JP2002034599A - １塩基多型を検出する方法 - Google Patents
１塩基多型を検出する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】試料中に含まれる１塩基多型を含む特定の核酸
配列中に塩基多型の種類を容易に検出できる核酸配列分
析法を提供できる 【解決手段】染色体又はその断片の配列上の１塩基多型
を検出する方法であって、多型塩基に隣接する塩基を
３' 末端に有する核酸プライマー、識別可能な特徴を有
する多型塩基に対応したいずれか１種類のダイデオキシ
ヌクレオチド或いはその混合物、DNAポリメラーゼとそ
の活性発現に必要な組成物を含む反応液に試料核酸を反
応させ、核酸プライマーへのダイデオキシヌクレオチド
取り込みの有無を検出することにより特定すべき塩基の
種類を検出する方法。
配列中に塩基多型の種類を容易に検出できる核酸配列分
析法を提供できる 【解決手段】染色体又はその断片の配列上の１塩基多型
を検出する方法であって、多型塩基に隣接する塩基を
３' 末端に有する核酸プライマー、識別可能な特徴を有
する多型塩基に対応したいずれか１種類のダイデオキシ
ヌクレオチド或いはその混合物、DNAポリメラーゼとそ
の活性発現に必要な組成物を含む反応液に試料核酸を反
応させ、核酸プライマーへのダイデオキシヌクレオチド
取り込みの有無を検出することにより特定すべき塩基の
種類を検出する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸配列の分析法
に関する。さらに詳しくは、特定の核酸配列中に含まれ
る塩基多型を検出することができる核酸配列分析法に関
する。本発明の核酸配列分析法は、遺伝子工学や分子生
物学及びこれらに関連する産業分野において有用であ
る。
に関する。さらに詳しくは、特定の核酸配列中に含まれ
る塩基多型を検出することができる核酸配列分析法に関
する。本発明の核酸配列分析法は、遺伝子工学や分子生
物学及びこれらに関連する産業分野において有用であ
る。
【０００２】
【従来の技術】本発明において、塩基多型とは野生型と
は異なる配列を有する遺伝子型であって、多型遺伝子は
薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において
個体間変動の原因として重要な役割を果たしている。ま
た体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因として
も知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マ
ーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異
の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が
臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとっ
て特に推奨される（GramおよびBrsen, European Consen
sus Conference on Pharmacogenetics. Commission of
the European Communities, Luxembourg,1990, pp87-9
6; Balantら, Eur. J. Clin. Pharmacol. 36, 551-55
4、1989）。それゆえ、原因となる多型遺伝子の同定に
続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所
望される。
は異なる配列を有する遺伝子型であって、多型遺伝子は
薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において
個体間変動の原因として重要な役割を果たしている。ま
た体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因として
も知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マ
ーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異
の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が
臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとっ
て特に推奨される（GramおよびBrsen, European Consen
sus Conference on Pharmacogenetics. Commission of
the European Communities, Luxembourg,1990, pp87-9
6; Balantら, Eur. J. Clin. Pharmacol. 36, 551-55
4、1989）。それゆえ、原因となる多型遺伝子の同定に
続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所
望される。
【０００３】従来の核酸配列分析技術としては、例えば
核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配
列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定
することができるが、鋳型核酸の調製、ポリメラーゼ反
応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析
等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年
の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うこと
ができるが、高価な装置が必要であるという問題があ
る。
核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配
列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定
することができるが、鋳型核酸の調製、ポリメラーゼ反
応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析
等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年
の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うこと
ができるが、高価な装置が必要であるという問題があ
る。
【０００４】他の方法として、サザンハイブリダイゼー
ション法がある（村松正實編「ラボマニュアル遺伝子工
学 増補版」丸善株式会社発行、第７０〜７５頁）。こ
の方法によれば、標識されたＤＮＡプローブと相補的な
塩基配列を持つＤＮＡの領域を同定することができる。
即ち、サザンハイブリダイゼーション法では、核酸断片
をアガロースゲルやポリアクリルアミドゲルの平板上で
電気泳動させ、断片の大きさ（長さ）によって分離した
後、変性させて一本鎖とし、その平板にニトロセルロー
スやナイロン等のメンブランを張り付け、核酸断片を電
気泳動パターンそのままにトランスファーし、固定した
後、ＲＩ（放射性同位体）等で標識した塩基多型特異的
ＤＮＡプローブとハイブリッドを形成させ、プローブに
相補的なメンブラン上の核酸断片をオートラジオグラフ
ィー等により検出する。
ション法がある（村松正實編「ラボマニュアル遺伝子工
学 増補版」丸善株式会社発行、第７０〜７５頁）。こ
の方法によれば、標識されたＤＮＡプローブと相補的な
塩基配列を持つＤＮＡの領域を同定することができる。
即ち、サザンハイブリダイゼーション法では、核酸断片
をアガロースゲルやポリアクリルアミドゲルの平板上で
電気泳動させ、断片の大きさ（長さ）によって分離した
後、変性させて一本鎖とし、その平板にニトロセルロー
スやナイロン等のメンブランを張り付け、核酸断片を電
気泳動パターンそのままにトランスファーし、固定した
後、ＲＩ（放射性同位体）等で標識した塩基多型特異的
ＤＮＡプローブとハイブリッドを形成させ、プローブに
相補的なメンブラン上の核酸断片をオートラジオグラフ
ィー等により検出する。
【０００５】サザンハイブリダイゼーション法によれ
ば、目的とするＤＮＡ断片の電気泳動位置や分子量を決
めることができるが、電気泳動やオートラジオグラフィ
ー等の操作に長時間を要し、迅速に分析を行うことがで
きないこと、塩基多型特異的ＤＮＡプローブとハイブリ
ダイゼーションしたか否かだけで検出するため、プロー
ブの特異性を厳密にしないと、塩基多型の有無を検出す
るための類似配列を識別することが困難である等の問題
があった。
ば、目的とするＤＮＡ断片の電気泳動位置や分子量を決
