましくは５〜９である。

【００５５】ｂ）ＰＣＲ methodsに適用する場合ＰＣＲ methodsであればどのような方法でも適用できる
のであるが、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法に適用する
場合を以下に記す。即ち、リアルタイム定量的ＰＣＲ方
法において、本発明の特定の核酸プローブを用いてＰＣ
Ｒを行い、反応前後の蛍光色素の発光の減少をリアルタ
イムで測定するものである。本発明のＰＣＲとは各種方
法のＰＣＲを意味するものである。例えば、ＲＴ−ＰＣ
Ｒ、ＲＮＡ−primed ＰＣＲ、Stretch ＰＣＲ、逆ＰＣ
Ｒ、Ａｌｕ配列を利用したＰＣＲ、多重ＰＣＲ、混合プ
ライマーを用いたＰＣＲ、ＰＮＡを用いたＰＣＲ法等を
も含む。また、定量的とは、本来の定量測定の他に、検
出程度の定量測定をも意味するものとする。

【００５６】前記のとおり、標的核酸とは、存在量を定
量若しくは定量的検出するまたは単に検出する核酸のこ
とを云う。精製の有無を問わない。また、濃度の大小も
問わない。各種の核酸が混在していてもよい。例えば、
複合微生物系（複数微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮ
Ａの混在系）又は共生微生物系（複数の動植物及び／又
は複数微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）
における増幅目的の特定核酸である。尚、標的核酸の精
製が必要な場合は従来公知の方法で行うことができる。
例えば、市販されている精製キット等を使用して行うこ
とができる。

【００５７】従来公知の定量的ＰＣＲ方法はｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ若しくはｄＵＴＰ、標的
核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、Ｔａｑポリメラーゼ、プラ
イマー、並びに蛍光色素で標識した核酸プローブ若しく
はインターカレーターを用いてＭｇイオンの存在下に、
温度を低温、高温を繰り返しつつ標的核酸を増幅し、増
幅過程の蛍光色素の発光の増加量をリアルタイムでモニ
タリングするものである（実験医学、１５巻、７号、４
６〜５１ページ、１９９７年、羊土社）。

【００５８】本発明の定量的ＰＣＲ方法は、本発明の核
酸プローブを用いて標的核酸を増幅させ、増幅過程にお
いて、蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴と
するものである。本発明の定量的ＰＣＲにおいて、好ま
しい本発明のプローブとしては、その塩基数は５〜５０
であり、好ましくは１０〜２５、特に好ましくは１５〜
２０で、ＰＣＲサイクル中に標的核酸の増幅産物とハイ
ブリダイゼーションするものであれば、どのようなもの
でもよい。また、フォワード（forward）型、リバース
（reverse）型のどちらに設計してもよい。

【００５９】例えば、以下のものを挙げることができ
る。（１）５’末端部、好ましくは５’末端が、本発明の実
施に有用な蛍光色素で標識され、標的核酸に当該末端部
においてハイブリダイゼーションしたとき、当該プロー
ブと標的核酸とがハイブリダイゼーションした５’末端
の塩基部分から１〜３塩基５’側に離れて、標的核酸の
塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在
するように、塩基配列が設計されている。（２）前記（１）のプローブの内、３’末端が蛍光色素
で標識されているプローブ。

【００６０】（３）前記（１）のプローブの内、３’末
端、例えば、３’末端のリボース若しくはデオキシリボ
ースの３’位ＣのＯＨ基がリン酸基等で修飾されている
もの、または、３’末端のリボースの２’位ＣのＯＨ基
がリン酸基等で修飾されているもの。（４）３’末端部、好ましくは３’末端が、本発明の蛍
光色素で標識され、３’末端の塩基がＧ又はＣであるも
の、または３’末端のリボースの２’位のＯＨ基がリン
酸基等で修飾されいるもの。（５）前記（１）のプローブのうち、５’末端部、好ま
しくは５’末端が、本発明の蛍光色素で標識されている
もの。（６）５’末端部、好ましくは５’末端が、本発明の実
施に有用な蛍光色素で標識され、５’末端の塩基がＧ又
はＣであるもの。

【００６１】前記（４）、（６）の場合、標的核酸の塩
基配列から、どうしても５’末端がＧ又はＣに設計でき
ない場合は、標的核酸の塩基配列から設計したプライマ
ーであるオリゴヌクレオチドの５’末端に、５’−グア
ニル酸又は５’−シチジル酸を付加しても、本発明の目
的は好適に達成できる。よって、本発明において、
３’、又は５’末端の塩基がＧ又はＣになるように設計
した核酸プローブとは、標的核酸の塩基配列から設計し
たプローブの他に、当該のプローブの３’又は５’末端
に５’−グアニル酸又は５’−シチジル酸を付加してな
るプローブを含むものと定義する。

【００６２】特に上記の（１）、（２）、（３）又は
（４）のプローブはプライマーとして利用されないよう
に設計したものである。ＦＲＥＴ現象を用いるリアルタ
イム定量的ＰＣＲ方法において使用する（蛍光色素で標
識した）二つのプローブの代わりに、本発明の一つのプ
ローブを用いてＰＣＲを行うものである。ＰＣＲの反応
系に当該プローブを添加し、ＰＣＲを行う。核酸伸長反
応時、標的核酸若しくは増幅標的核酸にハイブリダイズ
していた当該プローブがポリメラーゼにより分解され、
ハイブリダイゼーション物から分解除去される。このと
きの反応系または核酸変性反応が完了した反応系の蛍光
強度値を測定する。また、標的核酸若しくは増幅した増
幅標的核酸が当該プローブとハイブリダイズしている反
応系（アニーリング反応、若しくはポリメラーゼにより
当該プローブがハイブリダイゼーション物から除かれる
までの核酸伸長反応時の反応系）の蛍光強度値を測定す
る。そして、前者からの蛍光強度値の減少率を算出する
ことにより増幅された核酸を測定する。当該プローブが
標的核酸若しくは増幅標的核酸から、核酸変性反応によ
り完全に解離するか、または核酸伸長時にポリメラーゼ
により当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸と
のハイブリダイゼーション物から分解除去されたときは
蛍光強度値は大きい。しかし、当該プローブが標的核酸
若しくは増幅標的核酸に十分にハイブリダイズしている
アニーリング反応が完了している反応系若しくは核酸伸
長反応時にポリメラーゼにより当該プローブと標的核酸
若しくは増幅標的核酸とのハイブリダイゼーション物か
ら分解除去されるまでの反応系の蛍光強度値は前者より
減少している。蛍光強度値の減少は増幅された核酸量に
比例する。この場合、当該プローブが標的核酸とハイブ
リダイゼーションしたときのそのハイブリダイゼーショ
ン物のＴｍが、プライマーのハイブリダイゼーション物
のＴｍ値の±１５℃、好ましくは±５℃の範囲になるよ
うに、（２）、（３）、（４）のプローブの塩基配列が
設計されることが望ましい。プローブのＴｍ値が、プラ
イマーのＴｍ値−５℃、特に−１５℃未満であると、プ
ローブがハイブリダイゼーションしないために、蛍光色
素の発光の減少は起こらない。反対にプライマーのＴｍ
値＋５℃、特に＋１５℃を超えると、プローブが目的と
しない標的核酸ともハイブリダイゼーションするので、
プローブの特異性が失われる。

【００６３】上記の（５）、（６）のプローブは、プラ
イマーとしてＰＣＲの反応系に添加するものである。蛍
光色素で標識されたプライマーを用いるＰＣＲ方法は本
発明以外未だ知られていない。ＰＣＲの反応が進むに従
い、増幅された核酸は本発明の蛍光色素で標識される。
それで、核酸変性反応が完了している反応系の蛍光強度
値は大きいが、アニーリング反応完了しているか若しく
は核酸伸長反応時の反応系においては、反応系の蛍光強
度は前者の蛍光強度より減少する。

【００６４】ＰＣＲの反応は通常のＰＣＲ方法と同様の
反応条件で行うことができる。それで、Ｍｇイオン濃度
が低濃度（１〜２ｍＭ）である反応系で標的核酸の増幅
を行うことができる。勿論、従来公知の定量的ＰＣＲに
おいて使用されている高濃度（２〜４ｍＭ）のＭｇイオ
ン存在下の反応系でも本発明は実施できる。

【００６５】尚、本発明のＰＣＲ方法において、本発明
のＰＣＲを行い、その増幅産物について核酸の融解曲線
を分析を行ってＴｍ値を求めるできる。この方法は新規
な核酸の融解曲線の分析方法である。本方法において本
発明のＰＣＲ方法に用いた核酸プローブ又はプライマー
として用いた核酸プローブが好適に利用できる。この場
合、本発明のプローブの塩基配列を、ＳＮＰ（スニッ
プ；一塩基置換多型）を含む領域と相補的な配列にする
ことで、ＰＣＲ終了後、その核酸の本発明のプローブか
ら解離曲線を解析することにより、その解離曲線の違い
からＳＮＰの検出ができる。本発明のプローブの配列と
しては、ＳＮＰを含む配列と相補的な塩基配列を使用す
れば、プローブ配列とＳＮＰを含む配列との解離曲線よ
り得られるＴｍ値は、ＳＮＰを含まない配列との解離曲
線から得られるＴｍ値より高くなる。

【００６６】本発明の第二の特徴は、前記のリアルタイ
ム定量的ＰＣＲ方法ので得られるデータを解析する方法
の発明である。リアルタイム定量的ＰＣＲ方法は、現
在、ＰＣＲを行わせる反応装置、蛍光色素の発光を検出
装置、ユーザーインターフェース、即ち、データー解析
方法の各手順をプログラム化して、それを記録したコン
ピュータ読み取り可能な記録媒体（別称：Sequence Det
ection Software System）、及びそれらを制御し、デ
ーター解析するコンピュータから構成される装置で、リ
アルタイムで測定されている。それで、本発明の測定も
このような装置で行われる。

【００６７】以下に、先ず、リアルタイム定量的ＰＣＲ
の解析装置から説明する。本発明において用いる装置
は、ＰＣＲをリアルタイムでモニタリングできる装置で
あればどのような装置でもよいが、例えば、ABI PRISM
^TM 7700 塩基配列検出システム（Sequence Detection S
ystem SDS 7700)(パーキン・エルマー・アプライド・バ
イオシステム社(Perkin Elmer Applied Biosytems社、
USA))、ライトサイクラー^TM システム（ロシュ・ダイア
グノスティックス株式会社、ドイツ）等を特に好適なも
のとして挙げることができる。

【００６８】尚、前記の反応装置は、標的核酸の熱変性
反応、アニーリング反応、核酸の伸長反応を繰り返し行
う装置（例えば、温度を９５℃、６０℃、７２℃に繰り
返し行うことができる。）である。また、検出システム
は、蛍光励起用アルゴンレーザー、スペクトログラフ並
びにＣＣＤカメラからなっている。更に、データー解析
方法の各手段をプログラム化して、それを記録したコン
ピュータ読み取り可能な記録媒体は、コンピュータにイ
ンストールされており、コンピュータを介して上記のシ
ステムを制御し、検出システムから出力されたデーター
を解析処理するプログラムを記録したものである。

【００６９】コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記
録されているデータ解析用プログラムは、サイクルごと
の蛍光強度を測定する過程、測定された蛍光強度を、サ
イクルの関数として、ＰＣＲのamplifcation plotをコ
ンピュータのデスプレー上に表示する過程、蛍光強度が
検出され始めるＰＣＲサイクル数（threshold cyclenum
ber:Ct）を算出する過程、Ｃｔ値から試料核酸のコピー
数を求める検量線を作成する過程、前記各過程のデータ
ー、プロット値を印字する過程、からなっている。ＰＣ
Ｒが指数的に進行している場合、ＰＣＲ開始時の標的核
酸のコピー数のＬｏｇ値と、Ｃｔとの間には直線関係が
成り立つ。従って標的核酸の既知量のコピー数を用いて
検量線を作成し、未知コピー数の標的核酸を含有するサ
ンプルのＣｔを検出することにより、標的核酸のＰＣＲ
開始時のコピー数を計算できる。

