JP2021510541A - 新規なプライマーおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年1月12日に出願された米国仮特許出願第62/617,066号の利益を主張するものであり、該文献は、その全体が、本明細書において参照により援用されている。
本出願には、ASCII形式にて電子的に送信された配列表が含まれており、この配列表は、その全体が、本明細書において参照により援用されている。前記ASCIIコピーは、作成日を2018年12月27日とし、名称をN_022_WO_Ol_SL.txtとし、且つサイズを3,844バイトとしたものである。
(a)標的特異的セクションとアダプターセクションとステム形成セクションとを含むループ可能プライマーであって、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能である、ループ可能プライマー、あるいは
(b)第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、第1の標的特異的セクションと第2の標的特異的セクションとの間に位置するアダプターセクションとを備える、スプリットプライマー、あるいは
(c)第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、第1の標的特異的セクションと第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含むか、または、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、第1のアダプターセクションと第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーに該当するものである。
少なくとも2つの予備増幅サイクルを含む。本予備増幅サイクルに使用されるプライマーは、以下:
(a)標的特異的セクションとアダプターセクションとステム形成セクションとを含むループ可能プライマーであって、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であるループ可能プライマー、あるいは
(b)第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、第1の標的特異的セクションと第2の標的特異的セクションとの間に位置するアダプターセクションとを備える、スプリットプライマー、あるいは
(c)第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、第1の標的特異的セクションと第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションとを含むか、または、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、第1のアダプターセクションと第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマーであって、各予備増幅サイクルが、プライマーを鋳型DNAまたはその予備増幅産物にアニーリングし、アニーリングされたプライマーを伸長することを含む、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーに該当するものである。
(a)標的特異的セクションとアダプターセクションとステム形成セクションとを含むループ可能プライマーであって、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能である、ループ可能プライマー、あるいは
(b)第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、第1の標的特異的セクションと第2の標的特異的セクションとの間に位置するアダプターセクションとを備える、スプリットプライマー、あるいは
(c)第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、第1の標的特異的セクションと第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含むか、または、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、第1のアダプターセクションと第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーに該当するものである。
鋳型DNAから対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも2回の予備増幅サイクルを用い、以下:
(a)1つ以上のループ可能プライマーであって、各々が標的特異的セクションとアダプターセクションと分子インデクシングセクションとステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと分子インデクシングセクションと標的特異的セクションの5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、ループ可能プライマー、
(b)1つ以上のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、第1の標的特異的セクションと第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、アダプターセクションとを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと分子インデクシングセクションとを含むループおよびステム構造を形成するために、第2の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、スプリットループ可能プライマー、あるいは
(c)1つ以上のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、第1のアダプターセクションと第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、標的特異的セクションとを含み、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、第2のアダプターセクションと分子インデクシングセクションと標的特異的セクションの5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第1および/または第2のアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して予備増幅産物を増幅することと、
増幅産物の配列決定を行い、分子インデクシング配列を使用して対象の標的遺伝子座のコピー数多型を判別することと、
を含む、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用するものである。
母体の血液サンプルから分離された無細胞DNAから、1つ以上の染色体の、複数の対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際に、少なくとも2回の予備増幅サイクルを用い、以下:
(a)複数のループ可能プライマーであって、各々が標的特異的セクションとアダプターセクションと分子インデクシングセクションとステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと分子インデクシングセクションと標的特異的セクションの5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、ループ可能プライマー、
(b)複数のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、第1の標的特異的セクションと第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、アダプターセクションとを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと分子インデクシングセクションとを含むループおよびステム構造を形成するために、第2の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、スプリットループ可能プライマー、あるいは
(c)複数のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、第1のアダプターセクションと第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、標的特異的セクションとを含み、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、第2のアダプターセクションと分子インデクシングセクションと標的特異的セクションの5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第1および/または第2のアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して予備増幅産物を増幅することと、
増幅産物の配列決定を行い、分子インデクシング配列を使用して胎児の異数性を判別することと、
を含む。
鋳型DNAから対象の1つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも2回の予備増幅サイクルを用い、以下:
(a)少なくとも第1のループ可能プライマーおよび第2のループ可能プライマーであって、これらプライマーの各々が標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと標的特異的セクションの5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含む、第1および第2のループ可能プライマー、
(b)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、これらプライマーの各々が、第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、第1の標的特異的セクションと第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、ステム形成セクションが、ステム構造およびアダプターセクションを含むループを形成するために、第2の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含む、スプリットループ可能プライマー、あるいは
(c)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、これらプライマーの各々が、第1アダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、第1アダプターセクションと第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、第2のアダプターセクションと標的特異的セクションの5’部分を含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第1および/または第2のアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、
第1のプライマーおよび第2のプライマーが、それらの標的特異的セクション内に相補的配列を含み、ステム形成セクションによる保護無しの場合にプライマーの二量体が形成され得る、第1および第2のスプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して予備増幅産物を増幅することと、
