KR20170009445A - Pna 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법 - Google Patents

Pna 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acids) 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 유전자인 아멜로제닌(amelogenin)을 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍과 상기 유전자와 혼성화할 수 있는 PNA 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브 및 프라이머 쌍을 이용하면, 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 유전자인 아멜로제닌을 간단하고 신속하게 판별할 수 있으므로 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단에 유용하다.

Description

PNA 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법{Method for Sex Determination and Diagnosing Klinefelter Syndrome Using PNA Probe}
본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acids) 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 유전자인 아멜로제닌(amelogenin)을 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍과 상기 유전자와 혼성화할 수 있는 PNA 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법에 관한 것이다.
클라인펠터 증후군(Klinefelter Syndrome(KS), 47,XXY 핵형(karyotype) 또는 XXY 핵형)은 염색체 비분리 현상으로 발생하는 성염색체이상 질환으로서 남자의 염색체인 46,XY 핵형에서 염색체가 1개 이상 더 있는 상태로 지적 능력, 생식선(sexual gland) 기능 저하 및 신체 발달 이상 등을 초래한다. 클라인펠터 증후군의 발병률은 남아 500~1000명 당 1명 꼴로 나타나는 것으로 알려져 있으며, 이중 핵형 검사로 나타나는 비모자이크(non-mosaicism) 핵형인 47,XXY 핵형, 48,XXXY 핵형, 49,XXXXY 핵형이 80~90%를 차지하며, 나머지 10~20% 정도는 46,XY/47,XXY 핵형, 46,XX/47,XXY 핵형, 46,XX/46,XY/47,XXY 핵형, 46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XX/48,XXXY 핵형, 46,XX/46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XY/49,XXXXY 핵형, 46,XX/49,XXXXY 핵형, 46,XX/46,XY/49,XXXXY 핵형 등의 다양한 모자이크(mosaicism) 핵형이 있을 수 있다. 모자이크 핵형인 경우 신체 일부의 세포는 정상 핵형을 가지고 있으므로 비모자이크 핵형보다 임상적 소견이 경미한 편이다(Visootsak J et al .,Orphanet J Rare Dis 1:42, 2006).
클라인펠터 증후군의 진단은 고환 기능의 저하 및 이차 성징의 이상과 관련된 성염색체에 포함된 유전자를 이용하여 염색체 검사를 수행하게 된다. 이때, 상기 염색체 검사는 핵형 검사를 주로 수행한다. 핵형 검사는 생물의 종, 개체, 세포 고유의 염색체 구성. 염색체의 수 및 형태로 나타내는 것으로, 염색체 각각의 길이와 굵기, 그 수와 위치, 동원체의 위치, 부수체 및 2차 협착의 유무, 응축부가 다른 부분 및 이질염색질부와 진정염색질부, 염색소립, 말단소체의 형태, 크기, 분포, 각종 분염법에 의한 띠모양(band)의 형태와 수, 위치 등을 기준으로 하여 결정한다. 핵형을 도식화한 것은 핵형도라고 한다. 사람의 핵형은 남성은 46,XY, 여성은 46,XX로 나타내며, 염색체 이상이 있는 세포에서는 이상염색체의 번호와 이상의 종류를 기호로 부기한다(파리회의, 1971).
클라인펠터 증후군은 사춘기 이후(일반적으로 만 13세 이상)에 관찰되는 신체적 이상소견으로, 클라인펠터 증후군의 특징인 고환의 기능저하 및 신체의 이상 여부로 진단하므로 다운 증후군 및 터너 증후군에 비해 진단되는 연령이 조금 높다.
한편, 클라인펠터 증후군을 가지는 환자는 다른 염색체 이상의 질환과 달리 정기적인 검진 및 약물 치료만으로도 정상적으로 살아갈 수 있으므로 태아의 조기 검진이 필수적이다. 상기 증후군에 대한 조기 진단 및 관리가 이뤄지지 않을 경우 미세한 학습장애, 정자 생성의 불능, 심장 질환 유발 등과 같은 질환에 대한 증상 및 합병증을 유발할 수 있다.
클라인펠터 증후군의 진단은 세포유전학적 검사(말초혈액 염색체 검사로 47,XXY 핵형 확인), 호르몬 검사(FSH, LH, 에스트라디올(estradiol) 등의 농도 확인) 및 고환 생검(고환의 위축, 무정자증 여부 확인)을 이용한다. 또한, 최근 산전검사법을 이용하여 클라인펠터 증후군 검사를 수행하고 있지만, 정확도가 낮고, 검사 비용이 매우 비싸다.
