CN113272444A - 基于消除探针的检测染色体数目异常的方法和用于检测染色体数目异常的核酸组合物 - Google Patents

基于消除探针的检测染色体数目异常的方法和用于检测染色体数目异常的核酸组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN113272444A
CN113272444A CN201980060332.XA CN201980060332A CN113272444A CN 113272444 A CN113272444 A CN 113272444A CN 201980060332 A CN201980060332 A CN 201980060332A CN 113272444 A CN113272444 A CN 113272444A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
nucleotide sequence
artificial sequence
sequence
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980060332.XA
Other languages
English (en)
Inventor
李施锡
金敬卓
梁银珠
朴希卿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Seasunbio Materials Co ltd
Original Assignee
Seasunbio Materials Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seasunbio Materials Co ltd filed Critical Seasunbio Materials Co ltd
Publication of CN113272444A publication Critical patent/CN113272444A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/107—Modifications characterised by incorporating a peptide nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/107—Temperature of melting, i.e. Tm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/165—Mathematical modelling, e.g. logarithm, ratio
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/101—Interaction between at least two labels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于分析靶染色体数目异常的方法，以及一种用于检测染色体数目异常的组合物，并且更具体地涉及一种如下方法，在所述方法中：通过使用能够扩增对照序列和靶序列二者的引物将位于与染色体数目异常无关的染色体上的所述对照序列和位于与染色体数目异常有关的染色体上的所述靶序列同时扩增；通过使用测定探针和消除探针进行与所述扩增产物的杂交，其中所述测定探针能够与如下序列杂交，所述序列与所述对照或靶序列相差一个或两个碱基，并且所述测定探针包含与所述靶序列或对照序列杂交的序列的整体或其一部分，并且其中所述消除探针比所述测定探针具有更高的对于所述扩增产物的亲和力；以及通过分析所述杂交反应产物的熔解曲线来鉴定染色体数目异常。用于通过使用所述消除探针来根据本发明检测染色体数目异常的所述方法从所述测定以预先确定的比率排除了等效量的所述靶序列和对照序列，并且因此可以以高分辨率分析所述靶序列与所述对照序列的比率，并且本发明的这种优点实现了以高灵敏度和高速度检测以低频率存在的染色体数目异常(例如，母亲血液或羊水中的胎儿染色体)。

Description

基于消除探针的检测染色体数目异常的方法和用于检测染色 体数目异常的核酸组合物
技术领域
本发明涉及一种用于以高灵敏度分析靶染色体的非整倍性是否存在的方法，以及一种用于检测染色体非整倍性的组合物，并且更具体地涉及一种鉴定染色体非整倍性的方法，所述方法通过以下进行：通过使用相同引物将对照核苷酸序列(位于与染色体非整倍性无关的染色体上)和靶核苷酸序列(位于与染色体非整倍性有关的染色体上)扩增；然后使所述扩增产物与测定探针以及包含所述测定探针的部分或全部序列的消除探针杂交，所述测定探针与所述对照核苷酸序列或靶核苷酸序列相差一个或两个核苷酸，所述消除探针与所述靶核苷酸序列或所述对照核苷酸序列杂交，所述消除探针比所述测定探针具有更高的对于扩增产物的结合亲和力；以及分析所述杂交产物的熔解曲线。
背景技术
染色体异常与遗传缺陷和退行性疾病有关。染色体异常可指示染色体的缺失或重复、染色体的一部分的缺失或重复或者染色体的断裂、易位或倒位。染色体异常为遗传平衡的紊乱并且导致胎儿死亡或身体和精神状态的严重缺陷。例如，唐氏综合征为染色体非整倍性(染色体数目异常)的常见形式，由三个21号染色体的存在(21三体)引起。爱德华氏综合征(18三体)、帕陶氏综合征(13三体)、特纳氏综合征(XO)和克兰费尔特综合征(XXY)也对应于染色体非整倍性。
染色体异常可以使用核型分析和荧光原位杂交(FISH)进行检测。这些检测方法在时间、精力和准确性方面是不利的。此外，核型分析需要大量时间进行细胞培养。FISH仅可用于已知核酸序列和染色体定位的样品。FISH可能仅用于具有已知核酸序列和染色体定位的样品。为了避免FISH存在的问题，可以使用比较基因组杂交(CGH)。CGH可以通过分析全基因组来检测已发生染色体非整倍性的区域。然而，CGH具有缺点，因为其分辨率低于FISH的分辨率。
作为替代方法，可以使用DNA微阵列检测染色体异常。根据固定在微阵列上的生物分子的类型，可以将DNA微阵列系统分类成cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列和基因组微阵列。cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列易于制作，但这些系统的缺点在于固定在微阵列上的探针的数目有限，探针制作昂贵并且难以检测位于探针之外的染色体异常。
特别地，在基因组DNA微阵列系统的情况下，易于制作探针，并且不仅可以检测染色体延伸区中的染色体异常而且可以检测染色体内含子区中的染色体异常，但是难以产生大量在染色体内的其定位和功能已知的DNA片段。
最近，下一代测序技术已用于分析染色体数目异常(染色体非整倍性)(Park,H.,Kim等人,Nat Genet 2010,42,400-405.；Kidd,J.M.等人,Nature 2008,453,56-64)。然而，这项技术需要针对染色体非整倍性的分析进行高覆盖读取，并且CNV测量也需要独立验证。因此，这项技术在当时不适合作为通用的基因搜索分析方法，因为它非常昂贵，并且结果难以理解。
出于此目的，实时qPCR目前被用作定量基因分析的先进技术，因为可重复地观察到宽的动态范围(Weaver,S.等人,Methods 2010,50,271-276)和阈值循环与初始目标量之间的线性相关性(Deepak,S.等人,Curr Genomics 2007,8,234-251)。然而，qPCR的灵敏度不够高，无法区别拷贝数的差异。尽管qPCR测定的动态范围很宽，但是小的变化(诸如1.5倍变化)由于基于qPCR的测定的固有变量而不能被可靠地测量。此外，在具有类似DNA拷贝的样品之间进行可靠区分需要多次时间重复分析。此外，qPCR不适用于多模态分析。例如，对于多个靶标的检测，需要将靶标彼此分离的反应以将一个靶标与其他靶标区分开(Bustin,S.A.,J Mol Endocrinol 2002,29,23-39)。此外，由于荧光标签的可用性有限和谱重叠，因此qPCR可在每次测定时分离至多仅4个靶标。然而，对于qPCR中成功的四联体分析，荧光标签的小心组合对于每次分析是必不可少的(Bustin,SA,J Mol Endocrinol 2002,29,23-39)，这是qPCR作为临床诊断工具的严重缺点。