めることができるが、電気泳動やオートラジオグラフィ
ー等の操作に長時間を要し、迅速に分析を行うことがで
きないこと、塩基多型特異的ＤＮＡプローブとハイブリ
ダイゼーションしたか否かだけで検出するため、プロー
ブの特異性を厳密にしないと、塩基多型の有無を検出す
るための類似配列を識別することが困難である等の問題
があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、試料
中に含まれる塩基多型を含む特定の核酸配列中に塩基多
型の種類を容易に検出できる核酸配列分析法を提供する
ことにある。
中に含まれる塩基多型を含む特定の核酸配列中に塩基多
型の種類を容易に検出できる核酸配列分析法を提供する
ことにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、シークエ
ンシング法（サンガー法）の長所を残しつつも、煩雑な
操作をせずに１塩基多型を識別する方法について鋭意検
討し、本発明を完成するに至った。
ンシング法（サンガー法）の長所を残しつつも、煩雑な
操作をせずに１塩基多型を識別する方法について鋭意検
討し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は以下のような構成から
なる。 （１）染色体又はその断片の配列上の１塩基多型を検出
する方法であって、多型塩基に隣接する塩基を３' 末端
に有する核酸プライマー、識別可能な特徴を有する多型
塩基に対応したいずれか１種類のダイデオキシヌクレオ
チド或いはその混合物、DNAポリメラーゼとその活性発
現に必要な組成物を含む反応液に試料核酸を反応させ、
核酸プライマーへのダイデオキシヌクレオチド取り込み
の有無を検出することにより特定すべき塩基の種類を検
出する方法。 （２）取り込まれるダイデオキシヌクレオチドの識別可
能な特徴がビオチン基である、（１）記載の方法。 （３）取り込み反応後に核酸プライマーを捕捉用プロー
ブとハイブリダイズすることにより捕捉して検出するこ
とを特徴とする、（１）記載の方法。 （４）DNAポリメラーゼが耐熱性であり、温度サイクル
により核酸変性とアニール・取り込みを繰り返して感度
を向上させることを特徴とする、（１）記載の方法。 （５）検出される側のストランドが優先的に増幅するよ
うに核酸プライマーの量比を不均一にして、検出に使用
する試料核酸を事前に増幅することを特徴とする、
（１）に記載の方法。 （６）核酸プライマーと同じ試料核酸ストランドにハイ
ブリダイズする増幅用プライマーを逆側の試料核酸スト
ランドにハイブリダイズする増幅用プライマーに比べて
5〜10倍増やすことを特徴とする（５）に記載の方法。 （７）検出に使用する試料核酸を事前に増幅した後、１
塩基多型を検出する際に障害となる各種デオキシヌクレ
オチドをフォスファターゼで脱リン酸化することを特徴
とする、（１）に記載の方法。 （８）それぞれの核酸プライマーの5'末端側にあらかじ
め任意に設定した共通の配列のオリゴヌクレオチドを結
合させ、該共通配列オリゴヌクレオチドと相補性の捕捉
プローブを用いて核酸プライマーを捕捉した後、検出す
ることを特徴とする（１）に記載の方法。
なる。 （１）染色体又はその断片の配列上の１塩基多型を検出
する方法であって、多型塩基に隣接する塩基を３' 末端
に有する核酸プライマー、識別可能な特徴を有する多型
塩基に対応したいずれか１種類のダイデオキシヌクレオ
チド或いはその混合物、DNAポリメラーゼとその活性発
現に必要な組成物を含む反応液に試料核酸を反応させ、
核酸プライマーへのダイデオキシヌクレオチド取り込み
の有無を検出することにより特定すべき塩基の種類を検
出する方法。 （２）取り込まれるダイデオキシヌクレオチドの識別可
能な特徴がビオチン基である、（１）記載の方法。 （３）取り込み反応後に核酸プライマーを捕捉用プロー
ブとハイブリダイズすることにより捕捉して検出するこ
とを特徴とする、（１）記載の方法。 （４）DNAポリメラーゼが耐熱性であり、温度サイクル
により核酸変性とアニール・取り込みを繰り返して感度
を向上させることを特徴とする、（１）記載の方法。 （５）検出される側のストランドが優先的に増幅するよ
うに核酸プライマーの量比を不均一にして、検出に使用
する試料核酸を事前に増幅することを特徴とする、
（１）に記載の方法。 （６）核酸プライマーと同じ試料核酸ストランドにハイ
ブリダイズする増幅用プライマーを逆側の試料核酸スト
ランドにハイブリダイズする増幅用プライマーに比べて
5〜10倍増やすことを特徴とする（５）に記載の方法。 （７）検出に使用する試料核酸を事前に増幅した後、１
塩基多型を検出する際に障害となる各種デオキシヌクレ
オチドをフォスファターゼで脱リン酸化することを特徴
とする、（１）に記載の方法。 （８）それぞれの核酸プライマーの5'末端側にあらかじ
め任意に設定した共通の配列のオリゴヌクレオチドを結
合させ、該共通配列オリゴヌクレオチドと相補性の捕捉
プローブを用いて核酸プライマーを捕捉した後、検出す
ることを特徴とする（１）に記載の方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明は、核酸配列決定技術であ
るサンガー法を基本として、特定すべき１塩基多型の部
分のみ伸長させることを第一の特徴とする。１塩基のみ
伸長するので、通常のサンガー法で用いられる各種のヌ
クレオチドなどは必要とせず、特異的なターミネーター
の役割を果たすダイデオキシヌクレオチド(ddNTP)１種
類を加える。更に本発明の特徴は、その特異的なターミ
ネーターに識別可能な特徴を付加している点である。こ
れによりddNTP取り込みの有無を明確に識別することが
できる。また、複数の相互に識別可能な特徴を用いれ
ば、それぞれを異なるｄｄＮＴＰに付加することによ
り、一反応で複数のアッセイも可能であることはいうま
でもない。
るサンガー法を基本として、特定すべき１塩基多型の部
分のみ伸長させることを第一の特徴とする。１塩基のみ
伸長するので、通常のサンガー法で用いられる各種のヌ
クレオチドなどは必要とせず、特異的なターミネーター
の役割を果たすダイデオキシヌクレオチド(ddNTP)１種
類を加える。更に本発明の特徴は、その特異的なターミ
ネーターに識別可能な特徴を付加している点である。こ
れによりddNTP取り込みの有無を明確に識別することが
できる。また、複数の相互に識別可能な特徴を用いれ
ば、それぞれを異なるｄｄＮＴＰに付加することによ
り、一反応で複数のアッセイも可能であることはいうま
でもない。
【００１０】ddNTPに付加する識別可能な特徴は、公知
の標識物が使用可能である。本発明では主にビオチンを
使用しているが、これはアビジンとの結合により後工程
で様々な標識物を付加することが可能であるという柔軟
性が、研究段階において有利であったためであり、他の
識別可能な特徴を使用可能であることは自明である。
の標識物が使用可能である。本発明では主にビオチンを
使用しているが、これはアビジンとの結合により後工程
で様々な標識物を付加することが可能であるという柔軟
性が、研究段階において有利であったためであり、他の
識別可能な特徴を使用可能であることは自明である。
【００１１】識別可能な特徴としては、例えば、酵素、
ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物
質および発光団などの標識が例示され、ddNTPの付加反
応後に該識別可能な特徴を検出することによって、行う
ことができる。または、リバースプライマーを標識して
おいてもよい。
ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物
質および発光団などの標識が例示され、ddNTPの付加反
応後に該識別可能な特徴を検出することによって、行う
ことができる。または、リバースプライマーを標識して
おいてもよい。
【００１２】酵素としては、アルカリフォスファター
ゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
ゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
【００１３】蛍光物質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡ
Ｍ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃ
ｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。
Ｍ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃ
ｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。
【００１４】ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲ
ニンなどが挙げられる。
ニンなどが挙げられる。
【００１５】放射性物質としては、32Ｐ、35Ｓなどが挙
げられる。
げられる。
【００１６】発光団としては、ルテニウムなどが挙げら
れる。
れる。
【００１７】該標識は、プライマーの伸長反応に影響を
与えることがなけれddNTPのどの位置に結合させてもよ
い。
与えることがなけれddNTPのどの位置に結合させてもよ
い。
【００１８】好ましい態様として、ddNTPを取り込ませ
た核酸プライマーをハイブリダイズにより捕捉して検出
する。一般にサンガー法による配列決定はポリアクリル
アミドゲルによる電気泳動分析により検出するが、これ
はかなりの労力を要し、コストも高い。本願発明では、
これに代わる検出方法として捕捉プローブを使用したリ
バースハイブリダイゼーションにより核酸プライマーを
捕捉し、洗浄後にddNTPに付加した標識物を検出する方
法を提示している。ハイブリダイゼーションに用いるプ
ローブは、核酸プライマーのアンチセンス配列を有する
ものでも良いが、本発明者らはこれを更に改良して、核
酸プライマーの5'末端側にあらかじめ共通の配列のオリ
ゴヌクレオチドを結合させ、共通のプローブで捕捉する
方法も提示している。これによって、項目毎にプローブ
を合成する必要が無くなり、プローブの量産化によりコ
ストが下がる他、項目毎にハイブリ条件を設定する必要
もなくなり、開発効率が向上する。具体的に実施例２で
は、核酸プライマーの5'末端側にはdA 20merを付け、dT
20merのプローブで捕捉している。
た核酸プライマーをハイブリダイズにより捕捉して検出
する。一般にサンガー法による配列決定はポリアクリル
アミドゲルによる電気泳動分析により検出するが、これ
はかなりの労力を要し、コストも高い。本願発明では、
これに代わる検出方法として捕捉プローブを使用したリ
バースハイブリダイゼーションにより核酸プライマーを
捕捉し、洗浄後にddNTPに付加した標識物を検出する方
法を提示している。ハイブリダイゼーションに用いるプ
ローブは、核酸プライマーのアンチセンス配列を有する
ものでも良いが、本発明者らはこれを更に改良して、核
酸プライマーの5'末端側にあらかじめ共通の配列のオリ
ゴヌクレオチドを結合させ、共通のプローブで捕捉する
方法も提示している。これによって、項目毎にプローブ
を合成する必要が無くなり、プローブの量産化によりコ
ストが下がる他、項目毎にハイブリ条件を設定する必要
もなくなり、開発効率が向上する。具体的に実施例２で
は、核酸プライマーの5'末端側にはdA 20merを付け、dT
20merのプローブで捕捉している。
【００１９】さらに好ましい態様として、ddNTPを核酸
プライマーに取り込ませる酵素に、耐熱性のDNAポリメ
ラーゼを用いている。これにより、温度サイクルで変
性、アニール、伸長(取り込み)の工程を複数回繰り返す
ことによって取り込み効率の向上を図ることができる。
本発明には、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を持たない
Taq DNAポリメラーゼやTth DNAポリメラーゼなどが好適
である。
プライマーに取り込ませる酵素に、耐熱性のDNAポリメ
ラーゼを用いている。これにより、温度サイクルで変
性、アニール、伸長(取り込み)の工程を複数回繰り返す
ことによって取り込み効率の向上を図ることができる。
本発明には、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を持たない
Taq DNAポリメラーゼやTth DNAポリメラーゼなどが好適
である。
【００２０】試料核酸中に含まれる１塩基多型部位を含
む遺伝子、例えば染色体又はその断片は、目的の遺伝子
の情報を担う塩基多型部位を含む標的核酸であれば、特
に制限されない。該標的核酸の例としては、Alu配列、
蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プ
ロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病
を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿
病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、高血圧
としてＡＣＥ(Angiotensin I Converting Enzyme)遺伝
子が挙げられる。
む遺伝子、例えば染色体又はその断片は、目的の遺伝子
の情報を担う塩基多型部位を含む標的核酸であれば、特
に制限されない。該標的核酸の例としては、Alu配列、
蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プ
ロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病
を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿
病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、高血圧
としてＡＣＥ(Angiotensin I Converting Enzyme)遺伝
子が挙げられる。
【００２１】本発明において、染色体又はその断片を単
に核酸ということがある。変異型核酸とは、野生型核酸
のうち１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレ
オチドに置換されているものや、野生型核酸に１塩基の
挿入、欠失等を含む核酸のことであり、どの部位のヌク
レオチドが変異しているかが解明されているものであ
る。このような塩基多型により体質等が異なっているこ
とが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸
がこのような予想される変異を有しているか否かを検査
する方法である。
に核酸ということがある。変異型核酸とは、野生型核酸
のうち１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレ
オチドに置換されているものや、野生型核酸に１塩基の
挿入、欠失等を含む核酸のことであり、どの部位のヌク
レオチドが変異しているかが解明されているものであ
る。このような塩基多型により体質等が異なっているこ
とが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸
がこのような予想される変異を有しているか否かを検査
する方法である。
【００２２】本発明における核酸プライマー、検出プラ
イマー、捕捉プライマーのハイブリダイズする部分の長
さとしては、通常１３〜３５塩基、好ましくは、１６〜
３０塩基である。
イマー、捕捉プライマーのハイブリダイズする部分の長
さとしては、通常１３〜３５塩基、好ましくは、１６〜
３０塩基である。
【００２３】本発明者らは、上記の反応に用いるサンプ
ルの調製方法も提示している。理論的には、ゲノムDNA
などの検体中の核酸から直接検出することも可能ではあ
るが、現実問題として、十分なシグナルを得るだけの試
料を確保することは多くの場合困難であるため、PCR(Po
lymerase chain reaction；特公平４−６７９６０号公
報、特公平４−６７９５７号公報)などの核酸増幅技術
により特定配列のみ増幅することが行われる。本発明者
らもPCRにより試料核酸を増幅していたが、十分な増幅
が行われているにもかかわらずシグナルは必ずしも高く
なかった。そこで鋭意検討の結果、PCRにより増幅した
核酸が２本鎖であることが、検出用の核酸プライマーの
結合を阻害していることを見いだした。さらに、検出用
プライマーとアニールする側の増幅用プライマーを逆側
の増幅用プライマーに比べて極端に増やす(5〜10倍)こ
とにより、アニールする側のストランドを１本鎖の状態
で増やすことが可能であり、それによりシグナルが向上
することを見いだした。
ルの調製方法も提示している。理論的には、ゲノムDNA
などの検体中の核酸から直接検出することも可能ではあ
るが、現実問題として、十分なシグナルを得るだけの試
料を確保することは多くの場合困難であるため、PCR(Po
lymerase chain reaction；特公平４−６７９６０号公
報、特公平４−６７９５７号公報)などの核酸増幅技術
により特定配列のみ増幅することが行われる。本発明者
らもPCRにより試料核酸を増幅していたが、十分な増幅
が行われているにもかかわらずシグナルは必ずしも高く
なかった。そこで鋭意検討の結果、PCRにより増幅した
核酸が２本鎖であることが、検出用の核酸プライマーの
結合を阻害していることを見いだした。さらに、検出用
プライマーとアニールする側の増幅用プライマーを逆側
の増幅用プライマーに比べて極端に増やす(5〜10倍)こ