구강점막상피 유래인 에나멜아(芽) 세포에 의해 형성되는 치아 상아질(齒牙象牙質) 표면을 덮는 경(硬)조직인 에나멜(enamel)은 사기질이라고도 한다. 94~98%가 무기성분이고, 나머지는 단백질 및 수분으로 구성되어 있다. 에나멜 형성(amelogenesis)의 초기 단계에서, 에나멜을 구성하는 단백질의 주성분은 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 단백질인 아멜로제닌(amelogenin)과 에나멜린(enamelin)이고 그 후, 아멜로제닌은 거의 탈각하여 최종적으로 성숙된 에나멜질로 변화한다. 상기 두 단백질은 아멜로블라스틴(ameloblastins), 및 투프텔린(tuftelins) 단백질과 함께 에나멜 형성의 무기화(mineralization)에 관여하는 것으로 보고된 바 있다. 상기 무기화의 무기질은 인산칼슘으로서 히드록시아파타이트(hydroxyapatite)(Ca10(PO4)6(OH)2)인 결정으로 구성되며, 결정입(grain)은 대단히 미소(5nm)하다.
아멜로제닌은 성염색체에 한 카피(copy)씩 이성질체(isomer) 형태로 존재하기 때문에 성염색체에 따른 아멜로제닌 유전자를 이용하면 성별 판별이 가능한다. 성별에 따라, X 아이소형(isoform) 단백질을 코딩하는 X-염색체의 Xp22.1-Xp22.3에 위치하는 AMELX(amelogenin, X-linked) 유전자와 Y 아이소형(isoform) 단백질을 코딩하는 Y-염색체의 Yp 11.2에 위치하는 AMELY(amelogenin, Y-linked) 유전자가 있다(Nakahori Y, et al ., Genomics, 9(2):264-9, 1991; Salido EC et al ., American Journal of Human Genetics, 50(2):303-16).
성염색체 비분리 현상으로 발생되는 질환인 클라인펠터 증후군은 성별을 구분할 수 있는 다양한 유전자들 중 아멜로제닌 유전자를 이용하여 이상 여부를 확인할 수 있다. 아멜로제닌 유전자의 경우 염기서열 분석이 완료되어 X-염색체(X chromosome) 및 Y-염색체(Y chromosome)의 유전적 변이(Single-nucleotide polymorphism, SNP)를 가지며, 이는 클라인펠터 증후군을 확인할 수 있는 중요한 바이오 마커로 활용할 수 있다. 하지만 일반적인 유전적 변이의 염기서열 분석만으로는 성염색체 수의 이상을 확인하기는 불가능하다. 이는 정상인 남성과의 상대적 비율을 이용하여 성별을 구분하기 때문에 기존의 검사법보다 복잡하며 많은 비용이 들어가게 된다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 간편·신속·정확하게 성별 판별 및 클라인펠터 증후군을 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브를 디자인하고, 상기 PNA 프로브를 이용한 혼성화를 통해 얻은 융해곡선을 분석하여, 핵형에 따른 아멜로제닌 유전자 변이를 효율적으로 판별하여 성별 판별 및 클라인펠터 증후군을 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프라이머 쌍, PNA 프로브 및 이를 포함하는 조성물 및 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프리이머 쌍을 이용하여 증폭된 성염색체에 포함된 아멜로제닌(amelogenin) 유전자 부위에 상기 PNA 프로브의 혼성화에 따른 성별 및 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype)에 따른 Tm값을 얻어 성별 판별 및 클라인펠터 증후군을 진단하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 PNA 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 PNA 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; (b) 아멜로제닌(amelogenin) 유전자를 증폭시킬 수 있는 상기 프라이머를 이용하여 상기 유전자를 증폭시키고, 상기 유전자와 혼성화할 수 있는 상기 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선 분석을 통해 성별을 판별하고 클라인펠터 증후군의 유무를 판별하는 단계를 포함하는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브 및 프라이머 쌍을 이용하면, 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 유전자인 아멜로제닌(amelogenin)을 간단하고 신속하게 판별할 수 있으므로 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단에 유용하다.
도 1은 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위한 X- 및 Y-염색체 내 아멜로제닌(amelogenin) 유전자의 염기서열에 따른 프로브 결합위치, 프라이머 결합위치 및 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브의 검증을 위한 DNA 올리고머의 PCR 증폭 조건을 나타낸 것이다.
도 3은 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위한 성염색체 내 아멜로제닌 유전자의 PNA 프로브의 검증 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위한 U-TOPTM 방법의 성염색체 내 아멜로제닌 유전자의 PCR 증폭 및 U-TOPTM을 위한 조건을 나타낸 것이다.