を含む。プライマーの二量体が形成されるのを防止することは、PCRタイリング(例えば、シングルマルチプレックスPCR反応において、オーバーラップまたはタイリングされた標的配列を増幅する場合)おいて、特に有用とされる。
鋳型DNAから対象の1つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも2回の予備増幅サイクルを用い、以下:
(a)標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを備える、ループ可能プライマーであって、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと標的特異的セクションの5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、ループ可能プライマーが、標的特異的セクションの5’部分もしくは3’部分にSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、ループ可能プライマー、
(b)第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、第1の標的特異的セクションと第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを備える、スプリットループ可能プライマーであって、ステム形成セクションが、アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、第2の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、スプリットループ可能プライマーが、標的特異的セクションにSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、スプリットループ可能プライマー、あるいは
(c)第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、第1のアダプターセクションと第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマーであって、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションは、第2のアダプターセクションと標的特異的セクションの5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第1および/または第2のアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含むみ、スプリットループ可能プライマーが、標的特異的セクションの3’部分にSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して、予備増幅産物を増幅することと、
を含む。
鋳型DNAから対象の1つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも2回の予備増幅サイクルを用い、以下:
(a)少なくとも第1のループ可能プライマーおよび第2のループ可能プライマーであって、各々が標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと標的特異的セクションの5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第1のループ可能プライマーのアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、第2のループ可能プライマーのアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列を含み、第1のループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’部分もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、第2のループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’部分もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、第1および第2のループ可能プライマー、
(b)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、第1の標的特異的セクションと第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、第2の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、第1のスプリットループ可能プライマーのアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、第2のスプリットループ可能プライマーのアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列を含み、第1のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’部分もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、第2のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’部分もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、第1および第2のスプリットループ可能プライマー、あるいは
(c)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、第1のアダプターセクションと第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、この標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、第2のアダプターセクションと標的特異的セクションの5’部分を含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第1のスプリットループ可能プライマーの第1および/または第2のアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、第2のスプリットループ可能プライマーの第1および/または第2のアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列を含み、第1のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’部分もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、第2のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’部分もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、第1および第2のループ可能プライマー、のいずれかである、増幅することと、
第1の蛍光プローブおよび第2の蛍光プローブの存在下にて、ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して、予備増幅産物を増幅することと、
第1の蛍光プローブおよび第2の蛍光プローブからの蛍光信号のリアルタイム強度を検出することと、
を含む。
代替的に、対立遺伝子特異的qPCRのための方法は、予備増幅ステップを必要とせず、代わりに、第1の蛍光プローブおよび第2の蛍光プローブの存在下にて(a)、(b)または(c)のプライマーを使用して、鋳型DNAから対象の1つ以上の標的遺伝子座を増幅することと、
第1の蛍光プローブおよび第2の蛍光プローブからの蛍光信号のリアルタイム強度を検出することと、
を含む。
鋳型DNAから対象の1つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも2回の予備増幅サイクルを用い、以下:
(a)少なくとも第1のループ可能プライマーおよび第2のループ可能プライマーであって、各々が標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと標的特異的セクションの5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第1のループ可能プライマーのアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、第2のループ可能プライマーのアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列を含み、第1のループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’部分もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、第2のループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’部分もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、第1および第2のループ可能プライマー、
(b)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、第1の標的特異的セクションと第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、第2の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、第1のスプリットループ可能プライマーのアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、第2のスプリットループ可能プライマーのアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列を含み、第1のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’部分もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、第2のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’部分もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、第1および第2のスプリットループ可能プライマー、あるいは
(c)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、第1のアダプターセクションと第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、この標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、第2のアダプターセクションと標的特異的セクションの5’部分を含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第1のスプリットループ可能プライマーの第1および/または第2のアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、第2のスプリットループ可能プライマーの第1および/または第2のアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列を含み、第1のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’部分もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、第2のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’部分もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、第1および第2のループ可能プライマー、のいずれかである、増幅することと、