因此，本发明人做了很大的努力来解决上述问题并开发了用于检测染色体非整倍性的方法，从而可快速地以高灵敏度提供分析结果。作为结果，本发明人发现，当将对照核苷酸序列和靶核苷酸序列二者扩增，然后使用消除探针消除来自对照核苷酸序列的扩增产物时，可快速地以高灵敏度获得分析结果，从而完成本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测染色体非整倍性的方法。
本发明的另一目的是提供一种用于检测染色体非整倍性的PCR组合物。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于检测染色体非整倍性的方法，所述方法包括以下步骤：a)分别从正常样品和受试者样品分离DNA；b)使用引物进行扩增，所述引物能够扩增位于与染色体非整倍性无关的染色体上的对照核苷酸序列和位于与染色体非整倍性有关的染色体上的靶核苷酸；c)使所述扩增产物与能够与如下序列杂交的测定探针以及包含所述测定探针的部分或全部序列的消除探针杂交，所述序列与所述对照核苷酸序列或所述靶核苷酸序列相差一个或两个核苷酸，所述消除探针与所述靶核苷酸序列或所述对照核苷酸序列杂交，所述消除探针比所述测定探针具有更高的对于步骤b)的扩增产物的结合亲和力；以及d)通过分析在步骤c)中获得的所述正常样品和所述受试者样品的杂交产物的熔解曲线来鉴定染色体非整倍性。
本发明还提供了一种用于检测染色体非整倍性的PCR组合物，所述PCR组合物包含：i)引物，其能够扩增位于与染色体非整倍性无关的染色体上的对照核苷酸序列和位于与染色体非整倍性有关的染色体上的靶核苷酸；ii)能够与如下序列杂交的测定探针，所述序列与所述对照核苷酸序列或所述靶核苷酸序列相差一个或两个核苷酸；和iii)包含所述测定探针的部分或全部序列的消除探针，所述消除探针与所述靶核苷酸序列或所述对照核苷酸序列杂交，所述消除探针比所述测定探针具有更高的结合亲和力。
本发明还提供了所述PCR组合物用于检测染色体非整倍性的用途。
附图说明
图1是示出通过使用根据本发明的消除探针以相同比率消除正常和异常染色体的示意图。
图2是示出取决于通过使用根据本发明的消除探针所得的消除率的分析分辨率的变化示意图。
图3是示出用于选择根据本发明的靶核苷酸序列的条件和用于选择扩增所述靶核苷酸序列的引物的条件的示意图。
图4是示出用于根据本发明确定染色体比率是否异常的实时PCR条件的图。
图5是示出根据本发明的检测探针和消除探针的示意图。图5(A)示出了与靶核苷酸序列和对照核苷酸序列二者结合的非荧光消除探针，图5(B)示出了仅与对照核苷酸序列结合的非荧光探针，并且图5(C)示出了仅与对照核苷酸序列结合的荧光消除探针。
图6示出了根据本发明使用唐氏综合征细胞系的分析的结果。图6(A)和图6(B)示出了基于不同对照核苷酸序列和靶核苷酸序列的分析的结果。
图7示出了根据本发明使用爱德华氏综合征细胞系的分析的结果。图7(A)和图7(B)示出了基于不同对照核苷酸序列和靶核苷酸序列的分析的结果。
图8示出了根据本发明使用帕陶氏综合征细胞系的分析的结果。图8(A)和图8(B)示出了基于不同对照核苷酸序列和靶核苷酸序列的分析的结果。
图9示出了根据本发明使用唐氏综合征细胞系分析取决于DNA比例的灵敏度的结果。图9(A)和图9(B)示出了基于不同对照核苷酸序列和靶核苷酸序列的分析的结果。
图10示出了指示通过使用根据本发明仅消除对照核苷酸序列的非荧光探针使分析分辨率增加的结果。
图11示出了指示通过使用根据本发明同时消除靶核苷酸序列和对照核苷酸序列的非荧光探针使分析分辨率增加的结果。
图12是示出使用根据本发明靶向对照核苷酸序列的荧光消除探针获得的结果的校正的示意图。
图13示出了根据本发明校正结果的结果。
图14示出了标准物质和临床样品的比较分析的结果。
具体实施方式
除非另外定义，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语均具有与本公开文本所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。通常，本说明书中使用的命名法是本领域公知且通常使用的。
在本发明中，基于从正常样品和受试者样品分离的DNA，使用相同引物将位于预期与染色体非整倍性有关的染色体上的靶核苷酸序列和位于预期与染色体非整倍性无关的染色体上同时与靶核苷酸序列具有至少90％同源性的对照核苷酸序列扩增，用消除探针消除一定量的所述扩增产物，然后使用测定探针分析所述扩增产物的溶解曲线。作为结果，确认可以以高灵敏度检测染色体非整倍性。
也就是说，在本发明的一个例子中，使用以下合成引物产生扩增产物：能够扩增1号、4号和7号染色体中每一个的某一区域，同时扩增21号染色体的某一区域的合成引物；或能够扩增1号、4号、9号和15号染色体中每一个的某一区域，同时扩增19号染色体的某一区域的合成引物；或能够扩增3号、6号和12号染色体中每一个的某一区域，同时扩增13号染色体的某一区域的合成引物，然后通过使用能够与所述扩增产物杂交的消除探针来防止一定比例的每一种扩增产物与测定探针结合，然后通过分析熔解曲线来计算所述正常样品和所述受试者样品的错配/完美匹配比率。作为结果，确认可以以高灵敏度检测染色体非整倍性(图1和图2)。
因此，在一个方面，本发明涉及一种用于检测染色体非整倍性的方法，所述方法包括以下步骤：
a)分别从正常样品和受试者样品分离DNA；
b)使用引物进行扩增，所述引物能够扩增位于与染色体非整倍性无关的染色体上的对照核苷酸序列和位于与染色体非整倍性有关的染色体上的靶核苷酸；
c)使扩增产物与能够与如下序列杂交的测定探针以及包含所述测定探针的部分或全部序列的消除探针杂交，所述序列与所述对照核苷酸序列或所述靶核苷酸序列相差一个或两个核苷酸，所述消除探针与所述靶核苷酸序列或所述对照核苷酸序列杂交，所述消除探针比所述测定探针具有更高的对于步骤b)的扩增产物的结合亲和力；以及
d)通过分析在步骤c)中获得的所述正常样品和所述受试者样品的杂交产物的熔解曲线来鉴定染色体非整倍性。
如本文所用，术语“靶核苷酸序列”是指待检测的所有类型的核酸，并包括来自不同物种、亚种或变体的染色体序列或者同一物种内的染色体突变。靶核苷酸序列的特征可在于所有DNA类型(包括基因组DNA、线粒体DNA和病毒DNA)或所有RNA类型(包括mRNA、核糖体RNA、非编码RNA、tRNA和病毒RNA)，但不限于此。
在本发明中，所述靶核苷酸序列可以是包括核苷酸序列的变异的突变体核苷酸序列，并且突变可以选自单核苷酸多态性(SNP)、插入、缺失、点突变、融合突变、易位、倒位和LOH(杂合性缺失)，但不限于此。
如本文所用，术语“核苷”是指核酸碱基(核碱基)与糖部分连接的葡基胺化合物。术语“核苷酸”是指磷酸核苷。核苷酸可使用如表1中所述与其核苷对应的字母(字母名称)表示。例如，A表示腺苷(含有核碱基腺嘌呤的核苷)，C表示胞苷，G表示鸟苷，U表示尿苷并且T表示胸苷(5-甲基尿苷)。W表示A或T/U，并且S表示G或C。N表示随机核苷，并且dNTP是指脱氧核糖核苷三磷酸。N可以是A、C、G或T/U中的任一个。
[表1]
字母符号 由字母符号表示的核苷酸
G G
A A
T T
C C
U U
R G或A
Y T/U或C
M A或C
K G或T/U
S G或C
W A或T/U
H A或C或T/U
B G或T/U或C
V G或C或A
D G或A或T/U
H G或A或T/U或C
