KR102061896B1 - 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별용 pna 프로브 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별방법 - Google Patents
소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별용 pna 프로브 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 소 바이러스성 설사 바이러스 유전자 타입에 따라 혼성화 여부가 상이한 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브와 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별방법에 관한 것으로, 본 발명은 종래 방법으로 용이하게 구분하기 어려웠던 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형을 한 번의 실험으로 신속, 정확하게 검출할 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별용 PNA 프로브 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 소 바이러스성 설사 바이러스 유전자 타입에 따라 혼성화 여부가 상이한 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브와 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브 및 이들 PNA 프로브가 검체 시료와 혼성화된 후 융해될 때 관찰되는 융해 피크를 분석하여 소 바이러스성 설사 바이러스 유전자가 1형 유전형인지 2형 유전형인지 판별하기 위한 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별방법에 관한 것이다.
소 바이러스성 설사병은 소 바이러스성 설사 바이러스 (bovine viral diarrhea virus, BVDV)가 감염되어 호흡기 증상, 설사, 수태율 감소, 유산, 지속감염우 출산 등으로 인한 심각한 경제적 손실을 유발하는 바이러스성 전염병이다. 소 바이러스성 설사 병원체는 돼지의 classical swine fever virus (CSFV)와 면양의 border disease virus (BDV)와 함께 플라비비리대과 (Flaviviridae family)의 페스티바이러스속 (Pestivirus genus)에 속하는 소 바이러스성 설사 바이러스(bovine viral diarrhea virus, BVDV)로서, 이와 같은 소 바이러스성 설사병이 발생할 경우 생산성 저하 및 경제적 피해를 야기시킨다.
특히 암소는 비세포변성형 바이러스가 생식기에 감염될 경우 태아감염으로 진행되며 감염된 임신 시기에 따라 배아 사망으로 인한 재발정, 유산, 사산, 선천성 기형 송아지의 출산과 지속적인 농장의 감염을 일으키는 지속감염 송아지를 출산하게 되는데 생존한 지속감염우는 BVD 바이러스에 면역관용 상태로, 살아있는 동안 지속해서 바이러스를 배출하게 되며, BVD의 주요 전파요인으로 농장 내 BVD 근절을 위해 가장 먼저 색출하여야 한다.
현재 BVD의 근절 또는 통제를 위한 수단으로 백신 및 감염원의 조기 색출을 통한 우군 내 BVD 발생을 예방하는 것이 가장 효과적인 방법으로 대두되고 있으며, 우군 내 주 감염원인 지속감염우의 효과적인 진단을 위해 PCR, IHC, ELISA 등의 다양한 진단법들이 이용되고 있다.
BVDV는 바이러스의 유전형 (genotype)에 따라 BVDV-1과 BVDV-2로 구분되며, 국내에는 이 2가지 타입의 바이러스에 의한 발생보고가 있어(Vet immunol immunopathol 2013,15;156(1-2):147-52., J Vet Diagn Invest. 2010,22:518-23), 질병 진단시 바이러스 타입의 구분에 따른 농장내 발생상황 조사, 변이주 발생여부 확인 및 치료에 유전형 분석이 필요하다고 할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형을 판별할 수 있는 신규한 PNA 프로브를 동정하고, 상기 PNA 프로브를 이용하면 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형을 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 판별할 수 있는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Vet immunol immunopathol 2013,15;156(1-2):147-52., Pathogenetic differences after experimental infection of calves with Korean non-cytopathic BVDV-1 and BVDV-2 isolates.
J Vet Diagn Invest. 2010,22:518-23, Characterization and phylogenetic analysis of bovine viral diarrhea virus in brain tissues from nonambulatory (downer) cattle in Korea.
본 발명의 목적은 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형 판별용 PNA 프로브를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형 판별용 조성물 및 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형 판별방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 1형 유전형 판별용 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 2형 유전형 판별용 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 2 종의 PNA 프로브를 포함하는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형 판별용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형 판별방법을 제공한다.
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
(b) 상기 표적 핵산에 포함된 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)를 주형으로, 프라이머 쌍을 이용하여 증폭된 서열단편을 생성시키는 단계;
(c) 상기 증폭된 서열단편을 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계;
(d) 상기 혼성화된 산물의 온도를 높이며 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및
(e) 상기 융해곡선에서 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해 피크가 관찰되면 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 1형 유전형으로 판별하고, 상기 융해곡선에서 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해 피크가 관찰되면 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 2형 유전형으로 판별하는 단계.