【００７０】本発明のＰＣＲ関連発明は、前記のような
リアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデーターを解
析する方法である。以下に各特徴について記す。第一の
特徴は、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデー
ターを解析する方法において、各サイクルにおける増幅
した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した
核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダ
イズしたときの反応系の蛍光強度値を、各サイクルにお
ける前記の結合したもの、あるいは前記のハイブリダイ
ズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値により
補正する演算処理過程、即ち、補正演算処理過程であ
る。

【００７１】「増幅した核酸が蛍光色素と結合したと
き、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸
プローブとハイブリダイズしたときの反応系」とは、具
体的に例示すると、ＰＣＲの各サイクルにおける４０〜
８５℃、好ましくは５０〜８０℃の反応温度を有する核
酸伸長反応あるいはアニーリングのときの反応系を挙げ
ることができる。具体的温度は増幅した核酸の長さに依
存する。また、「前記の結合したもの、あるいは前記の
ハイブリダイズしたものが解離したときの反応系」と
は、ＰＣＲの各サイクルにおける核酸の熱変性の反応
系、具体的には、例えば、反応温度９０〜１００℃、好
ましくは９４〜９６℃のときのものである。

【００７２】補正演算処理過程の補正演算処理としては
本発明の目的に合致するものであればどのようなもので
もよいのであるが、具体的には、次の〔数式１〕あるい
は〔数式２〕による処理過程を含むものを例示すること
ができる。ｆ_n＝ｆ_hyb,n／ｆ_den,n 〔数式１〕ｆ_n＝ｆ_den,n／ｆ_hyb,n 〔数式２〕〔式中、ｆ_n：〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出された
ｎサイクルにおける補正演算処理値、ｆ_hyb,n：ｎサイクルにおける、増幅した核酸が蛍光色
素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で
標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反
応系の蛍光強度値、ｆ_den,n：ｎサイクルにおける、前記の結合したもの、
あるいはハイブリダイズしたものが解離したときの反応
系の蛍光強度値〕。尚、本過程においては、本過程で得られた補正演算処理
値若しくは当該値を各サイクル数に対してグラフ上にプ
ロットし、コンピュータのデスプレー上に表示及び／又
は印字する過程を含むものである。

【００７３】第二の特徴は、各サイクルにおける〔数式
１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値を次の
〔数式３〕あるいは〔数式４〕に代入し、各サンプル間
の蛍光変化割合あるいは蛍光変化率を算出し、それらを
比較するデータ解析方法である。

【００７４】Ｆ_n＝ｆ_n／ｆ_a 〔数式３〕Ｆ_n＝ｆ_a／ｆ_n 〔数式４〕〔式中、Ｆ_n：ｎサイクルにおける、〔数式３〕あるいは〔数式
４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化
率、ｆ_n：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処
理値ｆ_a：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処
理値で、ｆ_nの変化が観察される以前の任意のサイクル
数のものであるが、通常は、例えば、１０〜４０サイク
ルのもの、好適には１５〜３０サイクルのもの、より好
適には２０〜３０サイクルのものが採用される。〕。尚、本過程においては、本過程で得られた算出値、比較
値若しくは当該値を各サイクル数に対してグラフ上にプ
ロットし、コンピュータのデスプレー上に表示及び／又
は印字する過程を含むものであるが、〔数式１〕あるい
は〔数式２〕による補正演算処理値については、それら
の過程は含むものであっても、含まないものであっても
よい。

【００７５】第三の特徴は、３１）〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された
蛍光変化割合あるいは蛍光変化率のデーターを用いて、
〔数式５〕、〔数式６〕あるいは〔数式７〕による演算
処理する過程、ｌｏｇ_b（Ｆ_n）、ｌｎ（Ｆ_n）〔数式５〕ｌｏｇ_b｛（１−Ｆ_n）×Ａ｝、ｌｎ｛（１−Ｆ_n）×ｂ｝〔数式６〕ｌｏｇ_b｛（Ｆ_n−１）×Ａ｝、ｌｎ｛（Ｆ_n−１）×Ａ｝〔数式７〕

【００７６】〔式中、Ａ、ｂ：任意の数値、好ましくは整数値、より好ましく
は自然数である。そして、Ａ＝１００、ｂ＝１０のとき
は、｛（Ｆ_n−１）×Ａ｝は百分率（％）を表す。Ｆ_n：〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された
ｎサイクルにおける蛍光変化割合あるいは蛍光変化
率〕、３２）前記３１）の演算処理値が一定値に達したサイク
ル数を求める演算処理過程、３３）既知濃度の核酸試料におけるサイクル数と反応開
始時の標的核酸のコピー数の関係式を計算する演算処理
過程、３４）未知試料におけるＰＣＲ開始時の標的核酸のコピ
ー数を求める演算処理過程、を有するデータ解析方法で
ある。そして、３１）→３２）→３３）→３４）の順か
らなる過程が好適である。

【００７７】前記３１）〜３３）の各過程においては、
各過程で得られた演算処理値若しくは当該値を各サイク
ル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデ
スプレー上に表示及び／又は印字する過程を含むもので
あってもよい。前記３４）の過程の演算処理値は、前記
と同様であるが、少なくとも印字される必要があるの
で、その過程を含むものである。尚、〔数式１〕あるい
は〔数式２〕による補正演算処理値、〔数式３〕あるい
は〔数式４〕による算出処理値は、各サイクル数に対し
てグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上
に表示及び／又は印字されても、されなくてもよいの
で、それらの過程は必要に応じて追加すればよい。

【００７８】前記データ解析方法は、リアルタイム定量
的ＰＣＲ方法が蛍光色素の発光の減少量を測定するもの
である場合に特に有効である。その具体例として、前記
の本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法である。

【００７９】第４の特徴は、リアルタイム定量的ＰＣＲ
の解析装置において、前記本発明のリアルタイム定量的
ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法を実行する演算及び
記憶手段を有するリアルタイム定量的ＰＣＲの測定及び
／又は解析装置である。

【００８０】第５の特徴は、リアルタイム定量的ＰＣＲ
の解析装置を用いてＰＣＲを解析するデータ解析方法の
各手段をプログラム化して、そのプログラムを記録した
コンピュータ読取可能な記録媒体において、前記本発明
のデータ解析方法の各手段をコンピュータに実行させる
ことができるようにしたプログラムを記録したコンピュ
ータ読取可能な記録媒体である。

【００８１】第６の特徴は、核酸測定方法において、前
記本発明のデータ解析方法、測定及び／又は解析装置、
記録媒体を利用する新規な核酸の測定方法である。

【００８２】また、第７の特徴は、前記の本発明の核酸
の融解曲線の分析方法、即ち、本発明のＰＣＲ方法を行
って核酸のＴｍ値を求める方法によって得られるデータ
を解析する方法である。即ち、本発明のＰＣＲ法により
増幅された核酸について、低い温度から核酸が完全に変
性するまで、温度を徐々に上げる過程（例えば、５０℃
から９５℃まで）、この過程において、短い時間間隔
（例えば、０．２℃〜０．５℃間隔）で蛍光強度を測定
する過程、測定結果を時間毎にデスプレー上に表示する
過程、即ち、核酸の融解曲線を表示する過程、この融解
曲線を一次微分する過程、その値（−ｄＦ／ｄＴ、Ｆ：
蛍光強度、Ｔ：時間）を微分値としてデスプレー上に表
示する過程、その微分値から変曲点を求める過程からな
る、解析方法である。本発明においては、蛍光強度は温
度が上がるごとに増加する。本発明においては、各サイ
クルにおける核酸伸長反応時、好ましくはＰＣＲ反応終
了時の蛍光強度値を熱変性反応時の蛍光強度値を用いて
割る演算処理する過程を上記の過程に追加することによ
り、より好ましい結果が得られる。

【００８３】本発明においては、前記の本発明の新規な
ＰＣＲ方法のデータ解析方法に、本発明の核酸の融解曲
線の分析をする方法を追加してなる本発明のリアルタイ
ム定量的ＰＣＲの測定及び／又は解析装置も本発明の技
術的範囲内である。

【００８４】更に、本発明の特徴の一つは、本発明の核
酸の融解曲線の分析をする方法の各手段をコンピュータ
に実行させることができるようにしたプログラムを記録
したコンピュータ読取可能な記録媒体、また、前記本発
明のＰＣＲ方法のデータ解析方法の各手段をコンピュー
タに実行させることができるようにしたプログラムを記
録したコンピュータ読取可能な記録媒体において、本発
明の核酸の融解曲線の分析をする方法の各手段をコンピ
ュータに実行させることができるようにしたプログラム
を追加して記録したコンピュータ読取可能な記録媒体で
ある。

【００８５】本発明の前記のデータ解析方法、装置、及
び記録媒体は、医学、法医学、人類学、古代生物学、生
物学、遺伝子工学、分子生物学、農学、植物育種学等の
各種の分野で利用できる。また、複合微生物系、共生微
生物系と云われ、色々の種類の微生物若しくは他の動
物、植物が混在していて相互に単離できない微生物系等
に好適に利用できる。ここで云う微生物とは一般的に云
う微生物のことで、特に限定されるものではない。例え
ば、真核微生物、原核微生物、その他マイコプラズマ、
ウイルス、リッケチャ等を挙げることができる。

【００８６】また、本発明の前記データ解析方法、装置
及び記録媒体を用いて、複合微生物系又は共生微生物系
における特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若し
くは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡのコピー
数を定量することにより、当該系における特定菌株の存
在量を測定することができる。それは、５ＳｒＲＮＡ、
１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡの遺伝子ＤＮＡ
のコピー数は菌株よって一定であるからである。尚、本
発明においては、複合微生物系又は共生微生物系のホモ
ジネートを用いて、本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ
を行い、特定菌株の存在量を測定する方法も、本発明の
技術的範囲内とする。

【００８７】

【実施例】次に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に
具体的に説明する。実施例１大腸菌（Escherichia coli）の１６ＳｒＲＮＡの核酸塩
基配列にハイブリダイゼーションする、即ち、(3')CCGC
TCACGCATC(5')の塩基配列を有する核酸プローブの調製
を以下の通りに行った。

【００８８】核酸プローブの調製：(3')CCGCTCACGCATC
(5')の塩基配列をもつデオキシリボオリゴヌクレオチド
の３’末端のデオキシリボースの３’位炭素のＯＨ基
に、−（ＣＨ₂）₇−ＮＨ₂を結合したものを、メドラン
ド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Mi
dland Certified Reagent Company、米国）から購入し
た。更に、モレキュラープローブ（Molecular Probes）
社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kit
s）F-6082（ボデピーＦＬのプロピオン酸サクシニミジ
ルエステル（BODIPY FL propionic acid succinimidyl
esters）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのア
ミン誘導体に結合する試薬を含有するキット）を購入し
た。当該キットを前記購入のオリゴヌクレオチドに作用
させて、本発明で使用するボデピーＦＬで標識した核酸
プローブを合成した。

【００８９】合成物の精製：得られた合成物を乾固し乾
固物を得た。それを０．５ＭＮａＨＣＯ₃／Ｎａ₂ＣＯ
₃緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。当該溶解物をＮＡ
Ｐ−２５カラム（ファルマシア社製）でゲルろ過を行
い、未反応物を除去した。更に逆相HPLC（B gradient：
１５〜６５％、２５分間）を以下の条件で行った。そし
て、溶出するメインピークを分取した。分取した画分を
凍結乾燥して、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭよ
り２３％の収率で核酸プローブを得た。

【００９０】尚、上記の逆相クトマトグラフィーの条件
は次の通りである：溶出ソルベントＡ：０．０５Ｎ TEAA ５％CH₃CN 溶出ソルベントＢ（グラジエント(gradient)用）：０．
０５Ｎ TEAA ４０％CH₃CN カラム：CAPCEL PAK C18；６×２５０ｍｍ溶出速度：１．０ｍｌ／ｍｉｎ温度：４０℃ 検出：２５４ｎｍ

【００９１】実施例２殺菌したニュウトリエントブロス（ＮＢ）（Difco社
製）液体培地５０ｍｌ（組成：ＮＢ、０．０８ｇ／１０
０ｍｌ）を含有する２００ｍｌ容の三角フラスコを用い
て、大腸菌ＪＭ１０９株を３７℃で一晩振蘯培養した。
次に、本培養液に９９．７％エタノールを当量添加し
た。このエタノール添加培養液２ｍｌを２．０ｍｌ容量
のエッペンドルフ遠心チューブで遠心分離し、菌体を得
た。３０ｍＭリン酸緩衝液（ソーダ塩）（ｐＨ：７．
２）１００μｌで菌体を一回洗浄した。菌体を１３０ｍ
ＭのＮａＣｌ含有の前記リン酸緩衝液１００μｌに懸濁
した。当該懸濁液を氷冷中で４０分間超音波処理し（出
力：３３ｗ、発振周波数：２０ｋＨｚ、発振法：０．５
秒発振、０．５秒休止）、ホモジネートを作製した。

【００９２】前記ホモジネートを遠心分離した後、上澄
液を採取し蛍光光度計のセルに移した。それを３６℃に
温調した。それに３６℃に予め加温した前記核酸プロー
ブの溶液を最終濃度で５ｎＭとなるように添加した。３
６℃に温調しながら９０分間大腸菌１６ＳｒＲＮＡと核
酸プローブとをハイブリダイゼーションさせた。そして
蛍光光度計で蛍光色素の発光量を測定した。

【００９３】ハイブリダイゼーション前の蛍光色素の発
光量は、上記の上澄液の代りに、１３０ｍＭのＮａＣｌ
含有の３０ｍＭのリン酸緩衝液（ソーダ塩）（ｐＨ：
７．２）を用いて測定した値を採用した。核酸プローブ
の量と上澄液の量の比を変えて発光量を測定した（励起
光５０３ｎｍ；測定蛍光色５１２ｎｍ）。その結果を図
１に示した。図１から分かるように、上澄液の量比が増
加することにより蛍光色素の発光が減少することが分か
る。即ち、本発明においては、核酸プローブにハイブリ
ダイゼーションする標的核酸量に比例して、蛍光色素の
発光の減少量の大きさが大きくなることが分かる。

【００９４】実施例３核酸プローブの調製：大腸菌ＪＭ１０９株の２３ＳｒＲ
ＮＡにハイブリダイゼーションする(5')CCCACATCGTTTTG
TCTGGG(3')の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの５’
末端ヌクレオチドの３’位炭素のＯＨ基に、−（ＣＨ₂)
₇−ＮＨ₂を結合したものを、実施例１と同様にメドラン
ド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Mi
dland Certified Reagent Company、米国）から購入し
た。更に、実施例１と同様にモレキュラープローブ（Mo
lecular Probes）社からフロオ・リポーターキット（Fl
uoReporter Kit) F-6082 (ボデピーＦＬのプロピオン酸
サクシニミジルエステル(BODIPY FL propionic acid su
ccinimidyl ester）の他に、当該化合物をオリゴヌクレ
オチドのアミン誘導体に結合する試薬を含有するキッ
ト）を購入した。当該キットを前記オリゴヌクレオチド
に作用させて、ボデピーＦＬで標識した核酸プローブを
合成した。得られた合成物を実施例１と同様に精製し
て、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭより２５％の
収率でボデピーＦＬで標識した核酸プローブを得た。

【００９５】実施例４実施例２で得られた大腸菌ＪＭ１０９株の菌体に実施例
２と同一の培地及び培養条件で調製したシュウドモナス
・プウシモビルス４２１Ｙ株（Pseudomonaspaucimobi
lis）（現在名：スフィンゴモナス・プウシモビルス）
（FERM P-5122）の菌体をＯＤ６６０値で大腸菌ＪＭ１
０９株と同濃度混合し、複合微生物系を調製した。得ら
れた混合液（大腸菌ＪＭ１０９株の菌体濃度は実施例２
と同一）について実施例２と同じ方法によりホモジネー
トを調製した。実施例３で調製した核酸プローブを用い
て、励起光を５４３ｎｍ、また、測定蛍光色を５６９ｎ
ｍにする以外は、実施例２と同様な実験を行った結果、
実施例２と同様な結果を得た。

【００９６】実施例５蛍光消光現象における標的核酸の塩基選択性、即ち、本
発明の塩基特異性を検討した。下記に示す標的合成デオ
キシリボオリゴヌクレオチド（３０mer）のpoly a〜jの
１０種類をＤＮＡ合成機ＡＢＩ３９４（Perkin Elmer社
製、米国)で調製した。

【００９７】更に、上記の合成ＤＮＡに対応するデオキ
シリボオリゴヌクレオチドの５’末端にボデピーＦＬで
標識した下記に示す本発明のプローブを調製した。上記
の合成ＤＮＡに対応するプライマーＤＮＡの５’末端の
リン酸基に、−（ＣＨ₂)₆−ＮＨ₂を結合したものをメド
ランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社
（Midland Certified Reagent Company、米国）から購
入した。更に、モレキュラープローブ（Molecular Prob
es）社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter K
its）Ｆ−６０８２（ボデピーＦＬのプロピオン酸サク
シニジルエステル（BODIPY FL propionic acid succini
dyl esters)の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチド
のアミン誘導体に結合させる試薬を含有するキット）を
購入した。当該キットを前記購入のプライマーＤＮＡに
作用させて下記のボデピーＦＬで標識した本発明のプロ
ーブｐｒｏｂｅａ〜ｄ、及びｆ〜ｈのを合成した。そ
して対応する合成デオキシリボオリゴヌクレオチドとハ
イブリダイゼーションしたときに、蛍光色素の発光がど
の程度減少するかを下記の条件下に調べ、本発明のプロ
ーブの特異性を検討した。

【００９８】

【００９９】

【０１００】

【０１０１】

【０１０２】（１）ハイブリダイゼーション溶液のコンポーネント合成ＤＮＡ３２０ｎＭ（終濃度）核酸プローブ８０ｎＭ（終濃度）ＮａＣｌ５０ｍＭ（終濃度）ＭｇＣｌ₂ １ｍＭ（終濃度）トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）１００ｍＭ（終濃度）ミリＱ純水１．６９９２ｍｌ終全量２．００００ｍｌ（２）ハイブリダイゼーションの温度：５１℃ （３）測定条件：励起光：５４３ｎｍ測定蛍光色：５６９ｎｍ

【０１０３】

【表１】

【０１０４】その結果を表１に示した。表１から分かる
ように、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的ＤＮ
Ａ（デオキシリボオリゴヌクレオチド）にハイブリダイ
ゼーションしたときに、当該末端部において、当該プロ
ーブと標的ＤＮＡとがハイブリダイゼーションした末端
塩基部から１〜３塩基離れて、標的ＤＮＡの塩基配列に
Ｇ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在するよう
に、当該プローブの塩基配列が設計されていることが好
適であることを示している。また、蛍光色素で標識され
た核酸プローブが標的ＤＮＡにハイブリダイゼーション
したときに、当該末端部においてハイブリダイゼーショ
ン物の塩基対がＧとＣのペアーを少なくとも一対以上形
成するように、当該プローブの塩基配列が設計されてい
ることが好適であることが表１から分かる。

【０１０５】実施例６下記のような塩基配列の標的核酸と本発明の核酸プロー
ブを調製した。標的核酸内のＧ及び本発明の核酸プロー
ブ内のＧの数の影響について、前記実施例と同様にして
調べた。

【０１０６】

【０１０７】

【０１０８】

【０１０９】

【０１１０】

【表２】

【０１１１】表２から分かるように、標的核酸内のＧの
数、本発明のプローブ内のＧの数はそれほど蛍光強度の
減少に影響しないことが認識される。

【０１１２】実施例７下記のような塩基配列の標的核酸と本発明の核酸プロー
ブを調製した。標的核酸内の塩基種及び本発明の核酸プ
ローブ内の塩基種の影響について、前記実施例と同様に
して調べた。

【０１１３】

【０１１４】

【０１１５】

【表３】

【０１１６】表３及び前記の実施例から分かるように、
(i)蛍光色素で標識される本発明のプローブの末端がＣ
で構成され、標的核酸がハイブリダイゼーションしたと
き、ＧＣペアーを形成するとき、(ii)蛍光色素で標識
される本発明のプローブの末端がＣ以外の塩基で構成さ
れた場合、蛍光色素で標識されている個所の塩基と、標
的核酸の塩基との塩基ペアーより、標的核酸の３’末端
側にＧが少なくとも１個以上存在する場合に、蛍光強度
の減少率が大きいことが分かる。

【０１１７】実施例８本発明の核酸プローブに標識する色素の種類について、
前記実施例と同様にして調べた。なお、本発明のプロー
ブは、前記実施例７のプローブｚを、また、標的核酸は
前記実施例７のオリゴヌクレオチドｚを用いた。その結
果を、表４に示した。表から分かるように、本発明に用
いる蛍光色素として好適なものは、FITC、 BODIPY FL、
BODIPY FL/C3、 6-joe、TMRなどを挙げることができ
る。

【０１１８】

【表４】

【０１１９】実施例９核酸プローブの調製：大腸菌ＪＭ１０９株の１６ＳｒＲ
ＮＡの１１５６塩基目から１１９０塩基の塩基配列に相
当するＫＹＭ−７株の１６ＳｒＲＮＡ塩基配列に特異的
にハイブリダイゼーションする(5')CAT CCC CAC CTT CC
T CCC AGT TGACCC CGG CAG TC(3')（３５塩基対）の塩
基配列をもち、１〜１６及び２５〜３５塩基目がデオキ
シリボヌクレオチド、１７〜２４塩基目が２’位炭素の
ＯＨ基をアミノ基で修飾したリボオリゴヌクレオチドか
らなり、５’末端のリン酸基のＯＨ基を-(CH₂)₇-NN₂で
修飾しを結合したものを、実施例１と同様にメドランド
・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Midl
and Certified Reagent Company、米国）から購入し
た。更に実施例１と同様にモレキュラープローブ（Mole
cular Probes）社からフロオ・リポーターキット（Fluo
Reporter Kits) F-6082（ボデピーＦＬ／Ｃ６のプロピ
オン酸サクシニミジルエステル（BODIPY FL/ C6 propio
nic acid succinimidyl ester）の他に、当該化合物を
オリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合する試薬を含
有するキット）を購入した。当該キットを前記オリゴヌ
クレオチドに作用させて、ボデピーFL/C6で標識した核
酸プローブを合成した。得られた合成物を実施例１と同
様に精製して、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭよ
り２３％の収率でボデピーFL/C6で標識した核酸プロー
ブを得た。このプローブを３５塩基鎖2-O-Meプローブと
名づけた。

【０１２０】（５’）AGG CCG GCC CTT GAC TTT CCT
（３’）の塩基配列を有するリボキシオリゴヌクレオチ
ドを前記同様にしてＤＮＡ合成機を用いて合成して、ホ
ワード（ｆｏｒｗａｒｄ）型のヘルパープローブとし
た。一方、（５’）AUG GGA GUUCAG UAG UAC CCG CAA U
GC UGG UCC(3')の塩基配列を有するリボキシオリゴヌク
レオチドを前記同様にしてＤＮＡ合成機を用いて合成し
て、バックワード(backward) 型のヘルパープローブと
した。

【０１２１】前記の１６ＳｒＲＮＡを９５℃で５分加熱
処理した後、下記に示す反応条件においたプローブ溶液
に添加した後、蛍光測定機器パーキンエルマー（Perkin
Elmer) LS-50Bで蛍光強度を測定した。その結果を図
２に示した。尚、上記の加熱処理しない１６ＳｒＲＮＡ
を用いたものをコントロールとした。加熱処理した実験
区においては、蛍光強度の減少が大きいことが図２から
分かる。この結果は、１６ＳｒＲＮＡを９５℃で加熱処
理することで本発明のプローブとより強いハイブリダイ
ゼーションをしていることを示している。反応条件： 16SrRNA: 10.0 nM プローブ: 25nM 緩衝液： 100mM コハク酸、125mM 水酸化リチウム、８．５％リチウムドデシルサルファイト、pH 5.1 温度: 70℃

【０１２２】実施例１０（ヘルパープローブのハイブリ
ダイゼーション効率への影響）前記の１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイゼーションする下
記の本発明のプローブ及びヘルパープローブを前記と同
様にして調製した。そして下記の条件にて、本発明の2'
-O-Meプローブの効果、当該プローブの塩基鎖の長さの
影響、及びヘルパープローブの効果について検討した。
その結果を図３のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄに示した。図から、本
発明の2'-O-Meプローブがハイブリダイゼーション効率
に寄与していることが分かる。また、2'-O-Meプローブ
の塩基鎖が短い場合にヘルパープローブがハイブリダイ
ゼーション効率を高めるのに役立っている。

【０１２３】１）前記と同じ３５塩基鎖2'-O-Meプロー
ブ、２）前記１）と同じ３５塩基鎖2'-O-Meプローブと同じ
塩基配列であるが、オリゴヌクレオチドがデオキシリボ
ヌクレオチドで構成されているプローブ（３５塩基鎖DN
A プローブ）、３）前記１）の３５塩基鎖2-O-Meプローブと同じ塩基配
列であるが、５’末端から８塩基分、３’末端から１０
塩基分のヌクレオチドを削除したプローブ（１７塩基鎖
2-O-Me プローブ）、４）前記２）の３３塩基鎖DNAプローブと同じ塩基配列
であるが、３’末端から１６塩基分のヌクレオチドを削
除したプローブ（１７塩基鎖DNAプローブ）、

【０１２４】５）前記ホワード型ヘルパープローブの中
央８塩基分のＯＨ基をメチル基で修飾したヘルパープロ
ーブ(ファード型 2-O-Meヘルパープローブ) ６）前記リバース型ヘルパープローブの中央８塩基分
のＯＨ基をメチル基で修飾したヘルパープローブ(リバ
ース型 2-O-Meヘルパープローブ）７）前記フォワード型ヘルパープローブの塩基配列と同
じ塩基配列であるが、オリゴヌクレオチドがデオキヌク
レオチドで構成されているヘルパープローブ(ファワー
ド型 DNA ヘルパープローブ）８）前記リバース型ヘルパープローブの塩基配列と同
じ塩基配列であるが、デオキリボヌクレオチドがで構成
されているヘルパープローブ(リバース型 DNAヘルパー
プローブ）９）(5')GUGACGGUCACUAUUUGACCUCCUUCCACCCC(3')なる塩
基配列を有するリボオリゴヌクレオチド（３５塩基リボ
オリゴヌクレオチド）、１０）(5')GUGACGGUCACUAUUUG(3')なる塩基配列を有す
るリボオリゴヌクレオチド（１７塩基鎖リボオリゴヌク
レオチド）、

【０１２５】反応条件：１６ＳｒＲＮＡ： 10nM プローブ： 25nM ヘルパープローブ： 1μM 緩衝液： 100mM コハク酸、125mM 水酸化リ
チウム、８．５％リチウムドデシルサルファイト、pH
5.1 温度：・３５塩基鎖リボオリゴヌクレオチド2-O-Meプローブ使
用の場合：７０℃ ・１７塩基鎖リボオリゴヌクレオチド２−Ｏ−Ｍｅプロ
ーブまたは３３塩基鎖リボオリゴヌクレオチドＤＮＡプ
ローブ：６５℃ ・１７塩基鎖リボオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブ：
５０℃

【０１２６】実施例１１（ｒＲＮＡ測定のための検量線
の作成）０．１〜１０ｎＭの範囲の前記ｒＲＮＡを９５℃で５分
間加熱後、予め下記反応条件においた反応液に添加し、
１０００秒後、蛍光強度の減少をパーキンエルマーLS-5
0Bを使用して測定した。その結果を図４に示した。図か
ら検量線は０．１〜１０ｎＭにおいて直線性を示すこと
が分かる。反応条件：３３塩基鎖リボオリゴヌクレオチド2-O-Meプローブ：
1.0〜25nM 緩衝液： 100mM コハク酸、125mM 水酸化リチウム、
８．５％リチウムドデシルサルファイト、ｐＨ５．
１温度：７０℃

【０１２７】実施例１２(FISH方法) セルロモナス（Cellulomonas）sp.KYM-7（FERM P-1680
6）及びアグロバクテリウム（Agrobacterium) sp. KYM-
8(FERM P-11358)の各々のｒＲＮＡにハイブリダイゼー
ションする本発明のプローブ35〜36塩基鎖デオキシオリ
ゴヌクレオチド 2-O-Meプローブを前記と同様にして調
製した。各プローブの塩基配列は下記の通りである。

【０１２８】セルロモナス sp.KYM-7のｒＲＮＡ測定の
ための３５塩基鎖デオキシオリゴヌクレオチド２−Ｏ−
Ｍｅプローブ：（5')CAT CCC CAC CTT CCT CCG AGT TGA
CCC CGG CAG TC(3')（アンダーライン部分がメチル基
で修飾されている。）。アグロバクテリウム sp. KYM-8
(FERM P-11358)のｒＲＮＡ測定のための３６塩基鎖デオ
キシオリゴヌクレオチド２−Ｏ−Ｍｅプローブ：(5')CA
T CCC CAC CTT CCT CTC GGC TTA TCA CCG GCA GTC(3')
（アンダーライン部分がメチル基で修飾されてい
る。）。

【０１２９】セルロモナス sp. KYM-7及びアグロバク
テリウムsp. KYM-8を下記の培地組成で下記の培養条件
で混合培養し、培養時間毎に培養物を採取した。それら
から、ｒＲＮＡをRNeasy Maxikit（QIAGENE社）を用い
て調製した。当該ｒＲＮＡを９５℃で５分加熱後、予め
反応条件においた反応液に添加し、７０℃、１０００秒
間反応させた後、蛍光強度をパーキンエルマーLS-50Bを
使用して測定した。その結果を図５に示した。尚、全r
ＲＮＡはリボグリーン（RiboGreen) RNA Kit （会社
名：モレキュラープローブ（molecular probes)、所在
地名：Eugene,Oregon,USA）を用いて測定した。図から
分かるように、各菌株のｒＲＮＡの動態は全 rＲＮＡの
動態と一致した。また、各菌株のｒＲＮＡの合計量は全
ｒＲＮＡと一致した。このことは、本発明方法はFISH方
法において有効な方法になることを示している。

【０１３０】培地組成（g/l）：デンプン，10.0；アス
パラギン酸，0.1； K₂HPO₄，5.0;KH₂PO₄,2.0;MgSO₄・7
H₂O ,0.2;NaCl，0.1; (NH₄)₂SO₄;0.1 . 培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のコニカルフラスコ
に分注し、該フラスコを１２０℃で１０分間、オートク
レーブ釜を用いて殺菌した。

【０１３１】培養条件：前記の菌株を斜面培地で予め培
養した。該斜面培地より１白金耳の菌体をとり、前記の
殺菌したコニカルフラスコに接種した。３０℃、１５０
ｒｐｍで撹拌培養した。

【０１３２】反応条件：３３塩基鎖デオキシオリゴヌクレオチド２−Ｏ−Ｍｅプ
ローブ: 1.0〜10nM 緩衝液: 100mM コハク酸、125mM 水酸化リチウ
ム、8.5% リチウムドデシルサルファイト、ｐＨ５．
１温度： 70℃

【０１３３】以下実施例１３に、標的核酸若しくは遺伝
子の多型及び変異を解析若しくは測定する方法を記す。実施例１３下記に示した塩基配列をもつ４種類のオリゴヌクレオチ
ドを前記実施例５のＤＮＡ合成機を用いて合成した。ま
た、前記実施例５と同様にして、下記の塩基配列の本発
明の核酸プローブを合成した。該プローブと各々のオリ
ゴヌクレオチドを溶液中でハイブリダイゼーションさせ
た後、蛍光強度の変化から１塩基置換の評価ができるか
どうか検討した。本発明の核酸プローブの塩基配列は、
標的オリゴヌクレオチドの３’末端にＧが存在する場合
に、１００％マッチするように設計されている。ハイブ
リダイゼーション温度は、プローブと標的オリゴヌクレ
オチドの全塩基対（base-pairs）が１００％ハイブリダ
イゼーションできる４０℃に設定した。プローブ及び標
的オリゴヌクレオチドの濃度、緩衝液の濃度，蛍光測定
装置、蛍光測定条件、実験操作などは、前記実施例５と
同様である。

【０１３４】

【０１３５】その結果を表５に示した。表から、標的オ
リゴヌクレオチドＮｏ．１〜３においては、蛍光強度に
変化は観察されなかったが、標的オリゴヌクレオチドＮ
ｏ．４においては８４％の減少が観察された。

【０１３６】

【表５】

【０１３７】本発明において、標的核酸若しくは遺伝子
（Ｎｏ．１〜４）の多型及び変異を解析若しくは測定若
しくは測定する方法により得られるデータ（表５のカラ
ムＡ及びＢのデータ）を解析する方法において、標的核
酸若しくは遺伝子が蛍光色素で標識された核酸プローブ
（上記の核酸プローブ）とハイブリダイズしたときの反
応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダイズしていない
ときの反応系の蛍光強度値により補正するとは、表３の
（Ａ−Ｂ）／Ｂの計算をいう。以上の結果より、標的核
酸が２本鎖の場合、Ｇ→Ａ、Ｇ←Ａ、Ｃ→Ｔ、Ｃ←Ｔ、
Ｇ→Ｃ、Ｇ←Ｃの置換を検出できることが明らかになっ
た。

【０１３８】実施例１４図６に本発明のＤＮＡチップのモデルを図示した。先
ず、実施例１３で調製した本発明のプローブ、3'TTTTTT
TTGGGGGGGGC5'BODIPY FL/C6の３’末端の３’位のＯＨ
にアミノ基を導入したもの、また、スライドガラスを反
応基としてエポキシ基を有するシランカップリン剤でス
ライドガラスの表面を処理したものを用意する。上記の
本発明のプローブを含む溶液をＤＮＡチップ作成装置GM
S^TM417ARRAYER(TAKARA)で該スライドガラス上にスポッ
トする。そうすると、３’末端で発明のプローブがガラ
ス面に結合する。該スライドガラスを密閉容器内に４時
間位おき反応を完結させる。そして該スライドガラスを
０．２％ＳＤＳ溶液、水に１分程度交互に２回づつ漬け
る。更にホウ素溶液（水３００ｍｌにNaBH₄１．０ｇを
溶かしたもの。）に５分位つける。９５℃の水に２分つ
けてから、素早く０．２％ＳＤＳ溶液、水に１分程度交
互に２回づつ漬けて試薬を洗い流す。室温で乾燥する。
このようにして本発明のＤＮＡチップが調製される。更
に、各スポットのガラスの下面に図のような微小な温度
センサーとヒータを設けることにより、高性能な本発明
のＤＮＡチップを作成することができる。このＤＮＡチ
ップを用いて標的核酸若しくは遺伝子を測定する場合を
説明する。該プローブに標的核酸若しくは遺伝子がハイ
ブリダイゼーションしていないときは、又はハイブリダ
イゼーションしても本発明の蛍光色素標識末端でＧＣペ
アーを形成しないとき、若しくは当該プローブと標的核
酸しくは遺伝子とがハイブリダイゼーションした末端塩
基部分から１ないし３塩基離れて、標的核酸若しくは遺
伝子の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１ないし
３塩基存在しないときは、蛍光強度に変化ない。しか
し、ハイブリダイゼーションすると蛍光強度が減少す
る。この蛍光強度はＤＮＡチップ解析装置ＧＭＳ^TM４１
８アレースキャナー（Array Scanner）（TAKARA）を使
用して測定できる。

【０１３９】以下、実施例１５〜１９に本発明のＰＣＲ
方法を記す。実施例１５大腸菌のゲノムＤＮＡにおける１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を
標的核酸として、当該核酸の増幅のための（BODIPY FL/
C6で標識した）プライマーを調製した。

【０１４０】プライマー１（Eu800R：リバース型）の調
製：(5')CATCGTTTACGGCGTGGAC(3')の塩基配列をもつデ
オキシリボオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機ABI394
(Perkin Elmer社製、米国）を用いて合成し、更に当該
オリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端のリン酸基
をホスファターゼ処理してシトシンとし、そのシトシン
の５’位の炭素OH基に、-(CH₂)₉-NH₂を結合したもの
を、ミドランド・サーテイファイド・レージンド・カン
パニー社（米国）から購入した。更に、モレキュラープ
ローブ社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter
Kits)F-6082（ボデピーFL/C6のプロピオン酸サクシニ
ミジルエステル（BODIPY FL propionic acid succinimi
dyl ester）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチド
のアミン誘導体に結合させる試薬を含有するキット）を
購入した。前記購入したオリゴヌクレオチドに当該キッ
トを作用させて、本発明のボデピーFL/C6で標識したプ
ライマー１を合成した。

【０１４１】合成物の精製：得られた合成物を乾固し乾
固物を得た。それを0.5M Na₂CO₃/NaHCO₃緩衝液（ｐＨ
９．０）に溶解した。当該溶解物をＮＡＰ−２５カラム
（ファルマシア社製）でゲルろ過を行い、未反応物を除
去した。更に逆相HPLC（B gradient：１５〜６５％、２
５分間）を以下の条件で行った。そして、溶出するメイ
ンピークを分取した。分取した画分を凍結乾燥して本発
明のプライマー１を、最初のオリゴヌクレオチド原料２
ｍＭより５０％の収率で得た。

【０１４２】尚、上記の逆相クロマトグラフィーの条件
は次の通りである：溶出ソルベントＡ：0.05N TEAA 5%CH₃CN 溶出ソルベントＢ（グラジエント(gradient)用）：0.05N TEAA 40%CH₃CN カラム：CAPCEL PAK C₁₈ ；6×250mm 溶出速度：１．０ml/min 温度：４０℃ 検出：２５４ｎｍ

【０１４３】実施例１６プライマー２（Eu500R/forward：フォワード型）の調
製：(5')CCAGCAGCCGCGGTAATAC(3')の塩基配列をもつデ
オキシリボオリゴヌクレオチドの５’末端に蛍光色素
（BODIPY FL/C6）で標識したプライマー２を実施例１３
と同様にして収率５０％で調製した。

【０１４４】実施例１７殺菌したニュトリエントブロス(NB)（Difco社製）液体
培地５ml（組成：NB、0.08g/100ml）を含有する試験管
を用いて、大腸菌JM109株を３７℃で一晩振蘯培養し
た。培養液１．５mlを１．５ml容量の遠心チューブで遠
心分離し、菌体を得た。この菌体から、DNeasy Tissue
Kit（キアゲン社、ドイツ国）を用いてゲノムＤＮＡを
抽出した。その方法は本キットのプロトコルに従った。
その結果、17ng/μlのＤＮＡ溶液を得た。

【０１４５】実施例１８上記の大腸菌のゲノムＤＮＡ、プライマー１及び／又は
プライマー２を使用して、ロシュ・ダイアグノスティッ
クス株式会社発売のライトサイクラー^TMシステム（Ligh
tCycler^TM System）を用いて常法通りにＰＣＲ反応を行
った。操作は当該システム機器の手順書に従った。ま
た、上記システムにおいてＰＣＲは、当該手順書に記さ
れている核酸プローブ（FRET現象を利用する二個のプロ
ーブ）と通常のプライマー（蛍光色素で標識されていな
い通常のプライマー）の代りに本発明プライマー１及び
／又は２を用いる以外は当該手順書通りに行った。

【０１４６】ＰＣＲは次のコンポーネントで行った。大腸菌ゲノムＤＮＡ溶液３．５μｌ（終濃度０〜６ｎｇ／２０μｌ）（終コピー数０〜２．４・１０⁶個）プライマー溶液０．８μｌ（終濃度０．０８μＭ）Ｔａｑ溶液１０．０μｌミリＱ純水５．７μｌ全容量２０．０μｌ尚、標的核酸である大腸菌１６ＳｒＤＮＡは、図７の説
明欄に示される実験区の濃度で、また、プライマーは、
同様に図７の注に示される実験区のプライマー１及び／
又は２の組合せで実験を行った。

【０１４７】また、上記のTaq溶液は次の試薬の混合液
である。 Taq 溶液９６．０μｌミリＱ純水６８．２μｌ Taq DNA ポリメラーゼ溶液２４．０μｌ Taq スタート(start) ３．８μｌ

【０１４８】尚、Taq 溶液、 Taq DNAポリメラーゼ溶液
はロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発売のＤＮ
Ａマスターハイブリダイゼーションプローブ（DNA Mast
er Hybridization Probes)キットのものである。特にTa
q DNA ポリメラーゼ溶液は10×conc.（赤いキャップ）
を１０倍に希釈して用いた。また、Taq スタートは、ク
ローンテック社（ＵＳＡ）より販売されているTaq DNA
ポリメラーゼ用の抗体で、これを反応液に添加すること
で７０℃までTaq DNAポリメラーゼの活性を抑えること
ができる。即ち、ホット・スタート(hot start)を行う
ことができるものである。

【０１４９】反応条件は次の如くである。変性（denaturation）初期：９５℃、１２０秒再：９５℃、０秒アニーリング（annealing）条件５７℃、５秒測定は、ライトサイクラー^TMシステムを用いて行った。
その際、該システムにあるＦ１〜３の検出器にうち、Ｆ
１の検出器を用い、その検出器のゲインは１０、励起強
度は７５に固定した。

【０１５０】その結果を図７及び８に示した。図７及び
８から、蛍光色素の発光の減少が観察される時点のサイ
クル数と標的核酸の大腸菌１６ＳｒＤＮＡのコピー数が
比例していることが分かる。尚、図においては、蛍光色
素の発光の減少量を蛍光強度の減少値として表現した。
図９は、サイクル数を関数として、大腸菌１６ＳｒＤＮ
Ａのコピー数を表現した大腸菌１６ＳｒＤＮＡの検量線
である。相関係数は０．９９７３で、極めてよい相関を
示した。以上の結果から分かるように、本発明の定量的
ＰＣＲ方法を用いると標的核酸の当初のコピー数を測定
できるようになる。即ち、標的核酸の測定ができる。

【０１５１】実施例１９実施例１８においては、本発明のプローブをプライマー
としてＰＣＲを行ったが、本実施例では従来法に用いる
ＦＲＥＴ現象を利用する二個のプローブの代わりに本発
明のプローブを用いて下記の条件で本発明のＰＣＲを行
った。ａ）標的核酸:大腸菌の16S-rDNA ｂ）使用プライマー：・フォワードプライマー E8F: (3')AGAGTTTGATCCTGGCTC
AG(5') ・リバースプライマー E1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT
(5') ｃ）使用プローブ: BODIPY FL-(3')CCTTCCCACATCGTTT
(5') ｄ）使用PCR測定機器:ライトサイクラー^TMシステムｅ）ＰＣＲの条件: 変性反応:95℃ for 0秒 (60秒間、95℃) アニーリング反応: 50℃ for 5秒核酸伸長反応: 72℃ for 70秒全サイクル数: 70サイクル

【０１５２】ｆ）蛍光測定（アニーリング反応と変性反
応後各サイクル後一回づつ測定された。ｇ）反応液の組成: 反応液の全量:20 μl DNA ポリメラーゼの量 (TaKaRa Ex taq): 0.5U Taq スタート(抗体): 0.3μl プライマーの濃度: 0.2μM (双方とも) プローブの濃度: 0.05 μM MgCl₂ 濃度: 2 mM BSA(bovine serum albumin)濃度:0.25 mg/ml dNTPs濃度: 2.5 mM (各ヌクレオチドについて).

【０１５３】その結果を図１０に示した。図から、蛍光
色素の発光の減少が観察される時点のサイクル数と標的
核酸の大腸菌１６ＳｒＤＮＡのコピー数が比例している
ことが分かる。以上の結果から分かるように、本発明の
定量的ＰＣＲ方法を用いると標的核酸の当初のコピー数
を測定できるようになる。即ち、標的核酸の測定ができ
る。

【０１５４】次に以下の実施例に、上記の本発明の定量
的ＰＣＲ方法を用いて得られるデータを解析する本発明
のデータ解析方法について記す。実施例２０ヒトゲノムＤＮＡ（ヒトβ−グロビン（globin）（TaKa
Raカタログ商品番号９０６０）（TaKaRa株式会社製）
（以下、ヒトゲノムＤＮＡという。）を標的核酸とし
て、当該核酸の増幅のためのボデピー FL/C6で標識した
プライマーを調製した。

【０１５５】プライマーKM38+C（リバース型）の調製：
（5')CTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG(3')の塩基配列をもつデ
オキシリボオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機ABI394
(Perkin Elmer社製、米国）を用いて合成し、更に当該
オリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端のリン酸基
をホスファターゼ処理してシトシンとし、そのシトシン
の５’位の炭素ＯＨ基に、-(CH₂)₉-NH₂を結合したもの
を、ミドランド・サーテイファイド・レージンド・カン
パニー社から購入した。更に、モレキュラープローブ社
からリポーターキット（FluoReporter Kits)F-6082（ボ
デピーFL/C6のプロピオン酸サクシニミジルエステル(BO
DIPY FL propionic acid succinimidylesters)の他に、
当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合
させる試薬を含有するキット）を購入した。前記購入し
たオリゴヌクレオチドに当該キットを作用させて、本発
明のボデピーFL/C6で標識したプライマーKM38+Cを合成
した。

【０１５６】合成物の精製：得られた合成物を乾固し乾
固物を得た。それを0.5M Na₂CO₃/NaH₂CO₃緩衝液(pH9.0)
に溶解した。当該溶解物をNAP-25カラム（ファルマシア
社製）でゲルろ過を行い、未反応物を除去した。更に逆
相HPLC(B gradient:15〜65%、25分間）を以下の条件で
行った。そして、溶出するメインピークを分取した。分
取した画分を凍結乾燥して本発明のプライマーKM38+C
を、最初のオリゴヌクレオチド原料2mMより５０％の収
率で得た。

【０１５７】尚、上記の逆相クロマトグラフィーの条件
は次の通りである：溶出ソルベントＡ：0.05N TEAA 5%CH₃CN 溶出ソルベントＢ（グラジエント（gradient）用）：0.
05NTEAA 40%CH₃CN カラム：CAPCEL PAK C18;6×250mm 溶出速度：1.0ml/min 温度：40℃ 検出：254nm

【０１５８】実施例２１プライマーKM29（フォワード型）の調製：(5')GGTTGGCC
AATCTACTCCCAGG(3')の塩基配列をもつデオキシリボオリ
ゴヌクレオチドを実施例１８と同様に合成した。

【０１５９】比較実験例１（本発明の、核酸伸長反応時
の蛍光強度値を、熱変性反応時の蛍光強度値を用いて割
る演算処理過程を有ないデーター解析用ソフトウエアを
用いた実験例）。上記のヒトゲノムＤＮＡ、プライマー
KM38+C及びプライマーKM29を使用して、ライトサイクラ
ー ^TMシステムを用いてＰＣＲ反応を行い、各サイクル
毎の蛍光強度を測定した。尚、本比較実施例のＰＣＲ
は、前記に説明した蛍光色素色素で標識したプライマー
を用いるものであり、蛍光発光の増加でなく、減少を測
定する新規なリアルタイム定量的ＰＣＲ方法である。デ
ーター解析用ソフトウエアは当該システムのものを用い
て行った。上記システムにおいてＰＣＲは、当該手順書
に記されている核酸プローブ（ＦＲＥＴ現象を利用する
二個のプローブ）と通常のプライマー（蛍光色素で標識
されていない通常のプライマー）の代りに本発明プライ
マーKM38+C及びKM29を用いる以外は当該装置の手順書通
りに行った。

【０１６０】ＰＣＲは次のコンポーネントで行った。ヒトゲノムＤＮＡ 1.0μl（最終濃度1〜10000コピー）プライマー溶液 4.0μl（最終濃度0.1μM） Taq溶液 10.0μｌミリＱ純水 5.0μl 全容量 20.0μl 尚、ヒトゲノムＤＮＡは、図１１の説明欄に示される実
験区の濃度で実験を行った。MgCl₂の最終濃度は2mMであ
った。