도 5는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위한 아멜로제닌 유전자의 PNA 융해곡선을 나타낸 것이다.
도 6은 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위한 아멜로제닌 유전자의 PNA 융해곡선의 반복실험을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acids) 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype) 판별 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 성염색체의 유전자인 아멜로제닌(amelogenin)을 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍과 상기 유전자와 혼성화할 수 있는 PNA 프로브를 이용한 성별 및 클라인펠터 증후군의 핵형 판별 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는, 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위해 제조(합성)된 PNA 프로브의 검증을 수행하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브를 사용하면 이종의(Heterogeneous) 올리고머(즉, Kline-HE(XY))의 검출이 가능하였으므로 X- 및 Y-염색체의 수적 이상(차이)에 따른 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 판별이 가능할 것으로 추정하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는, U-TOPTM 방법을 이용한 융해곡선 분석을 통한 성염색체의 수적 이상에 따른 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단의 가능 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 사람의 gDNA를 주형으로 PCR 증폭되고, PNA 프로브로 혼성화된 gDNA의 산물을 융해곡선 분석 시 아멜로제닌(amelogenin) 유전자의 염기변이는 성별에 따라 융해온도(Tm)의 차이가 있는 것으로 나타났다. 즉, X-염색체의 해당하는 융해 피크(Melting peak)(65℃)의 형광 값에서 Y-염색체에 해당하는 융해 피크(50℃)의 값을 제외한 값을 이용하면, 대조군의 성별 타입(XX 또는 XY)과 혼합 제조된 클라인펠터 증후군의 타입(XXY 또는 XXXY)을 형광 값(relative fluorescence unit, RFU)과 Tm 값으로 구분할 수 있었다.
표 3 및 표 4에 나타난 바와 같이, 각각의 시료에 대해 X-염색체 및 Y-염색체 융해 피크의 형광 값(RFU)의 차이(Z = X-염색체 형광 값 - Y-염색체 형광 값)를 계산한 결과, 성별 염색체에 따른 Tm에서의 형광 패턴은 유사하였고, 클라인펠터 증후군의 타입을 나타내는 실험군 1(XXY) 및 실험군 2(XXXY)의 형광 값이 대조군 2(XY)보다 증가하는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 토대로, 성별 및 클라인펠터 증후군을 판정하기 위한 기준을 설정하였다. 즉, 대조군(XY)과 실험군(XXY, XXXY) 간의 융해곡선의 차이를 이용하여, X-염색체는 63.0~67.0℃, Y-염색체는 48.0~52.0℃에서의 핵형에 따른 융해온도 범위에서의 PNA 프로브로 혼성화된 반응물의 형광 값(relative fluorescence unit, RFU)을 수학식 1에 대입하여 성별의 확인 및 클라인펠터 증후군의 존재 여부를 확인(진단)하였다.
[수학식 1]
Q(%) = ((｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜)/X-염색체 RFU) X 100
여기서, Q(%)는 X-염색체 비율임;
｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜의 값은 절대값임;
Q = 100 %일 경우, 정상 여성(XX);
0 % < Q < 10.0 %일 경우, 정상 남성(XY);
15.0 % < Q < 100 %일 경우, 클라인펠터 증후군(XXY 핵형 또는 XXXY 핵형)으로 진단함.
결국, 아멜로제닌(amelogenin) 유전자의 염기변이 64C>T를 표적으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브를 사용하여 아멜로제닌 특유 유전자 증폭용 프라이머로 증폭된 방응물의 염색체별 융해온도 범위에서의 증폭량(형광량)으로 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1로 표시되는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브에 관한 것이다.
사람의 성별은 성염색체 상의 아멜로제닌 유전자를 이용하면 판별할 수 있다. 아멜로제닌 유전자의 염기서열은 유전자은행(GenBank)에서 확인할 수 있으며, 남성의 경우 Y-염색체에 존재하는 AMELY(amelogenin, Y-linked, HUMAMELY) 유전자를, 여성의 경우 X-염색체에 존재하는 AMELX(amelogenin, X-linked, HUMAMELX) 유전자를 이용하면 성별을 확인할 수 있다. 본 명세서에서 A(adenine), T(thymine), G(guanine) 및 C(cytosine)는 뉴클레오티드(nucleotide)의 기호를 나타낸 것이며, 본 명세서에서 사용되는 아멜로제닌 유전자의 '64C>T' 염기변이는, X-염색체 상에서 64번째 염기인 C(cytosine)를 나타내고, 이에 대한 염기변이로 Y-염색체 상에서 70번째 염기인 T(thymine)를 나타낸 것이다(도 1 참조). 따라서, '64C>T' 염기변이의 양상을 이용하면 성별의 판별이 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 아멜로제닌(amelogenin) 유전자와 혼성화하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 PNA 프로브는 아멜로제닌 유전자의 64C>T 염기변이가 포함된 부위와 혼성화하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter) 및/또는 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하며, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하고, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype)은 47,XXY 핵형, 48,XXXY 핵형, 49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 비모자이크(non-mosaicism) 핵형, 또는 46,XY/47,XXY 핵형, 46,XX/47,XXY 핵형, 46,XX/46,XY/47,XXY 핵형, 46,XY/48,XXX 핵형, 46,XX/48,XXXY 핵형, 46,XX/46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XY/49,XXXXY 핵형, 46,XX/49,XXXXY 핵형, 46,XX/46,XY/49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 모자이크(mosaicism) 핵형인 것을 특징으로 할 수 있다.