본 발명은 종래 방법으로 용이하게 구분하기 어려웠던 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형을 한 번의 실험으로 신속, 정확하게 검출할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 소 바이러스성 설사 바이러스 표적 핵산의 선택적 증폭을 위한 프라이머 검증 실험 조건을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 소 바이러스성 설사 바이러스 표적 핵산의 선택적 증폭을 위한 프라이머 검증 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별을 위한 PNA 프로브의 검증 실험 조건을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별을 위한 PNA 프로브의 검증 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 프라이머를 이용한 실험 조건을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 46종의 BVDV 균주를 검출한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용한 실험 조건을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용하여 BVDV를 분석하는 증폭 곡선, 융해 곡선, 융해 피크를 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용하여 46종의 BVDV의 유전형을 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용하여 CSFV의 융해 피크를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 소 바이러스성 설사 바이러스 표적 핵산의 선택적 증폭을 위한 프라이머 검증 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별을 위한 PNA 프로브의 검증 실험 조건을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별을 위한 PNA 프로브의 검증 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 프라이머를 이용한 실험 조건을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 46종의 BVDV 균주를 검출한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용한 실험 조건을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용하여 BVDV를 분석하는 증폭 곡선, 융해 곡선, 융해 피크를 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용하여 46종의 BVDV의 유전형을 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용하여 CSFV의 융해 피크를 확인한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)는 그 유전형에 따라 사용할 수 있는 백신이 상이하다. 또한, 바이러스 유전형에 따라 여러 가지 아형(subtype)으로 구분되기 때문에, 일단 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)에 의한 질환이 발병하면 그 유전형을 명확히 판별하여야 해당 바이러스의 확산을 조기에 차단할 수 있다. 또한 실험실 진단시 바이러스 오염으로 인한 위양성 진단이 쉽게 이루어지므로, 이를 방지하기 위해서는 정확한 정성분석이 필요하다. 이에, 본 발명에서는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)의 유전형을 간단하고 신속하며 정확하게 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 하였고, 그 결과 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)의 유전형에 따라 특이적으로 융해 피크를 나타내는 두 개의 PNA 프로브를 이용하면 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)의 유전형을 간단하고 신속하며 정확하게 판별할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 1형 유전형 판별용 PNA 프로브 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 2형 유전형 판별용 PNA 프로브에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 PNA 프로브는 하나의 말단에 리포터(reporter)가 결합되어 있고 다른 말단에 상기 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자가 결합되어 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.
펩티드핵산(Peptide nucleic acid, PNA)이란 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로, 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었으며, 자연계에서는 발견되지 않아 화학적인 방법으로 인공 합성될 수 있다.
PNA는 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Mopholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식물질의 하나로, 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는 장점이 있다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.
PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, PNA는 단일 염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중 가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다
또한, DNA-DNA 결합력보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 뉴클레오티드 미스 매치(nucleotide miss match)에도 10~15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 및 In/Del의 뉴클레오티드(nucleotide)의 변화를 검출(detection)할 수 있게 된다.
본 발명에 따른 PNA 염기서열의 길이는 특별히 제한되지는 않지만, 바이러스 종류에 따른 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP))이 포함되도록 10~18mer 길이로 제작할 수 있다. 이 때, PNA 프로브의 길이를 조절하여 원하는 Tm값을 가지도록 PNA 프로브를 디자인할 수도 있고, 같은 길이의 PNA 프로브라도 염기서열에 변화를 주어 Tm값을 조절하는 것도 가능하다. 또한, PNA 프로브는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 염기변이 또는 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM(High Resolution Melt) 방법에 의하면 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어서 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도 변화 또는 보정을 필요로 하고, 이 때문에 2개 이상의 염기변이 또는 SNP가 나타날 경우에는 분석이 어려웠지만, 본 발명에 따른 PNA 프로브는 PNA 프로브의 서열과 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 간편하게 분석이 가능하다.
예를 들어, PNA 프로브가 12개의 염기서열을 포함하는 경우에는, 가운데 염기서열 중 하나 이상의 위치에 바이러스의 염기변이 또는 SNP 부위에 상응하는 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, PNA 프로브는 염기서열의 가운데 부분에 바이러스의 염기변이 또는 SNP 부위에 상응하는 서열을 포함하여 구조적인 변형을 가질 수 있고, 이를 통해 완전한 혼성화를 이루는 표적 핵산(perfect match)과의 융해온도(Tm) 차이를 더욱 크게 할 수 있다.