【０１６１】また、上記のTaq溶液は次に試薬の混合液
である。 Taq 溶液 96.0μl ミリＱ純水 68.2μl Taq DNA ポリメラーゼ 24.0μl Taq スタート 3.8μl

【０１６２】尚、Taq溶液、 Taq DNA ポリメラーゼ溶液
はロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発売のＤＮ
Ａマスターハイブリダイゼーションプローブ（DNA Mast
er Hybridization Probes）キットのものである。特に
Ｔaq DNA ポリメラーゼ溶液は10×conc.（赤いキャッ
プ）を１０倍に希釈して用いた。また、Ｔaqスタート
は、クローンテック社（ＵＳＡ）より販売されているTa
q DNA ポリメラーゼ用の抗体で、これを反応液に添加す
ることで７０℃までTaq DNAポリメラーゼの活性を抑え
ることができる。即ち、ホット・スタートを行うことが
できるものである。

【０１６３】反応条件は次の如くである。変性反応初期：95℃、60秒再変性反応：95℃、10秒アニーリング反応：60℃、5秒ＤＮＡ伸長反応：72℃、17秒測定は、ライトサイクラー^TMシステムを用いて行った。
その際、該システムにあるＦ１〜３の検出器にうち、Ｆ
１の検出器を用い、その検出器のゲインは１０、励起強
度は７５に固定した。

【０１６４】前記の如くにＰＣＲを行って、各サイクル
の蛍光強度を実測した結果を図１１に示した。即ち、各
コピー数のヒトゲノムＤＮＡについて、各サイクルの変
性反応時及び核酸伸長反応時の蛍光強度を測定し、印字
したものである。どのサイクルにおいても変性反応時に
は蛍光強度値は一定であるが、核酸伸長反応時には、２
５サイクル目当たりから蛍光強度が減少しているのが観
察される。そうして、減少はヒトゲノムＤＮＡのコピー
数がおおい順に起こることが分かる。

【０１６５】図１１においてヒトゲノムＤＮＡの各コピ
ー数について初期のサイクル数の蛍光強度値が一様でな
い。それで、本実験例で使用するデーター解析方法に以
下の過程を追加した。（ｂ）１０サイクル目の蛍光強度値を１として各サイク
ルの蛍光強度値を換算する過程、即ち、下記の〔数式
８〕による計算をする過程、Ｃ_n＝Ｆ_n（７２）／Ｆ₁₀（７２）〔数式８〕ただし、Ｃ_n＝各サイクル値の換算値、Ｆ_n（７２）＝各
サイクルの７２℃の蛍光強度値、Ｆ₁₀（７２）＝１０サ
イクル目の７２℃の蛍光強度値。（ｃ）前記（ｂ）の過程で得られた換算値を、各サイク
ル数に対してプロットし、デスプレー上に表示及び／又
は印字する過程、

【０１６６】（ｄ）前記（ｂ）の過程で得られた各サイ
クルの換算値から下記の〔数式９〕による蛍光強度の変
化率（減少率、消光率）を計算をする過程、〔数式９〕Ｆ_dn ＝ｌｏｇ₁₀｛１００−Ｃ_n×１００）｝Ｆ_dn ＝２ｌｏｇ₁₀｛１−Ｃ_n｝ただし、Ｆ_dn＝蛍光強度変化率（減少率、消光率）、Ｃ
_n＝〔数式８〕で得られた値。（ｅ）前記（ｄ）の過程で得られた換算値を、各サイク
ル数に対してプロットし、デスプレー上に表示及び／又
は印字する過程、

【０１６７】（ｆ）前記（ｄ）の過程で処理されたデー
ターの内、０．５をスレッシュホールド（ｔｈｒｅｓｈ
ｈｏｌｄ）し、その値に達したサイクル数を計算する過
程、（ｇ）前記（ｆ）の過程で計算した値をＸ軸に、反応開
始前のコピー数をＹ軸にプロットしたグラフを作成する
過程、（ｈ）前記（ｇ）の過程で作成したグラフをデスプレー
上に表示及び／又は印字する過程、（ｊ）前記（ｈ）の過程で描かれた直線の相関係数又は
関係式を計算する過程、（ｉ）前記（ｊ）の過程で計算された計算値又は関係式
をデスプレー上に表示及び／又は印字する過程。

【０１６８】上記のデーター解析用ソフトウエアを用い
て、前記図１１で得られたデーターを前記に引き続いて
以下のようにデーターを処理した。図１２は、上記
（ｂ）の過程で処理されたデーターを印字した（前記
（ｃ）過程）したものである。即ち、１０サイクル目の
蛍光強度値を１として換算し、その換算値をサイクル数
に対してプロットしたものである。図１３は、前記
（ｄ）の過程で処理したデーターを印字した（前記
（ｅ）過程）ものである。即ち、図１２の各プロット値
から蛍光強度の減少率（消光率）を計算して、各計算値
を各サイクル数に対してプロットしたものである。

【０１６９】図１４は、前記（ｆ）の過程で処理したデ
ーターについて、前記（ｇ）の過程で作成したグラフを
印字した（前記（ｈ）の過程）ものである。即ち、蛍光
強度減少率＝０．５をスレッシュホールド（threshhol
d）し、その値に達したサイクル数をＸ軸に、ヒトゲノ
ムＤＮＡの反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットした
グラフである。このグラフの直線の相関係数（Ｒ２）を
前記（ｊ）の過程で計算し、印字した（前記（ｉ）の過
程）もので、０．９５１４であった。このように、この
相関係数では正確なコピー数を求めるは無理であった。

【０１７０】実施例２２（本発明のデーター解析方法を
用いてデーター処理がなされた実験例）ＰＣＲは比較実
験例１と同様に行った。データー処理は、比較実験例１
の（ｂ）の過程の前に下記の（ａ）の過程をおき、
（ｂ）、（ｄ）の過程を以下のように変更する以外は比
較実験例１と同様な過程で行った。（ａ）各サイクルに
おける増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プライ
マーとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値
（即ち、核酸伸長反応時（７２℃）の蛍光強度値）を、
増幅した核酸が核酸プライマーとハイブリダイズしたも
のが解離したときの反応系の蛍光強度値（即ち、核酸熱
変性反応時（９５℃）の蛍光強度値）で割る補正演算処
理過程、即ち、実測の蛍光強度値を〔数式１〕で補正し
た。ｆ_n＝ｆ_hyb,n／ｆ_den,n 〔数式１〕［式中、ｆ_n＝サイクルの蛍光強度の補正値、ｆ_hyb,n＝
各サイクルの７２℃の蛍光強度値、ｆ_den,n＝各サイク
ルの９５℃の蛍光強度値］得られた値を各サイクル数にプロットしたのが図１５で
ある。

【０１７１】（ｂ）各サイクルにおける〔数式１〕にお
ける補正演算処理値を〔数式３〕に代入し、各サイクル
における各サンプル間の蛍光変化率（減少率又は消光
率）を算出する演算処理過程、即ち、下記の〔数式１
０〕で演算処理する過程、Ｆ_n＝ｆ_n／ｆ₂₅ 〔数式１０〕［式中、Ｆ_n＝各サイクルの演算処理値、ｆ_n＝〔数式
１〕で得られた各サイクルの値、ｆ₂₅＝〔数式１〕で得
られた値で、サイクル数が２５回目のもの］。〔数式１
０〕は〔数式３〕において、ａ＝２５とした場合におけ
るものである。

【０１７２】（ｄ）前記（ｂ）の過程で得られた各サイ
クルの演算処理値を〔数式６〕による蛍光強度の変化率
（減少率又は消光率）の対数値を演算処理をする過程、
即ち、下記の〔数式１１〕で演算処理する過程、ｌｏｇ₁₀｛（１−Ｆ_n）×１００｝〔数式１１〕［式中、Ｆ_n＝［数式１０］で得られた値］。〔数式１
１〕は〔数式６〕において、ｂ＝１０、Ａ＝１００とし
た場合におけるものである。

【０１７３】上記の結果を図１６及び１７に示した。図
１６は、前記（ａ）及び（ｂ）の過程で処理された値を
サイクル数に対してプロットし、印字したものである。
図１７は、図１６で得られた値について前記（ｄ）の過
程で計算された値を、サイクル数に対してプロットし、
印字したものである。

【０１７４】次に、図１７のグラフを基に、前記
（ｆ）、（ｇ）、及び（ｈ）の過程で処理した。即ち、
図１７のグラフを基に比較実験例１と同様に、ｌｏｇ₁₀
（蛍光強度変化率）のスレッシュホールド値として、
０．１、０．３、０．５、０．７、０．９、１．２を選
び、その値に達したサイクル数をＸ軸に、ヒトゲノムＤ
ＮＡの反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットし、検量
線を描かせた。その結果を図１８に示した。これらの検
量線について前記（ｊ）及び（ｉ）の過程で処理して求
めた相関係数（Ｒ²）は、前記各スレッシュホールド値
に対して、各々０．９９８、０．９９９、０．９９９
３、０．９９８５、０．９９８９、０．９９８８であっ
た。これらの相関係数から、スレッシュホールド値とし
て０．５（相関係数０．９９９３）を採用することが望
ましいことが認識できた。この相関係数をもつ検量線で
あれば、未知コピー数の核酸試料について反応開始前の
コピー数を精度よく求めることができることが分かる。

【０１７５】実施例２３（核酸の融解曲線分析及びＴｍ
値分析の例）本発明の新規なＰＣＲ法により増幅された核酸につい
て、５１）低い温度から核酸が完全に変性するまで、温
度を徐々に上げるあるいは下げる過程（例えば、５０℃
から９５℃まで）、５２）前記５１）過程において、短
い時間間隔（例えば、０．２℃〜０．５℃間隔）で蛍光
強度を測定する過程、５３）前記５２）過程の測定結果
を時間毎にデスプレー上に表示する過程、即ち、核酸の
融解曲線を表示する過程、５４）前記５３）過程の融解
曲線を一次微分する過程、５５）前記５４）過程の微分
値（−ｄＦ／ｄＴ、Ｆ：蛍光強度、Ｔ：時間）をデスプ
レー上に表示する過程、５６）前記５５）から得られる
微分値から変曲点を求める過程からなるソフトウエアを
作成し、前記本発明のデーター解析用ソフトウエアに合
体した。当該データー解析用ソフトウエアを記録したコ
ンピューター読み取り可能な記録媒体をインストールし
た前記ライトサイクラー^TMシステムを用いて本発明の新
規リアルタイム定量的ＰＣＲ反応を行い、核酸融解曲線
の分析を行った。本発明においては、蛍光強度は温度が
上がるごとに増加する。

【０１７６】実施例２２と同じヒトゲノムＤＮＡの１コ
ピーと１０コピーについて、実施例２０と同様のＰＣＲ
を行い、前記５１）、５２）、５３）、５４）及び５
５）の過程で処理されたデーターを印字したものが図１
９である。１コピーと１０コピーの７５回目の増幅産物
について、本実施例の５１）、５２）及び５３）の過程
で処理した核酸融解曲線の図が図２０である。５４）の
過程でこの曲線を微分し、５５）及び５６）の過程で変
曲点（Ｔｍ値）を求めたものが図２１である。図２１か
ら、１コピーと１０コピーの増幅産物のＴｍ値が異なる
故に、各増幅産物は異なる産物であることが判明した。