予備増幅産物を複数の反応容量にパーティショニングすることと、
第1の蛍光プローブおよび第2の蛍光プローブの存在下にて、ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して、予備増幅産物を各反応容量にて増幅することと、
第1の蛍光プローブおよび第2の蛍光プローブからの蛍光信号の存在または不在を検出することと、
を含む。
代替的に、対立遺伝子特異的dPCRのための方法は、予備増幅ステップを必要とせず、代わりに、
サンプルを複数の反応容量にパーティショニングすることと、
第1の蛍光プローブおよび第2の蛍光プローブの存在下にて(a)、(b)または(c)のプライマーを使用して、鋳型DNAから対象の1つ以上の標的遺伝子座を増幅することと、
第1の蛍光プローブおよび第2の蛍光プローブからの蛍光信号の存在または不在を検出することと、
を含む。
図2に、ループ可能プライマーの1つのスキームを示す。本スキーム中、標的特異的セクションは、5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能である。標的特異的セクションの3’部分がステム構造内で保護されている場合、標的特異的セクションの5’部分が、標的ハイブリダイゼーションの開始に利用可能となる。
図3に、ループ可能プライマーのもう1つのスキームを示す。本スキーム中、標的特異的セクションは、5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの5’部分に対しハイブリダイズ可能である。標的特異的セクションの5’部分がステム構造内で保護されている場合、標的特異的セクションの3’部分が、標的ハイブリダイゼーションを開始する目的に利用可能となる。
図4に、スプリットプライマーの1つのスキームを示す。本スキーム中、アダプターセクションは、第1の標的特異的セクションと第2の標的特異的セクションとの間に位置する。第1の標的特異的セクションおよび第2の標的特異的セクションの両方が、標的配列に対するハイブリダイゼーションに利用可能である。
(a)第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、第1の標的特異的セクションと第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含むか、あるいは(b)第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、第1のアダプターセクションと第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、(第1および/または第2の)標的特異的セクションが、増幅を目的とする鋳型DNAの標的配列に対しハイブリダイズ可能である。
図13に、スプリットループ可能プライマーの1つのスキームを示す。本スキーム中、第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、第1の標的特異的セクションと第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの5’部分に対しハイブリダイズ可能である。第1の標的特異的セクションが、ステム構造内で保護されている場合、第2の標的特異的セクションが標的ハイブリダイゼーションの開始に利用可能となる。
図13に、スプリットループ可能プライマーのもう1つのスキームを示す。本スキーム中、第1アダプターセクションと、第2アダプターセクションと、第1アダプターセクションと第2アダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、5’部分を含む標的特異的セクションとを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能である。標的特異的セクションの3’部分がステム構造内で保護されている場合、標的特異的セクションの5’部分が、標的ハイブリダイゼーションを開始する目的に利用可能となる。
いくつかの実施形態において、順方向ループ可能プライマーおよび逆方向ループ可能プライマーの両方は、図3に図示されているスキームBに対応している。
いくつかの実施形態において、順方向スプリットループ可能プライマーおよび逆方向スプリットループ可能プライマーの両方は、図13に図示されているスキームEに対応している。
鋳型DNAから対象の標的遺伝子座を増幅するための方法に関する。本方法は、
上記ループ可能プライマーまたは上記スプリットプライマーまたは上記スプリットループ可能プライマーを使用する少なくとも2回の予備増幅サイクルを含み、各予備増幅サイクルは、プライマーを鋳型DNAまたはその予備増幅産物にアニーリングし、アニーリングされたプライマーを伸長することを含む。
少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも10回、または最大15回、または最大10回、または最大7回、または最大5回の予備増幅サイクルを含む。
いくつかの実施形態において、順方向ループ可能プライマーおよび逆方向ループ可能プライマーの両方は、図3に図示されているスキームBに対応している。
いくつかの実施形態において、順方向スプリットループ可能プライマーおよび逆方向スプリットループ可能プライマーの両方は、図13に図示されているスキームEに対応している。
1つ以上のループ可能プライマーを用いた少なくとも2つの予備増幅サイクルを使用して鋳型DNAから対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、ループ可能プライマーの各々が、標的特異的セクションとアダプターセクションと分子インデクシングセクションとステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションは、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して予備増幅産物を増幅することと、
増幅産物の配列決定を行い、分子インデクシング配列を使用して、対象の標的遺伝子座のコピー数多型を判別することと、
を含む。
複数のループ可能プライマーを用いた少なくとも2つの予備増幅サイクルを使用して、母体の血液サンプルから単離された無細胞DNAから1つ以上の染色体の複数の対象の標的遺伝子座子座を予備増幅することであって、ループ可能プライマーの各々が、標的特異的セクションとアダプターセクションと分子インデクシングセクションとステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションは、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して予備増幅産物を増幅することと、
増幅産物の配列決定を行い、分子インデクシング配列を使用して胎児の異数性を判別することと、
を含む。
少なくとも第1のループ可能プライマーおよび第2のループ可能プライマーを用いた少なくとも2つの予備増幅サイクルを使用して、鋳型DNAから対象の1つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、各ループ可能プライマーが、標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションは、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、第1のループ可能プライマーおよび第2のループ可能プライマーが、それらの標的特異的セクション内に相補的配列を含み、ステム形成セクションによる保護無しの場合にプライマーの二量体が形成され得る、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して、予備増幅産物を増幅することと、
を含む。
ループ可能プライマーを用いた少なくとも2つの予備増幅サイクルを使用して、鋳型DNAから対象の1つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、このループ可能プライマーが、標的特異的セクションとアダプターセクションとステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションは、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、ループ可能プライマーは、標的特異的セクションの5’部分もしくは3’部分にSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して、予備増幅産物を増幅することと、
を含む。
少なくとも第1のループ可能プライマーおよび第2のループ可能プライマーを用いた少なくとも2つの予備増幅サイクルを使用して、鋳型DNAから対象の1つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、これらループ可能プライマーの各々が、標的特異的セクションとアダプターセクションとステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第1のループ可能プライマーのアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、第2のループ可能プライマーのアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列を含み、第1のループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、第2のループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、予備増幅すること、
第1の蛍光プローブおよび第2の蛍光プローブの存在下にてユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して予備増幅産物を増幅することと、
第1の蛍光プローブおよび第2の蛍光プローブからの蛍光信号のリアルタイム強度を検出することと、
を含む。
代替的に、対立遺伝子特異的qPCRのための方法は、予備増幅ステップを必要とせず、代わりに、
第1および第2の蛍光プローブの存在下にて第1および第2のループ可能プライマーを使用して鋳型DNAから対象の1つ以上の標的遺伝子座を増幅することと、
第1および第2の蛍光プローブからの蛍光信号のリアルタイム強度を検出することと、
を含む。
少なくとも第1のループ可能プライマーおよび第2のループ可能プライマーを用いた少なくとも2つの予備増幅サイクルを使用して、鋳型DNAから対象の1つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、これらループ可能プライマーの各々が、標的特異的セクションとアダプターセクションとステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第1のループ可能プライマーのアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、第2のループ可能プライマーのアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列および第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列を含み、第1のループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、第2のループ可能プライマーの標的特異的セクションの5’もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、予備増幅すること、