한편, 본 발명에서는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형 판별용 PNA 프로브와 혼성화하는 표적 핵산을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍과 2 종의 유전형 판별용 PNA 프로브를 함께 포함하는 조성물을 사용하면 한 번의 간단한 실험으로 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형을 판별할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 포함하는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형 판별용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물 및 키트는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 서열 단편 증폭용 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이에 한정되지는 않으나, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머와 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브는 각각 서로 상이한 리포터가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있는데, 이는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 하나의 튜브에 넣고 반응시킬 때, 융해 곡선과 융해 피크를 좀 더 명확히 구별하기 위한 것이므로, 융해 곡선과 융해 피크의 명확한 구별이 가능하다면 동일한 리포터와 소광자를 사용하여도 무방할 것이다.
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
상기 키트를 이용하면, PNA 프로브에 의한 용해곡선 분석을 통하여 오염 여부를 포함하여 표적 핵산의 유전형까지 효과적으로 검출할 수 있고, 이를 통하여 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형 판별이 정확히 가능하다.
소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형 판별은 도 7에 도시된 실험 조건에서와 같이, 표적 핵산을 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머와 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하고, 증폭된 서열단편을 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브 또는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브와 혼성화시킨 후, 그 융해곡선을 확인한 결과, 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 1형 유전형의 경우 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브와 혼성화된 후 융해 피크를 나타내고, 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 2형 유전형의 경우 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브와 혼성화된 후 융해 피크를 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서 다음 단계를 포함하는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형을 판별할 수 있는 방법에 관한 것이다.
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
(b) 상기 표적 핵산에 포함된 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)를 주형으로프라이머 쌍을 이용하여 증폭된 서열단편을 생성시키는 단계;
(c) 상기 증폭된 서열단편을 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계;
(d) 상기 혼성화된 산물의 온도를 높이며 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및
(e) 상기 융해곡선에서 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해 피크가 관찰되면 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 1형 유전형으로 판별하고, 상기 융해곡선에서 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해 피크가 관찰되면 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 2형 유전형으로 판별하는 단계.
본 발명에 있어서, 이에 한정되지는 않으나, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머와 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "검체 시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 소 등)로부터 분리된 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 '표적 핵산', '합성 DNA' 또는 '인공합성 올리고'는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열(염기변이 또는 SNP 포함)을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 염기 변성(염기변이 또는 SNP 포함) 유무를 검출할 수 있다. 상기 PNA 프로브는 표적 핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적 핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것이 특징이다.
본 발명의 '염기변이'는 표적 핵산의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 PNA 프로브는 표적 핵산의 SNP 또는 표적 핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 융해곡선 분석을 통해 분석할 수 있다.
PNA 프로브의 뉴클레오티드와 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 뉴클레오티드의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 애플리케이션(application)의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 가수분해방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화방법(hybridization method)를 이용하여 분석하며 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 비컨 프로브(molecular beacon probe), 스코피언 프로브(scorpion probe)가 있다.
PNA 프로브를 이용한 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 SNP) 분석을 위해서는 우선 특정 염기서열을 인식하는 염기(들)가 포함된 프로브와 PCR을 위한 정방향/역방향(Forward/Reverse) 프라이머 세트(종래 프라이머 쌍: OIE(Office of International Epizootics, 세계동물보건기구) 기준에 따름) 및 상기 프라이머 세트에 의해 증폭된 유전자 마커 염기서열을 주형(template)으로 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 프라이머만 있으면 충분하다. 상기 PCR 조건은 기존의 방법을 사용가능하며 PCR이 끝난 후 융해(melting) 과정이 필요하고 0.5℃ 씩 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여 Tm값을 얻는다. 특히 일반적인 실시간 PCR(real-time PCR) 장치는 널리 보급되어 있으며 HRM(High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.
본 발명의 융해곡선 분석은 표적 핵산인 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 대상(표적)의 특정 염기서열(염기변이 또는 SNP 포함)에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 특정 염기서열의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 검출 대상의 특정 염기서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 특정 염기서열이 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값 보다 낮으면, 미스매치, 즉 표적 DNA에 변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.
본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.
본 발명의 리얼타임 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 특정 염기서열(염기변이, SNP 포함)의 유무로 바이러스 유형의 검출 및/또는 판별이 가능하여 위양성의 가능성을 낮출 수 있다..
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1.
BVDV
검출 및
유전형 구분용
프라이머
및
프로브의
제조
BVDV 검출 및 유전형 구분을 위한 프라이머 및 프로브의 제작을 위해, NCBI 염기서열 분석을 진행하였으며, 추가적으로 특이도를 높이기 위하여 염기서열이 유사한 CSFV, BDV 바이러스와 함께 분석을 진행하였다. 분석을 진행하여 BVDV 검출 및 유전형 구분이 가능한 프라이머를 도출하였으며, 상기 프라이머를 이용한 증폭산물 안에서 PNA 프로브를 도출하고, 이를 표 1에 나타내었다.