펩티드핵산(peptide nucleic acid: PNA)은 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Mopholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식물질의 하나로 인공적으로 합성하며, 기본 골격이 포리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. 또한, DNA-DNA 결합력보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 뉴클레오티드 미스 매치(nucleotide miss match)에도 10~15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 및 In/Del의 뉴클레오티드(nucleotide)의 변화를 검출(detection) 할 수 있게 된다.
본 발명의 '표적 핵산', '합성 DNA' 또는 '인공합성 올리고'는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열(SNP 포함)을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석(Fluorescence Melting Curve Analysis; FMCA)을 통하여 표적 핵산의 염기 변성(SNP 포함) 유무를 검출할 수 있다.
PNA 프로브의 뉴클레오티드와 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 뉴클레오티드의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 애플리케이션(application)의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 가수분해방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화방법(hybridization method)를 이용하여 분석하며 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 비컨 프로브(molecular beacon probe), 스코피언 프로브(scorpion probe)가 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프라이머 쌍에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프리이머 쌍은 아멜로제닌(amelogenin) 유전자를 증폭시키는 데 이용되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 프리이머 쌍은 아멜로제닌 유전자의 64C>T 염기변이가 포함된 부위를 증폭시키는 데 이용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype)은 47,XXY 핵형, 48,XXXY 핵형, 49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 비모자이크(non-mosaicism) 핵형, 또는 46,XY/47,XXY 핵형, 46,XX/47,XXY 핵형, 46,XX/46,XY/47,XXY 핵형, 46,XY/48,XXX 핵형, 46,XX/48,XXXY 핵형, 46,XX/46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XY/49,XXXXY 핵형, 46,XX/49,XXXXY 핵형, 46,XX/46,XY/49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 모자이크(mosaicism) 핵형인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 PNA 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 PNA 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; (b) 아멜로제닌(amelogenin) 유전자를 증폭시킬 수 있는 상기 프라이머를 이용하여 상기 유전자를 증폭시키고, 상기 유전자와 혼성화할 수 있는 상기 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선 분석을 통해 성별을 판별하고 클라인펠터 증후군의 유무를 판별하는 단계를 포함하는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단 방법에 관한 것이다.
혼성화에 따른 분석 방법으로는 U-TOPTM 방법 및 MeltingArrayTM 방법으로 형광의 융해곡선을 이용한 분석방법(Fluorescence Melting Curve Analysis: FMCA), 즉 PCR(Polymerase Chain Reaction)이 종료한 후 생성된 산물과 첨가된 PNA 프로브간의 결합력의 차이를 Tm으로 판별하여 분석한다. 다른 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 검출용 프로브와는 다르게 프로브 디자인이 매우 간편하여 SNP를 포함하는 9~15mer의 염기서열을 이용하여 제작한다. 따라서 원하는 Tm값을 가지는 프로브를 디자인하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm값을 조절하거나 같은 길이의 PNA 프로브라도 프로브에 변화를 주어 Tm값을 조절할 수 있다. PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM(High resolution melting) 방법과는 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 작아 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되어 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어려운 반면 PNA 프로브의 프로브 서열은 SNP에 대해서 영향을 받지 않아 분석이 가능하다.
PNA 프로브를 이용한 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 분석을 위해서는 우선 SNP를 포함하는 부분의 염기를 이용한 프로브와 PCR을 위한 정방향/역방향(Forward/Reverse) 프라이머 세트만 있으면 충분하다. 상기 PCR 조건은 기존의 방법을 사용가능하며 PCR이 끝난 후 융해(melting) 과정이 필요하고 0.5℃ 씩 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여 Tm값을 얻는다. 특히 일반적인 실시간 PCR(real-time PCR) 장치는 널리 보급되어 있으며 HRM(High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.