予備増幅産物を複数の反応容量にパーティショニングすることと、
第1の蛍光プローブおよび第2の蛍光プローブの存在下にて、ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して、予備増幅産物を各反応容量にて増幅することと、
第1の蛍光プローブおよび第2の蛍光プローブからの蛍光信号の存在または不在を検出することと、
を含む。
代替的に、対立遺伝子特異的dPCRのための方法は、予備増幅ステップを必要とせず、代わりに、
サンプルを複数の反応容量にパーティショニングすることと、
第1および第2の蛍光プローブの存在下にて第1および第2のループ可能プライマーを使用して、各反応容積にて鋳型DNAから対象の1つ以上の標的遺伝子座を増幅することと、
第1および第2の蛍光プローブからの蛍光信号の存在または不在を検出することと、
を含む。
2サイクルのワークフロー
3/10サイクルのワークフロー
プライマースキームの組み合わせごとに(図1)、市販の高フィデリティ酵素ミックスおよびDNAを調製した。
サンプルは循環させる条件は、以下の通りである。3回または10回のサイクル後に、20μLの調製済みプロテアーゼ溶液を反応液に添加し、65℃で15分間インキュベートした後、95℃で15分間不活化させた。
Claims (136)
- プライマー含有の組成物であって、前記プライマーが、以下:
(a)標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含むループ可能プライマーであって、前記ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能である、前記ループ可能プライマー、または
(b)第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するアダプターセクションとを備える、スプリットプライマー、または
(c)第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含むか、または、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、前記第1のアダプターセクションと前記第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーである、組成物。 - 前記プライマーがループ可能プライマーである、請求項1に記載の組成物。
- 前記アダプターセクションが、前記標的特異的セクションと前記ステム形成セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、
前記アダプターセクションを含むループが形成される、請求項2に記載の組成物。 - 前記アダプターセクションが、前記標的特異的セクションの5’側および前記ステム形成セクションの3’側に位置する、請求項3に記載の組成物。
- 前記プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項2に記載の組成物。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションと前記アダプターセクションとの間に位置する、請求項5に記載の組成物。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションの5’側および前記アダプターセクションの3’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループが形成される、請求項6に記載の組成物。
- 前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能である、請求項2に記載の組成物。
- 前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記3’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループが形成される、請求項8に記載の組成物。
- 前記ループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの3’末端に、1つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの5’部分に対しハイブリダイズ可能である、請求項2に記載の組成物。
- 前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含み但し前記標的特異的セクションの前記3’端部分を含まないループが形成される、請求項11に記載の組成物。
- 前記ループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの前記5’側に位置する1つ以上のGまたはCヌクレオチドを更に含み、任意で、前記ステム形成セクションの前記3’側に位置する1つ以上の相補的なGまたはCヌクレオチドにより前記ステム構造を安定化させる、請求項11に記載の組成物。
- 少なくとも順方向ループ可能プライマーと逆方向ループ可能プライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項2に記載の組成物。
- 前記プライマーがスプリットプライマーである、請求項1に記載の組成物。
- 前記プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項15に記載の組成物。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションのうちの1つとの間に位置する、請求項16に記載の組成物。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションの3’側に位置する、請求項17に記載の組成物。
- 少なくとも順方向スプリットプライマーと逆方向スプリットプライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項15に記載の組成物。
- 前記プライマーが、第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを備える、スプリットループ可能プライマーである、請求項1に記載の組成物。
- 前記アダプターセクションが、前記ステム形成セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記第2の標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含むループが形成される、請求項20に記載の組成物。
- 前記アダプターセクションが、前記第2の標的特異的セクションの5’側および前記ステム形成セクションの3’側に位置する、請求項21に記載の組成物。
- 前記スプリットループ可能プライマーが、前記第2の標的特異的セクションの3’末端に、1つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項22に記載の組成物。
- 前記スプリットループ可能プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項20に記載の組成物。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置する、請求項24に記載の組成物。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記第2の標的特異的セクションの5’側および前記アダプターセクションの3’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記第2の標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループが形成される、請求項25に記載の組成物。
- 少なくとも順方向スプリットループ可能プライマーと逆方向スプリットループ可能プライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項20に記載の組成物。
- 前記プライマーが、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、前記第1のアダプターセクションと前記第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマーである、請求項1に記載の組成物。
- 前記第2のアダプターセクションが、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第2のアダプターセクションを含むループが形成される、請求項28に記載の組成物。
- 前記第2のアダプターセクションが、前記標的特異的セクションの5’側および前記ステム形成セクションの3’側に位置する、請求項29に記載の組成物。
- 前記スプリットループ可能プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項28に記載の組成物。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記第2のアダプターセクションと前記標的特異的セクションとの間に位置する、請求項31に記載の組成物。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションの5’側および前記第2のアダプターセクションの3’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第2のアダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループが形成される、請求項32に記載の組成物。
- 前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であって、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記3’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第2のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループが形成される、請求項28に記載の組成物。
- 前記スプリットループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの3’末端に、1つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項34に記載の組成物。
- 少なくとも順方向スプリットループ可能プライマーと逆方向スプリットループ可能プライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項28に記載の組成物。
- 前記アダプターセクションがPCR増幅および/または配列決定用の、ユニバーサルアダプター配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- 少なくとも50個の異なるプライマーを含み、前記プライマーの各々が異なるステム形成セクションを含む、請求項1に記載の組成物。