【０１７７】

【発明の効果】本発明は次のような効果を有する。１）前記のように本発明の核酸測定方法、本発明のプロ
ーブ及びデバイスを用いると、測定系から未反応の核酸
プローブを除く等の操作をすることがないので、標的核
酸を短時間でかつ簡便に測定できる。また、複合微生物
系又は共生微生物系に適用すると、当該系における特定
菌株の存在量を特異的かつ短時間に測定できる。また、
本発明は標的核酸若しくは遺伝子のＳＮＰなどの多型ま
たは変異などの解析若しくは測定する簡便な方法を提供
している。２）また、本発明の定量的ＰＣＲ方法は、次のような効
果を有する。ａ．ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる標的核酸の増幅に
阻害的に作用する因子が添加されていないことから、従
来公知の特異性のある通常のＰＣＲと同様の条件で定量
的ＰＣＲを行うことができる。ｂ．また、ＰＣＲの特異性を高く保つことができるの
で、プライマーダイマーの増幅が遅くなることから、従
来公知の定量的ＰＣＲと比較すると定量限界が約１オー
ダー低くなる。ｃ．複雑な核酸プローブを用意する必要がないので、そ
れに要する時間と費用が節約できる。ｄ．標的核酸の増幅効果も大きく、増幅過程をリアルタ
イムでモニタリングすることができる。３）また、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデ
ーターを解析する際、本発明のデーター解析方法を用い
て、未知核酸コピー数の核酸試料について核酸のコピー
数を求める検量直線を作成すると、検量線の相関係数は
従来の方法により得られたものに較べて格段に高い。そ
れで、本発明のデーター解析方法を用いると核酸の正確
なコピー数を求めることができる。４）また、本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法によ
って得られたデーターの解析方法に係るデーター解析用
ソフトウエア、また、その解析方法の手順をプログラム
として記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、
また、それを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの測定若
しくは解析装置を用いると、相関係数の高い検量直線を
自動的に作成することができる。５）また、本発明の新規な核酸の融解曲線の分析方法を
用いると、精度の高い、核酸のＴｍ値を求めることがで
きる。更に、当該方法に係るデーター解析用ソフトウエ
ア、また、その分析方法の手順をプログラムとして記録
したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それ
を用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの測定若しくは解析
装置を用いると、正確なＴｍ値を求めることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得た核酸プローブを用いて大腸菌の
１６ＳｒＲＮＡの５´末端から数えて３３５から３５８
番目の核酸塩基配列を測定した場合の蛍光強度測定デー
タを示す図。

【図２】３５塩基鎖2-o-Meプローブの標的核酸へのハイ
ブリダイゼーションに対する熱処理の効果を示す図。点線：rRNAを加熱処理後、標的核酸が添加された。実線：非加熱処理rRNA。

【図３】プローブと標的核酸１６ＳｒＲＮＡのハイブリ
ダイゼーションに対するプローブの塩基鎖の塩基数、ヘ
ルパープローブ及びプローブの５’末端のリボースの
２’位ＯＨ基のメチル基修飾の効果を示す図。

【図４】本発明方法によるｒＲＮＡ測定のための検量
線。

【図５】ＫＹＭ７株及びＫＹＭ８株の複合培養系のｒＲ
ＮＡ量の時間経過についての本発明のＦＩＳＨ方法によ
る分析。

【図６】本発明のＤＮＡチップを説明する図。

【図７】ボデピーＦＬで標識したプライマー１及び２を
用いた定量的ＰＣＲ方法：サイクル数と蛍光色素の発光
の減少量の関係を示す図。図中の〜なる記号は、下
記の意味を表す。

【図８】ボデピーＦＬで標識したプライマー１及び２を
用いた定量的ＰＣＲ方法：サイクル数と蛍光色素の発光
の減少量の対数値の関係を示す図。図中の〜なる記
号は、図７と同じ意味を表す。

【図９】本発明の定量的ＰＣＲ方法を用いて作成した大
腸菌１６ＳｒＤＮＡの検量線を示す図。ｎ：１０ⁿ

【図１０】上図は、ＦＲＥＴ現象を用いるリアルタイム
定量的ＰＣＲ方法において使用する蛍光色素で標識した
二つのプローブの代わりに、本発明の一つのプローブを
用いてリアルタイム定量的ＰＣＲを行った場合の蛍光強
度の現象率の変化を示す図である。下図は蛍光強度の現
象が有為に観察され始めるサイクル数（thresholdnumbe
r：Ct値）を算出し、検量線を作成した図である。

【図１１】本発明の補正演算処理しない場合の、本発明
のボデピーＦＬで標識したプライマーを用いたリアルタ
イム定量的ＰＣＲによって得られた蛍光減少曲線を示す
図。 ■：標的核酸＝１０コピー；蛍光強度測定の反応系の温
度＝７２℃ ●：標的核酸＝１００コピー；蛍光強度測定の反応系の
温度＝７２℃ ▲：標的核酸＝１０００コピー；蛍光強度測定の反応系
の温度＝７２℃ ◆：標的核酸＝１００００コピー；蛍光強度測定の反応
系の温度＝７２℃ □：標的核酸＝１０コピー；蛍光強度測定の反応系の温
度＝９５℃ ○：標的核酸＝１００コピー；蛍光強度測定の反応系の
温度＝９５℃ △：標的核酸＝１０００コピー；蛍光強度測定の反応系
の温度＝９５℃ ◇：標的核酸＝１００００コピー；蛍光強度測定の反応
系の温度＝９５℃

【図１２】各曲線の１０サイクル目の値を１として補正
する以外は、図１１の曲線の場合と同様にして得られた
リアルタイム定量的ＰＣＲの蛍光減少曲線を示す図。 ■：標的核酸＝１０コピー；蛍光強度測定温度＝７２℃ ●：標的核酸＝１００コピー；蛍光強度測定温度＝７２
℃ ▲：標的核酸＝１０００コピー；蛍光強度測定温度＝７
２℃ ◆：標的核酸＝１００００コピー；蛍光強度測定温度＝
７２℃

【図１３】図１２の各曲線の各プロット値について、
［数式９］の蛍光強度減少率（変化率）を計算し、計算
値をプロットした曲線を示す図。 ■：標的核酸＝１０コピー ●：標的核酸＝１００コピー ▲：標的核酸＝１０００コピー ◆：標的核酸＝１００００コピー

【図１４】図１３のデーターから求めたヒトゲノムＤＮ
Ａの検量直線を示す図。ｙ＝ヒトβ−グロビン遺伝子コピー数ｘ＝サイクル数（Ｃｔ）Ｒ²＝相関係数

【図１５】図１１の各サイクルの測定値を〔数式１〕で
補正演算処理した値を各サイクル数に対してプロットし
た曲線を示す図。 ■：標的核酸＝１０コピー ●：標的核酸＝１００コピー ▲：標的核酸＝１０００コピー ◆：標的核酸＝１００００コピー

【図１６】図１５の各サイクルの演算処理値を〔数式
３〕で演算処理した値をサイクル数に対してプロットし
た曲線を示す図。 ■：標的核酸＝１０コピー ●：標的核酸＝１００コピー ▲：標的核酸＝１０００コピー ◆：標的核酸＝１００００コピー

【図１７】図１６の各サイクルの演算処理値を〔数式
６〕の式で演算処理した値をサイクル数に対してプロッ
トした曲線を示す図。 ■：標的核酸＝１０コピー ●：標的核酸＝１００コピー ▲：標的核酸＝１０００コピー ◆：標的核酸＝１００００コピー

【図１８】図１６の各log（蛍光変化率）値からＣｔ値
の候補として、０．１、０．３、０．５、０．７、０．
９、１．２を適当に選んで、それに対応する検量直線を
描かせた場合の図。尚、各検量線における相関係数を下
記に示した。 ▲：log₁₀（蛍光変化率）＝０．１；相関係数＝０．９
９８ ■：log₁₀（蛍光変化率）＝０．３；相関係数＝０．９
９９ ●：log₁₀（蛍光変化率）＝０．５；相関係数＝０．９
９９３ △：log₁₀（蛍光変化率）＝０．７；相関係数＝０．９
９８５ □：log₁₀（蛍光変化率）＝０．９；相関係数＝０．９
９８９ ○：log₁₀（蛍光変化率）＝１．２；相関係数＝０．９
９８８

【図１９】１コピー及び１０コピーのヒトゲノムＤＮＡ
について、本発明のボデピーＦＬで標識したプライマー
を用いてリアルタイム定量的ＰＣＲを行った場合の蛍光
減少曲線を示す図。ただし、〔数式１〕の補正演算処理
を施した。１：標的核酸＝０コピー２：標的核酸＝１コピー３：標的核酸＝１０コピー

【図２０】図１９に示されるＰＣＲの増幅産物について
の核酸の融解曲線分析を行った場合の核酸の融解曲線を
示す図。１：標的核酸＝０コピー２：標的核酸＝１コピー３：標的核酸＝１０コピー

