KR20200013955A - 소거 프로브 기반 염색체 수적이상 검출방법 및 염색체 수적이상 검출용핵산의 조성물 - Google Patents

소거 프로브 기반 염색체 수적이상 검출방법 및 염색체 수적이상 검출용핵산의 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적 염색체의 수적이상 유무를 고민감도로 분석하기 위한 방법 및 염색체 수적이상 검출용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 염색체 수 이상과 관련이 없는 염색체 상에 위치한 대조 염기서열과 염색체 수 이상과 관련된 염색체 상에 위치한 표적 염기서열을 동일한 프라이머를 사용하여 증폭한 다음, 상기 대조 염기서열 또는 표적 염기서열과 1 또는 2개의 염기 서열이 상이한 분석 프로브; 및 분석 프로브의 표적 염기서열 또는 대조 염기서열 혼성화 서열의 일부 또는 전부를 포함하고, 분석 프로브보다 상기 증폭산물과 결합력이 높은 소거 프로브를 이용하여 상기 증폭산물과 혼성화시켜, 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 염색체 수적 이상을 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 염색체 수적이상 검출 방법은 일정 비율의 표적 염기서열과 대조 염기서열의 동량을 소거 프로브를 이용하여 분석에서 제한함으로써 표적 염기서열과 대조염기서열의 비율을 높은 해상도로 분석할 수 있고, 이를 사용하면 낮은 비율로 존재하는 염색체(예를 들어 산모의 양수 또는 산모의 혈액 내의 태아 염색체)의 수적이상을 높은 민감도와 빠른 속도로 검출할 수 있어 유용하다.

Description

소거 프로브 기반 염색체 수적이상 검출방법 및 염색체 수적이상 검출용핵산의 조성물{Method for Detecting Chromosomal Numeric Abnormality based on Elimination Probe and Composition for Detecting Chromosomal Numeric Abnormality}
본 발명은 표적 염색체의 수적이상 유무를 고민감도로 분석하기 위한 방법 및 염색체 수적이상 검출용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 염색체 수 이상과 관련이 없는 염색체 상에 위치한 대조 염기서열과 염색체 수 이상과 관련된 염색체 상에 위치한 표적 염기서열을 동일한 프라이머를 사용하여 증폭한 다음, 상기 대조 염기서열 또는 표적 염기서열과 1 또는 2개의 염기 서열이 상이한 분석 프로브; 및 분석 프로브의 표적 염기서열 또는 대조 염기서열 혼성화 서열의 일부 또는 전부를 포함하고, 분석 프로브 보다 상기 증폭산물과 결합력이 높은 소거 프로브를 이용하여 상기 증폭산물과 혼성화시켜, 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 염색체 수적 이상을 판별하는 방법에 관한 것이다.
염색체 이상(chromosomal abnormality)은 유전적 결함과 퇴행성 질환과 관련 있다. 염색체 이상은 염색체의 결실 또는 중복, 염색체 중 일부의 결실 또는 중복, 또는 염색체 내의 손상(break), 전위(translocation), 또는 역위(inversion)를 의미하는 것일 수 있다. 염색체 이상은 유전적 균형의 장애 중 하나로, 태아 사망 또는 육체 및 정신 상태의 심각한 결함을 유발한다. 예컨대, 다운증후군(Down's syndrome)은 21번 염색체가 3개 존재하여(trisomy 21) 유발되는 염색체 수 이상의 흔한 형태이다. 에드워드증후군(Edwards syndrome) (trisomy 18), 파타우 증후군(Patau syndrome) (trisomy 13), 터너증후군(Turner syndrome) (XO), 및 클라인펠터 증후군(Klinefelter syndrome) (XXY) 또한 염색체 수 이상에 해당한다.
염색체 이상은 핵형 검사(Karyotype), 및 HISH(Fluorescent In Situ Hybridization)를 사용하여 검출 가능하다. 이러한 검출법은 시간, 노력 및 정확도 측면에서 불리하다. 더욱이, 핵형 검사는 세포 배양에 많은 시간을 요한다. FISH는 핵산 서열과 염색체 위치가 알려진 샘플에 대해서만 사용 가능하다. FISH의 문제점을 회피하기 위하여, 비교유전자보합법(Comparative genome hybridization, CGH)을 사용할 수 있다. CGH는 전체게놈을 분석하여 염색체 수 이상이 발생한 부분을 검출할 수 있다. 그러나, CGH는 FISH와 비교하여 해상도가 낮다는 단점이 있다.
다른 접근으로, DNA 마이크로어레이를 염색체 이상 검출에 사용할 수 있다. DNA 마이크로어레이 시스템은 마이크로어레이 상에 고정된 생체분자(bio-molecules)의 종류에 따라서 cDNA 마이크로어레이, 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이, 및 게놈 마이크로어레이로 분류할 수 있다. cDNA 마이크로어레이와 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이는 제작은 용이하지만, 이들 시스템은 마이크로오레이 상에 고정되는 프로브의 수가 제한적이고, 프로브 제작이 비용이 많이 들며, 프로브 외부에 위치하는 염색체 이상을 검출하기 곤란하다는 단점이 있다.
특히, 게놈 DNA 마이크로어레이 시스템의 경우, 프로브의 제작이 용이하고 염색체의 확장된 영역뿐 아니라 염색체의 인트론 영역에서의 염색체 이상을 검출할 수 있지만, 염색체 내의 위치화 및 기능이 확인된 DNA 단편을 많은 수로 제작하기에 곤란하다.
최근, 차세대 시퀀싱 기술이 염색체 수이상 분석에 사용되고 있다(Park, H., Kim et al., Nat Genet 2010, 42, 400-405.; Kidd, J. M. et al., Nature 2008, 453, 56-64). 그러나 이 기술은 염색체 수이상 분석을 위한 높은 coverage reading을 요구하며, CNV 측정은 독립적인 입증(validation)을 또한 필요로 한다. 따라서 비용이 매우 높고, 결과를 이해하기 어려우므로, 그 당시 일반적인 유전자 검색분석으로서 적절하지 못하였다.