- 少なくとも50個の異なるプライマーを含み、前記プライマーの各々が異なる分子インデクシング配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- 少なくとも2,500個の異なるプライマーを含み、前記プライマーの各々が前記ステム形成セクションと前記分子インデクシング配列との異なる組み合わせを含む、請求項1に記載の組成物。
- 少なくとも2回の予備増幅サイクルを含む、鋳型DNAから対象の標的遺伝子座を増幅する方法であって、その際、以下:
(a)標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを備えるループ可能プライマーであって、前記ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために前記標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能である、前記ループ可能プライマー、または
(b)第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するアダプターセクションとを備える、スプリットプライマー、または
(c)第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションとを含むか、または、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、前記第1のアダプターセクションと前記第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションとを備える、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記方法において、
各予備増幅サイクルが、前記プライマーを前記鋳型DNAまたはその予備増幅産物にアニーリングし、前記アニーリングされたプライマーを伸長することを含む、増幅方法。 - 前記方法が、前記ループ可能プライマーまたは前記スプリットプライマーまたは前記スプリットループ可能プライマーを使用する3回以上の予備増幅サイクルを含む、請求項41に記載の方法。
- 前記方法が、前記ループ可能プライマーまたは前記スプリットプライマーまたは前記スプリットループ可能プライマーを使用する5回以上の予備増幅サイクルを含む、請求項41に記載の方法。
- 前記方法が、前記ループ可能プライマーまたは前記スプリットプライマーまたは前記スプリットループ可能プライマーを使用する10回以下の予備増幅サイクルを含む、請求項41に記載の方法。
- 前記プライマーがループ可能プライマーである、請求項41に記載の方法。
- 前記アダプターセクションが、前記標的特異的セクションと前記ステム形成セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含むループが形成される、請求項45に記載の方法。
- 前記アダプターセクションが、前記標的特異的セクションの5’側および前記ステム形成セクションの3’側に位置する、請求項46に記載の方法。
- 前記プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項45に記載の方法。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションと前記アダプターセクションとの間に位置する、請求項48に記載の方法。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションの5’側および前記アダプターセクションの3’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記分子インデクシング配列とを含むループが形成される、請求項49に記載の方法。
- 前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能である、請求項45に記載の方法。
- 前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記3’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループが形成される、請求項51に記載の方法。
- 前記ループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの3’末端に、1つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項51に記載の方法。
- 前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの5’部分に対しハイブリダイズ可能である、請求項45に記載の方法。
- 前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含み但し前記標的特異的セクションの前記3’端部分を含まないループが形成される、請求項54に記載の方法。
- 前記ループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの前記5’側に位置する1つ以上のGまたはCヌクレオチドを更に含み、任意で、前記ステム形成セクションの前記3’側に位置する1つ以上の相補的なGまたはCヌクレオチドにより前記ステム構造を安定化させる、請求項54に記載の方法。
- 各予備増幅サイクルが、対象の同じ遺伝子座を、前記鋳型DNAまたはその予備増幅産物に標的化する少なくとも順方向ループ可能プライマーおよび逆方向ループ可能プライマーをアニーリングし、前記アニーリングされた順方向ループ可能プライマーおよび前記アニーリングされた逆方向ループ可能プライマーを伸長することを含む、請求項45に記載の方法。
- 前記プライマーがスプリットプライマーである、請求項41に記載の方法。
- 前記プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項58に記載の方法。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションのうちの1つとの間に位置する、請求項59に記載の方法。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションの3’側に位置する、請求項60に記載の方法。
- 各予備増幅サイクルが、対象の同じ遺伝子座を、前記鋳型DNAまたはその予備増幅産物に標的化する少なくとも順方向スプリットプライマーおよび逆方向スプリットプライマーをアニーリングし、前記アニーリングされた順方向スプリットプライマーおよび前記アニーリングされた逆方向スプリットプライマーを伸長することを含む、請求項58に記載の方法。
- 前記プライマーが、第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを備える、スプリットループ可能プライマーである、請求項41に記載の方法。
- 前記アダプターセクションが、前記ステム形成セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記第2の標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含むループが形成される、請求項63に記載の方法。
- 前記アダプターセクションが、前記第2の標的特異的セクションの5’側および前記ステム形成セクションの3’側に位置する、請求項64に記載の方法。
- 前記スプリットループ可能プライマーが、前記第2の標的特異的セクションの3’末端に、1つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項65に記載の方法。
- 前記スプリットループ可能プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項63に記載の方法。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置する、請求項67に記載の方法。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記第2の標的特異的セクションの5’側および前記アダプターセクションの3’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記第2の標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループが形成される、請求項68に記載の方法。
- 各予備増幅サイクルが、対象の同じ遺伝子座を、前記鋳型DNAまたはその予備増幅産物に標的化する少なくとも順方向スプリットループ可能プライマーおよび逆方向スプリットループ可能プライマーをアニーリングし、前記アニーリングされた順方向スプリットループ可能プライマーおよび前記アニーリングされた逆方向スプリットループ可能プライマーを伸長することを含む、請求項63に記載の方法。
- 前記プライマーが、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、前記第1のアダプターセクションと前記第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマーである、請求項41に記載の方法。
- 前記第2のアダプターセクションが、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第2のアダプターセクションを含むループが形成される、請求項71に記載の方法。
- 前記第2のアダプターセクションが、前記標的特異的セクションの5’側および前記ステム形成セクションの3’側に位置する、請求項72に記載の方法。
- 前記スプリットループ可能プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項71に記載の方法。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記第2のアダプターセクションと前記標的特異的セクションとの間に位置する、請求項74に記載の方法。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションの5’側および前記第2のアダプターセクションの3’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第2のアダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループが形成される、請求項75に記載の方法。
- 前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であって、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記3’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第2のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループが形成される、請求項76に記載の方法。
- 前記スプリットループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの3’末端に、1つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項77に記載の方法。
- 各予備増幅サイクルが、対象の同じ遺伝子座を前記鋳型DNAまたはその予備増幅産物に標的化する少なくとも順方向スプリットループ可能プライマーおよび逆方向スプリットループ可能プライマーをアニーリングし、前記アニーリングされた順方向スプリットループ可能プライマーおよび前記アニーリングされた逆方向スプリットループ可能プライマーを伸長することを含む、請求項71に記載の方法。