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指核苷酸的低聚物。如本文所用的术语“核酸”是指核苷酸的聚合物。如本文所用的术语“序列”是指寡核苷酸或核酸的核苷酸序列。在整个说明书中，每当由字母序列表示寡核苷酸或核酸时，核苷酸从左到右为5'→3'的顺序。寡核苷酸或核酸可以是DNA、RNA或其类似物(例如，硫代磷酸类似物)。寡核苷酸或核酸还可以包括修饰的碱基和/或(例如，修饰的磷酸骨架连接或修饰的糖部分)。赋予核酸稳定性和/或其他优点的合成骨架的非限制性例子可包括硫代磷酸连接、肽核酸、锁核酸、木糖核酸或其类似物。
如本文所用，术语“核酸”是指核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则将涵盖可以以与天然存在的核苷酸相似的方式(例如，杂交)起作用的已知的天然核苷酸类似物。
术语“核酸”包括例如基因组DNA、互补DNA(cDNA)(其为mRNA的DNA表示，通常通过信使RNA(mRNA)的逆转录或通过扩增获得)、以合成方式或通过扩增产生的DNA分子以及任何形式的DNA或RNA，包括mRNA。
术语“核酸”涵盖双链或三链核酸以及单链分子。在双链或三链核酸中，核酸链不需要为共延的(即，双链核酸不需要沿着两条链的整个长度为双链)。
术语核酸还涵盖其任何化学修饰(诸如通过甲基化和/或通过加帽)。核酸修饰可包括将另外的电荷、极化率、氢键、静电相互作用和官能性并入单独核酸碱基或整个核酸中的化学基团的添加。此类修饰可包括碱基修饰，诸如2'位糖修饰、5位嘧啶修饰、8位嘌呤修饰、在胞嘧啶环外胺处的修饰、5-溴-尿嘧啶的取代、骨架修饰、不常见的碱基配对组合(诸如异碱基异胞苷和异胍等)。
一个或多个核酸可以来源于完全化学合成过程(诸如固相介导的化学合成)、生物来源(诸如通过从产生核酸的任何物种分离)或涉及通过分子生物学工具操纵核酸的过程(诸如DNA复制、PCR扩增、逆转录)或者这些过程的组合。
如本文所用，术语“互补”是指两个核苷酸之间精确配对的能力。也就是说，如果在核酸的给定位置处的核苷酸能够与另一核酸的核苷酸进行氢键合，那么这两个核酸被认为在该位置处彼此互补。两个单链核酸分子之间的互补性可能是“部分的”，其中仅一些核苷酸结合；或者可能是完全的，此时单链分子之间存在完全互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。
如本文所用，术语“引物”是指与靶核酸序列(例如，待扩增的DNA模板)杂交以引发核酸合成反应的短线性寡核苷酸。所述引物可以是RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或嵌合序列。所述引物可以含有天然、合成或修饰的核苷酸。所述引物的长度的上下限凭经验来确定。引物长度的下限是在核酸扩增反应条件下与靶核酸杂交时形成稳定双链体所需的最小长度。非常短的引物(通常长度少于3至4个核苷酸)在此类杂交条件下不与靶核酸形成热力学稳定的双链体。上限通常由在靶核酸中除预先确定的核酸序列之外的区域中具有双链体形成的可能性来确定。通常，合适的引物长度在约4至约40个核苷酸长的范围内。
如本文所用，术语“探针”是能够通过一种或多种类型的化学键、一般通过互补碱基配对、通常通过氢键形成来与具有互补序列的靶核酸结合，从而形成双链体结构的核酸。所述探针与“探针结合位点”结合或杂交。所述探针可以用可检测的标记来标记，以允许容易检测到探针，特别是当探针已与其互补靶标杂交时。然而，可替代地，所述探针可以是未标记的，但可以通过直接或间接地与标记的配体特异性结合来检测。探针的大小可以显著不同。通常，探针的长度为至少7个至15个核苷酸。其他探针的长度为至少20个、30个或40个核苷酸。还有其他稍微更长的探针，长度为至少50个、60个、70个、80个或90个核苷酸。还有其他更长的探针，并且长度为至少100个、150个、200个或更多个核苷酸。探针还可以具有在由上述任何值界定的任何范围内的任何长度(例如，长度为15个至20个核苷酸)。
如本文所用，术语“杂交”是指通过具有互补碱基序列的单链核酸之间的氢键合形成双链核酸，并以与退火相似的意义使用。然而，以更广泛的意义，杂交包括两个单链分子之间核苷酸完全互补(完美匹配)的情况，以及一些核苷酸不互补(错配)的情况。
在本发明中，所述扩增不受限制，只要是聚合酶链反应(PCR)即可，但优选不对称PCR。
在本发明中，步骤b)的对照核苷酸序列的引物或探针杂交区的同源性不受限制，只要相同探针或引物能够与靶核苷酸序列的引物或探针杂交区互补结合即可，但同源性优选至少80％、更优选至少90％、最优选95％。
在本公开文本中，可在图3中所述的条件下选择对照核苷酸序列。
在本发明中，可以不受限制地使用步骤c)中的测定探针，只要当测定探针与对照核苷酸序列或靶核苷酸序列完美匹配或错配时出现分析曲线图上可以区分的程度的熔解温度差即可。优选地，所述熔解温度差可以是5℃至20℃、更优选7℃至20℃、最优选8℃至20℃。
在本发明中，步骤c)中的测定探针可以是肽核酸(PNA)，并且可将报告物和猝灭剂附接至测定探针的两端。
在本发明中，肽核酸(PNA)是识别基因如LNA(锁核酸)和MNA(吗啉代核酸)的物质之一，且为人工合成的，并且其骨架由聚酰胺构成。PNA具有优异的亲和力和选择性，并且由于其对核酸酶的稳定性高而不被现有的限制酶降解。此外，PNA具有易于储存的优点，并且由于其热/化学性质和稳定性高而不易被降解。此外，PNA-DNA结合比DNA-DNA结合强得多，并且即使一个核苷酸错配，也可显现约10℃至15℃的熔解温度(Tm)差。利用这种结合强度的差异，可以检测到单核苷酸多态性(SNP)和插入/缺失(InDel)核酸的变化。
Tm值也根据PNA探针的核苷酸序列和与其互补的DNA的核苷酸序列之间的差异而改变，因此容易实现基于这种变化的应用的开发。使用与TaqMan探针的水解反应不同的杂交反应分析PNA探针，并且具有与PNA探针的功能相似的探针包括分子信标探针和蝎形探针。
在本发明中，可以将报告物或猝灭剂附接至PNA探针，但不限于此。根据本发明的包含报告物和猝灭剂的PNA探针在与靶核酸杂交之后生成荧光信号，并且随着温度升高，通过在适当的探针熔解温度下快速熔解靶核酸来使荧光信号猝灭。通过分析从由这种温度变化引起的荧光信号获得的高分辨率熔解曲线，可以检测靶核酸是否存在。
本发明的探针可以具有附接在其两端的报告物和能够使报告物荧光猝灭的猝灭剂，并且可以包括嵌入荧光团。所述报告物可以是选自FAM(6-羧基荧光素)、HEX、德克萨斯红、JOE、TAMRA、CY5、CY3和Alexa680中的一种或多种，并且所述猝灭剂优选地是TAMRA(6-羧基四甲基-罗丹明)、BHQ1、BHQ2或Dabcyl，但不限于此。所述嵌入荧光团可以选自：吖啶同二聚体及其衍生物、吖啶橙及其衍生物、7-氨基放线菌素D(7-AAD)及其衍生物、放线菌素D及其衍生物、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)及其衍生物、DAPI及其衍生物、二氢乙锭及其衍生物、溴化乙锭及其衍生物、乙锭均二聚物-1(EthD-1)及其衍生物、乙锭均二聚物-2(EthD-2)及其衍生物、单叠氮乙锭及其衍生物、碘化己锭(hexidium iodide)及其衍生物、双苯甲亚胺(Hoechst 33258)及其衍生物、Hoechst 33342及其衍生物、Hoechst 34580及其衍生物、羟芪巴脒及其衍生物、LDS 751及其衍生物、碘化丙锭(PI)及其衍生物以及Cy染料衍生物。
在本发明中，步骤c)中的消除探针可选自：仅消除所述靶核苷酸序列的扩增产物的探针；以及消除所述靶核苷酸序列和所述对照核苷酸序列二者的扩增产物的探针。
在本发明中，步骤c)中的消除探针可与测定探针竞争杂交所述对照核苷酸序列或所述靶核苷酸序列的扩增产物。
在本发明中，所述消除探针可选自寡核苷酸、LNA、PNA及其组合。
在本发明中，步骤c)中的消除探针可消除步骤b)中获得的扩增产物的50％至90％。
在本发明中，所述消除探针可以比测定探针具有更高的Tm值。
在本发明中，步骤d)中熔解曲线的分析可通过包括以下步骤的方法进行：
a)计算所述正常样品DNA的扩增产物的错配值/完美匹配值比率；
b)计算受试者样品DNA的扩增产物的错配值/完美匹配值比率；以及
c)当步骤a)中计算的比率与步骤b)中计算的比率相同时，确定受试者样品为正常的，并且当步骤a)中计算的比率与步骤b)中计算的比率不同时，确定受试者样品具有染色体非整倍性。
在本发明中，熔解曲线的分析可进一步包括：
步骤d)，当计算步骤a)和步骤b)中的比率时使用以下方程1校正通过消除探针值获得的完美匹配：
方程1：
Figure BDA0002976757970000101
将荧光熔解曲线分析(FMCA)用作用于分析杂交反应的方法。荧光熔解曲线分析根据熔解温度分析PCR反应产物与引入的探针之间的结合亲和力的差异。与其他SNP检测探针不同，所述探针设计得非常简单，并且因此使用11至18聚体核苷酸序列(包括SNP)来构建。因此，为了设计具有期望的熔解温度的探针，可以根据PNA探针的长度来调整Tm值，并且即使在具有相同长度的PNA探针的情况下，也可以通过改变探针来调整Tm值。因为PNA比DNA具有更高的结合亲和力，并且因此具有较高基础Tm值，PNA可被设计成长度短于DNA，并且因此甚至可以检测紧密相邻的SNP。在常规的HRM方法中，在约0.5℃下Tm值的差异非常小，并且因此需要另外的分析程序或微小的温度变化，并且当显现两个或更多个SNP时分析变得困难。然而，PNA探针不受除探针序列以外的SNP的影响，并且因此能够实现快速且准确的分析。
本发明还涉及一种用于检测多个染色体非整倍性的方法，其使用至少两个引物、至少两个测定探针和至少两个消除探针，并且在所述方法中测定探针具有不同的报告物。
对于本领域的技术人员而言清楚的是，根据本发明的用于检测染色体非整倍性的方法不仅可应用于检测胎儿染色体异常，而且可应用于检测癌症相关的染色体异常。
在另一方面，本发明涉及一种用于检测染色体非整倍性的PCR组合物，所述PCR组合物包含：
i)引物，其能够扩增位于与染色体非整倍性无关的染色体上的对照核苷酸序列和位于与染色体非整倍性有关的染色体上的靶核苷酸；
ii)能够与如下序列杂交的测定探针，所述序列与所述对照核苷酸序列或所述靶核苷酸序列相差一个或两个核苷酸；以及
iii)包含所述测定探针的部分或全部序列的消除探针，所述消除探针与所述靶核苷酸序列或所述对照核苷酸序列杂交，所述消除探针比所述测定探针具有更高的结合亲和力。
实施例
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。对于本领域的技术人员而言将明显的是，这些实施例仅用于说明本发明，并且本发明的范围不受限于这些实施例。
实施例1：构建用于检测染色体非整倍性的引物
对于染色体异常(唐氏综合征(21号染色体)、爱德华氏综合征(18号染色体)和帕陶氏综合征(13号染色体))的靶核苷酸序列和内部对照核苷酸序列的实时聚合酶链反应，构建了针对唐氏综合征(SEQ ID NO:1至10)、爱德华氏综合征(SEQ ID NO:11至20)和帕陶氏综合征(SEQ ID NO:21至30)的引物(表2)。
[表2]
Figure BDA0002976757970000111
Figure BDA0002976757970000121
实施例2：荧光PNA探针的构建
针对染色体非整倍性的靶核苷酸序列的检测，构建了具有熔解温度分析功能的双功能荧光PNA探针(测定探针)。每个探针被构建为使得靶向如下序列区的探针区可与靶核苷酸序列匹配或与对照核苷酸序列匹配，所述序列区与对照核苷酸序列相差一个或两个核苷酸，所述对照核苷酸序列与所述靶核苷酸序列具有至少90％同源性。将荧光团(德克萨斯红)和猝灭剂附接至包含靶核苷酸序列的测定探针(表3)。
[表3]
Figure BDA0002976757970000131
Figure BDA0002976757970000141
*在上述表3中，O-表示接头，并且K表示赖氨酸。
实施例3：构建消除探针
为了增加用于检测染色体异常的靶探针的分析分辨率，如SEQ ID NO:61至66中所示构建了通过靶向如下序列区来消除靶核苷酸序列和对照核苷酸序列二者的探针，所述序列区与对照核苷酸序列相差一个或两个核苷酸，所述对照核苷酸序列与靶核苷酸序列具有至少90％同源性。此外，如SEQ ID NO:67至71中所示构建了消除靶核苷酸序列的探针(非荧光)，并且如SEQ ID NO:72至86中所示构建了消除靶核苷酸序列并且已附接荧光团和猝灭剂的探针(表4)。
[表4]
Figure BDA0002976757970000142
Figure BDA0002976757970000151
*在上述表4中，O-表示接头，并且K表示赖氨酸。
实施例4：使用标准细胞系验证PBA探针
对于三体标准细胞系(表5)，将实施例1中构建的每个引物和实施例2中构建的每个PNA探针与从标准细胞系提取的DNA混合，然后使用CFX96TM实时系统(BIO-RAD，美国)进行PCR。
在实时聚合酶链反应的实验条件下，使用不对称PCR产生单链靶核酸。在以下条件下进行不对称PCR：将1μl标准细胞系DNA(表5)添加至2X SeaSunBio实时FMCATM缓冲液(SeaSunBio，韩国)、2.5mM MgCl2、200μM dNTP、1.0U Taq聚合酶、0.05μM正向引物(表2)和0.5μM反向引物(表2)(不对称PCR)中以达到总体积20μl，然后进行实时PCR，然后向其中添加0.5μl荧光PNA探针(表3)，并且在图4示出的条件下进行熔解曲线分析。
[表5]
Figure BDA0002976757970000152
Figure BDA0002976757970000161
作为结果，如图6、图7和图8中所示，确认显现出三体与整倍体细胞系之间的分析值(错配值/完美匹配值)的差异。
实施例5：基于PNA探针的唐氏综合征检测的灵敏度的比较分析
将从21三体(唐氏综合征)标准细胞系(表5)提取的DNA与整倍体正常gDNA以5％、10％、20％、30％和100％的比率混合，并分析灵敏度。向其中添加实施例1和2中构建的引物和PNA探针，然后使用CFX96TM实时系统(BIO-RAD，美国)进行PCR。
在实时聚合酶链反应的实验条件下，使用不对称PCR产生单链靶核酸。在以下条件下进行不对称PCR：将1μl标准细胞系DNA(表5)添加至2X SeaSunBio实时FMCATM缓冲液(SeaSunBio，韩国)、2.5mM MgCl2、200μM dNTP、1.0U Taq聚合酶、0.05μM正向引物(表2)和0.5μM反向引物(表2)(不对称PCR)中以达到总体积20μl，然后进行实时PCR，然后向其中添加0.5μl荧光PNA探针(表3)，并且在图4示出的条件下进行熔解曲线分析。
作为结果，确认21三体(唐氏综合征)的分析即使在含有5％DNA的混合物中也是可能的(图9)。
实施例6：验证消除探针对增加的分析分辨率的影响
为了增加实施例4和5中染色体异常的检测的分析分辨率，使用实施例1、2和3中构建的引物、PNA探针和非荧光消除探针在CFX96TM实时系统(BIO-RAD，美国)中进行PCR。
在实时聚合酶链反应的实验条件下，使用不对称PCR产生单链靶核酸。在以下条件下进行不对称PCR：将1μl标准细胞系DNA(表5)添加至2X SeaSunBio实时FMCATM缓冲液(SeaSunBio，韩国)、2.5mM MgCl2、200μM dNTP、1.0U Taq聚合酶、0.05μM正向引物(表2)和0.5μM反向引物(表2)(不对称PCR)中以达到总体积20μl，然后进行实时PCR。然后，向其中添加0.5μl荧光PNA探针(表3)和每个非荧光消除探针(表4，消除探针1至11)，并且在图4示出的条件下进行熔解曲线分析。
将单独使用测定探针的情况与组合使用测定探针和消除探针的情况进行比较。确认使用仅消除对照序列的非荧光探针时的分辨率(正常与异常之间的差异为1.8倍)高于单独使用常规测定探针时的分辨率(正常与异常之间的差异为1.3倍；图10)。
此外，确认即使当使用消除靶核苷酸序列和对照序列的非荧光探针时，正常与异常之间的差异也为1.8倍，并且分辨率高于常规分析方法中的分辨率(正常与异常之间的差异为1.4倍)(图11)。
实施例7：验证所得校正对增加的分析分辨率的影响
为了增加实施例4和5中染色体异常的检测的分析分辨率，使用实施例1、2和3中构建的引物、PNA探针和非荧光消除探针在CFX96TM实时系统(BIO-RAD，美国)中进行PCR。
在实时聚合酶链反应的实验条件下，使用不对称PCR产生单链靶核酸。在以下条件下进行不对称PCR：将1μl标准细胞系DNA(表5)添加至2X SeaSunBio实时FMCATM缓冲液(SeaSunBio，韩国)、2.5mM MgCl2、200μM dNTP、1.0U Taq聚合酶、0.05μM正向引物(表2)和0.5μM反向引物(表2)(不对称PCR)中以达到总体积20μl，然后进行实时PCR。然后，向其中添加0.5μl荧光PNA探针(表3)和每个荧光消除探针(表4，消除探针12至261)，并且在图4示出的条件下进行熔解曲线分析。
使用靶向对照核苷酸序列的荧光消除探针进行结果的校正(图12)。确认结果校正之后的分析分辨率(错配值/完美匹配值)/(完美匹配值/通过消除探针的完美匹配值)相比于校正之前的分析分辨率(错配值/完美匹配值)增加(1.6倍→2.3倍；图13)。
实施例8：验证使用临床样品的唐氏综合征检测
将从正常母体血液提取的cfDNA与21三体标准物质(21三体，唐氏综合征)进行比较分析。作为21三体标准物质(21三体，唐氏综合征)，使用SeraseqTM 21三体非整倍性线性盘(4％-8％胎儿分数)和标准细胞系。作为结果，如图14所示，确认对于4％和8％21三体标准物质(21三体，唐氏综合征)获得的结果全部与对于正常母体cfDNA获得的结果不同，表明可能检测到染色体异常(图14)。
尽管已经参考特定特征详细描述了本发明，但是对于本领域的技术人员而言清楚的是，此描述仅是其优选实施方案的描述，并且不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物来限定。
工业适用性
根据本发明的用于检测染色体非整倍性的方法可以通过从使用消除序列的分析消除等量(一定比例)靶核苷酸序列和对照核苷酸序列，以高分辨率分析靶核苷酸序列与对照核苷酸序列的比率。这种方法是有用的，因为通过使用这种方法可以快速地以高灵敏度检测出以低比率存在的染色体(例如，母体血液中的胎儿染色体以及癌症患者的循环肿瘤DNA)数目异常(非整倍性)。
序列表自由文本
附有电子文件。
<110> 海阳生物材料有限公司
<120> 基于消除探针的检测染色体数目异常的方法和用于检测染色体数目异常的核酸组合物
<130> PP-B2244
<150> KR 10-2018-0089224
<151> 2018-07-31
<160> 86
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
agaggtcata gaaggttatg aaatagc 27
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
gaggtacgaa gtagagatga gacttc 26
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
cagcaaggtt gaaattggga atg 23
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
gagtaggaga gtggttgagg aaatcc 26
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
caaactggaa tagctagcat gtgcttgc 28
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 6
ggacattccc aatttcaacc ttgctg 26
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 7
gggacatgat ttgtaaagtt caaggc 26
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 8
cacattctgt gaccaaacgg ttcaac 26
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 9
ccacagggct aaagcaacca tctcc 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 10
ctcccttctt atgacccaag tggct 25
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 11
cagggaaaat gaccttcact gctg 24
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 12
catccccttt accttagttt acccac 26
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 13
gtgctggtgg cagtgttatt tcc 23
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 14
agtaatgtgt tgtcagttca ctgagg 26
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 15
ggagctgcga cacggagaa 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 16
caagcacacc tgctgttca 19
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 17
cagtgcgcga aatgtagttt tg 22
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 18
gtgtagcaca aaccacagag gagac 25
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 19
cctcctccct gtcttctctg attc 24
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 20
caaacagagg tgtgcagcag agg 23
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 21
ctgccttttg aaccagttag tctggag 27
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 22
tcccttctct actctgactc ctacc 25
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 23
cctcaacagg agagcagaag gctc 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 24
gtgtgcttca aggctcagtt agtg 24
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 25
ccccatgctg cccagtcctg 20
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 26
ctaggttctc tacggcctct tgttact 27
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 27
gcgttcttgt tctctagctt cctg 24
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 28
gataccgatg tcagaggcag gagg 24
<210> 29
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 29
gttttgtttc tcttctctgc tgtcgg 26
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 30
ccaggtggaa tctgaatcaa gtgtac 26
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 31
atttggtatg ttgttctg 18
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 32
tcatccccca acacaa 16
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 33
gttcttaata gcaggtac 18
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 34
gactcttatt ggatacag 18
<210> 35
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 35
ggtatgttgt gtgatg 16
<210> 36
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 36
ggtatggttc ccttaga 17
<210> 37
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 37
cccagtcgtc agcaa 15
<210> 38
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 38
ctcaccaaac tcccag 16
<210> 39
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 39
gaaccccgct aagg 14
<210> 40
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 40
gggcttgttc agct 14
<210> 41
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 41
ttctgggtca agcct 15
<210> 42
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 42
agctccatag cagtg 15
<210> 43
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 43
tggtcctcat ctgctg 16
<210> 44
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 44
gctcgaattt cagag 15
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 45
cactggctta tcatgtct 18
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 46
attattccga actctagc 18
<210> 47
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 47
cagacctaag ttcaag 16
<210> 48
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 48
gatgattctg agcaca 16
<210> 49
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 49
ccccaggctg cttat 15
<210> 50
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 50
tgactctaaa gcaga 15
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 51
ctctagttcg ccatagcc 18
<210> 52
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 52
ccaccattag tgcctct 17
<210> 53
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 53
cctcaagcca cacaa 15
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 54
tgtcctcagc ctttctcg 18
<210> 55
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 55
cccttcactg tcatcct 17
<210> 56
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 56
ccagcagcct ccaca 15
<210> 57
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 57
gctgtgtcag tcctg 15
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 58
cagttgacat tagtaaat 18
<210> 59
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 59
ctcccgagct gactcc 16
<210> 60
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 60
aaatccgccc tgac 14
<210> 61
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 61
gatacagtgc agc 13
<210> 62
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 62
gatacagtgc agcg 14
<210> 63
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 63
ggatacagtg cagcg 15
<210> 64
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 64
gtgtgatgat cagc 14
<210> 65
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 65
gtgtgatgat cagca 15
<210> 66
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 66
gtgtgatgat cagcac 16
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 67
atttggtatg ttgttctg 18
<210> 68
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 68
tcatccccca acacaa 16
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 69
gttcttaata gcaggtac 18
<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 70
gactcttatt ggatacag 18
<210> 71
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 71
ggtatgaggt gtga 14
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 72
atttggtacg ttgttctg 18
<210> 73
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 73
tcatctccca gcacaa 16
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 74
gttcttaaca gcaggtac 18
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 75
gactcttact ggatacag 18
<210> 76
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 76
ggtatgaggt gtga 14
<210> 77
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 77
ttctggatca agcct 15
<210> 78
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 78
agctccgtag cagt 14
<210> 79
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 79
ggtcctcgtc tgctg 15
<210> 80
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 80
gctcgagttt cagag 15
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 81
cactggctca tcatgtct 18
<210> 82
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 82
ctctagttct ccatagcc 18
<210> 83
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 83
ccaccatcag tgcctct 17
<210> 84
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 84
cctcaaacca cacaa 15
<210> 85
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 85
tgtcctcaac ctttctcg 18
<210> 86
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 86
cccttcattg tcatcct 17

Claims (14)

1.一种用于检测染色体非整倍性的方法，所述方法包括以下步骤：
a)分别从正常样品和受试者样品分离DNA；
b)使用引物进行扩增，所述引物能够扩增位于与染色体非整倍性无关的染色体上的对照核苷酸序列和位于与染色体非整倍性有关的染色体上的靶核苷酸；
c)使所述扩增产物与能够与如下序列杂交的测定探针以及包含所述测定探针的部分或全部序列的消除探针杂交，所述序列与所述对照核苷酸序列或所述靶核苷酸序列相差一个或两个核苷酸，所述消除探针与所述靶核苷酸序列或所述对照核苷酸序列杂交，所述消除探针比所述测定探针具有更高的对于步骤b)的扩增产物的结合亲和力；以及
d)通过分析在步骤c)中获得的所述正常样品和所述受试者样品的杂交产物的熔解曲线来鉴定染色体非整倍性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)的所述对照核苷酸序列的引物或探针杂交区与所述靶核苷酸序列的引物或探针杂交区具有至少90％同源性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中当与所述对照核苷酸序列或所述靶核苷酸序列完美匹配或错配时，步骤c)的所述测定探针的熔解温度差为8℃或更多。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)的所述测定探针为肽核酸(PNA)，并且可将报告物和猝灭剂附接至所述测定探针的两端。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述报告物是选自FAM(6-羧基荧光素)、德克萨斯红、HEX(2',4',5',7'-四氯-6-羧基-4,7-二氯荧光素)和Cy5的至少一种。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述猝灭剂是选自TAMRA(6-羧基四甲基-罗丹明)、BHQ1、BHQ2和Dabcyl的至少一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)的所述消除探针选自：仅消除所述靶核苷酸序列的扩增产物的探针；以及消除所述靶核苷酸序列和所述对照核苷酸序列的扩增产物的探针。
8.根据权利要求7所述的方法，其中步骤c)的所述消除探针与所述测定探针竞争杂交所述对照核苷酸序列或所述靶核苷酸序列的扩增产物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述消除探针选自寡核苷酸、LNA、PNA及其组合。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)的所述消除探针消除步骤b)的扩增产物的50％至90％。
11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤d)中所述熔解曲线的分析通过包括以下步骤的方法进行：
a)计算所述正常样品DNA的扩增产物的错配值/完美匹配值比率；
b)受试者样品DNA的扩增产物的错配值/完美匹配值比率；以及
c)当步骤a)中计算的比率与步骤b)中计算的比率相同时，确定受试者样品为正常的，并且当步骤a)中计算的比率与步骤b)中计算的比率不同时，确定受试者样品具有染色体非整倍性。
12.根据权利要求11所述的方法，其中用于分析所述熔解曲线的所述方法进一步包括：步骤d)，当计算步骤a)和步骤b)中的比率时使用以下方程1校正通过所述消除探针获得的完美匹配值：
方程1：
Figure FDA0003143049980000021
13.根据权利要求1所述的方法，所述方法是一种用于检测多个染色体非整倍性的方法，其使用至少两个引物、至少两个测定探针和至少两个消除探针，在所述方法中所述测定探针具有不同的报告物。
14.一种用于检测染色体非整倍性的PCR组合物，所述PCR组合物包含：
i)引物，其能够扩增位于与染色体非整倍性无关的染色体上的对照核苷酸序列和位于与染色体非整倍性有关的染色体上的靶核苷酸；
ii)能够与如下序列杂交的测定探针，所述序列与所述对照核苷酸序列或所述靶核苷酸序列相差一个或两个核苷酸；以及
iii)包含所述测定探针的部分或全部序列的消除探针，所述消除探针与所述靶核苷酸序列或所述对照核苷酸序列杂交，所述消除探针比所述测定探针具有更高的结合亲和力。
CN201980060332.XA 2018-07-31 2019-07-23 基于消除探针的检测染色体数目异常的方法和用于检测染色体数目异常的核酸组合物 Pending CN113272444A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2018-0089224 2018-07-31
KR1020180089224A KR102079963B1 (ko) 2018-07-31 2018-07-31 소거 프로브 기반 염색체 수적이상 검출방법 및 염색체 수적이상 검출용핵산의 조성물
PCT/KR2019/009067 WO2020027482A1 (ko) 2018-07-31 2019-07-23 소거 프로브 기반 염색체 수적이상 검출방법 및 염색체 수적이상 검출용핵산의 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113272444A true CN113272444A (zh) 2021-08-17

Family

ID=69232005

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980060332.XA Pending CN113272444A (zh) 2018-07-31 2019-07-23 基于消除探针的检测染色体数目异常的方法和用于检测染色体数目异常的核酸组合物

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220127665A1 (zh)
KR (1) KR102079963B1 (zh)
CN (1) CN113272444A (zh)
WO (1) WO2020027482A1 (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170009445A (ko) * 2015-07-17 2017-01-25 주식회사 시선바이오머티리얼스 Pna 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140091944A (ko) * 2013-01-14 2014-07-23 주식회사 시선바이오머티리얼스 내부컨트롤 및 리포터 및 소광자가 결합된 pna 프로브를 이용한 용융곡선 분석방법, 이를 이용한 표적핵산 검출방법 및 표적핵산 검출 키트
KR102118180B1 (ko) * 2013-08-07 2020-06-02 주식회사 시선바이오머티리얼스 차세대 염기서열 분석법을 이용한 체성돌연변이 검출방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170009445A (ko) * 2015-07-17 2017-01-25 주식회사 시선바이오머티리얼스 Pna 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DZIFA Y DUOSE等: "Configuring robust DNA strand displacement reactions for in situ molecular analyses", NUCLEIC ACIDS RES, vol. 40, no. 7, pages 2 *
JIWU LOU等: "Rapid and simultaneous detection of common aneuploidies by quadruplex real-time polymerase chain reaction combined with melting curve analysis", PLOS ONE, vol. 12, no. 2, pages 1 - 2 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220127665A1 (en) 2022-04-28
KR20200013955A (ko) 2020-02-10
WO2020027482A1 (ko) 2020-02-06
KR102079963B1 (ko) 2020-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11345958B2 (en) Methods for performing multiplexed real-time PCR
EP2633071B1 (en) Compositions of toehold primer duplexes and methods of use
EP2572004B1 (en) Detection of target nucleic acid sequences by pto cleavage and extension assay
NZ521593A (en) Hybridisation beacon and method of rapid sequence detection and discrimination
EP2823061B1 (en) Detection of nucleotide variation on target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension assay
JP5993939B2 (ja) Ｐｏ切断及びハイブリダイゼーションによるターゲット核酸配列の検出
JP6144623B2 (ja) 核酸測定用の核酸プローブ
US11198903B2 (en) Methods for performing multiplexed real-time PCR
US20050277134A1 (en) Method for amplifying nucleic acid and analysis of single-nucleotide polymorphism using the same
US20090181375A1 (en) Method for detection of nucleic acid barcodes
EP3022319B1 (en) Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent immobilized oligonucleotide hybridization
US20220145284A1 (en) Method of detecting multiple targets based on single detection probe using tag sequence snp
CN105705657B (zh) 基于利用杂交-捕捉和模板化寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸分析的在固相中的靶核酸序列检测
CN113272444A (zh) 基于消除探针的检测染色体数目异常的方法和用于检测染色体数目异常的核酸组合物
CN109477139B (zh) 使用长ssDNA多核苷酸作为PCR测定中的引物的方法
KR20180033911A (ko) 표적 핵산 또는 유전적 변이를 다중 검출하는 방법
Park et al. DNA Microarray‐Based Technologies to Genotype Single Nucleotide Polymorphisms
JP4395363B2 (ja) 核酸検出方法
ZA200207652B (en) Hybridisation beacon and method of rapid sequence detection and discrimination.

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40048081

Country of ref document: HK