【図２１】図２０の曲線を微分して得られた、Ｔｍ値を
示す曲線を示す図（谷がＴｍ値）。２：標的核酸＝１コピー３：標的核酸＝１０コピー

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 21/77 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ４Ｂ０６３ 21/78 33/48 Ｚ 33/48 33/53 Ｍ 33/53 33/543 ５７５ 33/543 ５７５ 33/566 33/566 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＦ (31)優先権主張番号特願2000−28896(P2000−28896) (32)優先日平成12年２月１日(2000．2．1) (33)優先権主張国日本（ＪＰ） (72)発明者金川貴博茨城県つくば市東１−１−１独立行政法人産業技術総合研究所つくばセンター内 (72)発明者鎌形洋一茨城県つくば市東１−１−１独立行政法人産業技術総合研究所つくばセンター内 (72)発明者蔵田信也東京都千代田区東神田１−９−８環境エンジニアリング株式会社内 (72)発明者山田一隆東京都千代田区東神田１−９−８環境エンジニアリング株式会社内 (72)発明者横幕豊一東京都千代田区東神田１−９−８環境エンジニアリング株式会社内 (72)発明者小山修東京都千代田区東神田１−９−８環境エンジニアリング株式会社内 (72)発明者古庄健太東京都千代田区東神田１−９−８環境エンジニアリング株式会社内Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA04 DA02 EA01 FA03 FA06 GB07 GB21 KA03 KA05 NA01 NA05 2G045 AA35 BB10 BB20 BB29 BB50 DA13 FA29 FB02 FB03 FB06 FB12 GC15 JA01 2G054 AB04 BB04 CA22 CE02 EA03 GA04 4B024 AA11 CA09 HA14 4B029 AA07 BB20 CC01 FA15 4B063 QA01 QA12 QA18 QQ42 QQ52 QR32 QR56 QR62 QR82 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】蛍光色素で標識された核酸プローブが標
的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、上記蛍光
色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、か
つ、当該プローブは、その末端部において蛍光色素で標
識されており、当該核酸プローブが標的核酸にハイブリ
ダイゼーションしたとき、当該末端部において、当該プ
ローブと標的核酸とがハイブリダイゼーションした末端
塩基から１ないし３塩基離れて、標的核酸の塩基配列に
Ｇ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在するよう
に、当該プローブの塩基配列が設計されていることを特
徴とする核酸測定用核酸プローブ。
【請求項２】核酸プローブが３’末端において蛍光色
素で標識されている請求項１に記載の核酸測定用核酸プ
ローブ。
【請求項３】核酸プローブが５’末端において蛍光色
素で標識されている請求項１に記載の核酸測定用核酸プ
ローブ。
【請求項４】蛍光色素で標識された核酸プローブが標
的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、上記蛍光
色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、か
つ、当該プローブは、その末端部において蛍光色素で標
識されており、当該核酸プローブが、標的核酸にハイブ
リダイゼーションしたとき、当該末端部分においてハイ
ブリダイゼーションの塩基対がＧ（グアニン）とＣ（シ
トシン）のペアーを少なくも一対以上形成するように、
当該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴と
する核酸測定用核酸プローブ。
【請求項５】核酸プローブの３’末端塩基がＧまたは
Ｃで、かつ３’末端が蛍光色素で標識されている請求項
４に記載の核酸測定用核酸プローブ。
【請求項６】核酸プローブの５’末端塩基がＧまたは
Ｃで、かつ５’末端が蛍光色素で標識されている請求項
４に記載の核酸測定用核酸プローブ。
【請求項７】核酸プローブが、３’末端のリボース若
しくはデオキシリボースの３’炭素の水酸基、または
３’末端のリボースの３’炭素の水酸基がリン酸化され
ている請求項３または６に記載の核酸測定用核酸プロー
ブ。
【請求項８】核酸測定用核酸プローブのオリゴリボヌ
クレオチドが、２−ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド
(2-o-methyloligoribonucleotide）、ＰＮＡ、または、
他の化学的に修飾した核酸である請求項１〜７の何れか
１項に記載の核酸測定用核酸プローブ。
【請求項９】核酸測定用核酸プローブのオリゴリボヌ
クレオチドが、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレ
オチドを含むチメリックオリゴヌクレオチド（chimeric
oligonucleotide)である請求項１〜７の何れか１項に
記載の核酸測定用核酸プローブ。
【請求項１０】リボヌクレオチドが、２−ｏ−メチル
オリゴリボヌクレオチドである請求項９に記載の核酸測
定用核酸プローブ。
【請求項１１】請求項１〜７の何れか１項に記載の核
酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼー
ションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光
色素の発光の減少量を測定することを特徴とする核酸の
測定方法。
【請求項１２】請求項８〜１０の何れか１項に記載の
核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼ
ーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍
光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする核酸
の測定方法。
【請求項１３】標的核酸または遺伝子の多型（polymo
rphism）または／および変異（mutation）を解析若しく
は測定する方法において、請求項１〜１０の何れか１項
に記載の核酸プローブを標的核酸または遺伝子にハイブ
リダイゼーションさせ、蛍光強度の変化量を測定するこ
とを特徴とする標的核酸または遺伝子の多型または／お
よび変異を解析若しくは測定する方法。
【請求項１４】標的核酸または遺伝子の多型または／
および変異を解析若しくは測定する測定キットにおい
て、請求項１〜１０の何れか１項に記載の核酸プローブ
を含有することを特徴とする標的核酸若しくは遺伝子の
多型または／および変異を解析若しくは測定するキッ
ト。
【請求項１５】請求項１３に記載の方法により得られ
るデータを解析する方法において、標的核酸または遺伝
子が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイ
ズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダ
イズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正処
理する過程を有することを特徴とする標的核酸または遺
伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する
方法のためのデータ解析方法。
【請求項１６】標的核酸または遺伝子の多型または／
および変異を解析若しくは測定する測定装置において、
請求項１５に記載のデータ解析方法を実施するための手
段を有することを特徴とする標的核酸または遺伝子の多
型または／および変異を解析若しくは測定する測定装
置。
【請求項１７】請求項１５に記載の補正処理過程をコ
ンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコ
ンピュータ読取可能な記録媒体。
【請求項１８】ハイブリダイゼーション反応前にハイ
ブリダイゼーション反応実施のためのハイブリダイゼー
ション反応系にヘルパープローブを添加する請求項１２
に記載の核酸測定方法。
【請求項１９】標的核酸をその高次構造が十分に破壊
されるに適した条件で加熱処理後、核酸プローブと標的
核酸をハイブリダイゼーションさせる請求項１２に記載
の核酸測定方法。
【請求項２０】ハイブリダイゼーション反応系にヘル
パープローブを添加してなる請求項１４に記載のキッ
ト。
【請求項２１】標的核酸がＲＮＡである請求項１１、
１２、１８、１９の何れか１項に記載の核酸測定方法。
【請求項２２】請求項１〜１０の何れか１項に記載の
核酸プローブ、または一つの分子内に二つの異なった蛍
光色素を有し、標的核酸にハイブリダイゼーションして
いないときは、二つの蛍光色素の相互作用により消光若
しくは発光しているが、標的核酸にハイブリダイゼーシ
ョンすると発光若しくは消光するように設計された構造
をもつ核酸プローブを固体支持体表面に結合させ、それ
に標的核酸をハイブリダイゼーションさせて標的核酸を
測定することができるようにしたことを特徴とする核酸
測定用デバイス。
【請求項２３】請求項２２に記載の核酸測定用デバイ
スにおいて、核酸プローブが固体支持体表面にアレー状
に配列、結合させた核酸測定用デバイス（チップ）。
【請求項２４】固体支持体表面に結合させられた核酸
プローブ毎に、反対側の表面に少なくとも一つの温度セ
ンサーとヒーターが設置され、核酸プローブ結合領域が
最適温度条件になるように温度調節され得る請求項２
２、または２３に記載の核酸測定用デバイス。
【請求項２５】核酸プローブを蛍光色素で標識してい
ない端部で固体支持体表面に結合させた請求項２２〜２
４の何れか１項に記載の核酸測定用デバイス。
【請求項２６】請求項２２〜２５の何れか１項に記載
の核酸測定用デバイスを用いて標的核酸を測定すること
を特徴とする核酸の測定方法。
【請求項２７】請求項１１、１２、１８、１９、２
１、２６の何れか１項に記載の核酸の測定方法におい
て、標的核酸が、純粋分離して得た微生物由来、または
動物由来であることを特徴とする核酸の測定方法。
【請求項２８】標的核酸が、複合微生物系、または共
生微生物系の細胞内若しくは細胞のホモジネートの核酸
である請求項１１、１２、１８、１９、２１、２６の何
れか１項に記載の核酸の測定方法。
【請求項２９】ＰＣＲ方法において、請求項１、２、
４、５、７〜１０の何れか１項に記載の核酸プローブを
用いて反応を行い、核酸伸長反応時当該プローブがポリ
メラーゼにより分解除去されている反応系または核酸変
性反応時若しくは核酸変性反応が完了している反応系の
蛍光強度値と標的核酸若しくは増幅標的核酸が該核酸プ
ローブとハイブリダイズしているときの反応系の蛍光強
度値を測定し、前者からの蛍光強度値の減少率を算出す
ることを特徴とするＰＣＲ方法で増幅された核酸の測定
方法。
【請求項３０】ＰＣＲ方法において、請求項３または
６に記載の核酸プローブをプライマーとして反応を行
い、当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸がハ
イブリダイズしていない反応系の蛍光強度値と該核酸プ
ローブが標的核酸若しくは増幅標的核酸とハイブリダイ
ズしているときの反応系の蛍光強度値を測定し、前者の
蛍光強度値の減少率を算出することを特徴とするＰＣＲ
方法で増幅された核酸の測定方法。
【請求項３１】ＰＣＲ方法がリアルタイム定量的ＰＣ
Ｒ方法である請求項２９または３０に記載のＰＣＲ方法
で増幅された核酸の測定方法。
【請求項３２】請求項１１、１２、１８、１９、２
１、２６〜３１の何れか１項に記載の核酸測定方法で得
られたデーターを解析する方法において、標的核酸が蛍
光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズした
ときの反応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダイズし
たものが解離したときの反応系の蛍光強度値により補正
することを特徴とする核酸測定方法のためのデータ解析
方法。
【請求項３３】請求項３１に記載のリアルタイム定量
的ＰＣＲ方法で得られたデーターを解析する方法におい
て、各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素と結合
したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識され
た核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍
光強度値を、各サイクルにおける前記の結合したもの、
あるいは前記のハイブリダイズしたものが解離したとき
の反応系の蛍光強度値により補正する演算処理過程（以
下、補正演算処理過程という。）を有することを特徴と
するリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析
方法。
【請求項３４】請求項３３に記載の補正演算処理過程
が、次の〔数式１〕あるいは〔数式２〕によるものであ
る請求項３３に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法の
ためのデータ解析方法。ｆ_n＝ｆ_hyb,n／ｆ_den,n 〔数式１〕ｆ_n＝ｆ_den,n／ｆ_hyb,n 〔数式２〕〔式中、ｆ_n：〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出された
ｎサイクルにおける補正演算処理値、ｆ_hyb,n：ｎサイクルにおける、増幅した核酸が蛍光色
素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で
標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反
応系の蛍光強度値、ｆ_den,n：ｎサイクルにおける、前記の結合したもの、
あるいはハイブリダイズしたものが解離したときの反応
系の蛍光強度値〕。
【請求項３５】請求項３１に記載のリアルタイム定量
的ＰＣＲ方法で得られたデーターを解析する方法におい
て、各サイクルにおける〔数式１〕あるいは〔数式２〕
における補正演算処理値を次の〔数式３〕あるいは〔数
式４〕に代入し、各サイクルにおける各サンプル間の蛍
光変化割合あるいは蛍光変化率を算出し、それらを比較
することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法の
ためのデータ解析方法。Ｆ_n＝ｆ_n／ｆ_a 〔数式３〕Ｆ_n＝ｆ_a／ｆ_n 〔数式４〕〔式中、Ｆ_n：ｎサイクルにおける、〔数式３〕あるい
は〔数式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍
光変化率、ｆ_n：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による
補正演算処理値ｆ_a：〔数式１〕あるいは〔数式２〕に
よる補正演算処理値で、ｆ_nの変化が観察される以前の
任意のサイクル数のもの〕。
【請求項３６】請求項３１に記載のリアルタイム定量
的ＰＣＲ方法で得られたデーターを解析する方法におい
て、１）〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出され
た蛍光変化割合あるいは蛍光変化率のデーターを用い
て、〔数式５〕、〔数式６〕あるいは〔数式７〕による
演算処理する過程、ｌｏｇ_b（Ｆ_n）、ｌｎ（Ｆ_n）〔数式５〕ｌｏｇ_b｛（１−Ｆ_n）×Ａ｝、ｌｎ｛（１−Ｆ_n）×Ａ｝〔数式６〕ｌｏｇ_b｛（Ｆ_n−１）×Ａ｝、ｌｎ｛（Ｆ_n−１）×Ａ｝〔数式７〕〔式中、Ａ、ｂ：任意の数値、Ｆ_n：〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された
ｎサイクルにおける蛍光変化割合あるいは蛍光変化
率〕、２）前記１）の演算処理値が一定値に達したサイクル数
を求める演算処理過程、３）既知濃度の核酸試料におけるサイクル数と反応開始
時の標的核酸のコピー数の関係式を計算する演算処理過
程、４）未知試料におけるＰＣＲ開始時の標的核酸のコピー
数を求める演算処理過程、を有することを特徴とするリ
アルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。
【請求項３７】標的核酸について請求項１〜１０の何
れか１項に記載の核酸プローブを用いてＰＣＲ方法を行
い、増幅核酸について核酸の融解曲線の分析を行ってＴ
ｍ値を求めることを特徴とする核酸の融解曲線の分析方
法。
【請求項３８】標的核酸について請求項３または６に
記載の核酸プローブをプライマーとして用いてＰＣＲ方
法を行い、その増幅核酸について核酸の融解曲線の分析
を行ってＴｍ値を求めることを特徴とする核酸の融解曲
線の分析方法。
【請求項３９】請求項３３〜３６の何れか１項に記載
のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデーター解析
方法において、請求項３７および／または３８に記載の
核酸の融解曲線の新規分析方法により、核酸の融解曲線
を分析する過程、即ち、本発明のＰＣＲ方法により増幅
された核酸について、低い温度から核酸が完全に変性す
るまで、温度を徐々に上げる過程、この過程において、
時間間隔で蛍光強度を測定する過程、測定結果を時間毎
にデスプレー上に表示する過程（核酸の融解曲線を表示
する過程）、この融解曲線を一次微分する過程、その値
（−ｄＦ／ｄＴ、Ｆ：蛍光強度、Ｔ：時間）を微分値と
してデスプレー上に表示する過程、その微分値から変曲
点を求める過程、を有することを特徴とするリアルタイ
ム定量的ＰＣＲ方法のためのデーター解析方法。
【請求項４０】請求項３３に記載のデータ解析方法に
よりデータを解析する過程、請求項３４に記載のデータ
解析方法によりデータを解析する過程、請求項３５に記
載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求
項３６に記載のデータ解析方法によりデータを解析する
過程、請求項３９に記載のデータ解析方法によりデータ
を解析する過程、を有することを特徴とするリアルタイ
ム定量的ＰＣＲの測定および／または解析装置。
【請求項４１】請求項３３に記載のデータ解析方法に
よりデータを解析する過程、請求項３４に記載のデータ
解析方法によりデータを解析する過程、請求項３５に記
載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求
項３６に記載のデータ解析方法によりデータを解析する
過程、請求項３９に記載のデータ解析方法によりデータ
を解析する過程を、コンピュータに実行させるためのプ
ログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体。
【請求項４２】核酸定量方法において、請求項３３〜
３６、３９の何れか１項に記載のリアルタイム定量的Ｐ
ＣＲ方法のためのデータ解析方法を利用することを特徴
とする核酸の定量方法。
【請求項４３】核酸定量方法において、請求項４０に
記載の装置を利用することを特徴とする核酸の定量方
法。
【請求項４４】核酸定量方法において、請求項４１に
記載のコンピュータ読取可能な記録媒体を用いることを
特徴とする核酸の定量方法。