とにより、アニールする側のストランドを１本鎖の状態
で増やすことが可能であり、それによりシグナルが向上
することを見いだした。
【００２４】また、事前に核酸増幅を実施する際に加え
るデオキシヌクレオチド(dNTPs、通常は４種類入れるた
め、複数形で表記する)は、１塩基多型を検出する際に
は障害となる。実際、モル数で検出時に加えるddNTPの1
0分の1のdNTPsが残留しているだけでも、陰性のサンプ
ルのシグナルが上昇して特異性が得られなくなる。dNTP
はddNTPよりも取り込まれ易いためである。それ故、増
幅後はほぼ完全にdNTPsを取り除く必要があり、これま
では主にカラムによる精製を実施してきた。近年は微量
遠心機を用いたスピンカラム方式が開発され、操作はか
なり簡便になったが、それでも反応液の分注、遠心など
煩雑な操作が必要であり、PCR産物のコンタミなども懸
念される。コストも1検体あたり200円以上必要である。
本発明者らは、鋭意検討の結果、脱リン酸化酵素(フォ
スファターゼ)処理でdNTPsを不活性化させる方法を見い
だした。具体的には、PCR産物5マイクロリットルあたり
アルカリ性フォスファターゼを2単位投入し、37℃15分
保温する。このまま上記SNP検出反応に用いると、フォ
スファターゼが必要なddNTPまで分解してしまうので、8
0℃〜100℃で15分加温し、フォスファターゼを失活させ
る。この反応液は、そのまま上記SNP検出反応に使用可
能であることを確認した。37℃と80℃の加温はPCRに用
いるサーマルサイクラーを使用できるので、追加的な操
作はフォスファターゼを加えるだけであり、自動化しや
すい。使用するフォスファターゼは、処理後に加熱操作
で完全に失活させる必要があるため、熱安定性があまり
高くないものがよく、牛小腸アルカリ性フォスファター
ゼ(CIP)などが好適である。CIPはコストも低く、1検体
あたり40円以下で実施可能となる。この技術は、上記の
SNP検出方法以外にも、多くの検査技術に応用可能な汎
用性を持つ。
るデオキシヌクレオチド(dNTPs、通常は４種類入れるた
め、複数形で表記する)は、１塩基多型を検出する際に
は障害となる。実際、モル数で検出時に加えるddNTPの1
0分の1のdNTPsが残留しているだけでも、陰性のサンプ
ルのシグナルが上昇して特異性が得られなくなる。dNTP
はddNTPよりも取り込まれ易いためである。それ故、増
幅後はほぼ完全にdNTPsを取り除く必要があり、これま
では主にカラムによる精製を実施してきた。近年は微量
遠心機を用いたスピンカラム方式が開発され、操作はか
なり簡便になったが、それでも反応液の分注、遠心など
煩雑な操作が必要であり、PCR産物のコンタミなども懸
念される。コストも1検体あたり200円以上必要である。
本発明者らは、鋭意検討の結果、脱リン酸化酵素(フォ
スファターゼ)処理でdNTPsを不活性化させる方法を見い
だした。具体的には、PCR産物5マイクロリットルあたり
アルカリ性フォスファターゼを2単位投入し、37℃15分
保温する。このまま上記SNP検出反応に用いると、フォ
スファターゼが必要なddNTPまで分解してしまうので、8
0℃〜100℃で15分加温し、フォスファターゼを失活させ
る。この反応液は、そのまま上記SNP検出反応に使用可
能であることを確認した。37℃と80℃の加温はPCRに用
いるサーマルサイクラーを使用できるので、追加的な操
作はフォスファターゼを加えるだけであり、自動化しや
すい。使用するフォスファターゼは、処理後に加熱操作
で完全に失活させる必要があるため、熱安定性があまり
高くないものがよく、牛小腸アルカリ性フォスファター
ゼ(CIP)などが好適である。CIPはコストも低く、1検体
あたり40円以下で実施可能となる。この技術は、上記の
SNP検出方法以外にも、多くの検査技術に応用可能な汎
用性を持つ。
【００２５】
【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。しか
し、これによって、本発明の効果が限定されるものでは
ない。 実施例１．PCRと本発明を組み合わせたヒトACE遺伝子の
１塩基多型検出 ヒトACE(Angiotensin-I converting enzyme)遺伝子の転
写開始点より240番目の塩基に存在するSNP(ACE240 T/A)
を、本発明を用いて検出する。 （１）必要なオリゴヌクレオチドの準備 配列表・配列番号１に示される配列を有するオリゴヌク
レオチド（ACE遺伝子増幅用フォワードプライマー）、
配列表・配列番号２に示される配列を有するオリゴヌク
レオチド（ACE遺伝子増幅用リバースプライマー）、配
列表・配列番号３に示される配列を有するオリゴヌクレ
オチド（ACE240SNP検出プライマー）、配列表・配列番
号４に示される配列を有するオリゴヌクレオチド（ACE2
40SNP捕捉プローブ用オリゴヌクレオチド）を合成し
た。ACE240SNP捕捉プローブ用オリゴヌクレオチド（配
列番号４）は、5'末端にアミノリンカーアームを有す
る。
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。しか
し、これによって、本発明の効果が限定されるものでは
ない。 実施例１．PCRと本発明を組み合わせたヒトACE遺伝子の
１塩基多型検出 ヒトACE(Angiotensin-I converting enzyme)遺伝子の転
写開始点より240番目の塩基に存在するSNP(ACE240 T/A)
を、本発明を用いて検出する。 （１）必要なオリゴヌクレオチドの準備 配列表・配列番号１に示される配列を有するオリゴヌク
レオチド（ACE遺伝子増幅用フォワードプライマー）、
配列表・配列番号２に示される配列を有するオリゴヌク
レオチド（ACE遺伝子増幅用リバースプライマー）、配
列表・配列番号３に示される配列を有するオリゴヌクレ
オチド（ACE240SNP検出プライマー）、配列表・配列番
号４に示される配列を有するオリゴヌクレオチド（ACE2
40SNP捕捉プローブ用オリゴヌクレオチド）を合成し
た。ACE240SNP捕捉プローブ用オリゴヌクレオチド（配
列番号４）は、5'末端にアミノリンカーアームを有す
る。
【００２６】なお、配列番号３及び４のオリゴヌクレオ
チドは、完全に相補性である。 （２）捕捉プローブ用オリゴヌクレオチドのマイクロタ
イタープレートへの結合 上記（１）で合成した捕捉プローブ用オリゴヌクレオチ
ドについて、そのリンカーアームを介してのマイクロタ
イタープレート内面への結合を行った。リンカーオリゴ
ヌクレオチドを50mM ほう酸バッファー（pH10）・100mM
MgCl2の溶液に0.05pmol/μLになるように希釈し、マイ
クロタイタープレート（MicroFLUOR B、ダイナテック
社）に各100μLずつ分注し、１５時間程度室温に放置す
ることでリンカーオリゴヌクレオチドをマイクロタイタ
ープレート内面に結合させる。その後、0.1pmol dNTP・
0.5% PVP(ポリビニルピロリドン)・5×SSCに置換して、
非特異反応を抑えるためのブロッキングを室温で２時間
程度行った。最後に1×SSCで洗浄して乾燥させた。 （３）特定すべき１塩基多型を含む領域のPCRによる増
幅 配列表・配列番号１に示される配列を有するオリゴヌク
レオチド（ACE遺伝子増幅用フォワードプライマー）及
び配列表・配列番号２に示される配列を有するオリゴヌ
クレオチド（ACE遺伝子増幅用リバースプライマー）を
用いて、核酸抽出キット「QIAamp」（キアゲン）で血液
より抽出したヒトゲノムDNA試料からACE遺伝子の一部を
PCRで増幅した。これらのDNA試料は、通常の配列決定方
法により、あらかじめACE240の塩基が特定されており、
それぞれTT/TA/AAの3種類である。PCRにはKOD DNA poly
merase（東洋紡績）を用い、メーカー指定の条件で35サ
イクルの増幅反応を実施した。もっとも、このPCRは単
に遺伝子の特定領域を増幅することが目的であるため、
PCRの方法や酵素の種類に特段の制限はない。また、PCR
時にリバースプライマーを定法の10倍投入し、検出され
る側のストランドを優先的に増幅させた(＝表１中でPC
R"非対称"と記載)サンプルもある。その後、「QIAquic
k」カラム(キアゲン)で精製したもの(＝表１中で前処
理"カラム"と記載)、あるいは牛小腸アルカリ性ホスフ
ァターゼ(東洋紡)で37℃15分処理後、80℃15分で処理し
たもの(＝表１中で前処理"酵素"と記載)を準備した。 （PCR組成(定法)）total液量 25μL フォワードプライマー 5pmol リバースプライマー 5pmol(50pmol) ×10緩衝液 2.5μL 2mM dNTP 2.5μL KOD DNA polymerase 1U 抽出DNA溶液 100ng （PCR条件） 94℃・5分 94℃・1分、65℃・2分、68℃・1分（35サイクル） 68℃・2分 （４）特異的なddNTPの取り込み反応 (３)で準備したPCR産物に、ACE240SNP検出プライマー、