- 前記アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを用いた複数回のPCRサイクルを更に含む、請求項41に記載の方法。
- 前記1つ以上のPCRプライマーがそれぞれ、配列決定用アダプターおよび/またはサンプルバーコードを含む、請求項80に記載の方法。
- 各予備増幅サイクルが、少なくとも50個の異なるプライマーで、各プライマーが異なるステム形成セクションを含むものを、前記鋳型DNAまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む、請求項41に記載の方法。
- 各予備増幅サイクルが、少なくとも50個の異なるプライマーで、各プライマーが異なる分子インデクシング配列を含むものを、前記鋳型DNAまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む、請求項41に記載の方法。
- 各予備増幅サイクルが、少なくとも2,500個の異なるプライマーで、各プライマーが前記ステム形成セクションと前記分子インデクシング配列との異なる組み合わせを含むものを、前記鋳型DNAまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む、請求項41に記載の方法。
- 対象の標的遺伝子座を増幅するためのキットであって、以下のプライマー:
(a)標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを備える、ループ可能プライマーであって、前記ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能である、前記ループ可能プライマー、または
(b)第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するアダプターセクションとを備える、スプリットプライマー、または
(c)第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションとを含むか、または、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、前記第1のアダプターセクションと前記第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションとを備える、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを具備する、キット。 - ポリメラーゼを更に含む、請求項85に記載のキット。
- プロテアーゼを更に含む、請求項85に記載のキット。
- 前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な、1つ以上のPCRプライマーを更に含む、請求項85に記載のキット。
- 前記1つ以上のPCRプライマーがそれぞれ、配列決定用アダプターおよび/またはサンプルバーコードを含む、請求項88に記載のキット。
- 前記プライマーがループ可能プライマーである、請求項85に記載のキット。
- 前記アダプターセクションが、前記標的特異的セクションと前記ステム形成セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含むループが形成される、請求項90に記載のキット。
- 前記アダプターセクションが、前記標的特異的セクションの5’側および前記ステム形成セクションの3’側に位置する、請求項91に記載のキット。
- 前記プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項90に記載のキット。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションと前記アダプターセクションとの間に位置する、請求項93に記載のキット。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションの5’側および前記アダプターセクションの3’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記分子インデクシング配列とを含むループが形成される、請求項94に記載のキット。
- 前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能である、請求項90に記載のキット。
- 前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記3’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループが形成される、請求項96に記載のキット。
- 前記ループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの3’末端に、1つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項96に記載のキット。
- 前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの5’部分に対しハイブリダイズ可能である、請求項90に記載のキット。
- 前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含み但し前記標的特異的セクションの前記3’端部分を含まないループが形成される、請求項99に記載のキット。
- 前記ループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの前記5’側に位置する1つ以上のGまたはCヌクレオチドを更に含み、任意で、前記ステム形成セクションの前記3’側に位置する1つ以上の相補的なGまたはCヌクレオチドにより前記ステム構造を安定化させる、請求項99に記載のキット。
- 少なくとも順方向ループ可能プライマーと逆方向ループ可能プライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項90に記載のキット。
- 前記プライマーがスプリットプライマーである、請求項85に記載のキット。
- 前記プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項103に記載のキット。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションのうちの1つとの間に位置する、請求項104に記載のキット。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションの3’側に位置する、請求項105に記載のキット。
- 少なくとも順方向スプリットプライマーと逆方向スプリットプライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項103に記載のキット。
- 前記プライマーが、第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを備える、スプリットループ可能プライマーである、請求項85に記載のキット。
- 前記アダプターセクションが、前記ステム形成セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記第2の標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含むループが形成される、請求項108に記載のキット。
- 前記アダプターセクションが、前記第2の標的特異的セクションの5’側および前記ステム形成セクションの3’側に位置する、請求項109に記載のキット。
- 前記スプリットループ可能プライマーが、前記第2の標的特異的セクションの3’末端に、1つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項110に記載のキット。
- 前記スプリットループ可能プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項108に記載のキット。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置する、請求項112に記載のキット。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記第2の標的特異的セクションの5’側および前記アダプターセクションの3’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記第2の標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループが形成される、請求項113に記載のキット。
- 少なくとも順方向スプリットループ可能プライマーと逆方向スプリットループ可能プライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項108に記載のキット。
- 前記プライマーが、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、前記第1のアダプターセクションと前記第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマーである、請求項85に記載のキット。
- 前記第2のアダプターセクションが、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第2のアダプターセクションを含むループが形成される、請求項116に記載のキット。
- 前記第2のアダプターセクションが、前記標的特異的セクションの5’側および前記ステム形成セクションの3’側に位置する、請求項117に記載のキット。
- 前記スプリットループ可能プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項116に記載のキット。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記第2のアダプターセクションと前記標的特異的セクションとの間に位置する、請求項119に記載のキット。
- 前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションの5’側および前記第2のアダプターセクションの3’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第2のアダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループが形成される、請求項120に記載のキット。
- 前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であって、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記3’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第2のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’端部分とを含むループが形成される、請求項116に記載のキット。
- 前記スプリットループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの3’末端に、1つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項122に記載のキット。
- 少なくとも順方向スプリットループ可能プライマーと逆方向スプリットループ可能プライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項123に記載のキット。
- 前記アダプターセクションがPCR増幅および/または配列決定用の、ユニバーサルアダプター配列を含む、請求項85に記載のキット。