본 발명의 융해곡선 분석은 표적 핵산인 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해 곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 목적의 변이(SNP 포함)를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 점돌연변이(SNP 포함)의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 점돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 돌연변이(SNP 포함)가 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값 보다 낮으면, 미스매치, 즉 표적 DNA에 변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.
본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아멜로제닌(amelogenin) 유전자는 64C>T 염기변이를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 PNA 프로브는 리포터 및 소광자 중에서 어느 하나 이상이 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype)은 47,XXY 핵형, 48,XXXY 핵형, 49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 비모자이크(non-mosaicism) 핵형, 또는 46,XY/47,XXY 핵형, 46,XX/47,XXY 핵형, 46,XX/46,XY/47,XXY 핵형, 46,XY/48,XXX 핵형, 46,XX/48,XXXY 핵형, 46,XX/46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XY/49,XXXXY 핵형, 46,XX/49,XXXXY 핵형, 46,XX/46,XY/49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 모자이크(mosaicism) 핵형인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "검체 시료"는 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료(biosample)가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 검체 시료는, 바람직하게는, 인간의 객담, 혈액, 타액 또는 소변으로부터 유래된 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시간 PCR 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 정상 대조군과 돌연변이(SNP 포함) 사이에서 염기서열의 변이 유무를 분석할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 X-염색체: 63.0~67.0℃ 및 Y-염색체: 48.0~52.0℃의 핵형 융해온도 범위에서의 PNA 프로브로 혼성화된 반응물의 형광 값(relative fluorescence unit, RFU)을 하기 수학식 1에 대입하여 계산하는 방법을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
[수학식 1]
Q(%) = ((｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜)/X-염색체 RFU) X 100
여기서, Q(%)는 X-염색체 비율임;
｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜은 절대값임;
Q = 100 %일 경우, 정상 여성(XX);
0 % < Q < 10.0 %일 경우, 정상 남성(XY);
15.0 % < Q < 100 %일 경우, 클라인펠터 증후군(XXY 핵형 또는 XXXY 핵형)으로 진단함.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프로브의 제조
성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 성염색체의 유전자인 아멜로제닌(amelogenin)의 X- 또는 Y-염색체 특이적인 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 염기서열을 검출할 수 있는 1쌍의 프라이머와 PNA(Peptide Nucleic Acids) 프로브를 제조하였다. 또한, 상기 PNA 프로브를 검증하기 위해, PNA 프로브의 염기서열에 상보적인 DNA 올리고머를 제조하였다(표 1).
상기 PNA 프로브는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위하여 직접 설계하였고, 표적 핵산과의 효과적인 결합을 위해 PNA 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다. 특히 염기의 변이 부분(SNP)은 보통 표적 핵산과 5℃ 이상 융해온도(Tm)차이가 나도록 PNA 프로브 결합부위 중앙에 위치하도록 디자인하였고, 융해온도(Tm)의 최적화를 위해 표적 핵산과 PNA 프로브가 결합하는 염기서열의 중앙에 아멜로제닌 유전자 염기서열과 상보적 결합이 일어날 수 있도록 제작하였다.
상기 PNA 프로브는 형광물질(FAM-labeled, Dabcyl)로 표지한 다음, HPLC 정제방법을 통해 합성하였고(Panagene, 한국), 상기 합성된 PNA 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였다.
하기 표 1은 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브, 프라이머 및 PNA 프로브의 검증을 위한 DNA 올리고머 염기서열을 나타낸 것이다. 표 1에서 O는 링커 및 K는 라이신(lysine)을 나타낸 것이다.
Figure pat00001
표 1에 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 성염색체의 유전자인 아멜로제닌의 특이 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 사이트를 타입으로 나타내었다. 각 염기의 번호는 아멜로제닌의 유전자 로커스(locus)의 대립인자(allele)를 기준으로 작성하였으며, PNA 프로브가 퍼펙트 매치(perfect match)를 나타내도록 유도하여 제작하였다(도 1 참조).
실시예 2: 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위해 제조된 PNA 프로브의 검증
성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위해 실시예 1에서 제조(합성)된 PNA 프로브가 표적 핵산(예: 검출시료 gDNA(genomic DNA))에 대해 제대로 작동할 수 있는지 검증하기 위하여, 상기 PNA 프로브의 염기서열에 상보적인 DNA 올리고머를 사용하였다(표 1). 상기 DNA 올리고머는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군을 진단할 수 있게, 여성(XX)의 경우 Kline-PM(Perfect Match)(XX)을 사용하고, 남성(XY)의 경우 Kline-PM(XX)과 Kline-MM(Mismatch)이 동량으로 혼합된 이종의(Heterogeneous) 올리고머(즉, Kline-HE(XY))를 사용하여 검증하였다.
성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위해 제조된 PNA 프로브의 검증을 위해서, 상기 DNA 올리고머 및 PNA 프로브를 혼합하여 융해곡선 분석 장비인 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 PNA 프로브의 검증을 수행하였다. 더욱 상세하게는, 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X MeltingArray 버퍼(2X MeltingArray Buffer, 시선바이오머티리얼스, 한국) 10㎕, DNA 올리고머 2.5pmol/1㎕, PNA 프로브 10pmol/0.5㎕, 증류수 8.5㎕를 혼합한 다음, 도 2의 리얼타임 PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) 조건에서, 융해곡선 형광을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 제조(합성)된 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브를 사용하면 이종의(Heterogeneous) 올리고머(즉, Kline-HE(XY))의 검출이 가능하였으므로 X- 및 Y-염색체의 수적 이상(차이)에 따른 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 판별이 가능할 것으로 추정하였다.
실시예 3: U- TOP TM 방법을 이용한 융해곡선 분석을 통한 성염색체의 수적 이상(차이)에 따른 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단
실시예 1에서 제조된 PNA 프로브 및 표적 핵산(예: 검출시료 gDNA(genomic DNA))을 이용하여 융해곡선 분석을 수행하고자 하였다. 우선 검출가능한 표적 핵산을 생성하기 위하여 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 단일가닥 표적 핵산을 생성하기 위해 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 도 4의 조건으로 수행하였다. 더욱 상세하게는, 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 프리믹스 버퍼(2X SSB qPCR PreMix buffer, 시선바이오머티리얼스, 한국), 2.5mM MgCl2, 200μM dNTPs, 1.0 U Taq polymerase, forward 프라이머 및 reverse 프라이머 0.5㎕/10pmol, 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프로브 0.5㎕, 3㎕ 인간 DNA(또는 표적 핵산)를 첨가한 다음 리얼타임 PCR을 수행하였다. 클라인펠터 증후군의 염색체 수적 이상을 재현하기 위한 시료는 정상인 여성(대조군 1: XX)과 남성(대조군 2: XY)의 gDNA를 수득한 다음, NanoDrop spectrophotometer(Thermo Scientific, 미국)으로 최종 15ng/1㎕의 농도가 되도록 제조하여 사용하였다(표 2).
하기 표 2는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위한 gDNA 시료의 조성 조건을 나타낸 것이다.
Figure pat00002
리얼타임 PCR 과정은, 도 4에 나타난 바와 같이, 95℃에서 10분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 60℃에서 45초, 73℃에서 25초 동안 반응시켰으며, 이를 36 사이클 반복하였고, 실시간으로 형광을 측정하였다. 융해곡선 분석은 95℃에서 5분간 변성 단계를 거친 다음, 35℃에서 5분간 혼성화 시킨 후, 40℃에서 80℃까지 0.5℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 용해곡선 분석을 수행하였다. 각 단계 사이마다 0.5초간 정지 상태를 유지하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 사람의 gDNA를 주형으로 PCR 증폭되고, PNA 프로브로 혼성화된 gDNA의 산물을 융해곡선 분석 시 아멜로제닌(amelogenin) 유전자의 염기변이는 성별에 따라 융해온도(Tm)의 차이가 있는 것으로 나타났다. 즉, X-염색체의 해당하는 융해 피크(Melting peak)(65℃)의 형광 값에서 Y-염색체에 해당하는 융해 피크(50℃)의 값을 제외한 값을 이용하면, 대조군의 성별 타입(XX 또는 XY)과 혼합 제조된 클라인펠터 증후군의 타입(XXY 또는 XXXY)을 형광 값(relative fluorescence unit, RFU)과 Tm 값으로 구분할 수 있다.
표 3에 나타난 바와 같이, 각각의 시료에 대해 X-염색체 및 Y-염색체 융해 피크의 형광 값(RFU)의 차이(Z = X-염색체 형광 값 - Y-염색체 형광 값)를 계산한 다음, 대조군 2(XY)와 비교해보면, 실험군 1(XXY)의 경우 형광 값의 차이가 약 45 RFU로, 실험군 2(XXXY)의 경우 약 69 RFU로 나타나 성염색체의 수적 이상에 따른 특정 융해온도에서니 형광 값의 차이가 있음을 확인하였다.
하기 표 3은 PNA 프로브를 이용한 성별 및 클라인펠터 증후군 시료의 형광 값을 나타낸 것이다.
Figure pat00003
한편, 표 4에 나타난 바와 같이, 각각의 시료에 대해 3회 반복실험을 통하여 결과의 재현성을 확인한 결과, 각각의 시료로부터 유래된 성별 염색체에 따른 Tm에서의 형광 패턴은 유사하였고, 클라인펠터 증후군의 타입을 나타내는 실험군 1(XXY) 및 실험군 2(XXXY)의 형광 값이 대조군 2(XY)보다 증가하는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 토대로, 성별 및 클라인펠터 증후군을 판정하기 위한 기준을 설정하였다. 즉, 대조군과 실험군 간의 융해곡선의 차이를 이용하여, X-염색체는 63.0~67.0℃, Y-염색체는 48.0~52.0℃에서의 핵형에 따른 융해온도 범위에서의 형광 값(relative fluorescence unit, RFU)을 수학식 1에 대입하여 성별을 판별하고 클라인펠터 증후군의 존재 여부를 진단하였다.
[수학식 1]
Q(%) = ((｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜)/X-염색체 RFU) X 100
여기서, Q(%)는 X-염색체 비율임;
｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜은 절대값임;
0 % < Q < 10.0 %일 경우, 정상 남성;
Q > 15.0 %일 경우, 클라인펠터 증후군(XXY 핵형 또는 XXXY 핵형)으로 진단함.
하기 표 4는 3번 반복된 재현 실험에서의 PNA 프로브를 이용한 성별 및 클라인펠터 증후군 시료의 형광 값을 나타낸 것이다.
Figure pat00004
한편, 본 발명의 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법은 절대값으로 염색체 수적 이상(차이)의 확인은 불가능하고, 대조군 2(XY)와의 비교를 통한 상대값으로 클라인펠터 증후군의 유무를 진단하기 때문에 3대의 CFX96™ Real-Time 시스템 기계를 각각 사용하여 반복실험을 수행함으로써 기계 간 발생할 수 있는 오류를 최소화하고 실험의 재현성을 확인하고자 하였다.
그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, CFX96™ Real-Time 시스템 기계별 시료 테스트 수행 시, 클라인펠터 증후군의 타입을 나타내는 실험군 1(XXY) 및 실험군 2(XXXY)의 경우 전체 성염색체 중 X-염색체가 차지하는 % 비율(Q)이 대조군 2(XY)보다 더 높게 나타나는 것을 형광 값으로 확인하였다. 따라서, CFX96™ Real-Time 시스템 기계에 따른 형광 값은 조금씩 다르지만 전체 성염색체 중 X-염색체의 함유량에 따른 % 비율(Q)은 유사하게 증가하였다.
하기 표 5는 3대의 CFX96™ Real-Time 시스템 기계들을 이용한 성별 및 클라인펠터 증후군 시료의 형광 값을 나타낸 것이다.
Figure pat00005
한편, PNA 프로브 농도에 변화를 가하여, 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단이 가능한지 확인하였다. 그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, PNA 프로브 농도에 따른 X-염색체의 비율(Q)의 변화는 크게 없었고, X-염색체의 비율(Q)은 X-염색체의 수적 이상에 따라 증가하였다.
하기 표 6은 PNA 프로브 농도에 따른 성별 및 클라인펠터 증후군 시료의 X-염색체 비율(Q)을 나타낸 것이다.
Figure pat00006
실시예 4: 염기변이와 융해온도에 따른 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단
실시예 3의 U-TOPTM 결과로 확인된 Tm값을 표 4에 나타내었다. 즉, PM(Perfect Match), MM(Mismatch), 또는 PM 및 MM이 동시에 존재 시 온도의 ±2℃ 범위를 만들고 이 범위 안에 포함되면 각각의 문자로 표기하여 고유의 표기법을 가지도록 하였다.
실시예 3의 U-TOPTM 결과로 확인된 Tm 값을 표 7에 나타내었다. PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석에 따른 X- 및 Y-염색체의 Tm(℃) 값을 ±2℃ 범위로 설정하고, 이 범위 안에 포함되는 대조군과 실험군의 염색체 타입에 따른 형광 값(RFU)을 공식(수학식)에 대입하여 산출된 값을 기준으로 성별을 판별하고 클라인펠터 증후군 여부를 진단할 수 있도록 하였다.
하기 표 7은 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브의 융해온도 범위와 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위해 X-염색체의 % 비율(Q)을 구하는 공식이 포함된 판정표를 나타낸 것이다.
Figure pat00007
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Seasunbiomaterials <120> Method for Sex Determination and Diagnosing Klinefelter Syndrome Using PNA Probe <130> P15-B183 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klinefelter-P <400> 1 tcctaccacc agcttc 16 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klinefelter- F <400> 2 ccctgggctc tgtaaagaat agtg 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klinefelter- R <400> 3 aggcttgagg ccaaccatca g 21 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kline-PM (XX) <400> 4 gaagctggtg gtagga 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kline-MM <400> 5 gaagctgatg gtagga 16

Claims (20)

  1. 서열번호 1로 표시되는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브.
  2. 제1항에 있어서, 아멜로제닌(amelogenin) 유전자와 혼성화하는 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브.
  3. 제1항에 있어서, 아멜로제닌 유전자의 64C>T 염기변이가 포함된 부위와 혼성화하는 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브.
  4. 제1항에 있어서, 리포터 및 소광자 중에서 어느 하나 이상이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브.
  5. 제4항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브.
  6. 제4항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브.
  7. 제1항에 있어서, 상기 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype)은 47,XXY 핵형, 48,XXXY 핵형, 49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 비모자이크(non-mosaicism) 핵형, 또는 46,XY/47,XXY 핵형, 46,XX/47,XXY 핵형, 46,XX/46,XY/47,XXY 핵형, 46,XY/48,XXX 핵형, 46,XX/48,XXXY 핵형, 46,XX/46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XY/49,XXXXY 핵형, 46,XX/49,XXXXY 핵형, 46,XX/46,XY/49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 모자이크(mosaicism) 핵형인 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프로브.
  8. 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프라이머 쌍.
  9. 제8항에 있어서, 아멜로제닌(amelogenin) 유전자를 증폭시키는 데 이용되는 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프라이머 쌍.
  10. 제8항에 있어서, 아멜로제닌 유전자의 64C>T 염기변이가 포함된 부위를 증폭시키는 데 이용되는 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프라이머 쌍.
  11. 제8항에 있어서, 상기 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype)은 47,XXY 핵형, 48,XXXY 핵형, 49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 비모자이크(non-mosaicism) 핵형, 또는 46,XY/47,XXY 핵형, 46,XX/47,XXY 핵형, 46,XX/46,XY/47,XXY 핵형, 46,XY/48,XXX 핵형, 46,XX/48,XXXY 핵형, 46,XX/46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XY/49,XXXXY 핵형, 46,XX/49,XXXXY 핵형, 46,XX/46,XY/49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 모자이크(mosaicism) 핵형인 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프라이머 쌍.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 PNA 프로브 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 프라이머 쌍을 포함하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 조성물.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 PNA 프로브 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 프라이머 쌍을 포함하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 키트.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 PNA 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단 방법.
  15. 다음 단계를 포함하는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단 방법:
    (a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
    (b) 아멜로제닌(amelogenin) 유전자를 증폭시킬 수 있는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 프라이머를 이용하여 상기 유전자를 증폭시키고, 상기 유전자와 혼성화할 수 있는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 PNA 프로브로 혼성화된 반응물의 융해곡선 분석을 통해 성별을 판별하고 클라인펠터 증후군의 유무를 판별하는 단계.
  16. 제15항에 있어서, 상기 아멜로제닌 유전자는 64C>T 염기변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype)은 47,XXY 핵형, 48,XXXY 핵형, 49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 비모자이크(non-mosaicism) 핵형, 또는 46,XY/47,XXY 핵형, 46,XX/47,XXY 핵형, 46,XX/46,XY/47,XXY 핵형, 46,XY/48,XXX 핵형, 46,XX/48,XXXY 핵형, 46,XX/46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XY/49,XXXXY 핵형, 46,XX/49,XXXXY 핵형, 46,XX/46,XY/49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 모자이크(mosaicism) 핵형인 것을 특징으로 하는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단 방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단 방법.
  20. 제15항에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 X-염색체: 63.0~67.0℃ 및 Y-염색체: 48.0~52.0℃의 핵형 융해온도 범위에서의 PNA 프로브로 혼성화된 반응물의 형광 값(relative fluorescence unit, RFU)을 하기 수학식 1에 대입하여 계산하는 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단 방법.
    [수학식 1]
    Q(%) = ((｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜)/X-염색체 RFU) X 100

    여기서, Q(%)는 X-염색체 비율임;
    ｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜의 값은 절대값임;
    Q = 100 %일 경우, 정상 여성(XX);
    0 % < Q < 10.0 %일 경우, 정상 남성(XY);
    15.0 % < Q < 100 %일 경우, 클라인펠터 증후군(XXY 핵형 또는 XXXY 핵형)으로 진단함.
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