이러한 목적을 위해 실시간 qPCR이 현재 정량적인 유전자 분석용 첨단 기술로서 사용되는데, 이는 넓은 동역학범위(Weaver, S. et al, Methods 2010, 50, 271-276) 및 역치 주기(threshold cycle)와 초기 타겟 양 사이에 선형적인 상관관계가 재현성 있게 관찰되기 때문이다(Deepak, S. et al., Curr Genomics 2007,8, 234-251). 그러나 qPCR 분석의 민감도는 복제수 차이를 구별할 만큼 충분히 높지 않다. 이의 광범위한 동역학 범위에도 불구하고, qPCR 기반 분석의 고유 변수 때문에 1.5배 변화와 같은 작은 변화는 신뢰성 있게 측정되지 못한다. 또한, 유사한 DNA 복제수를 갖는 샘플들 사이의 신뢰성 있는 식별을 위해, 다중 시간적 반복 분석이 요구된다. 나아가, qPCR은 다중모드 분석에 적합하지 않다. 예컨대, 다중 타겟을 검출할 때, 다른 것들로부터 하나의 타겟을 구별하기 위해 각 타겟의 분리 반응이 요구된다(Bustin, S. A., J Mol Endocrinol 2002, 29, 23-39). 또한, 형광 태그의 제한된 이용가능성 및 스펙트럼 겹침 때문에, qPCR은 한 분석당 최고 4개의 타겟만을 분리할 수 있다. 그러나, qPCR에서 성공적인 4중 분석을 위해 매 분석에 형광 태그의 주의 깊은 조합이 필수적이고(Bustin, S. A., J Mol Endocrinol 2002, 29,23-39), 이는 임상적인 진단툴로서 qPCR의 중대한 결점이다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고, 높은 민감도와 신속한 분석결과를 제공할 수 있는 염색체 수적이상 검출방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 대조 염기서열과 표적 염기서열을 모두 증폭시킨 다음, 대조 염기서열의 증폭산물을 소거 프로브를 이용하여 제거할 경우, 높은 민감도와 빠른 속도로 분석결과를 얻을 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 염색체 수적이상을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 염색체 수적이상 검출용 PCR 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 정상시료 및 대상시료에서 DNA를 각각 수득하는 단계; b) 염색체 수 이상과 관련이 없는 염색체 상에 위치한 대조 염기서열과 염색체 수 이상과 관련된 염색체 상에 위치한 표적 염기서열을 동일한 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계; c) 상기 대조 염기서열 또는 표적 염기서열과 1 또는 2개의 염기 서열이 상이한 분석 프로브; 및 분석 프로브의 표적 염기서열 또는 대조 염기서열 혼성화 서열의 일부 또는 전부를 포함하고, 분석 프로브보다 상기 b) 단계의 증폭산물과 결합력이 높은 소거 프로브를 이용하여 상기 증폭산물과 혼성화시키는 단계; 및 d) 상기 c) 단계에서 혼성화된 정상시료와 대상시료 반응물의 융해곡선을 분석하여, 염색체 수적 이상을 판별하는 단계;를 포함하는 염색체 수적이상 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, i) 염색체 수 이상과 관련이 없는 염색체 상에 위치한 대조 염기서열과 염색체 수 이상과 관련된 염색체 상에 위치한 표적 염기서열을 동일한 프라이머; ii) 상기 대조 염기서열 또는 표적 염기서열과 1 또는 2개의 염기 서열이 상이한 분석 프로브; 및 iii) 분석 프로브의 표적 염기서열 또는 대조 염기서열 혼성화 서열의 일부 또는 전부를 포함하고, 분석 프로브보다 결합력이 높은 소거 프로브;를 포함하는 염색체 수적이상 검출용 PCR 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 염색체 수적이상 검출 방법은 일정 비율의 표적 염기서열과 대조 염기서열의 동량을 소거 프로브를 이용하여 분석에서 제한함으로써 표적 염기서열과 대조 염기서열의 비율을 높은 해상도로 분석할 수 있고, 이를 사용하면 낮은 비율로 존재하는 염색체(예를 들어 산모 혈액 내의 태아 염색체, 암 환자 내의 순환종양 DNA)의 수적이상을 높은 민감도와 빠른 속도로 검출할 수 있어 유용하다.
도 1은 본 발명에 따른 소거 프로브 사용을 통해 정상과 염색체이상이 동일한 비율로 소거됨을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 소거 프로브 사용을 통해 소거비율에 따른 분석적 해상도 변화를 나타낸 모식도이다
도 3은 본 발명에 따른 표적 염기서열의 선별과 표적 염기서열의 증폭 반응을 위한 프라이머 선별조건을 나타내는 도식이다.
도 4는 본 발명에 따라 염색체 비율 이상의 여부를 판별하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 조건을 나타내는 도식이다.
도 5는 본 발명에 따른 검출 프로브와 소거 프로브를 나타낸 모식도로서, (A)는 표적 염기서열 및 대조 염기서열에 모두 결합하는 비형광 소거 프로브를 나타낸 것이고, (B)는 대조 염기서열에만 결합하는 비형광 소거 프로브를 나타낸 것이며, (C)는 대조 염기서열에만 결합하는 형광 소거 프로브를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 다운증후군 세포주를 사용하여 분석한 결과로서, (A)와 (B)는 서로 다른 대조 염기서열과 표적 염기서열을 바탕으로 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 에드워드증후군 세포주를 사용하여 분석한 결과로서, (A)와 (B)는 서로 다른 대조 염기서열과 표적 염기서열을 바탕으로 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 파타우증후군 세포주를 사용하여 분석한 결과로서, (A)와 (B)는 서로 다른 대조 염기서열과 표적 염기서열을 바탕으로 분석한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 다운증후군 세포주를 사용한 DNA 비율별 민감도 결과예시로서 (A)와 (B)는 서로 다른 대조 염기서열과 표적 염기서열을 바탕으로 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 대조 염기서열만을 소거하는 비형광 프로브 사용을 통한 분석적 해상도 상승을 나타낸 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 표적 염기서열과 대조 염기서열을 동시에 소거하는 비형광 프로브 사용을 통한 분석적 해상도 상승을 나타낸 결과이다.
도 12는 본 발명에 따른 대조 염기서열을 표적한 형광 소거 프로브를 이용한 결과값 보정을 나타낸 모식도이다.
도 13은 본 발명에 따른 결과값 보정에 대한 결과 예시이다.
도 14는 표준물질과 임상샘플을 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 정상시료와 대상시료에서 수득한 DNA에서 염색체 수적 이상이 있을 것으로 예상되는 염색체에 위치한 표적 염기서열과 상동성이 90% 이상이면서 염색체 수적 이상이 없는 염색체에 위치한 대조 염기서열을 동일한 프라이머를 이용하여 증폭한 다음, 증폭 산물을 소거 프로브로 일정량 제거한 다음, 분석 프로브를 이용하여 증폭 산물의 융해곡선을 분석할 경우, 높은 민감도로 염색체 수적이상을 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는, 21번 염색체의 특정위치를 증폭하면서 1번, 4번, 7번 염색체의 특정위치를 동시에 증폭할 수 있는 프라이머, 18번 염색체의 특정위치를 동시에 증폭하면서 1번, 4번, 9번, 15번 염색체의 특정위치를 동시에 증폭할 수 있는 프라이머; 또는 13번 염색체의 특정 위치를 증폭하면서 3번, 6번, 12번 염색체의 특정위치를 동시에 증폭할 수 있는 프라이머를 제조하여 증폭산물을 생산한 다음, 증폭산물과 혼성화 할 수 있는 소거 프로브를 이용하여 증폭산물의 일정비율을 분석 프로브와 결합하지 못하도록 한 다음, 분석 프로브를 이용하여 융해 곡선을 분석하여, 정상시료와 대상시료의 완전혼성화(perfect match)와 불완전 혼성화(mismatch) 온도에서의 값에 대한 비율을 계산할 경우, 높은 민감도로 염색체 수적이상을 분석할 수 있다는 것을 확인하였다(도 1 내지 도 2).
따라서, 본 발명은 일관점에서,
a) 정상시료 및 대상시료에서 DNA를 각각 수득하는 단계;
b) 염색체 수 이상과 관련이 없는 염색체 상에 위치한 대조 염기서열과 염색체 수 이상과 관련된 염색체 상에 위치한 표적 염기서열을 동일한 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계;
c) 상기 대조 염기서열 또는 표적 염기서열과 1 또는 2개의 염기 서열이 상이한 분석 프로브; 및 분석 프로브의 표적 염기서열 또는 대조 염기서열 혼성화 서열의 일부 또는 전부를 포함하고, 분석 프로브보다 상기 b) 단계의 증폭산물과 결합력이 높은 소거 프로브를 이용하여 상기 증폭산물과 혼성화시키는 단계;
d) 상기 c) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 염색체 수적 이상을 판별하는 단계;
를 포함하는 염색체 수적이상 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 “표적 염기서열”는 검출하고자 하는 모든 종류의 핵산을 의미하며, 서로 다른 종(species), 아종(subspecies), 또는 변종(variant) 유래의 염색체 염기서열 또는 동일 종 내 염색체 돌연변이를 포함한다. 이는 genomic DNA와 mitochondrial DNA, viral DNA를 포함하는 모든 종류의 DNA 또는 mRNA, ribosomal RNA, non-coding RNA, tRNA, viral RNA 등을 포함하는 모든 종류의 RNA를 특징으로 할 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
본 발명에서 표적 염기서열은 이에 한정되는 것은 아니나, 염기서열의 변이를 포함하는 돌연변이 염기서열인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 돌연변이는 단일 염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP), 삽입(insertion), 결실(deletion), 점 돌연변이(point mutation), 융합 돌연변이(fusion mutation), 전좌(translocation), 역위(inversion) 및 LOH(loss of heterozygosity)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "뉴클레오시드"는 핵산 염기(핵염기)가 당 모이어티에 연결된 글리코실아민 화합물을 의미한다. "뉴클레오티드"는 뉴클레오시드 포스페이트를 의미한다. 뉴클레오티드는 표 1에 기재된 것과 같이, 그의 뉴클레오시드에 상응하는 알파벳 문자(문자 명칭)를 사용하여 표시될 수 있다. 예컨대, A는 아데노신(아데닌 핵염기를 함유하는 뉴클레오시드)을 지칭하고, C는 시티딘을 지칭하고, G는 구아노신을 지칭하고, U는 우리딘을 지칭하고, T는 티미딘(5-메틸 우리딘)을 지칭한다. W는 A 또는 T/U를 지칭하고, S는 G 또는 C를 지칭한다. N은 랜덤한 뉴클레오시드를 표시하고, dNTP는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 의미한다. N은 A, C, G, 또는 T/U 중 어떤 것도 될 수 있다.
Figure pat00001
본 발명에서 용어 "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 올리고머를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "핵산"은 뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "서열"은 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 명세서를 통틀어, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산이 문자의 서열에 의해 표시될 때마다, 뉴클레오티드는 좌에서 우로 5'→순서이다. 올리고뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA, RNA, 또는 그의 유사체(예컨대, 포스포로티오에이트 유사체)일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 또는 핵산은 개질된 염기 및/또는 골격(예컨대, 개질된 포스페이트 연결부 또는 개질된 당 모이어티)도 또한 포함할 수 있다. 핵산에 안정성 및/또는 다른 이점을 부여하는 합성 골격의 비-제한적 예시는 포스포로티오에이트 연결부, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 자일로스핵산, 또는 그의 유사체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 “핵산”은 뉴클레오티드 폴리머를 지칭하며, 달리 한정되지 않는다면 자연적으로 발생한 뉴클레오티드와 유사한 방식(예컨대, 혼성화)으로 작용할 수 있는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체(analog)를 포함한다.
용어 핵산은, 예를 들어 유전체 DNA; 상보 DNA(cDNA)(이는 보통 전령 RNA(mRNA)의 역전사 또는 증폭으로 얻어지는 mRNA의 DNA 표현임); 합성으로 또는 증폭으로 생성된 DNA 분자; 및 mRNA를 포함한 임의의 형태의 DNA 또는RNA를 포함한다.
용어 핵산은 단일 가닥 분자뿐만 아니라 이중 또는 삼중 가닥 핵산을 포함한다. 이중 또는 삼중 가닥 핵산에서, 핵산 가닥은 동연(coextensive)일 필요는 없다(즉, 이중 가닥 핵산은 양 가닥의 전체 길이를 따라 이중 가닥일 필요는 없다).
용어 핵산은 또한 메틸화 및/또는 캡핑과 같은 것에 의한 이의 임의의 화학적 개질을 포함한다. 핵산 개질은 개별적인 핵산 염기 또는 핵산 전체에 추가적인 전하, 분극률, 수소 결합, 정전기 상호작용, 및 기능성을 포함하는 화학기의 첨가를 포함할 수 있다. 이러한 개질은 2' 위치 당 개질, 5 위치 피리미딘 개질, 8 위치 퓨린개질, 시토신 환외(exocyclic) 아민에서의 개질, 5-브로모-우라실의 치환, 주쇄 개질, 이소염기 이소시티딘 및 이소구아니딘과 같은 특이 염기 쌍 조합 등과 같은 염기 개질을 포함할 수 있다.
핵산(들)은 고상 매개 화학적 합성(solid phase-mediated chemical synthesis)과 같은 완전한 화학적 합성 과정으로부터, 핵산을 생성하는 임의의 종으로부터 분리를 통해서와 같은 생물학적 공급원으로부터, 또는 DNA 복제, PCR 증폭, 역전사와 같은 분자 생물학 도구에 의한 핵산의 취급과 관련된 과정으로부터, 또는 이들 과정의 결합으로부터 유도될 수 있다.
본 발명에서 용어 “상보”는 2개의 뉴클레오티드 사이의 정확한 쌍형성에 대한 능력을 지칭한다. 즉, 핵산의 주어진 위치에서 뉴클레오티드가 다른 핵산의 뉴클레오티드와 수소 결합을 할 수 있다면, 2개의 핵산은 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 여겨진다. 뉴클레오티드의 일부만이 결합하여 2개의 단일 가닥 핵산 분자 사이의 상보성은 “부분적”일 수 있거나, 또는 전체 상보성이 단일 가닥 분자 사이에 존재할 때 상보성은 완전할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 핵산 합성 반응을 프라이밍하기 위한 표적 핵산 서열(예컨대, 증폭될 DNA 주형)에 혼성화되는 짧은 선형 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머는 RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드, 또는 키메라 서열일 수 있다. 프라이머는 천연, 합성, 또는 개질된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 프라이머 길이의 상한 및 하한 둘 모두는 실험적으로 결정된다. 프라이머 길이의 하한은 핵산 증폭 반응 조건에서 표적 핵산과의 혼성화 후 안정한 듀플렉스를 형성하는데 필요한 최소 길이이다. 매우 짧은 프라이머(흔히 3 개 뉴클레오티드 미만 길이)는 이러한 혼성화 조건 하에서 표적 핵산과의 열열학적으로 안정한 듀플렉스를 형성하지 않는다. 상한은 표적 핵산에서 미리 결정된 핵산 서열 이외의 영역에서 듀플렉스 형성을 가질 수 있는 가능성에 의해 보통 결정된다. 일반적으로, 적합한 프라이머 길이는 약 3 개 뉴클레오티드 길이 내지 약 40 개 뉴클레오티드 길이의 범위에 있다.
본 발명에서 용어 “프로브”는 하나 이상 유형의 화학 결합을 통하여, 일반적으로 상보적 염기 쌍형성을 통하여, 보통 수소 결합 형성을 통하여 상보적인 서열의 표적 핵산에 결합하고 따라서 이중나선(duplex) 구조를 형성할 수 있는 핵산이다. 프로브는 “프로브 결합 부위”에 결합 또는 혼성화한다. 특히, 일단 프로브가 프로브의 상보적인 표적에 혼성화하면 프로브의 검출을 용이하게 하도록 프로브는 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 그러나 대안적으로, 프로브는 표지화되지 않을 수 있지만, 표지화된 리간드와의 특이적 결합에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 프로브는 크기가 상당히 다양할 수 있다. 일반적으로 프로브는 길이가 적어도 7 내지 15개 뉴클레오티드이다. 다른 프로브는 길이가 적어도 20, 30 또는 40개 뉴클레오티드이다. 또 다른 프로브는 다소 더 길며, 길이가 적어도 50, 60, 70, 80, 또는 90개 뉴클레오티드이다. 또 다른 프로브는 더욱 더 길며, 길이가 적어도 100, 150, 200개 또는 그 이상의 뉴클레오티드이다. 프로브는 또한 상기 값(예컨대, 길이가 15~20개 뉴클레오티드)의 임의의 값으로 한정된 임의의 범위 내에 있는 임의의 길이의 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 “혼성화”는 상보적 염기서열을 가진 단일가닥 핵산들 간 수소결합에 의해 이중가닥 핵산이 형성되는 것을 의미하며, 어닐링(annealing)과 유사한 의미로 사용된다. 다만 조금 더 넓은 의미에서, 혼성화는 두 개의 단일가닥 간 염기서열이 완전히 상보적인 경우(perfect match)와 더불어 예외적으로 일부의 염기서열이 상보적이지 않은 경우(mismatch)까지 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 비대칭 PCR(asymmetric PCR)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계의 대조 염기서열의 프라이머 또는 프로브 혼성화 영역의 상동성은 표적 염기서열의 프라이머 또는 프로브 혼성화 영역과 동일한 프로브 또는 프라이머가 상보적 결합을 할 수 있을 정도의 상동성을 가지면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 대조 염기서열은 도 3에 개시된 조건으로 선별하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 c) 단계의 분석 프로브는 대조 염기서열 또는 표적 염기서열과 완전 혼성화(perfect match) 또는 불완전 혼성화(mismatch)를 이룰 경우, 융해 온도 차이가 분석 그래프 상 구별할 수 있을 정도로 발생하면 제한 없이 이용가능하나, 바람직하게는 5℃ 이상 20℃ 이하, 더욱 바람직하게는 7℃ 이상 20℃ 이하, 가장 바람직하게는 8℃이상 20℃ 이하인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, c) 단계의 분석 프로브는 PNA(Peptide Nucleic Acid)이고, 양 말단에 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 PNA(Peptide Nucleic Acid)는 LNA(Locked nucleic acid), MNA(Mopholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로, 인공적으로 합성하며 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성 (selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. 또한 DNA-DNA 결합력 보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 핵산 불일치(nucleotide mismatch)에도 10~15℃ 가량 융해온도(Tm) 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(single nucleotide polymorphism) 및 InDel(insertion/deletion) 핵산 변화를 검출할 수 있게 된다.
PNA 프로브의 핵산과 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 응용기술의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 수화(hydrolysis) 반응과는 다른 혼성화(hybridization) 반응을 이용하여 분석하며, 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 표지 프로브(molecular beacon probe), 스콜피온 프로브(scorpion probe)가 있다.
본 발명에 있어서 상기 PNA 프로브는 제한되지는 않으나 리포터 또는 소광자가 결합되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적핵산과 혼성화 된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적핵산의 유무를 검출할 수 있다.
본 발명의 프로브는 양 말단에 리포터와 리포터 형광을 소광할 수 있는 소광자의 형광 물질이 결합할 수 있으며, 인터컬레이팅(intercalating) 형광 물질을 포함할 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX, Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3, Alexa680 로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 또는 Dabcyl을 사용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 인터컬레이팅 형광 물질은 아크리딘 호모다이머(Acridine homodimer) 및 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 및 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 및 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 및 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 및 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 및 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 및 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 및 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 및 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 및 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 및 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 및 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 및 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 및 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 및 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI)와 이의 유도체 및 사이다이스(Cy-dyes) 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 c) 단계의 소거 프로브는 표적 염기서열 또는 대조 염기서열 증폭산물을 소거하는 프로브; 표적 염기서열 및 대조 염기서열 증폭산물을 모두 소거하는 프로브; 및 대조 염기서열 증폭산물을 소거하는 프로브로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 c) 단계의 소거 프로브는 분석 프로브와 경쟁적으로 대조 염기서열 또는 표적 염기서열의 증폭산물과 혼성화 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 소거 프로브는 올리고뉴클레오티드, LNA, PNA 및 이들의 혼합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 c) 단계의 소거 프로브는 상기 b) 단계의 증폭산물을 50~90% 양으로 소거하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 소거 프로브는 분석 프로브보다 높은 Tm값을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 d) 단계의 융해곡선 분석은
a) 정상시료 유전자 증폭 산물의 불완전 혼성화 값/완전 혼성화 값 비율을 계산하는 단계;
b) 대상시료 유전자 증폭 산물의 불완전 혼성화 값/완전 혼성화 값 비율을 계산하는 단계;
c) a)에서 계산한 비율과 b)에서 계산한 비율이 같을 경우, 정상으로 결정하고, 다를 경우 염색체 수 이상으로 결정하는 단계를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은
d) 상기 a) 단계와 b) 단계의 비율 계산 시, 소거 프로브에 의한 완전 혼성화 값을 하기의 식으로 보정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
수식 1:
Figure pat00002
/
Figure pat00003
혼성화 반응의 분석 방법으로는 형광융해곡선분석(Fluorescence Melting Curve Analysis, FMCA)를 이용하며, 형광융해곡선분석은 PCR 반응 종료 후 생성된 산물과 투입한 프로브 간의 결합력 차이를 융해온도로 구분하여 분석한다. 다른 SNP 검출 프로브와는 다르게 프로브 디자인이 매우 간편하여 SNP를 포함하는 11~18 mer의 염기서열을 이용하여 제작한다. 따라서 원하는 융해온도를 갖는 프로브를 설계하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm값을 조절할 수 있으며, 같은 길이의 PNA 프로브라도 프로브에 변화를 주어 Tm 값을 조절할 수 있다. PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM method는 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 작아 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되고 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어렵게 되는 반면, PNA 프로브는 프로브 서열 이외의 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 빠르고 정확한 분석이 가능하다.
본 발명은 또한, 2 종 이상의 프라이머, 2 종 이상의 분석 프로브 및 2 종 이상의 소거 프로브를 사용하고, 분석 프로브의 리포터가 상이한 것을 특징으로 하는 다중 염색체 수적이상 검출방법에 관한 것이다.
당업자에게 있어서, 본 발명의 염색체 수적이상 검출방법은 태아 염색체 이상 검사뿐만 아니라, 암과 관련된 염색체 이상에도 적용될 수 있다는 것은 자명하다.
본 발명은 다른 관점에서, i) 염색체 수 이상과 관련이 없는 염색체 상에 위치한 대조 염기서열과 염색체 수 이상과 관련된 염색체 상에 위치한 표적 염기서열을 동일한 프라이머;
ii) 상기 대조 염기서열 또는 표적 염기서열과 1 또는 2개의 염기 서열이 상이한 분석 프로브; 및
iii) 분석 프로브의 표적 염기서열 또는 대조 염기서열 혼성화 서열의 일부 또는 전부를 포함하고, 분석 프로브보다 결합력이 높은 소거 프로브;
를 포함하는 염색체 수적이상 검출용 PCR 조성물에 관한 것이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 염색체이상증후군 검출을 위한 프라이머의 제작
염색체이상증후군(다운증후군(21번 염색체), 에드워드증후군(18번 염색체), 파타우증후군(13번 염색체))의 표적 염기서열과 내부 대조염기서열에 대한 실시간 중합효소연쇄반응을 위해 다운증후군(서열번호 1-10), 에드워드증후군(서열번호 11-20), 파타우증후군(서열번호 21-30)에 대한 프라이머를 제작하였다(표 2).
서열번호 Name Sequence(5'-3') Position (bp)* Target
1 DS_F1 AGAGGTCATAGAAGGTTATGAAATAGC Chr21:29,066,953-29,067,073
Chr1:147,204,433-147,204,555		 Down
Syndrome
2 DS_R1 GAGGTACGAAGTAGAGATGAGACTTC
3 DS_F2 CAGCAAGGTTGAAATTGGGAATG Chr21:17,517,415-17,517,544
Chr1:52,087,749-52,087,880
4 DS_R2 GAGTAGGAGAGTGGTTGAGGAAATCC
5 DS_F3 CAAACTGGAATAGCTAGCATGTGCTTGC Chr21:17,517,519-17,517,644
Chr4:52,087,649-52,087,774
6 DS_R3 GGACATTCCCAATTTCAACCTTGCTG
7 DS_F4 GGGACATGATTTGTAAAGTTCAAGGC Chr21:25,769,018-25,769,131
Chr7:63,894,430-63,894,543
8 DS_R4 CACATTCTGTGACCAAACGGTTCAAC
9 DS_F5 CCACAGGGCTAAAGCAACCATCTCC Chr21:33,577,024-33,577,151
Chr1:157,711,009-157,711,136
10 DS_R5 CTCCCTTCTTATGACCCAAGTGGCT
11 ES_F1 CAGGGAAAATGACCTTCACTGCTG Chr18:51,126,794-51,126,903
Chr1:35,420,274-35,420,383		 Edward
Syndrome
12 ES_R1 CATCCCCTTTACCTTAGTTTACCCAC
13 ES_F2 GTGCTGGTGGCAGTGTTATTTCC Chr18:26,965,287-26,965,406
Chr4:22,614,174-22,614,293
14 ES_R2 AGTAATGTGTTGTCAGTTCACTGAGG
15 ES_F3 GGAGCTGCGACACGGAGAA Chr18:61,816,256-61,816,374
Chr9:5,418,772-5,418,890
16 ES_R3 CAAGCACACCTGCTGTTCA
17 ES_F4 CAGTGCGCGAAATGTAGTTTTG Chr18:3,580,328-3,580,443
Chr15:84,801,962-84,802,077
18 ES_R4 GTGTAGCACAAACCACAGAGGAGAC
19 ES_F5 CCTCCTCCCTGTCTTCTCTGATTC Chr18:3,581,283-3,581,403
Chr15:84,802,918-84,803,038
20 ES_R5 CAAACAGAGGTGTGCAGCAGAGG
21 PS_F1 CTGCCTTTTGAACCAGTTAGTCTGGAG Chr13:65,442,145-65,442,236
Chr3:12,157,715-12,157,806		 Patau
Syndrome
22 PS_R1 TCCCTTCTCTACTCTGACTCCTACC
23 PS_F2 CCTCAACAGGAGAGCAGAAGGCTC Chr13:21,351,718-21,351,840
Chr6:5,824,619-5,824,740
24 PS_R2 GTGTGCTTCAAGGCTCAGTTAGTG
25 PS_F3 CCCCATGCTGCCCAGTCCTG Chr13:21,345,064-21,345,164
Chr6:5,831,357-5,831,457
26 PS_R3 CTAGGTTCTCTACGGCCTCTTGTTACT
27 PS_F4 GCGTTCTTGTTCTCTAGCTTCCTG Chr13:19,647,040-19,647,128
Chr12:7,438,941-7,439,029
28 PS_R4 GATACCGATGTCAGAGGCAGGAGG
29 PS_F5 GTTTTGTTTCTCTTCTCTGCTGTCGG Chr13:19,646,853-19,646,949
Chr12:7,439,120-7,439,216
30 PS_R5 CCAGGTGGAATCTGAATCAAGTGTAC
실시예 2: 형광 PNA 프로브의 제작
염색체이상증후군의 표적 염기서열 검출을 위해 융해온도 분석 기능을 동시에 가지는 양기능성 형광 PNA 프로브(분석 프로브)를 제작하였다. 프로브는 표적 염기서열과 90% 이상의 상동성을 가지는 대조 염기서열에서 1 내지 2개가 다른 서열 부위를 표적하는 부위를 표적 염기서열과 일치 또는 대조 염기서열과 일치하도록 프로브로 제작하였다. 표적 염기서열을 포함하는 분석 프로브는 형광(Texas Red)과 소광자를 결합하였다(표 3).