特定のbiotin化ddNTP(B-ddNTP)、DNA polymeraseなどを
加え、ddNTPの取り込みを行わせる。今回はSNPの種類が
TとAであるため、B-ddTTP(ddUTPでも可能)あるいはB-dd
ATPを使用した。また、DNA polymeraseにはサンガー法
に広く使用されている改変型Tth DNA polymerase「Delt
a-Tth DNA polymerase」(東洋紡績)を使用した。B-ddTT
PはB-ddATPに比べて取り込み効率が悪いため、多く投入
している。 （ddNTP取り込み反応組成）total液量 25μL 検出プライマー 10pmol ×10緩衝液 2.5μL B-ddTTP 2000pmol あるいは、B-ddATP 400pmol Delta-Tth DNA polymerase 5U PCR反応液(処理後) 1μL （ddNTP取り込み反応条件） 92℃・1分 92℃・1分、45℃・1分（20サイクル） 75℃・1分 （５）マイクロタイタープレート中でのハイブリダイゼ
ーション (４)の取り込み反応液を10倍に希釈し、0.3N NaOH中でD
NAを変性させ、各サンプル20μLを200mMクエン酸−リン
酸緩衝液(pH6.0)、2%SDS、750mM NaClの溶液100μLに加
えて、上記(２)の捕捉プローブが結合したマイクロタイ
タープレートに投入した。蒸発を防ぐため流動パラフィ
ンを重層し、37℃で30分間振盪させた。これによって、
検出プライマーが、固定化された捕捉プローブによって
特異的にマイクロタイタープレートに捕捉される。
チドは、完全に相補性である。 （２）捕捉プローブ用オリゴヌクレオチドのマイクロタ
イタープレートへの結合 上記（１）で合成した捕捉プローブ用オリゴヌクレオチ
ドについて、そのリンカーアームを介してのマイクロタ
イタープレート内面への結合を行った。リンカーオリゴ
ヌクレオチドを50mM ほう酸バッファー（pH10）・100mM
MgCl2の溶液に0.05pmol/μLになるように希釈し、マイ
クロタイタープレート（MicroFLUOR B、ダイナテック
社）に各100μLずつ分注し、１５時間程度室温に放置す
ることでリンカーオリゴヌクレオチドをマイクロタイタ
ープレート内面に結合させる。その後、0.1pmol dNTP・
0.5% PVP(ポリビニルピロリドン)・5×SSCに置換して、
非特異反応を抑えるためのブロッキングを室温で２時間
程度行った。最後に1×SSCで洗浄して乾燥させた。 （３）特定すべき１塩基多型を含む領域のPCRによる増
幅 配列表・配列番号１に示される配列を有するオリゴヌク
レオチド（ACE遺伝子増幅用フォワードプライマー）及
び配列表・配列番号２に示される配列を有するオリゴヌ
クレオチド（ACE遺伝子増幅用リバースプライマー）を
用いて、核酸抽出キット「QIAamp」（キアゲン）で血液
より抽出したヒトゲノムDNA試料からACE遺伝子の一部を
PCRで増幅した。これらのDNA試料は、通常の配列決定方
法により、あらかじめACE240の塩基が特定されており、
それぞれTT/TA/AAの3種類である。PCRにはKOD DNA poly
merase（東洋紡績）を用い、メーカー指定の条件で35サ
イクルの増幅反応を実施した。もっとも、このPCRは単
に遺伝子の特定領域を増幅することが目的であるため、
PCRの方法や酵素の種類に特段の制限はない。また、PCR
時にリバースプライマーを定法の10倍投入し、検出され
る側のストランドを優先的に増幅させた(＝表１中でPC
R"非対称"と記載)サンプルもある。その後、「QIAquic
k」カラム(キアゲン)で精製したもの(＝表１中で前処
理"カラム"と記載)、あるいは牛小腸アルカリ性ホスフ
ァターゼ(東洋紡)で37℃15分処理後、80℃15分で処理し
たもの(＝表１中で前処理"酵素"と記載)を準備した。 （PCR組成(定法)）total液量 25μL フォワードプライマー 5pmol リバースプライマー 5pmol(50pmol) ×10緩衝液 2.5μL 2mM dNTP 2.5μL KOD DNA polymerase 1U 抽出DNA溶液 100ng （PCR条件） 94℃・5分 94℃・1分、65℃・2分、68℃・1分（35サイクル） 68℃・2分 （４）特異的なddNTPの取り込み反応 (３)で準備したPCR産物に、ACE240SNP検出プライマー、
特定のbiotin化ddNTP(B-ddNTP)、DNA polymeraseなどを
加え、ddNTPの取り込みを行わせる。今回はSNPの種類が
TとAであるため、B-ddTTP(ddUTPでも可能)あるいはB-dd
ATPを使用した。また、DNA polymeraseにはサンガー法
に広く使用されている改変型Tth DNA polymerase「Delt
a-Tth DNA polymerase」(東洋紡績)を使用した。B-ddTT
PはB-ddATPに比べて取り込み効率が悪いため、多く投入
している。 （ddNTP取り込み反応組成）total液量 25μL 検出プライマー 10pmol ×10緩衝液 2.5μL B-ddTTP 2000pmol あるいは、B-ddATP 400pmol Delta-Tth DNA polymerase 5U PCR反応液(処理後) 1μL （ddNTP取り込み反応条件） 92℃・1分 92℃・1分、45℃・1分（20サイクル） 75℃・1分 （５）マイクロタイタープレート中でのハイブリダイゼ
ーション (４)の取り込み反応液を10倍に希釈し、0.3N NaOH中でD
NAを変性させ、各サンプル20μLを200mMクエン酸−リン
酸緩衝液(pH6.0)、2%SDS、750mM NaClの溶液100μLに加
えて、上記(２)の捕捉プローブが結合したマイクロタイ
タープレートに投入した。蒸発を防ぐため流動パラフィ
ンを重層し、37℃で30分間振盪させた。これによって、
検出プライマーが、固定化された捕捉プローブによって
特異的にマイクロタイタープレートに捕捉される。
【００２７】次に、2×SSC(pH7.0)、1%SDSに置換し、同
様に蒸発を防ぐため、流動パラフィンを重層し、37℃で
20分間振盪させた。その後、アルカリフォスファターゼ
を標識したストレプトアビジン（DAKO製D0396）を50mM
トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)、1%BSAの溶液で2000倍に希
釈した溶液100μLと置換し、37℃で15分間振盪させた。
これによって、捕捉された検出プライマーにB-ddNTPが
取り込まれている場合、ビオチンにアルカリ性ホスファ
ターゼ標識したストレプトアビジンが特異的に結合す
る。250μLの50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)、0.025%
Tween20溶液で3回洗浄後、アルカリ性ホスファターゼの
発光基質であるジオキセタン化合物（商品名：CSPD；TR
OPIX社）50μLを注入し、37℃で15分間保温後に暗室中
でホトンカウンター（浜松ホトニクス社）で発光量を測
定した。 （６）ヒトACE遺伝子1塩基多型測定結果 上記(５)にて検出されたヒトACE遺伝子の挿入遺伝子多
型検出結果を表１に示す。数値は発光量(cps：count/se
cond)で表示される。表１に示すように、B-ddTTPを取り
込ませる反応系では、TT及びTAのようにTのアリルを含
むサンプルでは発光量が高く出るのに対し、Tのアリル
を含まないAAのサンプルでは3kcps未満の発光量にとど
まる。一方、B-ddATPを取り込ませる反応系では、TA及
びAAのようにAのアリルを含むサンプルでは発光量が高
く出るのに対し、Aのアリルを含まないTTのサンプルで
は3kcps未満の発光量にとどまる。カットオフとして3kc
psを設定すれば、TAサンプルはどちらも陽性、TTサンプ
ルはTのみ陽性、AAサンプルはAのみ陽性となり、SNPの
判定が可能となる。全体的にB-ddATPの陽性シグナルの
方がB-ddTTPよりも高く、ddNTPの種類で取り込み効率の
相違が考えられるが、判定には差し支えない。前処理と
してQIAquickよりもフォスファターゼの方がシグナルが
高いのは、前処理中の核酸の損失が少ないためと考えら
れる。また、非対称PCRでは明らかに陽性シグナルが向
上しており、B-ddNTP取り込み向上に対する効果が確認
できた。
様に蒸発を防ぐため、流動パラフィンを重層し、37℃で
20分間振盪させた。その後、アルカリフォスファターゼ
を標識したストレプトアビジン（DAKO製D0396）を50mM
トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)、1%BSAの溶液で2000倍に希
釈した溶液100μLと置換し、37℃で15分間振盪させた。
これによって、捕捉された検出プライマーにB-ddNTPが
取り込まれている場合、ビオチンにアルカリ性ホスファ
ターゼ標識したストレプトアビジンが特異的に結合す
る。250μLの50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)、0.025%
Tween20溶液で3回洗浄後、アルカリ性ホスファターゼの
発光基質であるジオキセタン化合物（商品名：CSPD；TR
OPIX社）50μLを注入し、37℃で15分間保温後に暗室中
でホトンカウンター（浜松ホトニクス社）で発光量を測
定した。 （６）ヒトACE遺伝子1塩基多型測定結果 上記(５)にて検出されたヒトACE遺伝子の挿入遺伝子多
型検出結果を表１に示す。数値は発光量(cps：count/se
cond)で表示される。表１に示すように、B-ddTTPを取り
込ませる反応系では、TT及びTAのようにTのアリルを含
むサンプルでは発光量が高く出るのに対し、Tのアリル
を含まないAAのサンプルでは3kcps未満の発光量にとど
まる。一方、B-ddATPを取り込ませる反応系では、TA及
びAAのようにAのアリルを含むサンプルでは発光量が高
く出るのに対し、Aのアリルを含まないTTのサンプルで
は3kcps未満の発光量にとどまる。カットオフとして3kc
psを設定すれば、TAサンプルはどちらも陽性、TTサンプ
ルはTのみ陽性、AAサンプルはAのみ陽性となり、SNPの
判定が可能となる。全体的にB-ddATPの陽性シグナルの
方がB-ddTTPよりも高く、ddNTPの種類で取り込み効率の
相違が考えられるが、判定には差し支えない。前処理と
してQIAquickよりもフォスファターゼの方がシグナルが
高いのは、前処理中の核酸の損失が少ないためと考えら
れる。また、非対称PCRでは明らかに陽性シグナルが向
上しており、B-ddNTP取り込み向上に対する効果が確認
できた。
【００２８】
【表１】
【００２９】実施例２．PCRと本発明を組み合わせたヒ
トCD14 receptor遺伝子の１塩基多型検出 ヒトCD14 receptor遺伝子転写開始点の上流260番目の塩
基に存在するSNP(CD14R-260 C/T)を、本発明を用いて検
出する。
トCD14 receptor遺伝子の１塩基多型検出 ヒトCD14 receptor遺伝子転写開始点の上流260番目の塩
基に存在するSNP(CD14R-260 C/T)を、本発明を用いて検
出する。
【００３０】実施例２で、CD14R-260SNP検出フォワード
プライマー（配列番号７）とCD14R-260SNP検出リバース
プライマー（配列番号８）の２種類を用いたのは、どち
らのプライマーでも検出可能であることを示すためであ
る。 （１）必要なオリゴヌクレオチドの準備 配列表・配列番号５に示される配列を有するオリゴヌク
レオチド（CD14R遺伝子増幅用フォワードプライマ
ー）、配列表・配列番号６に示される配列を有するオリ
ゴヌクレオチド（CD14R遺伝子増幅用リバースプライマ
ー）、配列表・配列番号７に示される配列を有するオリ
ゴヌクレオチド（CD14R-260SNP検出フォワードプライマ
ー）、配列表・配列番号８に示される配列を有するオリ
ゴヌクレオチド（CD14R-260SNP検出リバースプライマ
ー）、配列表・配列番号９に示される配列を有するオリ
ゴヌクレオチド（dT20捕捉プローブ用オリゴヌクレオチ
ド）を合成した。dT20捕捉プローブ用オリゴヌクレオチ
ドは、5'末端にアミノリンカーアームを有する。 （２）捕捉プローブ用オリゴヌクレオチドのマイクロタ
イタープレートへの結合 上記（１）で合成した捕捉プローブ用オリゴヌクレオチ
ドについて、そのリンカーアームを介してのマイクロタ
イタープレート内面への結合を行った。リンカーオリゴ
ヌクレオチドを50mM ほう酸バッファー（pH10）・100mM
MgCl2の溶液に0.05pmol/μLになるように希釈し、マイ
クロタイタープレート（MicroFLUOR B、ダイナテック
社）に各100μLずつ分注し、１５時間程度室温に放置す
ることでリンカーオリゴヌクレオチドをマイクロタイタ
ープレート内面に結合させる。その後、0.1pmol dNTP・
0.5% PVP(ポリビニルピロリドン)・5×SSCに置換して、
非特異反応を抑えるためのブロッキングを室温で２時間
程度行った。最後に1×SSCで洗浄して乾燥させた。 （３）特定すべき１塩基多型を含む領域のPCRによる増
幅 配列表・配列番号５に示される配列を有するオリゴヌク
レオチド（CD14R遺伝子増幅用フォワードプライマ
ー）、配列表・配列番号６に示される配列を有するオリ
ゴヌクレオチド（CD14R遺伝子増幅用リバースプライマ
ー）を用いて、核酸抽出キット「QIAamp」（キアゲン）
で血液より抽出したヒトゲノムDNA試料からCD14R遺伝子
の一部をPCRで増幅した。これらのDNA試料は、通常の配
列決定方法により、あらかじめCD14R-260の塩基が特定
されており、それぞれCC/CT/TTの3種類である。PCRには
KOD DNA polymerase（東洋紡績）を用い、メーカー指定
の条件で35サイクルの増幅反応を実施した。もっとも、
このPCRは単に遺伝子の特定領域を増幅することが目的
であるため、PCRの方法や酵素の種類に特段の制限はな
い。また、PCR時にリバースプライマーを定法の10倍投
入し、アンチセンスストランドを優先的に増幅させた
(＝表２中でPCR"R増量"と記載)サンプル、PCR時にフォ
ワードプライマーを定法の10倍投入し、センスストラン
ドを優先的に増幅させた(＝表２中でPCR"F増量"と記載)
サンプルもある。その後、牛小腸アルカリ性ホスファタ
ーゼ(東洋紡)で37℃15分処理後、80℃15分で処理した。 （PCR組成(定法)）total液量 25μL フォワードプライマー 5pmol(50pmol) リバースプライマー 5pmol(50pmol) ×10緩衝液 2.5μL 2mM dNTP 2.5μL KOD DNA polymerase 1U 抽出DNA溶液 100ng （PCR条件） 94℃・5分 94℃・1分、55℃・2分、68℃・1分（35サイクル） 68℃・2分 （４）特異的なddNTPの取り込み反応 (３)で準備したPCR産物に、SNP検出プライマー、特定の
biotin化ddNTP(B-ddNTP)、DNA polymeraseなどを加え、
ddNTPの取り込みを行わせる。今回はSNPの種類がCとTで
あるが、これはセンスストランドの塩基であり、アンチ
センスストランドではそれぞれGとAになる。よって、CD
14R-260SNP検出フォワードプライマーを用いる場合(＝
表２中でprimer"F"と記載)はB-ddCTPあるいはB-ddTTP、
CD14R-260SNP検出リバースプライマーを用いる場合(＝
表２中でprimer"R"と記載)はB-ddGTPあるいはB-ddATPを
使用した。また、DNA polymeraseにはサンガー法に広く
使用されている改変型Tth DNA polymerase「Delta-Tth
DNA polymerase」(東洋紡績)を使用した。B-ddTTPおよ
びB-CTPは、B-ddATPおよびB-ddGTPに比べて取り込み効
率が悪いため、多く投入している。 （ddNTP取り込み反応組成）total液量 25μL 検出プライマー 10pmol ×10緩衝液 2.5μL B-ddCTP 2000pmol あるいは、B-ddTTP 2000pmol あるいは、B-ddGTP 400pmol あるいは、B-ddATP 400
pmol Delta-Tth DNA polymerase 5U PCR反応液(処理後) 1μL （ddNTP取り込み反応条件） 92℃・1分 92℃・1分、45℃・1分（20サイクル） 75℃・1分 （５）マイクロタイタープレート中でのハイブリダイゼ
ーション (４)の取り込み反応液を10倍に希釈し、0.3N NaOH中でD
NAを変性させ、各サンプルごとに20μLを200mMクエン酸
−リン酸緩衝液(pH6.0)、2%SDS、750mM NaClの溶液100
μLに加えて、上記(２)の捕捉プローブが結合したマイ
クロタイタープレートに投入した。蒸発を防ぐため流動
パラフィンを重層し、37℃で30分間振盪させた。これに
よって、検出プライマーが、固定化された捕捉プローブ
によって特異的にマイクロタイタープレートに捕捉され
る。
プライマー（配列番号７）とCD14R-260SNP検出リバース
プライマー（配列番号８）の２種類を用いたのは、どち
らのプライマーでも検出可能であることを示すためであ
る。 （１）必要なオリゴヌクレオチドの準備 配列表・配列番号５に示される配列を有するオリゴヌク
レオチド（CD14R遺伝子増幅用フォワードプライマ
ー）、配列表・配列番号６に示される配列を有するオリ
ゴヌクレオチド（CD14R遺伝子増幅用リバースプライマ
ー）、配列表・配列番号７に示される配列を有するオリ
ゴヌクレオチド（CD14R-260SNP検出フォワードプライマ
ー）、配列表・配列番号８に示される配列を有するオリ
ゴヌクレオチド（CD14R-260SNP検出リバースプライマ
ー）、配列表・配列番号９に示される配列を有するオリ
ゴヌクレオチド（dT20捕捉プローブ用オリゴヌクレオチ
ド）を合成した。dT20捕捉プローブ用オリゴヌクレオチ
ドは、5'末端にアミノリンカーアームを有する。 （２）捕捉プローブ用オリゴヌクレオチドのマイクロタ
イタープレートへの結合 上記（１）で合成した捕捉プローブ用オリゴヌクレオチ
ドについて、そのリンカーアームを介してのマイクロタ
イタープレート内面への結合を行った。リンカーオリゴ
ヌクレオチドを50mM ほう酸バッファー（pH10）・100mM
MgCl2の溶液に0.05pmol/μLになるように希釈し、マイ
クロタイタープレート（MicroFLUOR B、ダイナテック
社）に各100μLずつ分注し、１５時間程度室温に放置す
ることでリンカーオリゴヌクレオチドをマイクロタイタ
ープレート内面に結合させる。その後、0.1pmol dNTP・
0.5% PVP(ポリビニルピロリドン)・5×SSCに置換して、
非特異反応を抑えるためのブロッキングを室温で２時間
程度行った。最後に1×SSCで洗浄して乾燥させた。 （３）特定すべき１塩基多型を含む領域のPCRによる増
幅 配列表・配列番号５に示される配列を有するオリゴヌク
レオチド（CD14R遺伝子増幅用フォワードプライマ
ー）、配列表・配列番号６に示される配列を有するオリ
ゴヌクレオチド（CD14R遺伝子増幅用リバースプライマ
ー）を用いて、核酸抽出キット「QIAamp」（キアゲン）
で血液より抽出したヒトゲノムDNA試料からCD14R遺伝子
の一部をPCRで増幅した。これらのDNA試料は、通常の配
列決定方法により、あらかじめCD14R-260の塩基が特定
されており、それぞれCC/CT/TTの3種類である。PCRには
KOD DNA polymerase（東洋紡績）を用い、メーカー指定
の条件で35サイクルの増幅反応を実施した。もっとも、
このPCRは単に遺伝子の特定領域を増幅することが目的
であるため、PCRの方法や酵素の種類に特段の制限はな
い。また、PCR時にリバースプライマーを定法の10倍投
入し、アンチセンスストランドを優先的に増幅させた
(＝表２中でPCR"R増量"と記載)サンプル、PCR時にフォ
ワードプライマーを定法の10倍投入し、センスストラン
ドを優先的に増幅させた(＝表２中でPCR"F増量"と記載)
サンプルもある。その後、牛小腸アルカリ性ホスファタ
ーゼ(東洋紡)で37℃15分処理後、80℃15分で処理した。 （PCR組成(定法)）total液量 25μL フォワードプライマー 5pmol(50pmol) リバースプライマー 5pmol(50pmol) ×10緩衝液 2.5μL 2mM dNTP 2.5μL KOD DNA polymerase 1U 抽出DNA溶液 100ng （PCR条件） 94℃・5分 94℃・1分、55℃・2分、68℃・1分（35サイクル） 68℃・2分 （４）特異的なddNTPの取り込み反応 (３)で準備したPCR産物に、SNP検出プライマー、特定の
biotin化ddNTP(B-ddNTP)、DNA polymeraseなどを加え、
ddNTPの取り込みを行わせる。今回はSNPの種類がCとTで
あるが、これはセンスストランドの塩基であり、アンチ
センスストランドではそれぞれGとAになる。よって、CD
14R-260SNP検出フォワードプライマーを用いる場合(＝
表２中でprimer"F"と記載)はB-ddCTPあるいはB-ddTTP、
CD14R-260SNP検出リバースプライマーを用いる場合(＝
表２中でprimer"R"と記載)はB-ddGTPあるいはB-ddATPを
使用した。また、DNA polymeraseにはサンガー法に広く
使用されている改変型Tth DNA polymerase「Delta-Tth
DNA polymerase」(東洋紡績)を使用した。B-ddTTPおよ
びB-CTPは、B-ddATPおよびB-ddGTPに比べて取り込み効
率が悪いため、多く投入している。 （ddNTP取り込み反応組成）total液量 25μL 検出プライマー 10pmol ×10緩衝液 2.5μL B-ddCTP 2000pmol あるいは、B-ddTTP 2000pmol あるいは、B-ddGTP 400pmol あるいは、B-ddATP 400
pmol Delta-Tth DNA polymerase 5U PCR反応液(処理後) 1μL （ddNTP取り込み反応条件） 92℃・1分 92℃・1分、45℃・1分（20サイクル） 75℃・1分 （５）マイクロタイタープレート中でのハイブリダイゼ
ーション (４)の取り込み反応液を10倍に希釈し、0.3N NaOH中でD
NAを変性させ、各サンプルごとに20μLを200mMクエン酸
−リン酸緩衝液(pH6.0)、2%SDS、750mM NaClの溶液100
μLに加えて、上記(２)の捕捉プローブが結合したマイ
クロタイタープレートに投入した。蒸発を防ぐため流動
パラフィンを重層し、37℃で30分間振盪させた。これに
よって、検出プライマーが、固定化された捕捉プローブ
によって特異的にマイクロタイタープレートに捕捉され
る。
【００３１】次に、2×SSC(pH7.0)、1%SDSに置換し、同
様に蒸発を防ぐため、流動パラフィンを重層し、37℃で
20分間振盪させた。その後、アルカリフォスファターゼ
を標識したストレプトアビジン（DAKO製D0396）を50mM
トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)、1%BSAの溶液で2000倍に希
釈した溶液100μLと置換し、37℃で15分間振盪させた。
これによって、捕捉された検出プライマーにB-ddNTPが
取り込まれている場合、ビオチンにアルカリ性ホスファ
ターゼ標識したストレプトアビジンが特異的に結合す
る。250μLの50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)、0.025%
Tween20溶液で3回洗浄後、アルカリ性ホスファターゼの
発光基質であるジオキセタン化合物（商品名：CSPD；TR
OPIX社）50μLを注入し、37℃で15分間保温後に暗室中
でホトンカウンター（浜松ホトニクス社）で発光量を測
定した。 （６）ヒトCD14 receptor遺伝子1塩基多型測定結果 上記(５)にて検出されたCD14 receptor遺伝子の挿入遺
伝子多型検出結果を表２に示す。数値は発光量(cps：co
unt/second)で表示される。表２中のCCとGG、CTとGA、T
TとAAは同じサンプルである。表２に示すように、CD14R
-260SNP検出フォワードプライマーを用いる場合、B-ddC
TPを取り込ませる反応系では、CC及びCTのようにCのア
リルを含むサンプルでは発光量が高く出るのに対し、C
のアリルを含まないTTのサンプルでは3kcps未満の発光
量にとどまる。一方、B-ddTTPを取り込ませる反応系で
は、TT及びCTのようにTのアリルを含むサンプルでは発
光量が高く出るのに対し、Tのアリルを含まないCCのサ
ンプルでは3kcps未満の発光量にとどまる。CD14R-260SN
P検出リバースプライマーを用いる場合、B-ddGTPを取り
込ませる反応系では、GG及びGAのようにAのアリルを含
むサンプルでは発光量が高く出るのに対し、Gのアリル
を含まないAAのサンプルでは3kcps未満の発光量にとど
まる。一方、B-ddATPを取り込ませる反応系では、AA及
びGAのようにAのアリルを含むサンプルでは発光量が高
く出るのに対し、Aのアリルを含まないGGのサンプルで
は3kcps未満の発光量にとどまる。カットオフとして3kc
psを設定すれば、実施例１の場合と同様にSNPの判定が
可能となる。この結果により、検出プライマーの5'末端
にdA 20merを付加し、dT 20merの捕捉プローブで検出す
ることが可能であることが示された。これにより、捕捉
プローブの共通化を図ることができる。また、非対称PC
Rの効果も再確認することができた。
様に蒸発を防ぐため、流動パラフィンを重層し、37℃で
20分間振盪させた。その後、アルカリフォスファターゼ
を標識したストレプトアビジン（DAKO製D0396）を50mM
トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)、1%BSAの溶液で2000倍に希
釈した溶液100μLと置換し、37℃で15分間振盪させた。
これによって、捕捉された検出プライマーにB-ddNTPが
取り込まれている場合、ビオチンにアルカリ性ホスファ
ターゼ標識したストレプトアビジンが特異的に結合す
る。250μLの50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)、0.025%