- 少なくとも50個の異なるプライマーの貯留物を含み、前記プライマーの各々が異なるステム形成セクションを含む、請求項85に記載のキット。
- 少なくとも50個の異なるプライマーの貯留物を含み、前記プライマーの各々が、異なる分子インデクシング配列を含む、請求項85に記載のキット。
- 少なくとも2,500個の異なるプライマーの貯留物を含み、前記プライマーの各々が前記ステム形成セクションと前記分子インデクシング配列との異なる組み合わせを含む、請求項85に記載のキット。
- 対象の標的遺伝子座のコピー数多型を判別する方法であって、
鋳型DNAから対象の前記標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも2回の予備増幅サイクルを用い、以下:
(a)1つ以上のループ可能プライマーであって、各々が標的特異的セクションとアダプターセクションと分子インデクシングセクションとステム形成セクションとを含み、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、前記ループ可能プライマー、
(b)1つ以上のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、アダプターセクションとを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第2の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、前記スプリットループ可能プライマー、あるいは
(c)1つ以上のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、前記第1のアダプターセクションと前記第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、標的特異的セクションとを含み、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記第2のアダプターセクションと前記分子インデクシングセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第1および/または第2のアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、前記スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記予備増幅することと、
前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して前記予備増幅産物を増幅することと、
前記増幅産物の配列決定を行い、前記分子インデクシング配列を使用して対象の前記標的遺伝子座のコピー数多型を判別することと、
を含む、方法。 - 胎児の異数性を判別する方法であって、
母体の血液サンプルから分離された無細胞DNAから、1つ以上の染色体の、複数の対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも2回の予備増幅サイクルを用い、以下:
(a)複数のループ可能プライマーであって、各々が標的特異的セクションとアダプターセクションと分子インデクシングセクションとステム形成セクションとを含み、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、前記ループ可能プライマー、
(b)複数のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、アダプターセクションとを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第2の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、前記スプリットループ可能プライマー、あるいは
(c)複数のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、前記第1のアダプターセクションと前記第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、標的特異的セクションとを含み、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記第2のアダプターセクションと前記分子インデクシングセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第1および/または第2のアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、前記スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記予備増幅することと、
前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して前記予備増幅産物を増幅することと、
前記増幅産物の配列決定を行い、前記分子インデクシング配列を使用して胎児の異数性を判別することと、
を含む、方法。 - マルチプレックス増幅の方法であって、
鋳型DNAから1つ以上の対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも2回の予備増幅サイクルを用い、以下:
(a)少なくとも第1のループ可能プライマーおよび第2のループ可能プライマーであって、前記プライマーの各々が標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含む、前記ループ可能プライマー、
(b)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、前記プライマーの各々が、第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第2の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含む、前記スプリットループ可能プライマー、あるいは
(c)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、前記プライマーの各々が、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、前記第1アダプターセクションと前記第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第2のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループを形成しており、前記第1および/または第2のアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、
前記第1のプライマーおよび前記第2のプライマーが、それらの標的特異的セクション内に相補的な配列を含み、前記ステム形成セクションによる保護無しの場合にプライマーの二量体が形成され得る、前記第1および第2のスプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記予備増幅することと、
前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して前記予備増幅産物を増幅することと、
を含む、方法。 - 対立遺伝子特異的増幅の方法であって、
鋳型DNAから1つ以上の対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも2回の予備増幅サイクルを用い、以下:
(a)標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを備える、ループ可能プライマーであって、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記ループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの前記3’部分にSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、前記ループ可能プライマー、
(b)第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを備える、前記スプリットループ可能プライマーであって、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第2の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記スプリットループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションにSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、前記スプリットループ可能プライマー、あるいは
(c)第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、前記第1のアダプターセクションと前記第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマーであって、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記第2のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第1および/または第2のアダプターセクションがPCR増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記スプリットループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの前記3’部分にSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、前記スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記予備増幅することと、
前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して前記予備増幅産物を増幅することと、
を含む、方法。 - 対立遺伝子特異的定量PCR(qPCR)の方法であって、
鋳型DNAから1つ以上の対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも2回の予備増幅サイクルを用い、以下:
(a)少なくとも第1のループ可能プライマーおよび第2のループ可能プライマーであって、各々が、標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第1のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、前記第2のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列とを含み、前記第1のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、前記第2のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、前記第1および第2のループ可能プライマー、
(b)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第2の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列とを含み、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、前記第1および第2のスプリットループ可能プライマー、あるいは