서열번호 Name Sequence(5'-3') Fluor Target
31 DS_P1 Dabcyl-ATTTGGTATGTTGTTCTG-O-K TxR Down1
32 DS_P2 Dabcyl-TCATCCCCCAACACAA-O-K TxR Down2
33 DS_P3 Dabcyl-GTTCTTAATAGCAGGTAC-O-K TxR Down3
34 DS_P4 Dabcyl-GACTCTTATTGGATACAG-O-K TxR Down4
35 DS_P5 Dabcyl-GGTATGTTGTGTGATG-O-K TxR Down5
36 DS_P6 Dabcyl-GGTATGGTTCCCTTAGA-O-K TxR Down6
37 DS_P7 Dabcyl-CCCAGTCGTCAGCAA-O-K TxR Down7
38 DS_P8 Dabcyl-CTCACCAAACTCCCAG-O-K TxR Down8
39 DS_P9 Dabcyl-GAACCCCGCTAAGG-O-K TxR Down9
40 DS_P10 Dabcyl-GGGCTTGTTCAGCT-O-K TxR Down10
41 ES_P1 Dabcyl-TTCTGGGTCAAGCCT-O-K TxR Edward1
42 ES_P2 Dabcyl-AGCTCCATAGCAGTG-O-K TxR Edward2
43 ES_P3 Dabcyl-TGGTCCTCATCTGCTG-O-K TxR Edward3
44 ES_P4 Dabcyl-GCTCGAATTTCAGAG-O-K TxR Edward4
45 ES_P5 Dabcyl-CACTGGCTTATCATGTCT-O-K TxR Edward5
46 ES_P6 Dabcyl-ATTATTCCGAACTCTAGC-O-K TxR Edward6
47 ES_P7 Dabcyl-CAGACCTAAGTTCAAG-O-K TxR Edward7
48 ES_P8 Dabcyl-GATGATTCTGAGCACA-O-K TxR Edward8
49 ES_P9 Dabcyl-CCCCAGGCTGCTTAT-O-K TxR Edward9
50 ES_P10 Dabcyl-TGA　CTC　TAA　AGC　AGA-O-K TxR Edward10
51 PS_P1 Dabcyl-CTCTAGTTCGCCATAGCC-O-K TxR Patau1
52 PS_P2 Dabcyl-CCACCATTAGTGCCTCT-O-K TxR Patau2
53 PS_P3 Dabcyl-CCTCAAGCCACACAA-O-K TxR Patau3
54 PS_P4 Dabcyl-TGTCCTCAGCCTTTCTCG-O-K TxR Patau4
55 PS_P5 Dabcyl-CCCTTCACTGTCATCCT-O-K TxR Patau5
56 PS_P6 Dabcyl-CCAGCAGCCTCCACA-O-K TxR Patau6
57 PS_P7 Dabcyl-GCTGTGTCAGTCCTG-O-K TxR Patau7
58 PS_P8 Dabcyl-CAGTTGACATTAGTAAAT-O-K TxR Patau8
59 PS_P9 Dabcyl-CTCCCGAGCTGACTCC-O-K TxR Patau9
60 PS_P10 Dabcyl-AAATCCGCCCTGAC-O-K TxR Patau10
* 표 3에서 O-는 링커 및 K는 라이신(lysine)을 의미한다.
실시예 3: 소거 프로브 제작
염색체이상증후군의 검출에 사용되는 표적 프로브의 분석 해상도를 높이기 위해 표적 염기서열과 90% 이상의 상동성을 가지는 대조 염기서열에서 1 내지 2개가 다른 서열 부위를 표적 하여 표적 염기서열과 대조 염기서열 모두를 소거하는 프로브는 서열번호 61-66과 같이, 표적 염기서열을 소거하는 프로브(무형광)는 서열번호 67-71과 같이, 형광과 소광자가 결합된 표적 염기서열 소거 프로브는 서열번호 72-86과 같이 제작하였다(표 4).
서열번호 Name Sequence (5'-3') Fluor Target
61 E-Probe 1 GATACAGTGCAGC non Down
62 E-Probe 2 GATACAGTGCAGCG non Down
63 E-Probe 3 GGATACAGTGCAGCG non Down
64 E-Probe 4 GTGTGATGATCAGC non Down
65 E-Probe 5 GTGTGATGATCAGCA non Down
66 E-Probe 6 GTGTGATGATCAGCAC non Down
67 E-Probe 7 ATTTGGTATGTTGTTCTG non Down
68 E-Probe 8 TCATCCCCCAACACAA non Down
69 E-Probe 9 GTTCTTAATAGCAGGTAC non Down
70 E-Probe 10 GACTCTTATTGGATACAG non Down
71 E-Probe 11 GGTATGAGGTGTGA non Down
72 E-Probe 12 Dabcyl-ATTTGGTACGTTGTTCTG-O-K FAM Down
73 E-Probe 13 Dabcyl-TCATCTCCCAGCACAA-O-K FAM Down
74 E-Probe 14 Dabcyl-GTTCTTAACAGCAGGTAC-O-K FAM Down
75 E-Probe 15 Dabcyl-GACTCTTACTGGATACAG-O-K FAM Down
76 E-Probe 16 Dabcyl-GGTATGAGGTGTGA-O-K FAM Down
77 E-Probe 17 Dabcyl-TTCTGGATCAAGCCT-O-K FAM Edward
78 E-Probe 18 Dabcyl-AGCTCCGTAGCAGT-O-K FAM Edward
79 E-Probe 19 Dabcyl-GGTCCTCGTCTGCTG-O-K FAM Edward
80 E-Probe 20 Dabcyl-GCTCGAGTTTCAGAG-O-K FAM Edward
81 E-Probe 21 Dabcyl-CACTGGCTCATCATGTCT-O-K FAM Edward
82 E-Probe 22 Dabcyl-CTCTAGTTCTCCATAGCC-O-K FAM Patau
83 E-Probe 23 Dabcyl-CCACCATCAGTGCCTCT-O-K FAM Patau
84 E-Probe 24 Dabcyl-CCTCAAACCACACAA-O-K FAM Patau
85 E-Probe 25 Dabcyl-TGTCCTCAACCTTTCTCG-O-K FAM Patau
86 E-Probe 26 Dabcyl-CCCTTCATTGTCATCCT-O-K FAM Patau
* 표 4에서 O-는 링커 및 K는 라이신(lysine)을 의미한다
실시예 4: 표준세포주를 사용한 PNA 프로브의 검증
삼염색체(Trisomy) 표준세포주(표 5)를 대상으로 실시예 1에서 제작된 프라이머와 실시예 2에서 제작된 PNA 프로브를 혼합한 후 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 PCR을 수행하였다.
실시간 중합효소연쇄반응 실험 조건은 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR (asymmetric PCR)을 이용하였다. 비대칭 PCR의 조건은 다음과 같다; 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 FMCA™ 버퍼 (SeaSunBio Real-Time FMCA™ buffer, 시선바이오, 한국), 2.5mM MgCl2, 200μM dNTPs, 1.0U Taq polymerase, 0.05μM 순방향 프라이머 (forward primer, 표 2) 및 0.5μM 역방향 프라이머 (reverse primer, 표 2)(asymmetric PCR)에 1㎕ 표준세포주 DNA (표 5)를 첨가한 다음 리얼타임 PCR을 실시한 후, 0.5㎕ 형광 PNA 프로브(표 3)를 첨가하여 융해곡선 분석을 수행하였으며 분석 조건은 도 4와 같다.
# 세포주 　
1 NA01137 Trisomy 21
2 NA01920 Trisomy 21
3 NA01921 Trisomy 21
4 NA02067 Trisomy 21
5 NA00143 Trisomy 18
6 NA02422 Trisomy 18
7 NA02732 Trisomy 18
8 NA03623 Trisomy 18
9 NA00526 Trisomy 13
10 NA03330 Trisomy 13
11 NA02948 Trisomy 13
12 NG12070 Trisomy 13
그 결과 도 6, 7, 8에 개시된 바와 같이, 삼염색체와 정배수체 세포주에서 분석값 (불완전혼성화값/완전혼성화값) 차이가 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 5: PNA 프로브 기반 다운증후군 검출의 민감도 비교 분석
삼염색체(Trisomy 21, 다운증후군) 표준 세포주 (표 5)에서 추출한 DNA를 5, 10, 20, 30, 100%의 비율로 정배수체(Euploid) 정상 gDNA에 혼합하여 민감도를 분석하였으며, 실시예 1과 2에서 제작된 프라이머와 PNA 프로브를 혼합한 후 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 PCR을 수행하였다.
실시간 중합효소연쇄반응 실험 조건은 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR (asymmetric PCR)을 이용하였다. 비대칭 PCR의 조건은 다음과 같다; 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 FMCA™ 버퍼 (SeaSunBio Real-Time FMCA™ buffer, 시선바이오, 한국), 2.5mM MgCl2, 200μM dNTPs, 1.0U Taq polymerase, 0.05μM 순방향 프라이머 (forward primer, 표 2) 및 0.5μM 역방향 프라이머 (reverse primer, 표 2)(asymmetric PCR)에 1㎕ 표준세포주 DNA (표 5)를 첨가한 다음 리얼타임 PCR을 실시한 후, 0.5㎕ 형광 PNA 프로브 (표 3)를 첨가하여 융해곡선 분석을 수행하였으며 분석 조건은 도 4와 같다.
그 결과 5%의 DNA 혼합액에서도 삼염색체(Trisomy 21, 다운증후군)의 분석이 가능한 것을 확인하였다(도 9).
실시예 6: 소거 프로브의 분석 해상도 상승 효과 검증
실시예 4와 5의 염색체이상증후군 검출의 분석적 해상도를 높이기 위해 실시예 1, 2, 3에서 제작된 프라이머, PNA 형광 프로브, 비형광 소거 프로브를 사용하여 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 PCR을 수행하였다.
실시간 중합효소연쇄반응 실험 조건은 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR(asymmetric PCR)을 이용하였다. 비대칭 PCR의 조건은 다음과 같다; 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 FMCA™ 버퍼(SeaSunBio Real-Time FMCA™ buffer, 시선바이오, 한국), 2.5mM MgCl2, 200μM dNTPs, 1.0U Taq polymerase, 0.05μM 순방향 프라이머(forward primer, 표 2) 및 0.5μM 역방향 프라이머(reverse primer, 표 2)(asymmetric PCR)에 1㎕ 표준세포주 DNA (표 5)를 첨가한 다음 리얼타임 PCR을 실시한 후, 0.5㎕ 형광 PNA 프로브 (표 3), 비형광 소거 프로브 (표 4, 서열번호 1-11)을 첨가하여 융해곡선 분석을 수행하였으며 분석 조건은 도 4와 같다.
분석 프로브를 단독으로 사용한 경우와 분석 프로브와 소거 프로브를 동시 사용한 경우를 같이 비교하였다. 대조 염기서열만을 소거하는 비형광 프로브를 사용한 경우 (정상과 비정상 차이가 1.8배) 기존 분석 프로브만 사용하였던 경우보다 높은 해상도가 나타나는 것을 확인하였다(정상과 비정상 차이가 1.3배, 도 10).
또한 표적 염기서열과 대조 염기서열을 소거하는 비형광 프로브를 사용한 경우에서도 정상과 비정상의 차이가 1.8배로, 기존 분석방법보다(정상과 비정상 차이가 1.4배) 높은 해상도가 나타나는 것을 확인하였다(도 11).
실시예 7: 결과값 보정을 통한 분석 해상도 상승 효과 검증
실시예 4와 5의 염색체이상증후군 검출을 위한 분석적 해상도를 높이기 위해 실시예 1, 2, 3에서 제작된 프라이머, PNA 형광 분석 프로브, 소거 프로브를 혼합한 후 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 PCR을 수행하였다.
실시간 중합효소연쇄반응 실험 조건은 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR(asymmetric PCR)을 이용하였다. 비대칭 PCR의 조건은 다음과 같다; 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 FMCA™ 버퍼(SeaSunBio Real-Time FMCA™ buffer, 시선바이오, 한국), 2.5mM MgCl2, 200μM dNTPs, 1.0U Taq polymerase, 0.05μM 순방향 프라이머(forward primer, 표 2) 및 0.5μM 역방향 프라이머(reverse primer, 표 2)(asymmetric PCR)에 1㎕ 표준세포주 DNA (표 5)를 첨가한 다음 리얼타임 PCR을 실시한 후, 0.5㎕ 형광 PNA 표적 프로브 (표 3), 형광 PNA 소거 프로브 (표 4, 서열번호 12-26)를 첨가하여 융해곡선 분석을 수행하였으며 분석 조건은 도 4와 같다.
결과값 보정은 대조 염기서열을 표적으로 한 형광 소거 프로브를 이용하여 진행하였고(도 12), 결과값 보정 (불완전혼성화값/완전혼성화값) / (완전혼성화값/소거프로브에 의한 완전 혼성화값)을 통해 보정 전(불완전혼성화값/완전혼성화값)비교하여 분석 해상도(정상과 비정상의 차이)가 증가하는 것을 확인하였다 1.6배
Figure pat00004
2.3배, 도 13).
실시예 8: 임상샘플을 사용한 다운증후군 검출 검증
정상 산모의 혈액에서 추출된 cfDNA를 삼염색체 표준물질(Trisomy 21, 다운증후군)과 비교 분석하였다. 삼염색체(Trisomy 21, 다운증후군)의 표준물질로는 Seraseq™Trisomy 21 Aneuploidy Linearity Panel (4-8% Fetal Fraction)과 표준 세포주를 사용하였다. 그 결과 도 16에 나타난 바와 같이, 정상 산모의 cfDNA 결과 값과 삼염색체(Trisomy 21, 다운증후군) 표준물질 4% 와 8%에 서의 결과값이 모두 차이를 보여 염색체이상증후군 검출이 가능한 것을 확인하였다(도 14).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> SeasunBio Materials <120> Method for Detecting Chromosomal Numeric Abnormality based on Elimination Probe and Composition for Detecting Chromosomal Numeric Abnormality <130> P18-B136 <160> 86 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 agaggtcata gaaggttatg aaatagc 27 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 gaggtacgaa gtagagatga gacttc 26 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 cagcaaggtt gaaattggga atg 23 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 gagtaggaga gtggttgagg aaatcc 26 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 caaactggaa tagctagcat gtgcttgc 28 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 ggacattccc aatttcaacc ttgctg 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 7 gggacatgat ttgtaaagtt caaggc 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 8 cacattctgt gaccaaacgg ttcaac 26 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 9 ccacagggct aaagcaacca tctcc 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 10 ctcccttctt atgacccaag tggct 25 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 11 cagggaaaat gaccttcact gctg 24 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 12 catccccttt accttagttt acccac 26 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 13 gtgctggtgg cagtgttatt tcc 23 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 14 agtaatgtgt tgtcagttca ctgagg 26 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 15 ggagctgcga cacggagaa 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 16 caagcacacc tgctgttca 19 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 17 cagtgcgcga aatgtagttt tg 22 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 18 gtgtagcaca aaccacagag gagac 25 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 19 cctcctccct gtcttctctg attc 24 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 20 caaacagagg tgtgcagcag agg 23 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 21 ctgccttttg aaccagttag tctggag 27 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 22 tcccttctct actctgactc ctacc 25 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 23 cctcaacagg agagcagaag gctc 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 24 gtgtgcttca aggctcagtt agtg 24 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 25 ccccatgctg cccagtcctg 20 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 26 ctaggttctc tacggcctct tgttact 27 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 27 gcgttcttgt tctctagctt cctg 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 28 gataccgatg tcagaggcag gagg 24 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 29 gttttgtttc tcttctctgc tgtcgg 26 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 30 ccaggtggaa tctgaatcaa gtgtac 26 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 31 atttggtatg ttgttctg 18 <210> 32 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 32 tcatccccca acacaa 16 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 33 gttcttaata gcaggtac 18 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 34 gactcttatt ggatacag 18 <210> 35 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 35 ggtatgttgt gtgatg 16 <210> 36 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 36 ggtatggttc ccttaga 17 <210> 37 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 37 cccagtcgtc agcaa 15 <210> 38 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 38 ctcaccaaac tcccag 16 <210> 39 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 39 gaaccccgct aagg 14 <210> 40 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 40 gggcttgttc agct 14 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 41 ttctgggtca agcct 15 <210> 42 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 42 agctccatag cagtg 15 <210> 43 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 43 tggtcctcat ctgctg 16 <210> 44 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 44 gctcgaattt cagag 15 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 45 cactggctta tcatgtct 18 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 46 attattccga actctagc 18 <210> 47 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 47 cagacctaag ttcaag 16 <210> 48 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 48 gatgattctg agcaca 16 <210> 49 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 49 ccccaggctg cttat 15 <210> 50 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 50 tgactctaaa gcaga 15 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 51 ctctagttcg ccatagcc 18 <210> 52 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 52 ccaccattag tgcctct 17 <210> 53 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 53 cctcaagcca cacaa 15 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 54 tgtcctcagc ctttctcg 18 <210> 55 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 55 cccttcactg tcatcct 17 <210> 56 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 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<220> <223> Artificial Sequence <400> 65 gtgtgatgat cagca 15 <210> 66 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 66 gtgtgatgat cagcac 16 <210> 67 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 67 atttggtatg ttgttctg 18 <210> 68 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 68 tcatccccca acacaa 16 <210> 69 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 69 gttcttaata gcaggtac 18 <210> 70 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 70 gactcttatt ggatacag 18 <210> 71 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 71 ggtatgaggt gtga 14 <210> 72 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 72 atttggtacg ttgttctg 18 <210> 73 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 73 tcatctccca gcacaa 16 <210> 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Claims (14)

  1. a) 정상시료 및 대상시료에서 DNA를 각각 수득하는 단계;
    b) 염색체 수 이상과 관련이 없는 염색체 상에 위치한 대조 염기서열과 염색체 수 이상과 관련된 염색체 상에 위치한 표적 염기서열을 동일한 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계;
    c) 상기 대조 염기서열 또는 표적 염기서열과 1 또는 2개의 염기 서열이 상이한 분석 프로브; 및 분석 프로브의 표적 염기서열 또는 대조 염기서열 혼성화 서열의 일부 또는 전부를 포함하고, 분석 프로브보다 상기 b) 단계의 증폭산물과 결합력이 높은 소거 프로브를 이용하여 상기 증폭산물과 혼성화시키는 단계; 및
    d) 상기 c) 단계에서 혼성화된 정상시료와 대상시료 반응물의 융해곡선을 분석하여 염색체 수적 이상을 판별하는 단계;
    를 포함하는 염색체 수적이상 검출방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 대조 염기서열의 프라이머 또는 프로브 혼성화 영역의 상동성은 표적 염기서열의 프라이머 또는 프로브 혼성화 영역과 90% 이상인 것을 특징으로 하는 염색체 수적이상 검출방법
  3. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계의 분석 프로브는 대조 염기서열 또는 표적염기서열과 완전 혼성화(perfect match) 또는 불완전 혼성화(mismatch)를 이룰 경우, 융해 온도 차이가 8℃ 이상인 것을 특징으로 하는 염색체 수적이상 검출방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계의 분석 프로브는 PNA(Peptide Nucleic Acid)이고, 양 말단에 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 염색체 수적이상 검출방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro- 6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 염색체 수적이상 검출방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 소광자 (quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 염색체 수적이상 검출방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계의 소거 프로브는 표적 염기서열 또는 대조 염기서열 증폭산물을 소거하는 프로브; 표적 염기서열 및 대조 염기서열 증폭산물을 모두 소거하는 프로브; 및 대조 염기서열 증폭산물을 소거하는 프로브로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염색체 수적이상 검출방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 c) 단계의 소거 프로브는 분석 프로브와 경쟁적으로 대조 염기서열 또는 표적 염기서열의 증폭산물과 혼성화 하는 것을 특징으로 하는 염색체 수적이상 검출방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 소거 프로브는 올리고뉴클레오티드, LNA, PNA 및 이들의 혼합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염색체 수적이상 검출방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계의 소거 프로브는 상기 b) 단계의 증폭산물을 50~90% 양으로 소거하는 것을 특징으로 하는 염색체 수적이상 검출방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 d) 단계의 융해곡선 분석은 하기의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 염색체 수적이상 검출방법:
    a) 정상시료 유전자 증폭 산물의 불완전 혼성화 값/완전 혼성화 값 비율을 계산하는 단계;
    b) 대상시료 유전자 증폭 산물의 불완전 혼성화 값/완전 혼성화 값 비율을 계산하는 단계;
    c) a)에서 계산한 비율과 b)에서 계산한 비율이 같을 경우, 정상으로 결정하고, 다를 경우 염색체 수 이상으로 결정하는 단계.
  12. 제11항에 있어서,
    d) 상기 a) 단계와 b) 단계의 비율 계산 시, 소거 프로브에 의한 완전 혼성화 값을 하기의 식으로 보정하는 단계:
    수식 1:
    Figure pat00005
    /
    Figure pat00006
    .
  13. 제1항에 있어서, 2 종 이상의 프라이머, 2 종 이상의 분석 프로브 및 2 종 이상의 소거 프로브를 사용하고, 분석 프로브의 리포터가 상이한 것을 특징으로 하는 다중 염색체 수적이상 검출방법.
  14. i) 염색체 수 이상과 관련이 없는 염색체 상에 위치한 대조 염기서열과염색체 수 이상과 관련된 염색체 상에 위치한 표적 염기서열을 동일한 프라이머;
    ii) 상기 대조 염기서열 또는 표적 염기서열과 1 또는 2개의 염기 서열이 상이한 분석 프로브; 및
    iii) 분석 프로브의 표적 염기서열 또는 대조 염기서열 혼성화 서열의 일부 또는 전부를 포함하고, 분석 프로브보다 결합력이 높은 소거 프로브;
    를 포함하는 염색체 수적이상 검출용 PCR 조성물.
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