표 1에 기재된 프라이머는 코스모진텍(한국)에 의뢰하여 제작하였으며, PNA 프로브는 파나진(한국)에 의뢰하여 제작하였다. PNA 프로브는 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였고, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였으며, 표적핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다. 한편, BVDV 검출 및 유전형 구분을 위한 PNA 프로브의 융해온도가 75℃ 넘지 않도록 하여 PCR의 증폭에 영향을 주지 않도록 제작하였다.
본 발명에서는 BVDV의 검출 특이도를 증가시키기 위하여 2 개의 프로브를 사용하고, BVDV의 유전형에 따라 결합 친화도가 상이하게 설계하였다.
BVDV AU501 strain을 이용하여, 제작된 프라이머 검증을 진행하였다. 실험 조성의 경우 BVDV AU501 strain RNA 3ul (6x105 copies), 서열번호 1 및 2 primer 1ul (3 : 20pmol), 20 X SYBR (바이오펙트, 한국), 2X qRT-PCR PreMix 10ul (시선바이오머티리얼스, 한국), 총 볼륨이 20ul가 되도록 D.W를 첨가하였다. 실험 조건은 도 1과 같으며, 증폭곡선 분석 결과, BVDV AU501 만 선택적으로 증폭곡선을 보이며, 음성 대조군(D.W)은 증폭되지 않음을 확인하였다(도 2).
제작된 PNA 프로브를 검증하기 위하여, 서열번호 3의 PNA 프로브에 100% 상동성을 갖는 서열을 포함하도록 서열번호 5의 올리고 뉴클레오티드를 제작하고, 서열번호 5 올리고 뉴클레오티드 1 ul (2.5pmol), 서열번호 3 PNA 프로브 0.5ul (5 pmol), 2X SSB Buffer 10ul (시선바이오머티리얼스, 한국)에 총 볼륨이 20ul가 되도록 D.W를 첨가하였다. 또한, 서열번호 4의 PNA 프로브에 100% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 서열번호 6의 뉴클레오티드를 제작하여, 서열번호 6 올리고 뉴클레오티드 1 ul (2.5pmol), 서열번호 4 PNA 프로브 0.5ul (5 pmol), 2X SSB Buffer 10ul (시선바이오머티리얼스, 한국)에 총 볼륨이 20ul가 되도록 D.W를 첨가하였다. 실험 조건은 도 3과 같으며, 그 결과 도 4와 같이 서열번호 3과 서열번호 4에 대해 각각 명확한 융해 피크를 확인할 수 있었다.
서열번호 5: GT CCA CGT GGC
서열번호 6: G TCC ACA TGG CAT
실시예
2.
프라이머
및 PNA
프로브를
이용한
BVDV
검출 및
유전형 분석
실시예 1에서 제작한 프라이머 및 PNA 프로브를 이용하여 BVDV의 검출 및 유전형 분석을 진행하였다. 33종의 BVDV1 유전형을 갖는 균주와, 13종의 BVDV2 유전형을 갖는 균주로, 총 46종의 균주를 대상으로 실험을 진행하였다.
우선 프라이머 쌍을 이용한 증폭을 검증하기 위하여, BVDV strain RNA 3ul, 2X qRT-PCR PreMix(시선바이오, 한국), 서열번호 1 프라이머 1ul (10 pmol), 서열번호 2 프라이머 1ul (10 pmol)를 첨가하고, 최종볼륨이 20ul이 되도록 D.W를 첨가하여 도 5의 조건으로 실험을 진행하였다. 그 결과, 도 6에서와 같이, 모든 시료에서 BVDV를 검출할 수 있었다.
이후, 상기 46종의 BVDV 균주를 이용하여 유전형 분석을 진행하였다. 이를 위하여 BVDV strain RNA 3ul, 2X qRT-PCR PreMix(시선바이오, 한국), 서열번호 1 프라이머 1ul (3 pmol), 서열번호 2 프라이머 1ul (20 pmol), 서열번호 3,4 각각 0.5ul(5pmol)를 첨가하고, 최종볼륨이 20ul이 되도록 D.W를 첨가하여 도 7의 조건으로 실험을 진행하였다. (50℃ 20분 후, 95℃ 10초, (95℃ 10초, 58℃ 30초, 72℃ 40초) X 40 사이클 후, 95℃ 3분, 75℃ 1분, 55℃ 1분, 40℃ 10초, 85℃)
그 결과, 도 8에서와 같은 증폭 곡선, 융해 곡선 및 융해 피크를 관찰할 수 있었고, 특히, 서열번호 3의 PNA 프로브와 서열번호 4의 PNA 프로브는 고유의 온도범위에서 융해 피크를 나타내었다(서열번호 3: 59.5℃ ~ 63.5℃ / 서열번호 4: 58.5℃ ~ 62.5℃).