Tween20溶液で3回洗浄後、アルカリ性ホスファターゼの
発光基質であるジオキセタン化合物（商品名：CSPD；TR
OPIX社）50μLを注入し、37℃で15分間保温後に暗室中
でホトンカウンター（浜松ホトニクス社）で発光量を測
定した。 （６）ヒトCD14 receptor遺伝子1塩基多型測定結果 上記(５)にて検出されたCD14 receptor遺伝子の挿入遺
伝子多型検出結果を表２に示す。数値は発光量(cps：co
unt/second)で表示される。表２中のCCとGG、CTとGA、T
TとAAは同じサンプルである。表２に示すように、CD14R
-260SNP検出フォワードプライマーを用いる場合、B-ddC
TPを取り込ませる反応系では、CC及びCTのようにCのア
リルを含むサンプルでは発光量が高く出るのに対し、C
のアリルを含まないTTのサンプルでは3kcps未満の発光
量にとどまる。一方、B-ddTTPを取り込ませる反応系で
は、TT及びCTのようにTのアリルを含むサンプルでは発
光量が高く出るのに対し、Tのアリルを含まないCCのサ
ンプルでは3kcps未満の発光量にとどまる。CD14R-260SN
P検出リバースプライマーを用いる場合、B-ddGTPを取り
込ませる反応系では、GG及びGAのようにAのアリルを含
むサンプルでは発光量が高く出るのに対し、Gのアリル
を含まないAAのサンプルでは3kcps未満の発光量にとど
まる。一方、B-ddATPを取り込ませる反応系では、AA及
びGAのようにAのアリルを含むサンプルでは発光量が高
く出るのに対し、Aのアリルを含まないGGのサンプルで
は3kcps未満の発光量にとどまる。カットオフとして3kc
psを設定すれば、実施例１の場合と同様にSNPの判定が
可能となる。この結果により、検出プライマーの5'末端
にdA 20merを付加し、dT 20merの捕捉プローブで検出す
ることが可能であることが示された。これにより、捕捉
プローブの共通化を図ることができる。また、非対称PC
Rの効果も再確認することができた。
【００３２】
【表２】
【００３３】
【発明の効果】本発明によれば、試料中に含まれる１塩
基多型を含む特定の核酸配列中に塩基多型の種類を容易
に検出できる核酸配列分析法を提供できる。
基多型を含む特定の核酸配列中に塩基多型の種類を容易
に検出できる核酸配列分析法を提供できる。
【００３４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOYO BOSEKI KABUSHIKI KAISHA <120> A METHOD FOR DETECTING SNPs <130> 20D00JP <140> <141> <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 1 TCGGGCTGGG AAGATCGAGC 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 CTCTGCCCCT TCTCCTGCGC 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 CTGCCGGGTC CCCATCTTC 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 GAAGATGGGG ACCCGGCAG 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 CGCCTGAGTC ATCAGGACAC 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 CCTTTCCTGG AAATATTGCA 20 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 7 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA CAGAATCCTT CCTGTTACGG 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 8 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AGGATGTTTC AGGGAGGGGG 40 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 9 TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 20
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 青野 利哉 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 (72)発明者 吉賀 聡子 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 HA12 HA19 4B063 QA12 QA18 QQ42 QR08 QR32 QR56 QR62 QS03 QS34 QX02
Claims (8)
- 【請求項１】染色体又はその断片の配列上の１塩基多型
を検出する方法であって、多型塩基に隣接する塩基を
３' 末端に有する核酸プライマー、識別可能な特徴を有
する多型塩基に対応したいずれか１種類のダイデオキシ
ヌクレオチド或いはその混合物、DNAポリメラーゼとそ
の活性発現に必要な組成物を含む反応液に試料核酸を反
応させ、核酸プライマーへのダイデオキシヌクレオチド
取り込みの有無を検出することにより特定すべき塩基の
種類を検出する方法。 - 【請求項２】 取り込まれるダイデオキシヌクレオチド
の識別可能な特徴がビオチン基である、請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】 取り込み反応後に核酸プライマーを捕捉
用プローブとハイブリダイズすることにより捕捉して検
出することを特徴とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 DNAポリメラーゼが耐熱性であり、温度
サイクルにより核酸変性とアニール・取り込みを繰り返
して感度を向上させることを特徴とする、請求項１記載
の方法。 - 【請求項５】 検出される側のストランドが優先的に増
幅するように核酸プライマーの量比を不均一にして、検
出に使用する試料核酸を事前に増幅することを特徴とす
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】核酸プライマーと同じ試料核酸ストランド
にハイブリダイズする増幅用プライマーを逆側の試料核
酸ストランドにハイブリダイズする増幅用プライマーに
比べて5〜10倍増やすことを特徴とする請求項５に記載
の方法。 - 【請求項７】 検出に使用する試料核酸を事前に増幅し
た後、１塩基多型を検出する際に障害となる各種デオキ
シヌクレオチドをフォスファターゼで脱リン酸化するこ
とを特徴とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】それぞれの核酸プライマーの5'末端側にあ
らかじめ任意に設定した共通の配列のオリゴヌクレオチ
ドを結合させ、該共通配列オリゴヌクレオチドと相補性
の捕捉プローブを用いて核酸プライマーを捕捉した後、
検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000225354A JP2002034599A (ja) | 2000-07-26 | 2000-07-26 | １塩基多型を検出する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000225354A JP2002034599A (ja) | 2000-07-26 | 2000-07-26 | １塩基多型を検出する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002034599A true JP2002034599A (ja) | 2002-02-05 |
Family
ID=18719140
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000225354A Pending JP2002034599A (ja) | 2000-07-26 | 2000-07-26 | １塩基多型を検出する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002034599A (ja) |
-
2000
- 2000-07-26 JP JP2000225354A patent/JP2002034599A/ja active Pending
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