(c)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、前記第1のアダプターセクションと前記第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記第2のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分を含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記第1および/または第2のアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記第1および/または第2のアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列とを含み、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、前記第1および第2のループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記予備増幅することと、
前記第1の蛍光プローブおよび前記第2の蛍光プローブの存在下にて、前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して、前記予備増幅産物を増幅することと、
前記第1の蛍光プローブおよび前記第2の蛍光プローブからの蛍光信号のリアルタイム強度を検出することと、
を含む、方法。 - 対立遺伝子特異的デジタルPCR(dPCR)の方法であって、
鋳型DNAから1つ以上の対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも2回の予備増幅サイクルを用い、以下:
(a)少なくとも第1のループ可能プライマーおよび第2のループ可能プライマーであって、各々が、標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第1のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、前記第2のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列とを含み、前記第1のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、前記第2のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、前記第1および第2のループ可能プライマー、
(b)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第2の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列とを含み、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、前記第1および第2のスプリットループ可能プライマー、あるいは
(c)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、前記第1のアダプターセクションと前記第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記第2のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分を含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記第1および/または第2のアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記第1および/または第2のアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列とを含み、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、前記第1および第2のループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記予備増幅することと、
前記予備増幅産物を複数の反応容量にパーティショニングすることと、
前記第1の蛍光プローブおよび前記第2の蛍光プローブの存在下にて、前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な1つ以上のPCRプライマーを使用して、前記予備増幅産物を各反応容量にて増幅することと、
前記第1の蛍光プローブおよび前記第2の蛍光プローブからの蛍光信号の存在または不在を検出することと、
を含む、方法。 - 対立遺伝子特異的定量PCR(qPCR)の方法であって、
前記第1の蛍光プローブおよび前記第2の蛍光プローブの存在下にて、鋳型DNAから対象の1つ以上の標的遺伝子座を増幅することであって、その際、以下:
(a)少なくとも第1のループ可能プライマーおよび第2のループ可能プライマーであって、各々が、標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第1のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、前記第2のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列とを含み、前記第1のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、前記第2のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、前記第1および第2のループ可能プライマー、
(b)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第2の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列とを含み、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、
前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、前記第1および第2のスプリットループ可能プライマー、あるいは
(c)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、前記第1のアダプターセクションと前記第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記第2のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分を含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記第1および/または第2のアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記第1および/または第2のアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列とを含み、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、前記第1および第2のスプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記増幅することと、
前記第1の蛍光プローブおよび前記第2の蛍光プローブからの蛍光信号のリアルタイム強度を検出することと、
を含む、方法。 - 対立遺伝子特異的デジタルPCR(dPCR)の方法であって、
鋳型DNAを含むサンプルを複数の反応容量にパーティショニングすることと、
前記第1の蛍光プローブおよび前記第2の蛍光プローブの存在下にて、鋳型DNAから対象の1つ以上の標的遺伝子座を各反応容量にて増幅することであって、その際、以下:
(a)少なくとも第1のループ可能プライマーおよび第2のループ可能プライマーであって、各々が、標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第1のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、前記第2のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列とを含み、前記第1のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、前記第2のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、前記第1および第2のループ可能プライマー、
(b)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第1の標的特異的セクションと、第2の標的特異的セクションと、前記第1の標的特異的セクションと前記第2の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第2の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列とを含み、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、前記第1および第2のスプリットループ可能プライマー、あるいは
(c)少なくとも第1のスプリットループ可能プライマーおよび第2のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第1のアダプターセクションと、第2のアダプターセクションと、前記第1のアダプターセクションと前記第2のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、前記標的特異的セクションが5’部分と3’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記第2のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記5’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記3’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記第1および/または第2のアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第1の蛍光プローブに結合し得る第1のプローブ特異的配列とを含み、前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記第1および/または第2のアダプターセクションが、PCR増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第2の蛍光プローブに結合し得る第2のプローブ特異的配列とを含み、前記第1のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第1のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含み、前記第2のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記5’もしくは3’部分が、第2のSNVもしくはSNP対立遺伝子を含む、前記第1および第2のスプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記増幅することと、
前記第1の蛍光プローブおよび前記第2の蛍光プローブからの蛍光信号の存在または不在を検出することと、
を含む、方法。
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