BVDV 각 유형별로 융해 피크를 확인해 본 결과, BVDV1 유전형에서는 서열번호 3의 PNA 프로브에서만 융해 피크가 관찰되었고, BVDV2 유전형에서는 서열번호 4의 PNA 프로브에서만 융해 피크가 관찰되었다.
한편, BVDV 검출시 위양성 판정의 가능성이 있는 유사한 염기서열을 갖는 CSFV의 백신주(LOM strain)과 야외 분리주(SW strain)의 경우, 본 발명에 따른 융해 피크가 관찰되지 않아, 본 발명에 따른 PNA 프로브가 높은 특이도로 유전형 구분이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency)
<120> PNA probe for detecting bovine viral diarrhea virus genetic type
and a method for detecting bovine viral diarrhea virus genetic
type using the same
<130> P18-B242
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 1
ggcatatgcc cwtagtagga ctagc 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
gaaatcaact ccatgtgcca tgtac 25
<210> 3
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 3
gccacgtgga c 11
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 4
atgccatgtg gac 13
<210> 5
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotide for PNA probe verification
<400> 5
gtccacgtgg c 11
<210> 6
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo nucleotide for PNA probe verification
<400> 6
gtccacatgg cat 13
Claims (13)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 1형 유전형 판별용 PNA 프로브 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 2형 유전형 판별용 PNA 프로브; 및 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머와 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형 판별용 조성물.
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- 제4항에 있어서, 상기 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 1형 유전형 판별용 PNA 프로브 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 2형 유전형 판별용 PNA 프로브는 각각 서로 상이한 리포터가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형 판별용 조성물.
- 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 1형 유전형 판별용 PNA 프로브 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 2형 유전형 판별용 PNA 프로브; 및 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머와 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형 판별용 키트.
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- 제8항에 있어서, 상기 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 1형 유전형 판별용 PNA 프로브 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 2형 유전형 판별용 PNA 프로브는 각각 서로 상이한 리포터가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형 판별용 키트.
- 다음 단계를 포함하는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유전형 판별방법:
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
(b) 상기 표적 핵산에 포함된 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)를 주형으로 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머와 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 이용하여 증폭된 서열단편을 생성시키는 단계;
(c) 상기 증폭된 서열단편을 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계;
(d) 상기 혼성화된 산물의 온도를 높이며 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및
(e) 상기 융해곡선에서 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해 피크가 관찰되면 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 1형 유전형으로 판별하고, 상기 융해곡선에서 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해 피크가 관찰되면 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 2형 유전형으로 판별하는 단계.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112176105A (zh) * | 2020-10-10 | 2021-01-05 | 河北农业大学 | 病毒bvdv、brv和bcv一管多重荧光pcr检测的专用引物及其应用 |
| CN112430686A (zh) * | 2020-11-24 | 2021-03-02 | 内蒙古农业大学 | 用于同时检测bvdv-1、bvdv-2和bvdv-3的试剂盒及引物和探针 |
| CN114015766A (zh) * | 2021-11-18 | 2022-02-08 | 银丰基因科技有限公司 | 一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101642784B1 (ko) * | 2016-01-15 | 2016-07-27 | 대한민국 | 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별방법 |
-
2018
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101642784B1 (ko) * | 2016-01-15 | 2016-07-27 | 대한민국 | 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Askaravi 등. AMB. Expr. Vol. 7, No. 137, 페이지 1-9 (2017.06.26)* |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112176105A (zh) * | 2020-10-10 | 2021-01-05 | 河北农业大学 | 病毒bvdv、brv和bcv一管多重荧光pcr检测的专用引物及其应用 |
| CN112430686A (zh) * | 2020-11-24 | 2021-03-02 | 内蒙古农业大学 | 用于同时检测bvdv-1、bvdv-2和bvdv-3的试剂盒及引物和探针 |
| CN114015766A (zh) * | 2021-11-18 | 2022-02-08 | 银丰基因科技有限公司 | 一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒 |
| CN114015766B (zh) * | 2021-11-18 | 2024-04-05 | 银丰基因科技有限公司 | 一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| AMND | Amendment | ||
| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |