JP5272230B2 - ユニバーサルな核酸プローブセットおよびその使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子工学の分野に関し、より詳しくは核酸の分析のために用いる核酸プローブセットおよびその使用方法に関する。

標的核酸の検出方法においては、標的核酸と特異的にハイブリダイズするように塩基配列が設計され、かつ蛍光物質で標識された一本鎖核酸プローブが広く用いられている。一本鎖核酸プローブの一例に、プローブを標識する蛍光物質として、グアニンの近傍にあるときにはグアニンの作用により通常の状態と比べ発蛍光が弱められる蛍光物質を用いるＱ−プローブ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ）がある。Ｑ−プローブを測定対象の溶液に加え、蛍光測定をすることにより簡便にＳＮＰタイピングや遺伝子の定量を行うことができる。Ｑ−プローブは、プローブの構造がシンプルであること、プローブ設計にトライ・アンド・エラーが不要であることおよび精度の高い測定結果が得られるという優れた利点がある（例えば、特許文献１および特許文献２を参照のこと）。

しかし、このような従来の一本鎖核酸プローブは、対象とする標的核酸ごとに、異なる塩基配列をもつ蛍光標識核酸プローブを用意しなければならない。また、蛍光標識した核酸プローブは、比較的高価であり、その合成に長時間を要するという問題点があるため、それを用いた実験もコストがかかり、準備に時間を要するという問題点がある。

そこで、本発明者らは、Ｑ−プローブを複数の核酸からなる複合体として設計することを提案した。具体的には、蛍光プローブ（Ａ）と、蛍光プローブに相補的な蛍光プローブ結合領域（ｂ１）及び標的核酸配列（Ｃ）に相補的な配列（ｂ２）を有するバインディングプローブ（Ｂ）とからなる核酸プローブセット（ユニバーサルＱ−プローブセット）を設計し、その実用化に取り組んでいる。

特許第３４３７８１６号公報 特許第３９６３４２２号公報

ユニバーサルＱ−プローブセットをリアルタイムＰＣＲ実験に使用することにより、プローブ調製に要する費用を劇的に低減することができる。しかし、ユニバーサルＱ−プローブセットを用いた場合の蛍光消光率は、従来の一本鎖Ｑ−プローブを用いた場合の２分の１から３分の１程度にとどまり、実用化のために蛍光消光率の改善が望まれている。
従って、本発明の第１の目的は、ユニバーサルＱ−プローブセットの蛍光消光率を従来の一本鎖Ｑ−プローブと同程度に向上させること及びその設計方法を提供し、さらにはその使用方法を提供することである。
本発明の第２の目的は、水系において解離しない安定な複合体を形成することができるオリゴヌクレオチドを提供し、さらにはその使用方法を提供することである。
本発明の第３の目的は、ユニバーサルＱ−プローブセットの蛍光消光率を向上させることおよびその設計方法を提供し、さらにはその使用方法を提供することである。

上記第１の目的は、以下の本発明によって達成される。すなわち、本発明の第１の態様は、蛍光物質（ｄ）で標識されたヌクレオチド（ａ）を含むオリゴヌクレオチドからなる蛍光プローブ（Ａ）、及び、該蛍光プローブ（Ａ）にハイブリダイズする蛍光プローブ結合領域（ｂ１）と、標的核酸配列（Ｃ）にハイブリダイズする標的核酸結合領域（ｂ２）とを有するオリゴヌクレオチドからなるバインディングプローブ（Ｂ）からなり、上記蛍光物質（ｄ）が、グアニンと相互作用することにより蛍光キャラクターが変化する蛍光物質であり、上記蛍光プローブ（Ａ）を構成するヌクレオチドの少なくとも１つが該プローブ（Ａ）と蛍光プローブ結合領域（ｂ１）との解離温度を上昇させる機能を有する人工ヌクレオチドであることを特徴とする核酸プローブセットを提供する。

上記本発明の第１態様の核酸プローブセットにおいては、解離温度を上昇させる機能を有する人工ヌクレオチドが、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＥＮＡ、２’，４’−ＢＮＡ^NCおよび２’，４’−ＢＮＡ^COCからなる群より選ばれる１種以上の人工ヌクレオチドであることが好ましい。

また、上記本発明の第１態様の核酸プローブセットにおいては、蛍光プローブ（Ａ）を構成するヌクレオチドの３分の１以上が人工ヌクレオチドであることが好ましく、８０％以上であることがより好ましい。

また、本発明の第１態様の核酸プローブセットにおいては、前記蛍光物質（ｄ）が、フルオレセイン、フルオレセイン−４−イソチオシアネート、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、テトラブロモスルホンフルオレセイン、EDANS（5-(2-アミノエチルアミノ)-1-ナフタレンスルホン酸）、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン（６−ＪＯＥ）、3,6-ジアミノ-9-[2,4-ビス(リチオオキシカルボニル)フェニル]-4-(リチオオキシスルホニル)-5-スルホナトキサンチリウム/3,6-ジアミノ-9-[2,5-ビス(リチオオキシカルボニル)フェニル]-4-(リチオオキシスルホニル)-5-スルホナトキサンチリウム、[2,3,3,7,7,8-ヘキサメチル-5-[4-[5-(2,5-ジオキソ-3-ピロリン-1-イル)ペンチルカルバモイル]フェニル]-2,3,7,8-テトラヒドロ-9-アゾニア-1H-ピラノ[3,2-f:5,6-f']ジインドール-10,12-ジスルホン酸12-ナトリウム]アニオン、2-オキソ-6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-2H-1-ベンゾピラン-3-カルボン酸、ローダミン６Ｇ、カルボキシローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミンおよび4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸からなる群から選択されるいずれかであることが好ましい。

また、本発明の第１態様の核酸プローブセットにおいては、前記標的核酸結合領域（ｂ２）が、バインディングプローブ（Ｂ）の５’末端側にあり、かつ、前記蛍光物質（ｄ）で標識されたヌクレオチド（ａ）が、前記蛍光プローブ（Ａ）の３’末端ヌクレオチドであることが好ましい。

また、本発明の第１態様は、以下の工程（１）〜（４）を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法を提供する。
（１）前記本発明の第１態様の核酸プローブセットと標的核酸とをハイブリダイズさせる工程、
（２）次いで上記ハイブリダイズした上記核酸プローブセットと上記標的核酸との複合体の蛍光強度を測定する工程、
（３）上記核酸プローブセットと上記標的核酸との比率を変えて、上記工程（１）および（２）を行う工程、
（４）上記工程（２）および（３）より得られた蛍光強度を比較する工程。

また、本発明の第１態様は、以下の工程（１）〜（４）を包含することを特徴とする核酸の塩基配列多型の分析方法を提供する。
（１）前記本発明の第１態様の核酸プローブセットと標的核酸とをハイブリダイズさせる工程、
（２）次いで上記ハイブリダイズした上記核酸プローブセットと上記標的核酸との複合体について蛍光強度の温度依存性を測定する工程、
（３）上記標的核酸に代えて別の核酸を用いて、上記工程（１）および（２）を行う工程、
（４）上記工程（２）および（３）より得られた蛍光強度の温度依存性を比較する工程。

また本発明の第１態様は、前記本発明の第１態様の核酸プローブセットと標的核酸との複合体について融解曲線分析を行うことを特徴とする方法を提供する。

本発明の第２態様は、標識物質（ｈ）で標識されたヌクレオチド（ａ’）を含み、一部または全てのヌクレオチドが、相補鎖からの解離温度を上昇させる機能を有する人工ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドプローブであって、常圧条件下で、相補鎖との解離温度が１００℃以上であることを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブを提供する。

本発明の第２態様においては、相補鎖からの解離温度を上昇させる機能を有する人工ヌクレオチドが、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＥＮＡ、２’，４’−ＢＮＡ^NCおよび２’，４’−ＢＮＡ^COCからなる群より選ばれる１種以上の人工ヌクレオチドであること；前記標識物質（ｈ）が蛍光物質、クエンチャー物質、タンパク質または官能基であることが好ましい。

また、本発明の第２態様は、上記本発明の第２態様のオリゴヌクレオチドプローブを、相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（Ｅ）とハイブリダイズさせることにより、該オリゴヌクレオチド（Ｅ）を前記標識物質（ｈ）で標識する方法；前記標識物質（ｈ）が、グアニンと相互作用することにより蛍光キャラクターが変化する蛍光物質である上記本発明の第２態様のオリゴヌクレオチドプローブを、蛍光プローブ（Ａ）として用いる本発明の第１態様の核酸プローブセットを提供する。

本発明の第３態様は、蛍光物質（ｄ）で標識されたヌクレオチド（ａ）を含むオリゴヌクレオチドからなる１本の蛍光プローブ（Ａ）、および、該蛍光プローブ（Ａ）にハイブリダイズする１つの蛍光プローブ結合領域（ｂ１）と、標的核酸配列（Ｃ）にハイブリダイズする１つの標的核酸結合領域（ｂ２）とを有するオリゴヌクレオチドからなる１本のバインディングプローブ（Ｂ）からなり、上記蛍光物質（ｄ）が、グアニンと相互作用することにより蛍光キャラクターが変化する蛍光物質であり、上記ヌクレオチド（ａ）が、蛍光プローブ（Ａ）の３’末端ヌクレオチドであり、上記標的核酸結合領域（ｂ２）が、上記バインディングプローブ（Ｂ）の５’末端側にあることを特徴とする核酸プローブセットを提供する。

本発明の第１態様によれば、従来の一本鎖Ｑ−プローブと同程度まで、蛍光消光率が改善されたユニバーサルＱ−プローブセットが提供される。本発明の第１態様のユニバーサルＱ−プローブセットを一本鎖Ｑ−プローブの代わりとして使用することにより、リアルタイムＰＣＲ実験に要するコストを大幅に削減することができる。
本発明の第２態様によれば、水系において解離しない安定な複合体を形成することができるオリゴヌクレオチドが提供される。
本発明の第３態様によれば、蛍光消光率が改善されたユニバーサルＱ−プローブセットが提供される。本発明の第３態様のユニバーサルＱ−プローブセットを従来の一本鎖Ｑ−プローブの代わりとして使用することにより、リアルタイムＰＣＲ実験に要するコストを大幅に削減することができる。

標的核酸（Ｃ）とハイブリダイズする前の本発明の第１態様の核酸プローブセット複合体を示す模式図である。 本発明の第１態様の核酸プローブセット複合体の蛍光物質（ｄ）近傍を拡大して示す模式図である。 標的核酸結合領域が５’末端側に位置するバインディングプローブを有する本発明の第１態様の核酸プローブセット複合体を示す模式図である。 標的核酸結合領域が３’末端側に位置するバインディングプローブを有する本発明の第１態様の核酸プローブセット複合体を示す模式図である。 蛍光プローブ結合領域を２つ有するバインディングプローブと２つの蛍光プローブとからなる本発明の第１態様の核酸プローブセット複合体を示す模式図である。 実施例１で使用した本発明の第１態様の核酸プローブセットと標的核酸配列とがハイブリダイズするときの模式図である。 βグロビン遺伝子を標的核酸とする本発明の第１態様の核酸プローブセットを用いてリアルタイムＰＣＲ増幅を行い、蛍光消光率をプロットしたグラフである。 βグロビン遺伝子を標的核酸とし、ＤＮＡのみから構成された蛍光プローブを有する核酸プローブセットを用いてリアルタイムＰＣＲ増幅を行い、蛍光消光率をプロットしたグラフである。 βアクチン遺伝子の一部を標的核酸配列とする本発明の第１態様の核酸プローブセットを用いてリアルタイムＰＣＲ増幅を行い、蛍光消光率をプロットしたグラフである。 βアクチン遺伝子の一部を標的核酸配列とし、ＤＮＡのみから構成された蛍光プローブを有する核酸プローブセットを用いてリアルタイムＰＣＲ増幅を行い、蛍光消光率をプロットしたグラフである。 融解曲線分析の結果を示すグラフである。 標的核酸（Ｃ）とハイブリダイズする前の本発明の第３態様の核酸プローブセット複合体を示す模式図である。 本発明の第３態様の核酸プローブセット複合体の蛍光物質（ｄ）近傍を拡大して示す模式図である。 蛍光プローブ結合領域（ｂ１）が３’末端側に位置するバインディングプローブ（Ｂ）を有する本発明の第３態様の核酸プローブセット複合体を示す模式図である。 蛍光プローブ結合領域（ｂ１）が５’末端側に位置するバインディングプローブ（Ｂ）を有する核酸プローブセット複合体を示す模式図である。 実施例５で使用した本発明の第３態様の核酸プローブセットと標的核酸配列とがハイブリダイズするときの模式図である。 βグロビン遺伝子を標的核酸とする本発明の第３態様の核酸プローブセットを用いてリアルタイムＰＣＲ増幅を行い、蛍光消光率をプロットしたグラフである。 βグロビン遺伝子を標的核酸とする比較例３の核酸プローブセットを用いてリアルタイムＰＣＲ増幅を行い、蛍光消光率をプロットしたグラフである。 融解曲線分析の結果を示すグラフである。 応用例１の概要を示す模式図である。 応用例２の蛍光プローブとバインディングプローブを示す模式図である。 応用例２の蛍光プローブとバインディングプローブがハイブリダイズした状態を示す模式図である。 応用例２の核酸プローブセットが標的核酸に結合した状態を示す模式図である。 応用例３の蛍光プローブとバインディングプローブを示す模式図である。 応用例３の蛍光プローブとバインディングプローブがハイブリダイズした状態を示す模式図である。 応用例３の核酸プローブセットが標的核酸に結合した状態を示す模式図である。 応用例４の蛍光プローブとバインディングプローブを示す模式図である。 応用例４の蛍光プローブとバインディングプローブがハイブリダイズした状態を示す模式図である。 応用例４の核酸プローブセットが標的核酸に結合した状態を示す模式図である。 応用例５の蛍光プローブとバインディングプローブを示す模式図である。 応用例５の蛍光プローブとバインディングプローブがハイブリダイズした状態を示す模式図である。 応用例５の核酸プローブセットが標的核酸に結合した状態を示す模式図である。 ＡＤＲＢ２遺伝子多型の融解曲線分析の結果を示すグラフである。 ＡＤＲＢ３遺伝子多型の融解曲線分析の結果を示すグラフである。 ＵＣＰ１遺伝子多型の融解曲線分析の結果を示すグラフである。

次に、本発明を実施するための最良の形態を、図面を参照しながら説明する。なお、本発明において、上記蛍光プローブ（Ａ）と上記バインディングプローブ（Ｂ）とがハイブリダイズした複合体を「核酸プローブセット複合体」と呼ぶことがある。

また、本発明において「ヌクレオチド」というときは、ＤＮＡの構成単位であるデオキシリボヌクレオチドおよびＲＮＡの構成単位であるリボヌクレオチドに限られず、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）やペプチド核酸（ＰＮＡ）のような人工的に合成されたモノマーをも含むものとする。「オリゴヌクレオチド」というときは、ヌクレオチドモノマーから構成されるオリゴマーのことをいい、このオリゴマーは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ＬＮＡまたはＰＮＡのみから構成されていてもよいし、これらのキメラ分子であってもよい。

本発明でいう「標的核酸」とは、定量、分析等の対象となる核酸のことをいい、種々の核酸または遺伝子の一部である場合も含むものとする。標的核酸を構成するモノマーは、その種類はいかなるものでもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ＬＮＡ、ＰＮＡおよび人工的に修飾された核酸などを挙げることができる。

また、本発明でいう「標的核酸配列（Ｃ）」とは、標的核酸中の塩基配列領域であって、本発明の核酸プローブセットを構成するバインディングプローブ（Ｂ）の標的核酸結合領域（ｂ２）と特異的にハイブリダイズする塩基配列領域を意味する。また、本発明でいう常圧とは、１気圧のことをいう。

＜本発明の第１態様＞
本発明の第１態様の核酸プローブセットの一例を図１、３〜６に示す。これらの図中、（Ａ）は蛍光プローブ、（Ｂ）はバインディングプローブ、（Ｃ）は標的核酸配列、（ｄ）が蛍光物質である。

本発明の第１態様の核酸プローブセットは、蛍光プローブ（Ａ）とバインディングプローブ（Ｂ）とからなる。バインディングプローブ（Ｂ）は蛍光プローブ（Ａ）に相補的な塩基配列を持つ蛍光プローブ結合領域（ｂ１）と、標的核酸配列（Ｃ）に相補的な塩基配列を持つ標的核酸結合領域（ｂ２）を有する。

本発明の第１態様の核酸プローブセットを構成する蛍光プローブ（Ａ）は、蛍光物質（ｄ）で標識されたヌクレオチド（ａ）を含むオリゴヌクレオチドである。当該蛍光プローブ（Ａ）の塩基配列は、バインディングプローブ（Ｂ）の蛍光プローブ結合領域（ｂ１）とハイブリダイズするものであれば特に制限されず、検出または分析対象の標的核酸の塩基配列に依存しない。従って、本発明の第１態様の核酸プローブセットを構成する蛍光プローブ（Ａ）は、特定の標的核酸に対応する塩基配列を持つ必要がなく、標的核酸が異なっても同じ塩基配列の蛍光プローブ（Ａ）を使用することができる。このため、本発明者らは、本発明の第１態様の核酸プローブセットをユニバーサルな核酸プローブセットと呼んでいる。本発明の第１態様の核酸プローブセットを用いて、標的核酸の分析を行う場合、高価な蛍光物質を有する蛍光プローブを検出または分析対象の標的核酸ごとに調製せずにすみ、製造コストを抑えることができるという利点がある。

上記蛍光プローブ（Ａ）は、その構成要素のヌクレオチドモノマーのうち少なくとも１つを該プローブ（Ａ）と蛍光プローブ結合領域（ｂ１）との解離温度を上昇させる機能を有する人工ヌクレオチドとする。蛍光プローブ（Ａ）が上記人工ヌクレオチドを含むことにより蛍光プローブ結合領域（ｂ１）とのＴｍが高くなる。このため、蛍光プローブ中（Ａ）の人工ヌクレオチドの割合を高めることにより蛍光プローブ（Ａ）とバインディングプローブ（Ｂ）とのＴｍを容易に標的核酸配列（Ｃ）と標的核酸結合領域（ｂ２）とのＴｍより高くすることができ、高温での本発明の第１態様の核酸プローブセットの安定性を高め、蛍光プローブとしての信頼性を向上させることができる。

また、蛍光プローブ（Ａ）中の人工ヌクレオチドの割合を高めることにより、蛍光プローブ（Ａ）とバインディングプローブ（Ｂ）とのＴｍをＰＣＲの熱変性温度（例えば９５℃）より高くすることができ、ＰＣＲサイクルの間常に安定な核酸プローブセット複合体とすることができる。

このような、蛍光プローブ（Ａ）と蛍光プローブ結合領域（ｂ１）との解離温度を上昇させる機能を有する人工ヌクレオチドの例としては、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＥＮＡ、２’，４’−ＢＮＡ^NCおよび２’，４’−ＢＮＡ^COCを挙げることができる。

ＬＮＡモノマーはリボースの２’部位の酸素原子と４’部位の炭素原子がメチレンを介して結合した２つの環状構造を持つヌクレオチドである。ＬＮＡモノマーは、２つの環状構造を持つため構造の自由度が少なく、ＤＮＡやＲＮＡと比べて相補鎖と強くハイブリダイズする。このため、ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドの塩基をＬＮＡに置換することで、当該ヌクレオチドと相補鎖とのＴｍが上昇することが知られている。

ＰＮＡは、ペプチド核酸（peptide nucleic acid）の略で、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンがアミド結合で結合した構造を主鎖とし、塩基部分（プリン環またはピリミジン環）が主鎖の窒素に−ＣＯＣＨ₂−を介して結合した構造を持っている。ＤＮＡやＲＮＡとは異なり、リン酸部位の電荷が存在しないため、相補鎖との静電反発が少なく、ＤＮＡをＰＮＡに置換すると相補鎖との解離温度が上昇する。

ＥＮＡは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓの略で、フラノース環の２位のＯと４位のＣをエチレンで架橋した構造を持っている。ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドの塩基をＥＮＡに置換することで、相補鎖とのＴｍが上昇することが知られている。

ＢＮＡはＢｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）の略で、２’，４’−ＢＮＡ^NCはフラノース環の２位のＯから４位のＣに対して−ＮＲＣＨ₂−（Ｒはメチル基）で架橋した構造を、２’，４’−ＢＮＡ^COCは、フラノース環の２位のＯと４位のＣを−ＣＨ₂ＯＣＨ₂−で架橋した構造を持っている。これらの人工ヌクレオチドも、ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドのＤＮＡモノマーと置換することで、相補鎖とのＴｍが上昇することが知られている。

蛍光プローブ（Ａ）とバインディングプローブ（Ｂ）とのＴｍをＰＣＲの熱変性温度より高くするための蛍光プローブ（Ａ）中の上記人工ヌクレオチドの割合は、蛍光プローブ（Ａ）の塩基数や塩基配列にも依存し、一概には言えないが、全ヌクレオチドの３分の１以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましい。

また、蛍光プローブ（Ａ）中の上記人工ヌクレオチドの割合を高めることにより、蛍光プローブ（Ａ）と蛍光プローブ結合領域（ｂ１）との相互作用が強くなるため、蛍光プローブ（Ａ）がＤＮＡのみから構成されている場合と比べ、蛍光プローブ（Ａ）と蛍光プローブ結合領域（ｂ１）の塩基数を短くすることができる。これにより塩基数の多いバインディングプローブ（Ｂ）の合成時のエラーを抑え、収率を高めることができ、本発明の第１態様のプローブセットの製造費用の低減につながる。

本発明の第１態様においては、蛍光プローブ（Ａ）に標識する蛍光物質（ｄ）は、グアニンと相互作用したときに、該蛍光物質（ｄ）の蛍光キャラクターが変化するものを使用する。なお、本発明において、「蛍光キャラクター」とは、蛍光強度のことを意味し、「グアニンと蛍光物質とが相互作用して蛍光物質の蛍光キャラクターが変化する」とは、グアニンと蛍光物質とが相互作用していない状態での蛍光物質の蛍光強度と、相互作用している状態での蛍光強度とが異なることを意味し、その程度は限定しないものとする。また、蛍光の「消光」とは、蛍光物質がグアニンと相互作用しない場合と比べて、グアニンと相互作用したときに蛍光強度が減衰することを意味し、その程度は限定しないものとする。

本発明の第１態様の核酸プローブセットに好適に使用できる蛍光物質の例としては、フルオレセインおよびその誘導体（例えば、フルオレセイン−４−イソチオシアネート（FITC）、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、テトラブロモスルホンフルオレセイン（TBSF）およびそれらの誘導体）、EDANS（5-(2-アミノエチルアミノ)-1-ナフタレンスルホン酸）、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン（６−ＪＯＥ）、3,6-ジアミノ-9-[2,4-ビス(リチオオキシカルボニル)フェニル]-4-(リチオオキシスルホニル)-5-スルホナトキサンチリウム/3,6-ジアミノ-9-[2,5-ビス(リチオオキシカルボニル)フェニル]-4-(リチオオキシスルホニル)-5-スルホナトキサンチリウム（インビトロジェン社から「Alexa Fluor 488」として入手できる）、[2,3,3,7,7,8-ヘキサメチル-5-[4-[5-(2,5-ジオキソ-3-ピロリン-1-イル)ペンチルカルバモイル]フェニル]-2,3,7,8-テトラヒドロ-9-アゾニア-1H-ピラノ[3,2-f:5,6-f']ジインドール-10,12-ジスルホン酸12-ナトリウム]アニオン（インビトロジェン社から「Alexa Fluor 532」として入手できる）、Cy3（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）、Cy5（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）、2-オキソ-6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-2H-1-ベンゾピラン-3-カルボン酸（インビトロジェン社から「Pacific Blue」として入手できる）、ローダミン６Ｇ（R6G）およびその誘導体（例えば、カルボキシローダミン６Ｇ（CR6G）、テトラメチルローダミン（TMR）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TMRITC）、ｘ−ローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA））、テキサスレッド（インビトロジェン社）、4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸（インビトロジェン社から「BODIPY-FL」として入手できる）、BODIPY-FL/C3（インビトロジェン社）、BODIPY-FL/C6（インビトロジェン社）、BODIPY-5-FAM（インビトロジェン社）、BODIPY-TMR（インビトロジェン社）、BODIPY-TR（インビトロジェン社）、BODIPY-R6G（インビトロジェン社）、BODIPY564（インビトロジェン社）並びにBODIPY581（インビトロジェン社）を挙げることができる。

これらの中でも、フルオレセイン、フルオレセイン−４−イソチオシアネート、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、テトラブロモスルホンフルオレセイン、EDANS、6-JOE、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Pacific Blue、ローダミン６Ｇ、カルボキシローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミンまたはBODIPY-FLを使用することがより好ましく、Pacific Blue、カルボキシローダミン６ＧまたはBODIPY-FLを使用することが特に好ましい。

バインディングプローブ（Ｂ）の標的核酸結合領域（ｂ２）は、本発明の核酸プローブセット複合体が標的核酸配列（Ｃ）とハイブリダイズしたときに、蛍光物質（ｄ）と標的核酸中のグアニン塩基とが接することができるように設計する。この結果、本発明の核酸プローブセット複合体と標的核酸配列（Ｃ）とがハイブリダイズしたときに、蛍光物質（ｄ）の蛍光が上記グアニン塩基により消光され、この消光現象を検出することにより、標的核酸を定量することができる。

蛍光物質（ｄ）と相互作用して蛍光消光作用を及ぼすグアニンは、標的核酸中にあれば、標的核酸配列（Ｃ）の塩基配列中にあっても、標的核酸配列（Ｃ）の外側の塩基配列中にあってもよい。上記グアニンが、標的核酸配列（Ｃ）中にあり、ハイブリダイズしたバインディングプローブ（Ｂ）のシトシンと塩基対を形成している場合、蛍光物質（ｄ）とグアニンとの相互作用が幾分低下するが特に問題はなく、さらには上記グアニンが、標的核酸の塩基配列領域の外側にあるなどの理由で塩基対を形成していない場合、蛍光物質（ｄ）とグアニンとの相互作用が容易となるのでより好ましい。

次に、図２を用いて、本発明の第１態様の核酸プローブセット複合体と標的核酸配列（Ｃ）とがハイブリダイズしている場合に、蛍光物質（ｄ）と標的核酸中のグアニン塩基を持つ任意のヌクレオチド（以下、「ヌクレオチドδ」と略す。）とが相互作用できる条件について説明する。なお、以下の説明のケースでは、標的核酸配列（Ｃ）の５’末端のグアニン塩基を持つヌクレオチドがヌクレオチドδである。

図２は、図１の蛍光物質（ｄ）の周辺部分を拡大して表示したものである。蛍光物質（ｄ）とヌクレオチドδとが相互作用できる条件は、後述する蛍光物質（ｄ）と蛍光物質（ｄ）で標識されたヌクレオチド（ａ）とを結ぶスペーサーの長さにも依存し、一定しないが、一般化すると以下のように表現できる。

蛍光プローブ（Ａ）とバインディングプローブ（Ｂ）とがハイブリダイズしている場合において、蛍光プローブ（Ａ）と塩基対を形成している蛍光プローブ結合領域（ｂ１）中のヌクレオチドであって、標的核酸結合領域（ｂ２）に最も近いヌクレオチドをヌクレオチドαとする。このヌクレオチドαと、ヌクレオチド（ａ）と塩基対を形成しているバインディングプローブ（Ｂ）中の塩基との距離を塩基数で表わした数をＸとする。なお、隣接しているヌクレオチドを「Ｘ＝１」とカウントし、１塩基を挟み隣接しているヌクレオチドを「Ｘ＝２」とカウントする。
図２においては、ヌクレオチドαと、ヌクレオチド（ａ）と塩基対を形成しているバインディングプローブ（Ｂ）中のヌクレオチドとはともに蛍光プローブ結合領域（ｂ１）の５’末端にあるチミン塩基を持つヌクレオチドであるのでＸ＝０である。

次に、標的核酸配列（Ｃ）と塩基対を形成している標的核酸結合領域（ｂ２）中のヌクレオチドであって、ヌクレオチドαに最も近いヌクレオチドをヌクレオチドβとする。このヌクレオチドβと塩基対を形成している標的核酸配列（Ｃ）中のヌクレオチドをヌクレオチドγとする。ヌクレオチドγとヌクレオチドδとの距離を塩基数で表わした数をＹとする。Ｙのカウント法はＸの場合と同じである。図２において、ヌクレオチドγとヌクレオチドδとはともに標的核酸配列（Ｃ）中の５’末端のグアニン塩基を持つヌクレオチドであるので、Ｙ＝０である。

本発明の核酸プローブセット複合体と標的核酸配列（Ｃ）とがハイブリダイズしている場合に、蛍光物質（ｄ）とヌクレオチドδのグアニンとが相互作用できる条件は、ＸおよびＹの和が５以下となる場合が好ましい。蛍光物質（ｄ）と蛍光物質（ｄ）で標識されたヌクレオチド（ａ）とを結ぶスペーサーの長さにも依存するが、ＸおよびＹの和は３以下がより好ましく、最も好ましくは０である。

本発明の第１態様の核酸プローブセットに使用する蛍光プローブ（Ａ）は、オリゴヌクレオチドの製造受託会社（例えば、つくばオリゴサービス株式会社、茨城県）などに製造を委託して使用することができる。オリゴヌクレオチドに蛍光物質を標識する方法は、特に限定されず、従来公知の標識方法を利用することができる。（Nature Biotechnology、１４巻、３０３〜３０８頁、１９９６年；Applied and Environmental Microbiology、６３巻、１１４３〜１１４７頁、１９９７年；Nucleic acids Research、２４巻、４５３２〜４５３５頁、１９９６年）。

例えば、５’末端ヌクレオチドに蛍光物質を結合させる場合は、まず、常法に従って５’末端のリン酸基にスペーサーとして、例えば、−（ＣＨ₂）_n−ＳＨを導入する。このようなスペーサーは市販のものを使用することができる（例えば、Midland Certified Reagent Company社、米国）。この場合、ｎは３〜８、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基反応性を有する蛍光物質またはその誘導体を結合させることにより蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを得ることができる。当該蛍光標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相クロマトグラフィーなどで精製して、本発明の蛍光プローブ（Ａ）とすることができる。

また、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドに蛍光物質を結合させることもできる。この場合は、リボースまたはデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基にスペーサーとして、例えば、−（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂を導入する。このようなスペーサーも市販のものを使用することができる（例えば、Midland Certified Reagent Company社、米国）。別の方法として、リボースまたはデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基にリン酸基を導入して、リン酸基のＯＨ基にスペーサーとして、例えば、−（ＣＨ₂）_n−ＳＨを導入する。この場合、ｎは３〜８、好ましくは４〜７である。

上記のスペーサーにアミノ基またはＳＨ基に反応性を有する蛍光物質またはその誘導体を結合させることにより蛍光物質で標識されたオリゴヌクレオチドを合成することができる。当該オリゴヌクレオチドを逆相クロマトグラフィーなどで精製して、本発明の第１態様の蛍光プローブ（Ａ）とすることができる。スペーサーとして−（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂を導入する場合、キット試薬（例えば、Uni-link aminomodifier、クロンテック社）を用いるのが便利である。そして、常法に従って当該オリゴヌクレオチドに蛍光物質を結合させることができる。

蛍光プローブ（Ａ）中の蛍光物質で標識されたヌクレオチド（ａ）は、オリゴヌクレオチドの両末端ヌクレオチドに限定されるものではなく、両末端ヌクレオチド以外のヌクレオチドを蛍光物質で標識することもできる（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY、２２５、３２−３８頁、１９９８年）。

１本の蛍光プローブ（Ａ）と１本のバインディングプローブ（Ｂ）とからなる核酸プローブセットを設計する場合、図３に示すように標的核酸結合領域（ｂ２）をバインディングプローブ（Ｂ）の５’末端側に設計する場合と、図４に示すように３’末端側に設計する場合の２通りが考えられる。これらの場合において、蛍光物質（ｄ）と標的核酸中のグアニン塩基とが相互作用できるようにするためには、標的核酸結合領域（ｂ２）がバインディングプローブ（Ｂ）の５’末端側にある場合には、蛍光物質（ｄ）で標識されたヌクレオチド（ａ）が、蛍光プローブ（Ａ）の３’末端側にあるように標識する必要がある。一方、標的核酸結合領域（ｂ２）がバインディングプローブ（Ｂ）の３’末端側にある場合には、蛍光物質（ｄ）で標識されたヌクレオチド（ａ）が、蛍光プローブ（Ａ）の５’末端側にあるように標識する必要がある。

多くの実験を行い、上記の２通りの蛍光プローブセットの蛍光消光率を精査した結果、本発明者らは、標的核酸結合領域（ｂ２）がバインディングプローブ（Ｂ）の５’末端側にあり、かつ、蛍光物質で標識されたヌクレオチド（ａ）が、蛍光プローブ（Ａ）の３’末端側にあるように設計した核酸プローブセットが、標的核酸結合領域（ｂ２）がバインディングプローブ（Ｂ）の３’末端側にあり、かつ、蛍光物質で標識されたヌクレオチド（ａ）が、蛍光プローブ（Ａ）の５’末端側にあるように設計した核酸プローブセットより高い消光率を示すことを見出した。従って、本発明の第１態様の核酸プローブセットを、標的核酸結合領域（ｂ２）がバインディングプローブ（Ｂ）の５’末端側にあり、かつ、蛍光物質で標識されたヌクレオチド（ａ）が、蛍光プローブ（Ａ）の３’末端側にあるように設計し、リアルタイムＰＣＲ測定などに使用することにより、標的核酸結合領域（ｂ２）がバインディングプローブ（Ｂ）の３’末端側にあり、かつ、蛍光物質で標識されたヌクレオチド（ａ）が、蛍光プローブ（Ａ）の５’末端側にあるように設計した核酸プローブセットを使用するよりも、より精度の高い測定をすることができ好ましい。

標的核酸結合領域（ｂ２）の位置の相違により上記のような蛍光消光率の差が生じる理由は不明であるが、本発明者らは、標的核酸結合領域（ｂ２）がバインディングプローブ（Ｂ）の３’末端側にある場合、蛍光プローブ（Ａ）の５’末端側に標識された蛍光物質（ｄ）が、ＰＣＲの伸長反応において、標的核酸の３’末端側から移動してくるＤＮＡポリメラーゼと相互作用をし、これにより蛍光物質（ｄ）の消光が妨げられるものと推測している。

本発明の第１態様の核酸プローブセットを構成する蛍光プローブ（Ａ）は、バインディングプローブ（Ｂ）の蛍光プローブ結合領域（ｂ１）とハイブリダイズする塩基配列であればよく、塩基長に特に制限はないが、４塩基以下であるとハイブリダイズ効率が低いという点で好ましくなく、５１塩基以上であるとリアルタイムＰＣＲ測定等に使用する際に非特異的なハイブリッドが生じやすくなるという点で好ましくないことがある。従って、蛍光プローブ（Ａ）は、５〜５０塩基であることが好ましく、より好ましくは１０〜３５塩基、特に好ましくは１０〜２０塩基である。

蛍光プローブ（Ａ）の塩基配列は、バインディングプローブ（Ｂ）の蛍光プローブ結合領域（ｂ１）とハイブリダイズする限り、当該蛍光プローブ結合領域（ｂ１）と相補的でないヌクレオチドを有してもよい。同様に、バインディングプローブ（Ｂ）中の蛍光プローブ結合領域（ｂ１）の塩基配列は、蛍光プローブ（Ａ）とハイブリダイズするものであればよく、その塩基長は蛍光プローブ（Ａ）の塩基長に依存する。

バインディングプローブ（Ｂ）中の標的核酸結合領域（ｂ２）は、標的核酸配列（Ｃ）とハイブリダイズする塩基配列であればよい。その塩基長は、標的核酸配列（Ｃ）の塩基配列などにも依存するが、４塩基以下であると標的核酸配列（Ｃ）とのハイブリダイズ効率が低いという点で好ましくなく、６１塩基以上であるとバインディングプローブ（Ｂ）を合成する際の収率が低下し、また、リアルタイムＰＣＲ測定等に使用する際に非特異的なハイブリッドが生じやすいという点で好ましくないことがある。従って、標的核酸結合領域（ｂ２）は、５〜６０塩基であることが好ましく、より好ましくは１５〜３０塩基である。標的核酸結合領域（ｂ２）の塩基配列は、標的核酸配列（Ｃ）とハイブリダイズする限り標的核酸配列（Ｃ）と塩基対を形成しない塩基配列を有してもよい。

本発明の第１態様の核酸プローブセットは、核酸の種々の分析方法に用いることができる。本発明の核酸プローブセットを用いて、溶液中に標的核酸が存在するか否かを判定する標的核酸の検出方法の例を以下に示す。

まず、標的核酸の検出をする溶液（以下、「検出サンプル」と略す。）を段階希釈して、数種の溶液を調製する。これらの段階希釈した検出サンプルに本発明の第１態様の核酸プローブセット、すなわち蛍光プローブ（Ａ）とバインディングプローブ（Ｂ）をそれぞれ一定量加え、次いで、添加した本発明の第１態様の核酸プローブセット複合体と標的核酸とがハイブリダイズするように溶液の温度を調整した後、蛍光強度を測定する。上記本発明のプローブセット複合体と標的核酸とをハイブリダイズさせる温度は、本発明の核酸プローブセット複合体と標的核酸との融解温度（以下「Ｔｍ１」と呼ぶ）やその他の溶液条件により変動するが、当該核酸プローブセット複合体と標的核酸との配列特異的なハイブリダイゼーションが起こり、かつ非特異的なハイブリダイゼーションが生じない温度範囲であることが好ましく、好ましくはＴｍ１〜（Ｔｍ１−４０）℃、より好ましくはＴｍ１〜（Ｔｍ１−２０）℃、さらに好ましくはＴｍ１〜（Ｔｍ１−１０）℃である。このような好ましい温度の一例として、約６０℃が挙げられる。

また、本発明の第１態様の核酸プローブセットを構成する蛍光プローブ（Ａ）とバインディングプローブ（Ｂ）との融解温度（以下「Ｔｍ２」と呼ぶ）は、蛍光強度を確実に測定するために、Ｔｍ１より高いことが好ましく、Ｔｍ２−Ｔｍ１が５℃以上であることがより好ましい。塩基長や塩基配列にもよるが、蛍光プローブ（Ａ）を構成するヌクレオチドがすべてＤＮＡである場合と比べて、少なくとも１ヌクレオチドをＬＮＡとすることにより、Ｔｍ２は２〜６℃上昇する。また、Ｔｍ２が９５℃以上となるように蛍光プローブ（Ａ）を構成するヌクレオチドのＬＮＡ量を調整することにより、本発明の第１態様の核酸プローブセットをＰＣＲに用いた場合に、当該核酸プローブセットが常に複合体を形成した状態となり、事実上一本鎖の核酸プローブとみなして使用することができる。このため、上記Ｔｍ２−Ｔｍ１に配慮することなく、蛍光プローブ（Ａ）および標的核酸結合領域（ｂ２）を設計することができる。

上記検出サンプル中に標的核酸が存在しない場合、段階希釈した検出サンプルのいずれにおいても同程度の蛍光強度が観察される。一方、上記検出サンプル中に標的核酸が存在する場合、本発明の第１態様の核酸プローブセットの蛍光物質による蛍光は標的核酸を含む核酸中のグアニンにより消光される。この消光の程度は、上記溶液中の核酸プローブセットと標的核酸との比率を変えることによって変化する。このため、上述したように段階希釈した検出サンプル中に本発明の第１態様の核酸プローブセットを添加して、それらの蛍光強度を測定することにより、蛍光消光の発生の有無から標的核酸の存在を判定することができ、蛍光消光の大きさから標的核酸の存在量を定量することができる。

また、本発明の第１態様の核酸プローブセットは、リアルタイムＰＣＲ方法に用いることもできる。リアルタイムＰＣＲ方法において、本発明の核酸プローブセットを用いて増幅産物を定量する場合、ＰＣＲで増幅する塩基配列またはその一部を標的核酸として、当該標的核酸とハイブリダイズするようにバインディングプローブ（Ｂ）中の標的核酸結合領域（ｂ２）の塩基配列を決定する。

このようにして作製した本発明の第１態様の核酸プローブセットをＰＣＲ反応溶液に添加して、ＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲの各サイクルにおいて蛍光強度を測定する。ＰＣＲ反応によって、反応溶液中の標的核酸が増幅すると、当該標的核酸中のグアニンにより本発明の核酸プローブセットの蛍光物質による蛍光が消光されるため、蛍光強度および蛍光消光の大きさからＰＣＲによる増幅産物を定量することができる。

さらに、本発明の第１態様の核酸プローブセットは、核酸の塩基配列多型の分析に用いることもできる。分析できる塩基配列多型の例としては、基準となる塩基配列からの１塩基多型、塩基置換、塩基欠失および塩基挿入などを挙げることができる。このような分析方法の一例を以下に示す。

本分析方法では、基準となる塩基配列を標的核酸配列（Ｃ）とする。まず、標的核酸を含む溶液と、分析対象の核酸を含む溶液とを調製する。それぞれの溶液に本発明の第１態様の核酸プローブセット、すなわち上記標的核酸配列（Ｃ）とハイブリダイズするように設計した標的核酸結合領域（ｂ２）を有するバインディングプローブ（Ｂ）と蛍光プローブ（Ａ）とを加えた後、各溶液において、添加した本発明の第１態様の核酸プローブセット複合体と標的核酸または分析対象の核酸とをハイブリダイズさせ、次いで蛍光強度の温度依存性を測定する。具体的には、溶液の温度を低温から高温に変化させながら、各温度について蛍光強度を測定する。

この測定結果を温度に対してプロットしたものを、「融解曲線」と呼ぶ。標的核酸を含む溶液の融解曲線を温度で微分することにより、本発明の第１態様の核酸プローブセット複合体と標的核酸とのＴｍ１を、極値を示す温度として容易に求めることができる。このような融解曲線分析は、当業者に周知の市販のプログラムを用いることによって行うことができる。

上記標的核酸を含む溶液の蛍光強度は、低温では標的核酸中のグアニンによる蛍光消光現象により抑制される。しかし、溶液温度をＴｍ１付近まで上げると本発明の第１態様の核酸プローブセット複合体から標的核酸が解離し、蛍光消光の程度が弱くなるため、蛍光強度は急激に増加する。分析対象の核酸の塩基配列中に塩基配列多型、例えば、標的核酸の塩基配列からの１塩基多型、塩基置換、塩基欠失および塩基挿入などがあると、当該分析対象の核酸と本発明の核酸プローブセット複合体とのＴｍ１は、標的核酸配列と本発明の核酸プローブセット複合体とのＴｍ１より低い値を示す。このため、標的核酸と本発明の第１態様の核酸プローブセット複合体の蛍光強度の温度依存性と、分析対象の核酸と本発明の核酸プローブセット複合体の蛍光強度の温度依存性とを比較することにより、標的核酸配列（Ｃ）に対する分析対象の核酸の塩基配列多型を分析することができる。このような分析手順としては、融解曲線どうしを比較することもできるが、それぞれの融解曲線を温度で微分し、極値を与える温度としてＴｍ１を求め、それを比較することによって、容易に変異の有無を判断することができる。

また、分析対象の核酸の塩基配列のうち、蛍光プローブの蛍光物質に対して消光作用をするグアニン塩基を持つヌクレオチドが変異している場合、いずれの温度においても蛍光消光現象による蛍光強度の低下が生じないため、その融解曲線から変異を特定することができる。

従来、融解曲線分析においては、標的核酸ごとに高価な蛍光標識をした塩基配列の異なる核酸プローブを用意する必要があり、その合成に長時間を要していたが、本発明の第１態様の核酸プローブセットを融解曲線分析に使用することにより、標的核酸ごとに高価な蛍光標識をした核酸プローブを用意する必要がないため、融解曲線分析の準備時間を短縮でき、かつ融解曲線分析をより安価に実施することができる。

前記で説明した本発明の第１態様の核酸プローブセットは、１個の蛍光プローブ結合領域（ｂ１）を持つバインディングプローブ（Ｂ）と１個の蛍光プローブ（Ａ）とから構成されているが、本発明の第１態様の核酸プローブセットは、図５に示すように、蛍光プローブ結合領域（ｂ１）を２個有するものであってもよい。これらの蛍光プローブ結合領域（ｂ１−１、ｂ１−２）の塩基配列は同じでも異なってもよいが、異なることが好ましい。この場合、蛍光プローブは塩基配列の異なる２個の蛍光プローブ（Ａ１、Ａ２）を有することが好ましい。

上記バインディングプローブ（Ｂ）が蛍光プローブ結合領域を２個有し、それらの塩基配列が異なる本発明の第１態様の核酸プローブセットは、ＡＢＣ−ＰＣＲ（Alternately Binding probe Competitive PCR；Taniら、Analytical Chemistry、印刷準備中を参照のこと）方法において従来使用されているＡＢプローブの代わりとして好適に使用することができる。

上記従来のＡＢＣ−ＰＣＲ方法において使用する蛍光標識されたＡＢプローブは、増幅対象の塩基配列ごとに異なるプローブを使用しなければならないが、本発明の第１態様の核酸プローブセットを上記ＡＢプローブの代わりに用いることにより、高価な蛍光標識をした蛍光プローブを、増幅対象の塩基配列ごとに用意する必要がないので、より安価にＡＢＣ−ＰＣＲ方法を実施することができる。

ＡＢＣ−ＰＣＲ方法において、ＡＢプローブの代わりとして蛍光プローブ結合領域（ｂ１）を２個有する本発明の第１態様の核酸プローブセットを使用する場合、２本の蛍光プローブ（Ａ１、Ａ２）に標識する蛍光物質は、それぞれの励起波長および蛍光波長が異なる別種の蛍光物質（ｄ１、ｄ２）であることが好ましい。好ましい蛍光物質（ｄ１、ｄ２）の組み合わせの例としては、BODIPY-FLとTAMRAの組み合わせを挙げることができる。

＜本発明の第２態様＞
本発明の第２態様は、標識物質（ｈ）で標識されたヌクレオチド（ａ’）を含み、一部または全てのヌクレオチドが、相補鎖からの解離温度を上昇させる機能を有する人工ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドプローブであって、常圧条件下で、相補鎖との解離温度が１００℃以上であることを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブに関する。

上記解離温度を上昇させる機能を有する人工ヌクレオチドとしては、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＥＮＡ、２’，４’−ＢＮＡ^NCおよび２’，４’−ＢＮＡ^COCからなる群より選ばれる１種以上の人工ヌクレオチドを挙げることができる。

上記本発明のオリゴヌクレオチドプローブを標識する標識物質（ｈ）としては、蛍光物質、クエンチャー物質、タンパク質および官能基などを挙げることができ、分析法に応じて当業者が適宜選択することができる。なお、クエンチャー物質とは、蛍光物質の近傍にある場合に蛍光物質が発する蛍光を弱める機能を有する物質をいう。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、該プローブと相補的な配列を有するヌクレオチド（Ｅ）と水系において常圧条件下で常に安定な複合体を形成することができるので、上記ヌクレオチド（Ｅ）と特異的にハイブリダイズし、該ヌクレオチドを事実上上記標識物質（ｈ）で標識することができる。
また、上記プローブと相補鎖により形成された複合体を単一の分子とみなして遺伝子解析など種々の分析に使用することもできる。

また、上記本発明の第２態様のプローブは、標識物質（ｈ）としてグアニンと相互作用することにより蛍光キャラクターが変化する蛍光物質を使用し、当該プローブを本発明の第１態様における蛍光プローブ（Ａ）として用いることができる。

＜本発明の第３態様＞
本発明の第３態様の核酸プローブセットの一例を図１２〜１４、１６に示す。これらの図中、（Ａ）は蛍光プローブ、（Ｂ）はバインディングプローブ、（Ｃ）は標的核酸配列、（ｄ）が蛍光物質である。

本発明の第３態様の核酸プローブセットは、１本の蛍光プローブ（Ａ）と１本のバインディングプローブ（Ｂ）とからなる。バインディングプローブ（Ｂ）は蛍光プローブ（Ａ）に相補的な塩基配列を持つ１つの蛍光プローブ結合領域（ｂ１）と、標的核酸配列（Ｃ）に相補的な塩基配列を持つ１つの標的核酸結合領域（ｂ２）を有する。

本発明の第３態様の核酸プローブセットを構成する蛍光プローブ（Ａ）は、蛍光物質（ｄ）で標識されたヌクレオチド（ａ）を含むオリゴヌクレオチドである。当該蛍光プローブ（Ａ）の塩基配列は、バインディングプローブ（Ｂ）の蛍光プローブ結合領域（ｂ１）とハイブリダイズするものであれば特に制限されず、検出または分析対象の標的核酸の塩基配列に依存しない。従って、本発明の第３態様の核酸プローブセットを構成する蛍光プローブ（Ａ）は、特定の標的核酸に対応する塩基配列を持つ必要がなく、標的核酸が異なっても同じ塩基配列の蛍光プローブ（Ａ）を使用することができる。このため、本発明者らは、本発明の核酸プローブセットをユニバーサルな核酸プローブセットと呼んでいる。本発明の第３態様の核酸プローブセットを用いて、標的核酸の分析を行う場合、高価な蛍光物質を有する蛍光プローブを検出または分析対象の標的核酸ごとに調製せずにすみ、製造コストを抑えることができるという利点がある。

上記蛍光プローブ（Ａ）の構成単位となるヌクレオチドは、ＤＮＡの構成単位であるデオキシリボヌクレオチドやＲＮＡの構成単位であるリボヌクレオチドに限られず、上記蛍光プローブ（Ａ）とバインディングプローブ（Ｂ）との解離温度を上昇させる機能を有する人工ヌクレオチドを使用することもできる。このような人工ヌクレオチドの例として、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＥＮＡ、２’，４’−ＢＮＡ^NCおよび２’，４’−ＢＮＡ^COCを挙げることができる。

上記ＬＮＡモノマーはリボースの２’部位の酸素原子と４’部位の炭素原子がメチレンを介して結合した２つの環状構造を持つヌクレオチドである。ＬＮＡモノマーは、２つの環状構造を持つため構造の自由度が少なく、ＤＮＡやＲＮＡと比べて相補鎖と強くハイブリダイズする。このため、蛍光プローブ中（Ａ）のＬＮＡモノマーの割合を高めることにより蛍光プローブ（Ａ）とバインディングプローブ（Ｂ）とのＴｍを容易に標的核酸配列（Ｃ）と標的核酸結合領域（ｂ２）とのＴｍより高くすることができ、高温での本発明の第３態様の核酸プローブセットの安定性を高め、蛍光プローブとしての信頼性を向上させることができる。

蛍光プローブ（Ａ）中の上記人工ヌクレオチドの割合を高めることにより、蛍光プローブ（Ａ）とバインディングプローブ（Ｂ）とのＴｍをＰＣＲの熱変性温度（例えば９５℃）より高くすることができ、ＰＣＲサイクルの間常に安定な核酸プローブセット複合体とすることができる。蛍光プローブ（Ａ）とバインディングプローブ（Ｂ）とのＴｍをＰＣＲの熱変性温度より高くするための蛍光プローブ（Ａ）中の人工ヌクレオチドの割合は、蛍光プローブ（Ａ）の塩基数や塩基配列にも依存し、一概には言えないが、全ヌクレオチドの３分の１以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましい。

また、蛍光プローブ（Ａ）中の上記人工ヌクレオチドの割合を高めることにより、蛍光プローブ（Ａ）と蛍光プローブ結合領域（ｂ１）との相互作用が強くなるため、蛍光プローブ（Ａ）がＤＮＡのみから構成されている場合と比べ、蛍光プローブ（Ａ）と蛍光プローブ結合領域（ｂ１）の塩基数を短くすることができる。これにより塩基数の多いバインディングプローブ（Ｂ）の合成時のエラーを抑え、収率を高めることができ、本発明の第３態様のプローブセットの製造費用の低減につながる。

本発明の第３態様においては、蛍光プローブ（Ａ）に標識する蛍光物質（ｄ）は、グアニンと相互作用したときに、蛍光物質（ｄ）の蛍光キャラクターが変化するものを使用する。なお、本発明の第３態様において、「蛍光キャラクター」とは、蛍光強度のことを意味し、「グアニンと蛍光物質とが相互作用して蛍光物質の蛍光キャラクターが変化する」とは、グアニンと蛍光物質とが相互作用していない状態での蛍光物質の蛍光強度と、相互作用している状態での蛍光強度とが異なることを意味し、その程度は限定しないものとする。また、蛍光の「消光」とは、蛍光物質がグアニンと相互作用しない場合と比べて、グアニンと相互作用したときに蛍光強度が減衰することを意味し、その程度は限定しないものとする。

本発明の第３態様核酸プローブセットに好適に使用できる蛍光物質の例としては、フルオレセインおよびその誘導体（例えば、フルオレセイン−４−イソチオシアネート（FITC）、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、テトラブロモスルホンフルオレセイン（TBSF）およびそれらの誘導体）、EDANS（５−（２−アミノエチル）アミノ−１−ナフタレンスルホン酸）、6-JOE、Alexa Fluor 488（インビトロジェン社）、Alexa Fluor 532（インビトロジェン社）、Cy3（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）、Cy5（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）、Pacific Blue（インビトロジェン社）、ローダミン６Ｇ（R6G）およびその誘導体（例えば、カルボキシローダミン６Ｇ（CR6G）、テトラメチルローダミン（TMR）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TMRITC）、ｘ−ローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA））、テキサスレッド（インビトロジェン社）、BODIPY-FL（インビトロジェン社）、BODIPY-FL/C3（インビトロジェン社）、BODIPY-FL/C6（インビトロジェン社）、BODIPY-5-FAM（インビトロジェン社）、BODIPY-TMR（インビトロジェン社）、BODIPY-TR（インビトロジェン社）、BODIPY-R6G（インビトロジェン社）、BODIPY564（インビトロジェン社）並びにBODIPY581（インビトロジェン社）を挙げることができる。

これらの中でも、フルオレセイン、フルオレセイン−４−イソチオシアネート、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、テトラブロモスルホンフルオレセイン、EDANS、6-JOE、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Pacific Blue、ローダミン６Ｇ、カルボキシローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミンおよびBODIPY-FLを使用することがより好ましく、BODIPY-FLを使用することがもっとも好ましい。

バインディングプローブ（Ｂ）の標的核酸結合領域（ｂ２）は、本発明の第３態様の核酸プローブセット複合体が標的核酸配列（Ｃ）とハイブリダイズしたときに、蛍光物質（ｄ）と標的核酸中のグアニン塩基とが接することができるように設計する。この結果、本発明の第３態様の核酸プローブセット複合体と標的核酸配列（Ｃ）とがハイブリダイズしたときに、蛍光物質（ｄ）の蛍光が上記グアニン塩基により消光され、この消光現象を検出することにより、標的核酸を定量することができる。

蛍光物質（ｄ）と相互作用して蛍光消光作用を及ぼすグアニンは、標的核酸中にあれば、標的核酸配列（Ｃ）の塩基配列中にあっても、標的核酸配列（Ｃ）の外側の塩基配列中にあってもよい。上記グアニンが、標的核酸配列（Ｃ）中にあり、ハイブリダイズしたバインディングプローブ（Ｂ）のシトシンと塩基対を形成している場合、蛍光物質（ｄ）とグアニンとの相互作用が幾分低下するが特に問題はなく、さらには上記グアニンが、標的核酸の塩基配列領域の外側にあるなどの理由で塩基対を形成していない場合、蛍光物質（ｄ）とグアニンとの相互作用が容易となるのでより好ましい。

次に、図１３を用いて、本発明の第３態様の核酸プローブセット複合体と標的核酸配列（Ｃ）とがハイブリダイズしている場合に、蛍光物質（ｄ）と標的核酸中のグアニン塩基を持つ任意のヌクレオチド（以下、「ヌクレオチドδ」と略す。）とが相互作用できる条件について説明する。なお、以下の説明のケースでは、標的核酸配列（Ｃ）の５’末端のグアニン塩基を持つヌクレオチドがヌクレオチドδである。
図１３は、図１２の蛍光物質（ｄ）の周辺部分を拡大して表示したものである。蛍光物質（ｄ）とヌクレオチドδとが相互作用できる条件は、後述する蛍光物質（ｄ）と蛍光物質（ｄ）で標識されたヌクレオチド（ａ）とを結ぶスペーサーの長さにも依存し、一定しないが、一般化すると以下のように表現できる。

蛍光プローブ（Ａ）とバインディングプローブ（Ｂ）とがハイブリダイズしている場合において、蛍光プローブ（Ａ）と塩基対を形成している蛍光プローブ結合領域（ｂ１）中のヌクレオチドであって、標的核酸結合領域（ｂ２）に最も近いヌクレオチドをヌクレオチドαとする。このヌクレオチドαと、ヌクレオチド（ａ）と塩基対を形成しているバインディングプローブ（Ｂ）中の塩基との距離を塩基数で表わした数をＸとする。なお、隣接しているヌクレオチドを「Ｘ＝１」とカウントし、１塩基を挟み隣接しているヌクレオチドを「Ｘ＝２」とカウントする。
図１３においては、ヌクレオチドαと、ヌクレオチド（ａ）と塩基対を形成しているバインディングプローブ（Ｂ）中のヌクレオチドとはともに蛍光プローブ結合領域（ｂ１）の５’末端にあるチミン塩基を持つヌクレオチドであるのでＸ＝０である。

次に、標的核酸配列（Ｃ）と塩基対を形成している標的核酸結合領域（ｂ２）中のヌクレオチドであって、ヌクレオチドαに最も近いヌクレオチドをヌクレオチドβとする。このヌクレオチドβと塩基対を形成している標的核酸配列（Ｃ）中のヌクレオチドをヌクレオチドγとする。ヌクレオチドγとヌクレオチドδとの距離を塩基数で表わした数をＹとする。Ｙのカウント法はＸの場合と同じである。図１３において、ヌクレオチドγとヌクレオチドδとはともに標的核酸配列（Ｃ）中の５’末端のグアニン塩基を持つヌクレオチドであるので、Ｙは０である。

本発明の第３態様の核酸プローブセット複合体と標的核酸配列（Ｃ）とがハイブリダイズしている場合に、蛍光物質（ｄ）とヌクレオチドδのグアニンとが相互作用できる条件は、ＸおよびＹの和が５以下となる場合が好ましい。蛍光物質（ｄ）と蛍光物質（ｄ）で標識されたヌクレオチド（ａ）とを結ぶスペーサーの長さにも依存するが、ＸおよびＹの和は３以下がより好ましく、最も好ましくは０である。

本発明の第３態様の核酸プローブセットに使用する蛍光プローブ（Ａ）は、オリゴヌクレオチドの製造受託会社（例えば、つくばオリゴサービス株式会社、茨城県）などに製造を委託して使用することができる。オリゴヌクレオチドに蛍光物質を標識する方法は、特に限定されず、従来公知の標識方法を利用することができる。（Nature Biotechnology、１４巻、３０３〜３０８頁、１９９６年；Applied and Environmental Microbiology、６３巻、１１４３〜１１４７頁、１９９７年；Nucleic acids Research、２４巻、４５３２〜４５３５頁、１９９６年）。

例えば、５’末端ヌクレオチドに蛍光物質を結合させる場合は、まず、常法に従って５’末端のリン酸基にスペーサーとして、例えば、−（ＣＨ₂）_n−ＳＨを導入する。このようなスペーサーは市販のものを使用することができる（例えば、Midland Certified Reagent Company社、米国）。この場合、ｎは３〜８、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基反応性を有する蛍光物質またはその誘導体を結合させることにより蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを得ることができる。当該蛍光標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相クロマトグラフィーなどで精製して、本発明の蛍光プローブ（Ａ）とすることができる。

また、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドに蛍光物質を結合させることもできる。この場合は、リボースまたはデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基にスペーサーとして、例えば、−（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂を導入する。このようなスペーサーも市販のものを使用することができる（例えば、Midland Certified Reagent Company社、米国）。別の方法として、リボースまたはデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基にリン酸基を導入して、リン酸基のＯＨ基にスペーサーとして、例えば、−（ＣＨ₂）_n−ＳＨを導入する。この場合、ｎは３〜８、好ましくは４〜７である。

上記のスペーサーにアミノ基またはＳＨ基に反応性を有する蛍光物質またはその誘導体を結合させることにより蛍光物質で標識されたオリゴヌクレオチドを合成することができる。当該オリゴヌクレオチドを逆相クロマトグラフィーなどで精製して、本発明の第３態様の蛍光プローブ（Ａ）とすることができる。スペーサーとして−（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂を導入する場合、キット試薬（例えば、Uni-link aminomodifier、クロンテック社）を用いるのが便利である。そして、常法に従って当該オリゴヌクレオチドに蛍光物質を結合させることができる。

蛍光プローブ（Ａ）中の蛍光物質で標識されたヌクレオチド（ａ）は、オリゴヌクレオチドの両末端ヌクレオチドに限定されるものではなく、両末端ヌクレオチド以外のヌクレオチドを蛍光物質で標識することもできる（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY、２２５、３２−３８頁、１９９８年）。

本発明の第３態様の核酸プローブセットにおいて、バインディングプローブ（Ｂ）の標的核酸結合領域（ｂ２）は、バインディングプローブ（Ｂ）の５’末端側にあるように設計する。

１本の蛍光プローブ（Ａ）と１本のバインディングプローブ（Ｂ）とからなる核酸プローブセットを設計する場合、図１４に示すように標的核酸結合領域（ｂ２）をバインディングプローブ（Ｂ）の５’末端側に設計する場合と、図１５に示すように３’末端側に設計する場合の２通りが考えられる。これらの場合において、蛍光物質（ｄ）と標的核酸中のグアニン塩基とが相互作用できるようにするためには、標的核酸結合領域（ｂ２）がバインディングプローブ（Ｂ）の５’末端側にある場合には、蛍光物質（ｄ）で標識されたヌクレオチド（ａ）が、蛍光プローブ（Ａ）の３’末端側にあるように標識する必要がある。一方、標的核酸結合領域（ｂ２）がバインディングプローブ（Ｂ）の３’末端側にある場合には、蛍光物質（ｄ）で標識されたヌクレオチド（ａ）が、蛍光プローブ（Ａ）の５’末端側にあるように標識する必要がある。

多くの実験を行い、上記の２通りの蛍光プローブセットの蛍光消光率を精査した結果、本発明者らは、標的核酸結合領域（ｂ２）がバインディングプローブ（Ｂ）の５’末端側にあり、かつ、蛍光物質で標識されたヌクレオチド（ａ）が、蛍光プローブ（Ａ）の３’末端側にあるように設計した場合、標的核酸結合領域（ｂ２）がバインディングプローブ（Ｂ）の３’末端側にあり、かつ、蛍光物質で標識されたヌクレオチド（ａ）が、蛍光プローブ（Ａ）の５’末端側にあるように設計した場合より高い消光率を示すことを見出した。本発明の第３態様の核酸プローブセットをリアルタイムＰＣＲに用いる場合、標的核酸結合領域（ｂ２）がバインディングプローブ（Ｂ）の３’末端側にあり、かつ、蛍光物質で標識されたヌクレオチド（ａ）が、蛍光プローブ（Ａ）の５’末端側にあるように設計した核酸プローブセットを用いる場合に比べ、より精度の高い測定をすることができる。

標的核酸結合領域（ｂ２）の位置の相違により上記のような蛍光消光率の差が生じる理由は不明であるが、本発明者らは、標的核酸結合領域（ｂ２）がバインディングプローブ（Ｂ）の３’末端側にある場合、蛍光プローブ（Ａ）の５’末端側に標識された蛍光物質（ｄ）が、ＰＣＲの伸長反応において、標的核酸の３’末端側から移動してくるＤＮＡポリメラーゼと相互作用をし、これにより蛍光物質（ｄ）の消光が妨げられるものと推測している。

本発明の第３態様の核酸プローブセットを構成する蛍光プローブ（Ａ）は、バインディングプローブ（Ｂ）の蛍光プローブ結合領域（ｂ１）とハイブリダイズする塩基配列であればよく、塩基長に特に制限はないが、４塩基以下であるとハイブリダイズ効率が低いという点で好ましくなく、５１塩基以上であるとリアルタイムＰＣＲ測定等に使用する際に非特異的なハイブリッドが生じやすくなるという点で好ましくないことがある。従って、蛍光プローブ（Ａ）は、５〜５０塩基であることが好ましく、より好ましくは１０〜３５塩基、特に好ましくは１０〜２０塩基である。

蛍光プローブ（Ａ）の塩基配列は、バインディングプローブ（Ｂ）の蛍光プローブ結合領域（ｂ１）とハイブリダイズする限り、当該蛍光プローブ結合領域（ｂ１）と相補的でないヌクレオチドを有してもよい。同様に、バインディングプローブ（Ｂ）中の蛍光プローブ結合領域（ｂ１）の塩基配列は、蛍光プローブ（Ａ）とハイブリダイズするものであればよく、その塩基長は蛍光プローブ（Ａ）の塩基長に依存する。

バインディングプローブ（Ｂ）中の標的核酸結合領域（ｂ２）は、標的核酸配列（Ｃ）とハイブリダイズする塩基配列であればよい。その塩基長は、標的核酸配列（Ｃ）の塩基配列などにも依存するが、４塩基以下であると標的核酸配列（Ｃ）とのハイブリダイズ効率が低いという点で好ましくなく、６１塩基以上であるとバインディングプローブ（Ｂ）を合成する際の収率が低下し、また、リアルタイムＰＣＲ測定等に使用する際に非特異的なハイブリッドが生じやすいという点で好ましくないことがある。従って、標的核酸結合領域（ｂ２）は、５〜６０塩基であることが好ましく、より好ましくは１５〜３０塩基である。標的核酸結合領域（ｂ２）の塩基配列は、標的核酸配列（Ｃ）とハイブリダイズする限り標的核酸配列（Ｃ）と塩基対を形成しない塩基配列を有してもよい。

本発明の第３態様の核酸プローブセットは、核酸の種々の分析方法に用いることができる。本発明の第３態様の核酸プローブセットを用いて、溶液中に標的核酸が存在するか否かを判定する標的核酸の検出方法の例を以下に示す。

まず、標的核酸の検出をする溶液（以下、「検出サンプル」と略す。）を段階希釈して、数種の溶液を調製する。これらの段階希釈した検出サンプルに本発明の第３態様の核酸プローブセット、すなわち蛍光プローブ（Ａ）とバインディングプローブ（Ｂ）をそれぞれ一定量加え、次いで、添加した本発明の核酸プローブセット複合体と標的核酸とがハイブリダイズするように溶液の温度を調整した後、蛍光強度を測定する。上記本発明のプローブセット複合体と標的核酸とをハイブリダイズさせる温度は、本発明の第３態様の核酸プローブセット複合体と標的核酸との融解温度（以下「Ｔｍ１」と呼ぶ）やその他の溶液条件により変動するが、当該核酸プローブセット複合体と標的核酸との配列特異的なハイブリダイゼーションが起こり、かつ非特異的なハイブリダイゼーションが生じない温度範囲であることが好ましく、好ましくはＴｍ１〜（Ｔｍ１−４０）℃、より好ましくはＴｍ１〜（Ｔｍ１−２０）℃、さらに好ましくはＴｍ１〜（Ｔｍ１−１０）℃である。このような好ましい温度の一例として、約６０℃が挙げられる。

また、本発明の核酸プローブセットを構成する蛍光プローブ（Ａ）とバインディングプローブ（Ｂ）との融解温度（以下「Ｔｍ２」と呼ぶ）は、蛍光強度を確実に測定するために、Ｔｍ１より高いことが好ましく、Ｔｍ２−Ｔｍ１が５℃以上であることがより好ましい。塩基長や塩基配列にもよるが、蛍光プローブ（Ａ）を構成するヌクレオチドがすべてＤＮＡである場合と比べて、少なくとも１ヌクレオチドをＬＮＡとすることにより、Ｔｍ２は２〜６℃上昇する。また、Ｔｍ２が９５℃以上となるように蛍光プローブ（Ａ）を構成するヌクレオチドのＬＮＡ量を調整することにより、本発明の第３態様の核酸プローブセットをＰＣＲに用いた場合に、当該核酸プローブセットが常に複合体を形成した状態となり、事実上一本鎖の核酸プローブとみなして使用することができる。このため、上記Ｔｍ２−Ｔｍ１に配慮することなく、蛍光プローブ（Ａ）および標的核酸結合領域（ｂ２）を設計することができる。

上記検出サンプル中に標的核酸が存在しない場合、段階希釈した検出サンプルのいずれにおいても同程度の蛍光強度が観察される。一方、上記検出サンプル中に標的核酸が存在する場合、本発明の核酸プローブセットの蛍光物質による蛍光は標的核酸を含む核酸中のグアニンにより消光される。この消光の程度は、上記溶液中の核酸プローブセットと標的核酸との比率を変えることによって変化する。このため、上述したように段階希釈した検出サンプル中に本発明の核酸プローブセットを添加して、それらの蛍光強度を測定することにより、蛍光消光の発生の有無から標的核酸の存在を判定することができ、蛍光消光の大きさから標的核酸の存在量を定量することができる。

また、本発明の第３態様の核酸プローブセットは、リアルタイムＰＣＲ方法に用いることもできる。リアルタイムＰＣＲ方法において、本発明の核酸プローブセットを用いて増幅産物を定量する場合、ＰＣＲで増幅する塩基配列またはその一部を標的核酸として、当該標的核酸とハイブリダイズするようにバインディングプローブ（Ｂ）中の標的核酸結合領域（ｂ２）の塩基配列を決定する。

このようにして作製した本発明の第３態様の核酸プローブセットをＰＣＲ反応溶液に添加して、ＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲの各サイクルにおいて蛍光強度を測定する。ＰＣＲ反応によって、反応溶液中の標的核酸が増幅すると、当該標的核酸中のグアニンにより本発明の核酸プローブセットの蛍光物質による蛍光が消光されるため、蛍光強度および蛍光消光の大きさからＰＣＲによる増幅産物を定量することができる。

さらに、本発明の第３態様の核酸プローブセットは、核酸の塩基配列多型の分析に用いることもできる。分析できる塩基配列多型の例としては、基準となる塩基配列からの１塩基多型、塩基置換、塩基欠失および塩基挿入などを挙げることができる。このような分析方法の一例を以下に示す。

本分析方法では、基準となる塩基配列を標的核酸配列（Ｃ）とする。まず、標的核酸を含む溶液と、分析対象の核酸を含む溶液とを調製する。それぞれの溶液に本発明の第３態様の核酸プローブセット、すなわち上記標的核酸配列（Ｃ）とハイブリダイズするように設計した標的核酸結合領域（ｂ２）を有するバインディングプローブ（Ｂ）と蛍光プローブ（Ａ）とを加えた後、各溶液において、添加した本発明の核酸プローブセット複合体と標的核酸または分析対象の核酸とをハイブリダイズさせ、次いで蛍光強度の温度依存性を測定する。具体的には、溶液の温度を低温から高温に変化させながら、各温度について蛍光強度を測定する。

この測定結果を温度に対してプロットしたものを、「融解曲線」と呼ぶ。標的核酸を含む溶液の融解曲線を温度で微分することにより、本発明の核酸プローブセット複合体と標的核酸とのＴｍ１を、極値を示す温度として容易に求めることができる。このような融解曲線分析は、当業者に周知の市販のプログラムを用いることによって行うことができる。

上記標的核酸を含む溶液の蛍光強度は、低温では標的核酸中のグアニンによる蛍光消光現象により抑制される。しかし、溶液温度をＴｍ１付近まで上げると本発明の第３態様の核酸プローブセット複合体から標的核酸が解離し、蛍光消光の程度が弱くなるため、蛍光強度は急激に増加する。分析対象の核酸の塩基配列中に塩基配列多型、例えば、標的核酸の塩基配列からの１塩基多型、塩基置換、塩基欠失および塩基挿入などがあると、当該分析対象の核酸と本発明の第３態様の核酸プローブセット複合体とのＴｍ１は、標的核酸配列と本発明の第３態様の核酸プローブセット複合体とのＴｍ１より低い値を示す。このため、標的核酸と本発明の核酸プローブセット複合体の蛍光強度の温度依存性と、分析対象の核酸と本発明の核酸プローブセット複合体の蛍光強度の温度依存性とを比較することにより、標的核酸配列（Ｃ）に対する分析対象の核酸の塩基配列多型を分析することができる。このような分析手順としては、融解曲線どうしを比較することもできるが、それぞれの融解曲線を温度で微分し、極値を与える温度としてＴｍ１を求め、それを比較することによって、容易に変異の有無を判断することができる。

また、分析対象の核酸の塩基配列のうち、蛍光プローブの蛍光物質に対して消光作用をするグアニン塩基を持つヌクレオチドが変異している場合、いずれの温度においても蛍光消光現象による蛍光強度の低下が生じないため、その融解曲線から変異を特定することができる。

従来、融解曲線分析においては、標的核酸ごとに高価な蛍光標識をした塩基配列の異なる核酸プローブを用意する必要があり、その合成に長時間を要していたが、本発明の第３態様の核酸プローブセットを融解曲線分析に使用することにより、標的核酸ごとに高価な蛍光標識をした核酸プローブを用意する必要がないため、融解曲線分析の準備時間を短縮でき、かつ融解曲線分析をより安価に実施することができる。

次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の単なる例示であって、本発明の限定を意図するものではない。

＜本発明の第１態様＞
［実施例１］
ヒトβ−グロビン遺伝子の一部を標的核酸配列とする本発明の核酸プローブセットを用いて、リアルタイムＰＣＲ実験を行い、本発明の核酸プローブセットの有効性を評価した。

リアルタイムＰＣＲ用の反応溶液として、ヒトゲノムＤＮＡ試料（Human Genomic DNA;Ｎｏｖａｇｅｎ社）を含まないＰＣＲ反応溶液およびヒトゲノムＤＮＡ試料を１０²、１０³、１０⁴、１０⁵、１０⁶又は１０⁷コピー含むＰＣＲ反応溶液を調製した。各反応溶液は、いずれも、ＤＮＡ合成酵素としてTITANIUM Taq DNAポリメラーゼ（クロンテック社）、４種のｄＮＴＰ（それぞれ最終濃度０．２ｍＭ）、フォワードプライマー（配列番号：１、最終濃度１μＭ）、リバースプライマー（配列番号：２、最終濃度０．３μＭ）、所定量のTITANUM Taq PCR緩衝液（クロンテック社）および本発明の核酸プローブセットを含む。本ＰＣＲ反応により上記標的核酸配列を含む核酸が増幅される。
配列番号１：ggttggccaatctactccagg
配列番号２：tggtctccttaaacctgtcttg

上記本発明の核酸プローブセットは、ヒトβ−グロビン遺伝子の一部を標的核酸配列（配列番号：３）とし、３’末端側に蛍光プローブと相補的な塩基配列の蛍光プローブ結合領域を、５’末端側に標的核酸配列と相補的な塩基配列の標的核酸結合領域を持つバインディングプローブ（配列番号：４、最終濃度１００ｎＭ）および配列番号５の塩基配列を持ち、３’末端ヌクレオチドをBODIPY-FL（インビトロジェン社）で標識した蛍光プローブ（最終濃度５０ｎＭ）とから構成される。なお、当該蛍光プローブを構成するヌクレオチドは、すべてＬＮＡ（ThermoElectron社）を使用した。
配列番号３：gttcactagcaacctcaaacagacacc
配列番号４：ggtgtctgtttgaggttgctagtgaactatgaggtggtaggatgggtagtggt
配列番号５：accactacccatcctaccacctcata-BODIPY-FL

上記本発明の核酸プローブセット複合体が、配列番号３の標的核酸配列とハイブリダイズしたときの模式図を図６に示す。蛍光プローブに結合した蛍光物質は、標的核酸配列の５’末端のグアニンにより蛍光消光作用を受けると考えられる。
上記本発明の核酸プローブセットのうち、バインディングプローブは、３’末端にリン酸基を持つ。なお、本実施例のようにＬＮＡ化された蛍光プローブを用いる場合、当該蛍光プローブは、通常の反応条件下ではバインディングプローブから解離しないため、バインディングプローブがプライマーとして機能することはないので、上記３’末端のリン酸化は必須ではない。上記核酸プローブは、つくばオリゴサービス株式会社（つくば市）に、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、株式会社日本遺伝子研究所（仙台市）に合成を委託した。

上記反応溶液をリアルタイムＰＣＲ装置（LightCycler（登録商標）１．５（Roche社））を用いて以下のＰＣＲ反応に供した。
（１）熱変性工程：９５℃で１２０秒間
（２）熱変性工程：９５℃、３０秒間
（３）アニーリング工程：５５℃、３０秒間
（４）伸長工程：７２℃、３０秒間
（１）の熱反応工程の後、工程（２）〜（４）を５０サイクル行い、（２）の熱変性工程と（３）のアニーリング工程において蛍光強度を測定した。なお、励起波長は４５０〜４９５ｎｍ、検出波長は５０５〜５３７ｎｍとした。

得られた蛍光強度を以下の式１に代入し、標的核酸を含む６種の反応溶液について蛍光消光率を求めた。
［式１］
蛍光消光率＝[(G_U,55/G_U,95)-(G₅₅/G₉₅)]/(G_U,55/G_U,95)
ここで、
Ｇ_U,55：反応溶液のアニーリング工程（３）における核酸増幅が発生する前の任意のサイクルにおける蛍光強度
Ｇ_U,95：反応溶液の熱変性工程（２）における核酸増幅が発生する前の任意のサイクルにおける蛍光強度
Ｇ₅₅：反応溶液のアニーリング工程（３）における蛍光強度
Ｇ₉₅：反応溶液の熱変性工程（２）における蛍光強度
である。

得られた蛍光消光率を、ＰＣＲサイクルを横軸にとったグラフにプロットしたグラフを図７に示す。この図より、本発明の核酸プローブセットを使用してリアルタイムＰＣＲを行うことにより、標的核酸を的確に定量できることが理解される。なお、上記６種のＰＣＲサンプルについての蛍光消光率の最大値の平均値は約３７％であった。

［実施例２］
蛍光プローブの５’末端側の５つのヌクレオチドをＤＮＡに代えたこと以外は実施例１と同様の実験を行った。この場合、蛍光消光率の最大値の平均値は約３５％であった。なお、本実施例で使用した蛍光プローブのＬＮＡの割合は全体の約８１％である。

［比較例１］
蛍光プローブを構成するヌクレオチドをすべてＤＮＡとしたこと以外は実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲ実験を行った。
得られた蛍光消光率を、ＰＣＲサイクルを横軸にとったグラフにプロットした図を図８に示す。６種のＰＣＲサンプルについての蛍光消光率の最大値の平均値は約２５％であり、蛍光プローブを構成するヌクレオチドがすべてＬＮＡである実施例１に比べて、蛍光消光率は３分の２程度であった。すなわち、蛍光プローブを構成するヌクレオチドをＤＮＡからＬＮＡとすることにより、蛍光消光率は約１．５倍向上した。

［実施例３］
ヒトβアクチン遺伝子の一部を標的核酸配列（配列番号：８）とする本発明の核酸プローブセットを用いて、リアルタイムＰＣＲ実験を行い、本発明の核酸プローブセットの有効性を評価した。

ヒトβアクチン遺伝子の全長配列を有するｍＲＮＡ（Beta actin mRNA, Human；ニッポン・ジーン社製）を１０²、１０³、１０⁴、１０⁵、１０⁶、１０⁷又は１０⁸コピー含む７種の試料について、逆転写酵素（SuperScript III RT；インビトロジェン社）を用いて周知の方法によりｃＤＮＡを調製した。

リアルタイムＰＣＲ用の反応溶液として、上記７種の試料から得たヒトβアクチン遺伝子のｃＤＮＡを有する反応溶液及び当該ｃＤＮＡを含まないＰＣＲ反応溶液を調製した。各反応溶液は、フォワードプライマー（配列番号：６、最終濃度０．３μＭ）、リバースプライマー（配列番号：７、最終濃度１．０μＭ）を含むほかは、キット（TITANIUM Taq PCR Kit、タカラバイオ株式会社製）に付属のマニュアルに従って調製した。本ＰＣＲ反応により上記標的核酸配列を含む２６２ｂｐの核酸が増幅される。
配列番号６：catgtacgttgctatccaggc
配列番号７：ctccttaatgtcacgcacgat

上記本発明の核酸プローブセットは、ヒトβアクチン遺伝子の一部を標的核酸（配列番号：８）とし、３’末端側に蛍光プローブと相補的な塩基配列の蛍光プローブ結合領域を、５’末端側に標的核酸と相補的な塩基配列の標的核酸結合領域を持つバインディングプローブ（配列番号：９、最終濃度１００ｎＭ）および配列番号１０の塩基配列を持ち、３’末端ヌクレオチドをBODIPY-FL（インビトロジェン社）で標識した蛍光プローブ（最終濃度５０ｎＭ）とから構成される。なお、当該蛍光プローブを構成するヌクレオチドは、すべてＬＮＡ（ThermoElectron社）を使用した。
配列番号８：gtgaggatcttcatgaggtagtcagtcag
配列番号９：ctgactgactacctcatgaagatcctcactatgaggtggtaggatgggtagtggt
配列番号１０：accactacccatcctaccacctcata-BODIPY-FL

上記本発明の核酸プローブセットのうち、バインディングプローブは、３’末端にリン酸基を持つ。上記核酸プローブは、つくばオリゴサービス株式会社（つくば市）に、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、株式会社日本遺伝子研究所（仙台市）に合成を委託した。

上記反応溶液をリアルタイムＰＣＲ装置（LightCycler（登録商標）１．５（Roche社））を用いて以下のＰＣＲ反応に供した。
（１）熱変性工程：９５℃で１２０秒間
（２）熱変性工程：９５℃、３０秒間
（３）アニーリング工程：５５℃、３０秒間
（４）伸長工程：７２℃、３０秒間
（１）の熱反応工程の後、工程（２）〜（４）を５０サイクル行い、（２）の熱変性工程と（３）のアニーリング工程において蛍光強度を測定した。なお、励起波長は４５０〜４９５ｎｍ、検出波長は５０５〜５３７ｎｍとした。

得られた蛍光強度を上記式１に代入し、標的核酸を含む７種の反応溶液について蛍光強度値を求めた。
得られた蛍光消光率を、ＰＣＲサイクルを横軸にとったグラフにプロットした図を図９に示す。この図より、本発明の核酸プローブセットを使用してリアルタイムＰＣＲを行うことにより、標的核酸を的確に定量できることが理解される。なお、上記７種のＰＣＲサンプルについての蛍光消光率の最大値の平均値は約３２％であった。

［比較例２］
蛍光プローブを構成するヌクレオチドをすべてＤＮＡとしたこと以外は実施例２と同様にしてリアルタイムＰＣＲ実験を行った。
得られた蛍光消光率を、ＰＣＲサイクルを横軸にとったグラフにプロットした図を図１０に示す。７種のＰＣＲサンプルについての蛍光消光率の最大値の平均値は約２５％であり、蛍光プローブを構成するヌクレオチドがすべてＬＮＡである実施例２に比べて、蛍光消光率は４分の３程度であった。すなわち、蛍光プローブを構成するヌクレオチドをＤＮＡからＬＮＡとすることにより、蛍光消光率は約１．３倍向上した。

＜本発明の第２態様＞
［実施例４］
３’末端ヌクレオチドをBODIPY-FL（インビトロジェン社）で標識したＬＮＡのみからなる配列番号１１のオリゴヌクレオチド（終濃度：５０ｎＭ）、ＤＮＡのみからなる配列番号１２のオリゴヌクレオチド（終濃度：４００ｎＭ）、ＫＣｌ（終濃度：５０ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（終濃度：１０ｍＭ）、ＭｇＣｌ₂（終濃度：１．５ｍＭ）を含む溶液を２０μＬにメスアップし、室温にてｐＨ８．７に調製した。
配列番号１１：ccccctcccccaa-BODIPY-FL
配列番号１２：gggttgggggaggggg

上記溶液をリアルタイムＰＣＲ測定装置（LightCycler（登録商標）、Roche社）に供し、融解曲線分析を行った。結果を図１１に示す。

図１１において解離ピークが観察されなかったことから、配列番号１１と１２のオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズをすると、９７℃においても解離せず、常圧の水系では常に安定な複合体を形成することが明らかとなった。

＜本発明の第３態様＞
［実施例５］
ヒトβ−グロビン遺伝子の一部を標的核酸配列とする本発明の核酸プローブセットを用いて、リアルタイムＰＣＲ実験を行い、本発明の核酸プローブセットの有効性を評価した。

リアルタイムＰＣＲ用の反応溶液として、ヒトゲノムＤＮＡ試料（Human Genomic DNA;Ｎｏｖａｇｅｎ社）を含まないＰＣＲ反応溶液およびヒトゲノムＤＮＡ試料を１０²、１０³、１０⁴、１０⁵、１０⁶または１０⁷コピー含むＰＣＲ反応溶液を調製した。各反応溶液は、いずれも、ＤＮＡ合成酵素としてTITANIUM Taq DNAポリメラーゼ（クロンテック社）、４種のｄＮＴＰ（それぞれ最終濃度０．２ｍＭ）、フォワードプライマー（配列番号：１３、最終濃度１μＭ）、リバースプライマー（配列番号：１４、最終濃度０．３μＭ）、所定量のTITANUM Taq PCR緩衝液（クロンテック社）および本発明の核酸プローブセットを含む。本ＰＣＲ反応により上記標的核酸配列を含む核酸が増幅される。
配列番号１３：ggttggccaatctactccagg
配列番号１４：tggtctccttaaacctgtcttg

上記本発明の核酸プローブセットは、ヒトβ−グロビン遺伝子の一部を標的核酸配列（配列番号：１５）とし、３’末端側に蛍光プローブと相補的な塩基配列の蛍光プローブ結合領域を、５’末端側に標的核酸配列と相補的な塩基配列の標的核酸結合領域を持つバインディングプローブ（配列番号：１６、最終濃度１００ｎＭ）および配列番号１７の塩基配列を持ち、３’末端ヌクレオチドをBODIPY-FL（インビトロジェン社）で標識した蛍光プローブ（最終濃度５０ｎＭ）とから構成される。なお、当該蛍光プローブを構成するヌクレオチドは、すべてＤＮＡである。
配列番号１５：gttcactagcaacctcaaacagacacc
配列番号１６：ggtgtctgtttgaggttgctagtgaactatgaggtggtaggatgggtagtggt
配列番号１７：accactacccatcctaccacctcata-BODIPY-FL

上記本発明の核酸プローブセット複合体が、配列番号１５の標的核酸配列とハイブリダイズしたときの模式図を図１６に示す。蛍光プローブに結合した蛍光物質は、標的核酸配列の５’末端のグアニンにより蛍光消光作用を受けると考えられる。
上記本発明の核酸プローブセットのうち、バインディングプローブは、３’末端にリン酸基を持つ。上記核酸プローブは、つくばオリゴサービス株式会社（つくば市）に、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、株式会社日本遺伝子研究所（仙台市）に合成を委託した。

上記反応溶液をリアルタイムＰＣＲ装置（LightCycler（登録商標）４８０（Roche社））を用いて以下のＰＣＲ反応に供した。
（１）熱変性工程：９５℃で１２０秒間
（２）熱変性工程：９５℃、３０秒間
（３）アニーリング工程：５５℃、３０秒間
（４）伸長工程：７２℃、３０秒間
（１）の熱反応工程の後、工程（２）〜（４）を５０サイクル行い、（２）の熱変性工程と（３）のアニーリング工程において蛍光強度を測定した。なお、励起波長は４５０〜４９５ｎｍ、検出波長は５０５〜５３７ｎｍとした。

得られた蛍光強度を以下の式２に代入し、標的核酸を含む６種の反応溶液について蛍光消光率を求めた。
［式２］
蛍光消光率＝[(G_U,55/G_U,95)-(G₅₅/G₉₅)]/(G_U,55/G_U,95)
ここで、
Ｇ_U,55：反応溶液のアニーリング工程（３）における核酸増幅が発生する前の任意のサイクルにおける蛍光強度
Ｇ_U,95：反応溶液の熱変性工程（２）における核酸増幅が発生する前の任意のサイクルにおける蛍光強度
Ｇ₅₅：反応溶液のアニーリング工程（３）における蛍光強度
Ｇ₉₅：反応溶液の熱変性工程（２）における蛍光強度
である。

得られた蛍光消光率を、ＰＣＲサイクルを横軸にとったグラフにプロットしたグラフを図１７に示す。この図より、本発明の核酸プローブセットを使用してリアルタイムＰＣＲを行うことにより、標的核酸を的確に定量できることが理解される。なお、上記６種のＰＣＲサンプルについての蛍光消光率の最大値の平均値は約２５％であった。

［比較例３］
バインディングプローブとして標的核酸結合領域を３’末端側に、蛍光プローブ結合領域を５’末端側に配置したもの（配列番号：１８）を用い、５’末端ヌクレオチドをBODIPY-FL（インビトロジェン社）で標識した配列番号１９の蛍光プローブを用い、ＰＣＲ反応溶液としてヒトゲノムＤＮＡ試料を１０、１０²、１０³、１０⁴、１０⁵、１０⁶１０⁷または１０⁸コピー含む７種を用いたこと以外は実施例５と同様にしてリアルタイムＰＣＲ実験を行った。なお、上記バインディングプローブは、３’末端にリン酸基を持つ。
配列番号１８：cgatgcagcgagtggcggcgatgggtgtctgtttgaggttgctagtgaac
配列番号１９：BODIPY-FL-catcgccgccactcgctgcatcg

得られた蛍光消光率を、ＰＣＲサイクルを横軸にとったグラフにプロットした図を図１８に示す。６種のＰＣＲサンプルについての蛍光消光率の最大値の平均値は約１５％であり、バインディングプローブ結合領域を５’末端側に、蛍光プローブ結合領域を３’末端側に配置した本発明の蛍光プローブを使用した実施例５に比べて、蛍光消光率は約６０％程度であった。すなわち、バインディングプローブ結合領域をバインディングプローブの５’末端側から３’末端側に変更することにより、蛍光消光率は約１．７倍向上した。

＜本発明の第２態様＞
［実施例６］
配列番号２０の塩基配列を持ち、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬで標識したＬＮＡのみからなるオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２１の塩基配列を持ち、ＤＮＡのみからなるオリゴヌクレオチド（相補鎖）を合成した。相補鎖は、上記プローブとハイブリダイズした際に、蛍光色素の近傍にグアニンが位置するように設計されている。なお、上記プローブの合成はジーンデザイン社（大阪府茨木市）に、上記プローブへのBODIPY-FLの標識およびHPLCによる精製は、つくばオリゴサービス（茨城県つくば市）に委託した。
配列番号２０：CCCCCTCCCCCTT-BODIPY-FL
配列番号２１：gggaagggggaggggg

表１に示す組成の反応液を調製し、リアルタイムＰＣＲ測定装置（LightCycler（登録商標）、Roche社）を用いて融解曲線分析を行った。また、ブランクとして表１の反応液に相補鎖を添加しないサンプルについても、同様の測定を行った。結果を図１９に示す。
この結果、相補鎖を添加した実施例では、相補鎖を添加しないブランクと比べて、低い蛍光強度を示した。これは、プローブと相補鎖との二本鎖形成によって、プローブに標識された蛍光色素が、相補鎖中のグアニンと相互作用し、蛍光が消光されたためである。このことから、本発明の第２態様のオリゴヌクレオチドプローブが、蛍光消光プローブとして好適に利用できることが明らかとなった。

また、融解曲線において解離ピークが観察されなかったことから、上記プローブとは相補鎖とハイブリダイズすると１００℃でも解離せず、常圧の水系では常に安定な複合体を形成することが明らかとなった。
なお、図１９中の蛍光強度（−）は任意単位である。

［実施例７］
配列番号２０のオリゴヌクレオチドプローブのＬＮＡをＰＮＡに変えたこと以外は、実施例６と同様にして融解曲線分析を行った。結果を図１９に示す。なお、当該プローブの合成はファスマック社（神奈川県厚木市）に委託した。

［実施例８］
配列番号２０のオリゴヌクレオチドプローブのＬＮＡをＥＮＡに変えたこと以外は、実施例６と同様にして融解曲線分析を行った。結果を図１９に示す。なお、当該プローブの合成はシグマジェノシス社（北海道石狩市）に委託した。

［実施例９］
配列番号２０のオリゴヌクレオチドプローブのＬＮＡを２',４'-ＢＮＡ^NCに変えたこと以外は、実施例６と同様にして融解曲線分析を行った。結果を図１９に示す。なお、当該プローブの合成はＢＮＡ社（大阪府茨木市）に委託した。

［実施例１０］
配列番号２０のオリゴヌクレオチドプローブのＬＮＡを２',４'-ＢＮＡ^COCに変えたこと以外は、実施例６と同様にして融解曲線分析を行った。結果を図１９に示す。なお、当該蛍光プローブの合成はＢＮＡ社（大阪府茨木市）に委託した。

図１９に示す結果より、実施例６〜１０で使用した人工ヌクレオチドは、本発明の第２の実施態様におけるオリゴヌクレオチドプローブに好適に使用できることが明らかとなった。また、これらのプローブは、本発明の第１の実施態様における核酸プローブセットの蛍光プローブとしても好適に使用できることが明らかとなった。

また、全ての解離曲線において解離ピークが観察されなかったことから、実施例６〜１０で使用したプローブは、いずれも相補鎖とハイブリダイズをすると、１００℃においても解離せず、常圧の水系では常に安定な複合体を形成することが明らかとなった。

＜本発明の第１態様、第２態様＞
［実施例１１］
実施例６で使用したオリゴヌクレオチドプローブを本発明の第１態様の核酸プローブセットにおける蛍光プローブ（Ａ）として使用し、リアルタイムＰＣＲ実験を行い、本発明の第２態様のオリゴヌクレオチドプローブについて、蛍光プローブ（Ａ）としての有効性を評価した。

具体的には、実施例６で使用したＬＮＡのみからなるオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２２のＤＮＡのみからなるオリゴヌクレオチドとからなる核酸プローブセットを用い、標的核酸（ヒトゲノムＤＮＡ試料）を１００コピーとしたこと以外は、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応を行った。
なお、配列番号２２のオリゴヌクレオチドのうち、３’末端の１３塩基が蛍光プローブ結合領域（ｂ１）、５’末端側がヒトβ−グロビン遺伝子の一部を標的核酸配列とする標的核酸結合領域（ｂ２）である。
配列番号２２：ggtgtctgtttgaggttgctagtgaactatgaggaagggggaggggg

最終サイクル（５０サイクル目）の蛍光強度について、実施例１と同様にして蛍光消光率を算出した。また、ブランクとして標的核酸を添加しない系についても同様の測定を行った。結果を表２に示す。

［実施例１２〜１５］
実施例７〜１０で使用した蛍光プローブをそれぞれ使用したこと以外は、実施例１１と同様にして蛍光消光率を算出した。結果を表２に示す。

以上の結果より、標的核酸が存在しないブランクにおいては、どの人工ヌクレオチドを用いた蛍光プローブでも、蛍光消光は確認されなかった。一方、１００コピーの標的核酸を含む場合、どの人工ヌクレオチドを用いた蛍光プローブでも、ほぼ同程度の蛍光消光率が得られた。
これらの結果より、実施例１１〜１５で使用した人工ヌクレオチドは全て、本発明の第１態様の核酸プローブセットおよび該プローブセットを利用する遺伝子解析手法に好適に利用できることが明らかとなった。

＜本発明に使用しうる蛍光物質の探索＞
［実施例１６］
本発明の核酸プローブセットに使用しうる蛍光物質のスクリーニングを実施した。具体的には、ＬＮＡのみからなる配列番号２０のオリゴヌクレオチドの３’末端をPacific Blue（インビトロジェン社）で標識したこと以外は実施例１１と同じ条件でＰＣＲ反応を行った。
なお、オリゴヌクレオチドの合成はジーンデザイン社（大阪府茨木市）に委託し、当該オリゴヌクレオチドへの蛍光物質の標識はつくばオリゴサービス（茨城県つくば市）に委託した。

ＰＣＲ反応後、得られた反応液を、PCRバッファー（×１）にて１０倍希釈した後、恒温装置付き蛍光光度計（LS50B、パーキンエルマー社製）にて、９５℃の蛍光強度と、５５℃の蛍光強度を測定した。９５℃の蛍光強度は、解離時の蛍光強度であり、５５℃の蛍光強度は、ハイブリダイズ時の蛍光強度である。
得られた蛍光強度を以下の式３に代入し、蛍光消光率を求めた。結果を表４に示す。
なお、色素の励起波長、蛍光測定波長は表３に示す値とした。また、スリット幅は、励起、蛍光測定ともに５ｎｍとした。

［式３］
蛍光消光率＝[(G_B,55/G_B,95)-(G_100,55/G_100,95)]/(G_B,55/G_B,95)
ここで、
Ｇ_B,55：ブランク（標的核酸添加量：０コピー）における５５℃の蛍光強度
Ｇ_B,95：ブランク（標的核酸添加量：０コピー）における９５℃の蛍光強度
Ｇ_100,55：標的核酸添加量：１００コピーにおける５５℃の蛍光強度
Ｇ_100,95：標的核酸添加量：１００コピーにおける９５℃の蛍光強度
である。

［実施例１７〜２３］
蛍光物質としてそれぞれ、Alexa Fluor 488（インビトロジェン社）、BODIPY-FL（インビトロジェン社）、フルオレセイン、6-JOE、カルボキシローダミン６Ｇ(CR6G)、テトラメチルローダミン(TMR)、Cy5（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を使用したこと以外は実施例１６と同様にして蛍光消光率を測定した。結果を表４に示す。

得られた蛍光消光率を、以下の表４に示す。Alexa Fluor 488、Cy5以外の色素で１５％以上の蛍光消光率が確認された。特に、Pacific Blue、BODIPY-FL、カルボキシローダミン６Ｇ(CR6G)については、約４０％と、著しい蛍光消光が確認された。以上の結果より、Pacific Blue、BODIPY-FL、カルボキシローダミン６Ｇ(CR6G)、フルオレセイン、6-JOE、テトラメチルローダミン(TMR)が、本発明に使用する蛍光物質として特に有用であることが示された。

＜本発明を利用した応用例＞
本発明は、様々な遺伝子解析法に応用することができる。以下に例を挙げて説明する。

［応用例１］
本発明の応用例として、図２０に示すような、ＤＮＡ／ＲＮＡのキメラオリゴヌクレオチドからなる標的核酸結合領域（ｂ２）の両端に、それぞれ配列が異なる蛍光プローブ結合領域１、２（ｂ１−１、ｂ１−２）を有するバインディングプローブと、末端を蛍光物質で標識し蛍光プローブ結合領域１にハイブリダイズしうる蛍光プローブ（Ａ）および末端をクエンチャー物質で標識し蛍光プローブ結合領域２にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド（Ｆ）からなる本発明の核酸プローブセットを挙げることができる。

上記蛍光プローブ（Ａ）およびオリゴヌクレオチド（Ｆ）にバインディングプローブとの解離温度を上昇させる機能を有する人工ヌクレオチドを導入することにより、バインディングプローブと強固に結合し、これらの３分子が常に一体となって移動することとなる。この状態では、蛍光物質とクエンチャー物質が非常に接近するため、ＦＲＥＴ（または、直接的エネルギー移動）が発生し、蛍光物質の発する蛍光は抑制される。

上記核酸プローブセットと標的核酸とがハイブリダイズした場合に、ＲＮＡとＤＮＡの２本鎖を認識しＲＮＡ部分を切断するＲＮａｓｅＨを作用させることにより、当該ＲＮａｓｅＨは、標的核酸結合領域のＲＮＡ領域（ｆ）でバインディングプローブを切断することとなる。
この結果、蛍光物質とクエンチャー物質との間のＦＲＥＴ（または、直接的エネルギー移動）が解消され、蛍光物質が蛍光を発することとなる。この変化をモニタリングすることで、標的核酸の存在を検出することができる。

［応用例２］
図２１に示すように、末端に数塩基のステム領域（ｓ１）を有し、少なくともその最末端塩基をシトシンとし、当該シトシンを蛍光物質で標識した人工ヌクレオチドを有する蛍光プローブ（Ａ）と、一端に蛍光プローブのステム領域（ｓ１）と相補的なステム領域（ｓ２）を、別の一端に蛍光プローブ結合領域（ｂ１）とを有し、それらの間に標的核酸結合領域（ｂ２）を有するバインディングプローブ（Ｂ）からなる本発明の核酸プローブセットを用いて、標的核酸を検出する方法について示す。

上述したとおり蛍光プローブのステム領域（ｓ１）とバインディングプローブのステム領域（ｓ２）は相補的な塩基配列を持つため、上記蛍光プローブとバインディングプローブとがハイブリダイズすると、図２２に示すような２次構造となり、ステム構造が形成される。この際、蛍光物質の近傍にグアニン塩基が位置するため、グアニンと蛍光物質とが相互作用し、蛍光が消光することとなる。

この核酸プローブセットを含む系に、標的核酸を添加すると、当該核酸プローブセットと標的核酸とが結合し、図２３に示すように核酸プローブセットの２次構造が変化する。この結果、グアニンと蛍光物質との距離が広がるため、蛍光消光が妨げられ、蛍光強度が増大する。この変化をモニタリングすることで、標的核酸の存在を検出することができる。

［応用例３］
本応用例では、図２４で示すような、人工ヌクレオチドを有する蛍光プローブ（Ａ）、人工ヌクレオチドを有し末端をクエンチャー物質で標識したオリゴヌクレオチド（Ｆ）並びに末端に上記蛍光プローブおよび上記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列領域（ｂ１−１、ｂ１−２）、それに隣接してステムループ構造を形成するための塩基配列領域、それらの間に標的核酸結合領域（ｂ２）を有するバインディングプローブ（Ｂ）を使用する。

上記蛍光プローブ（Ａ）、オリゴヌクレオチド（Ｆ）およびバインディングプローブ（Ｂ）を混合すると、これらの３分子は、図２５に示すような複合体を形成する。人工ヌクレオチドを有する２本のプローブとそれらに相補的な塩基配列領域（ｂ１−１、ｂ１−２）との間に形成される２本鎖は熱安定性が非常に高いため、これらの３分子が常に一体となって存在することとなる。この状態では、蛍光物質とクエンチャー物質とが非常に接近するため、FRET（または、直接的エネルギー移動）により蛍光物質の発する蛍光は抑制される。

標的遺伝子が存在する場合、図２６に示すようにバインディングプローブの標的核酸結合領域（ｂ２）と標的核酸とがハイブリダイズする。この際、核酸プローブセット複合体のステムループ構造が解消されるため、蛍光物質とクエンチャー物質との距離が開き、結果として、蛍光物質が蛍光を発するようになる。この変化をモニタリングすることで、標的核酸の存在を検出することができる。

［応用例４］
本応用例では、図２７に示すように、人工ヌクレオチドを有する蛍光プローブ（Ａ）、人工ヌクレオチドを有し末端をクエンチャー物質で標識したオリゴヌクレオチド（Ｆ）、蛍光プローブ結合領域（ｂ１−１）と標的核酸結合領域（ｂ２−１）とを有する第１のバインディングプローブ（Ｂ１）並びに上記オリゴヌクレオチド（Ｆ）との結合領域（ｂ２−１）と標的核酸結合領域（ｂ２−２）とを有する第２のバインディングプローブ（Ｂ２）を使用する。
なお、上記標的核酸結合領域ｂ２−１とｂ２−２とは、標的核酸の隣接した部分にハイブリダイズするように設計する。

上記蛍光プローブ（Ａ）、オリゴヌクレオチド（Ｆ）、第１および第２のバインディングプローブを混合すると、図２８に示すような２つの複合体を形成する。人工ヌクレオチドを有する２本のプローブとそれらに相補的な塩基配列領域（ｂ１−１、ｂ１−２）との間に形成される２本鎖は熱安定性が非常に高いため、これらの複合体は、水系では常に複合体として存在する。標的核酸が存在しない場合、蛍光物質とクエンチャー物質とは相互作用しないため、蛍光物質は強い蛍光を発生する。

一方、標的核酸が存在する場合、上記２つの複合体は図２９に示すように標的核酸とハイブリダイズする。この結果、蛍光物質とクエンチャー物質とが隣接することとなり、FRET（または、直接的エネルギー移動）により蛍光消光が起きる。この変化をモニタリングすることで、標的核酸の存在を検出することができる。

［応用例５］
本応用例では、図３０に示すように、一端を蛍光物質（ｄ）で、もう一端をクエンチャー物質（ｑ）で標識した人工ヌクレオチドとＤＮＡからなる蛍光プローブ（Ａ）と、蛍光プローブ結合領域（ｂ１）と標的核酸結合領域（ｂ２）とを有するバインディングプローブ（Ｂ）とからなる核酸プローブセットを使用する。
なお、蛍光プローブ（Ａ）は、一端をバインディングプローブの標的核酸結合領域（ｂ２）と隣接して標的核酸にハイブリダイズする標的核酸結合領域（ｅ）とする。

上記蛍光プローブ（Ａ）とバインディングプローブ（Ｂ）とを混合すると、図３１に示すような核酸プローブセット複合体を形成する。人工ヌクレオチドを有する蛍光プローブと蛍光プローブ結合領域との熱安定性は非常に高いため、当該複合体は、水系では常に複合体として存在する。
標的核酸が存在しない場合、蛍光プローブに標識された蛍光物質とクエンチャー物質は互いに近接するため、FRET（または、直接的エネルギー移動）により蛍光消光が起こる。

標的核酸が存在する場合、上記複合体が標的核酸に結合するが、結合しただけでは、蛍光物質とクエンチャー物質との距離は大きく変化しないので、蛍光強度は変化しない。しかし、標的核酸が存在する状況で、５’→３’のエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ）を添加してＤＮＡ合成反応を行うと、上記蛍光プローブがＤＮＡポリメラーゼによって加水分解され、その結果、蛍光物質とクエンチャー物質との相互作用がなくなり、蛍光物質が発蛍光することとなる。この変化をモニタリングすることで、標的核酸の存在を検出することができる。

＜ユニバーサルな核酸プローブセットを使用するＳＮＰタイピング実験＞
［実施例２４］
本発明の核酸プローブセットを用いて、β２−アドレナリン受容体（ＡＤＲＢ２）遺伝子（Ａ／Ｇ）を標的とするＳＮＰタイピング実験を行った。
ボランティアの口腔細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＤＲＢ２遺伝子の３種の遺伝型（Ａアレルホモ、ＧアレルホモおよびＡＧヘテロ）についてそれぞれゲノムＤＮＡを調製した。
上記３種のゲノムＤＮＡについて、フォワードプライマー（配列番号２３）およびリバースプライマー（配列番号２４）を用いてＰＣＲを行い、それぞれからＡＤＲＢ２遺伝子（Ａアレルホモ、ＧアレルホモおよびＡＧヘテロ）を調製した。
配列番号２３：CATGTACGTTGCTATCCAGGC
配列番号２４：CTCCTTAATGTCACGCACGAT
配列番号２３のＴｍの予想値は、６２．５℃、配列番号２４のＴｍの予想値は６１．９℃であった。

ＡＤＲＢ２遺伝子を１０⁴コピー有するサンプルを３種の遺伝子型についてそれぞれ調製した。これらのサンプルをそれぞれ５０サイクルのＰＣＲに供し十分に増幅した後、融解曲線分析に使用した。なお、ＰＣＲには、配列番号２５のフォワードプライマー（Ｔｍ：５９．５℃）と配列番号２６のリバースプライマー（Ｔｍ：５９．２℃）を使用した。
配列番号２５：CGCTGAATGAGGCTTCC
配列番号２６：CAGCACATTGCCAAACAC
増幅したＡＤＲＢ２遺伝子に、バインディングプローブ（配列番号２７）および蛍光プローブ（配列番号２８）を加え、融解曲線分析を行った。結果を図３３に示す。
図中、野生型遺伝子のホモ接合型（Ａアレルホモ）のサンプルをｗ、変異型遺伝子のホモ接合型（Ｇアレルホモ）のサンプルをｍ、野生型と変異型のヘテロ接合型（ＡＧヘテロ）のサンプルをｗ＋ｍで示す。

これらの結果から、野生型のホモ接合型（Ａアレルホモ）、変異型のホモ接合型（Ｇアレルホモ）およびヘテロ接合型（ＡＧアレルヘテロ）のＳＮＰ遺伝子型を明確に判別することができる。すなわち、野生型遺伝子のホモ接合型のＴｍは５３．０℃で変異型遺伝子のホモ接合型（Ｔｍ：６１．６℃）と明確に区別できた。また、ヘテロ接合型では、２つのＴｍが観測された。この結果から、本発明のユニバーサルな核酸プローブセットがＳＮＰタイピングにも応用できることが明らかとなった。

なお、実施例２４に使用した、配列番号２７のバインディングプローブは、５’末端側にＡＤＲＢ２遺伝子の一部と相補的な配列を有する標的核酸結合領域を、３’末端側に蛍光プローブ結合領域を有する、ＤＮＡのみからなるオリゴヌクレオチドである。
配列番号２７：CTTCCATTGGGTGCCAGCttgggggaggggg
配列番号２７において、標的核酸結合領域を大文字で、蛍光プローブ結合領域を小文字で示す。なお、５’末端から５番目のシトシンがＳＮＰ部位（Ｇアレルホモ又はＡＧヘテロのグアニン）と相補対を形成する。標的核酸結合領域のＴｍ予想値は６３．０℃であった。

一方、蛍光プローブ（配列番号２８）は、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬで標識したＬＮＡのみからなるオリゴヌクレオチドである。Ｔｍ予想値は１０２℃であった。
配列番号２８：CCCCCTCCCCCAA-BODIPY-FL

融解曲線分析の反応溶液は、全量が２０μＬで、サンプルＤＮＡを１０⁴コピー、ＬＣ４８０ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｍａｓｔｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）、０．２５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．１５−０．５μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、０．１５μＭの蛍光プローブ、０．５μＭのバインディングプローブおよび０．１ユニットのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を含む。リアルタイムＰＣＲ装置としては、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を使用した。

［実施例２５］
本発明の核酸プローブセットを用いて、β３−アドレナリン受容体（ＡＤＲＢ３）遺伝子（Ｃ／Ｔ）を標的とするＳＮＰタイピング実験を行った。
ボランティアの口腔細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＤＲＢ３遺伝子の３種の遺伝型（Ｃアレルホモ、ＴアレルホモおよびＣＴヘテロ）についてそれぞれゲノムＤＮＡを調製した。
上記３種のゲノムＤＮＡについて、フォワードプライマー（配列番号２９）およびリバースプライマー（配列番号３０）を用いてＰＣＲを行い、それぞれからＡＤＲＢ３遺伝子（Ｃアレルホモ、ＴアレルホモおよびＣＴアレルヘテロ）を調製した。
配列番号２９：AGCTCTCTTGCCCCATG
配列番号３０：GCCAGCGAAGTCACGAA
配列番号２９のＴｍの予想値は、６０．９℃、配列番号３０のＴｍの予想値は６１．７℃であった。

配列番号３１のフォワードプライマー（Ｔｍ：６０．５℃）と配列番号３２のリバースプライマー（Ｔｍ：６０．７℃）を使用した他は、実施例２４と同様の手順でそれぞれのサンプルについてＡＤＲＢ３遺伝子を増幅した。
配列番号３１：TGGCCTCACGAGAACAG
配列番号３２：GAGTCCCATCACCAGGTC
配列番号３３のバインディングプローブを用いたこと以外は実施例２４と同様にして、融解曲線分析を行った。結果を図３４に示す。
図中、野生型遺伝子のホモ接合型（Ｔアレルホモ）のサンプルをｗ、変異型遺伝子のホモ接合型（Ｃアレルホモ）のサンプルをｍ、野生型と変異型のヘテロ接合型（ＣＴアレルヘテロ）のサンプルをｗ＋ｍで示す。

これらの結果から、野生型遺伝子のホモ接合型（Ｔアレルホモ）のＴｍは６３．９℃で変異型遺伝子のホモ接合型（Ｃアレルホモ、Ｔｍ：７０．２℃）と明確に区別できた。

なお、実施例２５に使用した、配列番号３３のバインディングプローブは、５’末端側にＡＤＲＢ３遺伝子の一部と相補的な配列を有する標的核酸結合領域を、３’末端側に蛍光プローブ結合領域を有する、ＤＮＡのみからなるオリゴヌクレオチドである。
配列番号３３：CCATCGCCCGGACTCCGAGACTCttgggggaggggg
配列番号３３において、標的核酸結合領域を大文字で、蛍光プローブ結合領域を小文字で示す。なお、５’末端から９番目のシトシンがＳＮＰ部位（Ｃアレルホモ又はＣＴヘテロのシトシン）のアンチセンス鎖と相補対を形成する。標的核酸結合領域のＴｍ予想値は７１．８℃であった。

［実施例２６］
本発明の核酸プローブセットを用いて、脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）遺伝子（Ａ／Ｇ）を標的とするＳＮＰタイピング実験を行った。
ボランティアの口腔細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＵＣＰ１遺伝子の３種の遺伝型（Ａアレルホモ、ＧアレルホモおよびＡＧアレルヘテロ）についてそれぞれゲノムＤＮＡを調製した。
上記３種のゲノムＤＮＡについて、フォワードプライマー（配列番号３４）およびリバースプライマー（配列番号３５）を用いてＰＣＲを行い、それぞれからＵＣＰ１遺伝子（Ａアレルホモ、ＧアレルホモおよびＡＧアレルヘテロ）を調製した。
配列番号３４：AGTGGTGGCTAATGAGAGAA
配列番号３５：AAGGAGTGGCAGCAAGT
配列番号３４のＴｍの予想値は、６０．０℃、配列番号３５のＴｍの予想値は６０．７℃であった。

配列番号３６のフォワードプライマー（Ｔｍ：６０．８℃）と配列番号３７のリバースプライマー（Ｔｍ：５８．６℃）を使用した他は、実施例２４と同様の手順でそれぞれのサンプルについてＵＣＰ１遺伝子を増幅した。
配列番号３６：TTCTTCTGTCATTTGCACATTTATCT
配列番号３７：AACTGACCCTTTATGACGTAG
配列番号３８のバインディングプローブを用いたこと以外は実施例２４と同様にして、融解曲線分析を行った。結果を図３５に示す。
図中、野生型遺伝子のホモ接合型（Ａアレルホモ）のサンプルをｗ、変異型遺伝子のホモ接合型（Ｇアレルホモ）のサンプルをｍ、野生型と変異型のヘテロ接合型（ＡＧアレルヘテロ）のサンプルをｗ＋ｍで示す。

これらの結果から、野生型遺伝子のホモ接合型（Ａアレルホモ）のＴｍは５２．５℃で変異型遺伝子のホモ接合型（Ｇアレルホモ、Ｔｍ：６０．２℃）と明確に区別できた。

なお、実施例２６に使用した、配列番号３８のバインディングプローブは、５’末端側にＵＣＰ１遺伝子の一部と相補的な配列を有する標的核酸結合領域を、３’末端側に蛍光プローブ結合領域を有する、ＤＮＡのみからなるオリゴヌクレオチドである。
配列番号３８：CACTCGATCAAACTGTGGTCttgggggaggggg
配列番号３８において、標的核酸結合領域を大文字で、蛍光プローブ結合領域を小文字で示す。なお、５’末端から５番目のシトシンがＳＮＰ部位（Ｇアレルホモ又はＡＧヘテロのグアニン）と相補対を形成する。標的核酸結合領域のＴｍ予想値は５９．９℃であった。
実施例２４〜２６の結果から、本発明のユニバーサルな核酸プローブセットがＳＮＰタイピングにも応用でき、分析を安価でかつ迅速にできることが明らかとなった。

本発明の第１態様により、蛍光消光率が改善された、蛍光プローブとバインディングプローブとからなる核酸プローブセットが提供される。本発明の核酸プローブセットは、従来の一本鎖核酸プローブと同程度の蛍光消光率を示し、かつ、高価な蛍光標識した核酸プローブを分析対象の標的核酸ごとに調製する必要がないため、従来の核酸プローブに比べ安価にかつ短時間で標的核酸に対する核酸プローブを調製することができるという利点を有する。本発明の第１態様の核酸プローブセットは、医学、分子生物学および農学などの分野において、核酸の検出、定量、多型分析、突然変異の検出などに応用することができる。
本発明の第２態様によれば、常圧下では水系において解離しない安定な複合体を形成することができるオリゴヌクレオチドが提供され、さらにはその使用方法が提供される。
本発明の第３態様によれば、蛍光消光率が改善された核酸プローブセットが提供される。本発明の第３態様の核酸プローブセットは、高価な蛍光標識した核酸プローブを分析対象の標的核酸ごとに調製する必要がないため、従来の核酸プローブに比べ安価にかつ短時間で標的核酸に対する核酸プローブを調製することができるという利点を有する。本発明の核酸プローブセットは、医学、分子生物学および農学などの分野において、核酸の検出、定量、多型分析、突然変異の検出などに応用することができる。

Ａ 蛍光プローブ
Ｂ バインディングプローブ
Ｃ 標的核酸配列
Ｆ 人工ヌクレオチドを有し末端をクエンチャー物質で標識したオリゴヌクレオチド
Ｐ ５’→３’のエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ
Ｔ 標的核酸
ａ 蛍光物質で標識されたヌクレオチド
ａ’ 標識物質で標識されたヌクレオチド
ｂ１ 蛍光プローブ結合領域
ｂ２ 標的核酸結合領域
ｄ 蛍光物質
ｅ 標的核酸結合領域
ｆ ＲＮＡ領域
ｈ 標識物質
ｑ クエンチャー物質
ｓ ステム領域
α ヌクレオチドα
β ヌクレオチドβ
γ ヌクレオチドγ
δ ヌクレオチドδ
ｍ 変異型アレルホモの融解曲線
ｗ 野生型アレルホモの融解曲線
ｗ＋ｍ 野生型と変異型のアレルへテロの融解曲線

Claims (10)

1. 蛍光物質（ｄ）で標識されたヌクレオチド（ａ）を含むオリゴヌクレオチドからなる蛍光プローブ（Ａ）、及び、該蛍光プローブ（Ａ）にハイブリダイズする蛍光プローブ結合領域（ｂ１）と、標的核酸配列（Ｃ）にハイブリダイズする標的核酸結合領域（ｂ２）とを有するオリゴヌクレオチドからなるバインディングプローブ（Ｂ）からなり、上記蛍光物質（ｄ）が、グアニンと相互作用することにより蛍光消光する蛍光物質であり、上記ヌクレオチド（ａ）が上記蛍光プローブ（Ａ）の５’末端ヌクレオチドまたは３’末端ヌクレオチドであり、上記蛍光プローブ（Ａ）を構成するヌクレオチドの少なくとも１つが、該プローブ（Ａ）と蛍光プローブ結合領域（ｂ１）との解離温度を上昇させる機能を有する人工ヌクレオチドであることを特徴とする核酸プローブセット。
2. 前記解離温度を上昇させる機能を有する人工ヌクレオチドが、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＥＮＡ、２’，４’−ＢＮＡ^NCおよび２’，４’−ＢＮＡ^COCからなる群より選ばれる１種以上の人工ヌクレオチドである請求項１に記載の核酸プローブセット。
3. 蛍光プローブ（Ａ）を構成するヌクレオチドの３分の１以上が人工ヌクレオチドである請求項２に記載の核酸プローブセット。
4. 蛍光プローブ（Ａ）を構成するヌクレオチドの８０％以上が人工ヌクレオチドである請求項２に記載の核酸プローブセット。
5. 前記蛍光物質（ｄ）が、テトラブロモスルホンフルオレセイン、2-オキソ-6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-2H-1-ベンゾピラン-3-カルボン酸、ローダミン６Ｇ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシテトラメチルローダミンおよびBODIPY-FLからなる群から選択されるいずれかである請求項３に記載の核酸プローブセット。
6. 前記標的核酸結合領域（ｂ２）が、バインディングプローブ（Ｂ）の５’末端側にあり、かつ、前記蛍光物質（ｄ）で標識されたヌクレオチド（ａ）が、前記蛍光プローブ（Ａ）の３’末端ヌクレオチドである請求項３に記載の核酸プローブセット。
7. 以下の工程（１）〜（４）を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法。
   （１）請求項３に記載の核酸プローブセットと標的核酸とをハイブリダイズさせる工程、
   （２）次いで上記ハイブリダイズした上記核酸プローブセットと上記標的核酸との複合体の蛍光強度を測定する工程、
   （３）上記核酸プローブセットと上記標的核酸との比率を変えて、上記工程（１）および（２）を行う工程、
   （４）上記工程（２）および（３）より得られた蛍光強度を比較する工程。
8. 以下の工程（１）〜（４）を包含することを特徴とする核酸の塩基配列多型の分析方法。
   （１）請求項３に記載の核酸プローブセットと標的核酸とをハイブリダイズさせる工程、
   （２）次いで上記ハイブリダイズした上記核酸プローブセットと上記標的核酸との複合体について蛍光強度の温度依存性を測定する工程、
   （３）上記標的核酸に代えて別の核酸を用いて、上記工程（１）および（２）を行う工程、
   （４）上記工程（２）および（３）より得られた蛍光強度の温度依存性を比較する工程。
9. 請求項３に記載の核酸プローブセットと標的核酸との複合体について融解曲線分析を行うことを特徴とする方法。
10. グアニンと相互作用することにより蛍光消光する蛍光物質で標識されたヌクレオチド（ａ’）を含み、該ヌクレオチド（ａ’）が５’末端ヌクレオチドまたは３’末端ヌクレオチドであり、一部または全てのヌクレオチドが、相補鎖からの解離温度を上昇させる機能を有する人工ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドプローブであって、常圧条件下で、相補鎖との解離温度が１００℃以上であるオリゴヌクレオチドプローブを、蛍光プローブ（Ａ）として用いる請求項１に記載の核酸プローブセット。

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