JP3421036B2 - Ｄｎａ配列の解析のための化学的方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、DNA配列の標的位置にある塩基を同定する
ための新規方法に関する。

診断又は法廷用のDNA解析では、１個の塩基の変異や
ミスマッチを検出すれば必要な情報が得られるような場
合に標的DNAを完全に配列決定する必要はない。このよ
うな１塩基変異やミスマッチは例えば点変異によって生
ずることもあるし、遺伝物質の欠失や挿入によっても生
ずるが、このような場合には配列中の最初の異常塩基を
検出すれば診断に必要な情報が得られるであろう。こう
した点から、対立遺伝子特異的PCR法が開発された。こ
の方法では、標的DNAに対して一対のプライマー対を用
いて試料のPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を行なうが、
上記プライマー対の片方は比較的短くて標的DNAの一方
の対立遺伝子座とはハイブリダイズするがもう一方の対
立遺伝子配列とはハイブリダイズしない。したがって、
増幅が起こらなければ、ハイブリッドを形成しない対立
型のDNAが存在していることの指標となるが、残念なが
ら、正常なDNAに確実にハイブリダイズさせるために必
要とされる諸条件を現実に遂行することは困難である。

標的変異又は対立型変異領域から離れた位置にハイブ
リダイズするようなプローブを使用した後、突然変異領
域又は対立型変異領域とはハイブリダイズしないような
標識プローブを使用して、PCRを行なうことが提案され
ている。しかし、この方法も一般に偽陰性を与える。

対立遺伝子特異的DNAを検出するためのリガーゼ連鎖
反応（LCR）と呼ばれる方法が最近開発されており、バ
ラングによって概説されている（F.Barang,PCR Methods
and Applications Vol.1,5−16）。この方法では、相
補DNA上で互いに隣接してハイブリダイズするような２
つの異なるオリゴヌクレオチドが必要であり、結果を判
定する前にLCR生成物をポリアクリルアミドゲル上で分
離する必要がある。

完全に配列を決定する方法、特にWO89/09282に記載さ
れているような固相配列決定法は正確な結果を与える
が、もっと多大な労力を必要とし、そのため診断用スク
リーニングには適さない場合もある。

本発明は、増幅及び固定化された一本鎖形のDNAの４
つのアリコート（分割試料）についてポリメラーゼ連鎖
反応を行なうという発想に基づくものである。各々のア
リコートについて、同一の特異的伸長プライマーと異な
るジデオキシヌクレオチドとを用いるが、デオキシヌク
レオチドは使用せず、こうして、標的位置の塩基に相補
的なジデオキシヌクレオチドだけが組込まれるようにす
る。このとき、上記標的位置は上記DNAにハイブリダイ
ズする特異的伸長プライマーの３′末端の直ぐ隣であ
る。言い換えると、固定化鎖上での標的位置は、当該DN
Aに特異的伸長プライマーがハイブリダイズする場所の
直ぐ５′側である。次に、通常のデオキシヌクレオチド
を用いた鎖伸長反応（いわゆる追跡反応）を、上記特異
的プライマーを用いて行なって、ジデオキシヌクレオチ
ドでブロックされたDNAが未反応のまま残る一方で、ブ
ロックされていないDNAは二本鎖DNAを形成するようにす
る。次に、各種の方法を用いて二本鎖DNAを非伸長鎖
（即ち、実質的に一本鎖のDNA）と区別して、標的位置
の塩基の同定ができるようにする。

このように、本発明は、DNA配列のある標的位置の塩
基を同定する方法にして、試料DNAを増幅処理に付し；
その増幅DNAを固定化した後で二本鎖解離処理に付し
て、非固定鎖を取り除き、標的位置の直ぐ隣で固定化DN
Aにハイブリダイズするような伸長プライマーを与え、
固定化された一本鎖DNAの４つのアリコートの各々を１
種類のジデオキシヌクレオチド存在下でのポリメラーゼ
反応に付し、その際、各アリコートについて異なるジデ
オキシヌクレオチドを用いて標的位置の塩基に相補的な
ジデオキシヌクレオチドだけが組込まれるようにしてお
き；次に、４つのアリコートを４種類すべてのデオキシ
ヌクレオチドの存在下での伸長反応に付して、各アリコ
ート中においてジデオキシヌクレオチドと反応していな
いDNAが伸長して二本鎖DNAを形成する一方で、ジデオキ
シヌクレオチドでブロックされたDNAは非伸長鎖DNAとし
て残るようにしておき；しかる後に、二本鎖及び／又は
非伸長鎖DNAの同定を行なって、どのジデオキシヌクレ
オチドが導入されていて、したがってどの塩基が標的位
置に存在しているのかを明らかにすることを特徴とする
方法を提供する。

本明細書中で用いるジデオキシヌクレオチドという用
語は、３′−水酸基が存在しない又は３′−水酸基が修
飾されている２′−デオキシヌクレオチドであって、ポ
リメラーゼ存在下でプライマーに付加させることはでき
るがそれ以降の重合反応に入ることのできない２′−デ
オキシヌクレオチドをすべて包含する。

試料DNAはPCR法によってインヴィトロ（in vitro）で
増幅させるのが好ましいが、インヴィトロ自続式配列複
製法（Self Sustained Sequence Replication;3SR法と
略される）やベクター中でのインヴィボ（in vivo）増
幅法のようなその他の方法も用いることができ、所望に
よっては、インヴィトロ及びインヴィボ増幅を併用して
もよい。どのような増幅法を用いようとも、増幅された
DNAが固体担体に固定化されるか或いは固体担体への結
合手段を備えているのが望ましい。例えば、PCRプライ
マーを固体担体に固定化してもよいし、或いはPCRプラ
イマーに固体担体への結合手段を与えてもよい。また、
ベクター内の試料DNAの挿入部位の隣に固体担体結合手
段を含ませて、増幅試料DNAと結合手段とが一緒に切り
出されるようにしてもよい。

PCR法では、標的DNAの既知配列に特異的な一対の重合
用プライマーを選択する。即ち、一方のプライマーはそ
のDNA二本鎖の片方の鎖の５′末端もしくはその近傍に
ハイブリダイズし、もう一方のプライマーが相補鎖の
５′末端もしくはその近傍にハイブリダイズするように
して、ポリメラーゼ存在下でそれぞれのプライマーから
標的DNA鋳型の末端に至るまで伸長したDNA配列が生ずる
ようにする。こうして合成されたDNAを次に二本鎖解離
処理（通常は約90℃の温度で融解して行なう）に付す
と、新たに合成された一本鎖DNA配列が混合液中の過剰
のプライマーとハイブリダイズ（通常は温度をアニーリ
ングに適した範囲まで下げた後）するので、ポリメラー
ゼ存在下でさらにDNA鎖が合成されるが、このときは両
プライマーの末端から末端までの部分しか伸長しない。
ポリメラーゼは上記二本鎖解離段階で利用される高温に
耐え得るものが好ましいが、最近、これに適した好熱性
ポリメラーゼ、即ち、Taqが入手できるようになった。D
NA合成に必要な上記２種類のプライマーと各種ヌクレオ
チドとを媒液中に過剰量維持しておくと、各々の鎖を合
成し、解離し、プライマーをアニーリングし、さらに新
しい鎖を合成するという循環過程の繰返しを、単にこれ
ら各々の段階の至適温度に温度を上下させるだけで遂行
することができる。このようにして、最初の標的DNAを
指数関数適に増幅させることができ、比較的短時間のう
ちに濃度を百万倍も増大させることができる。

PCR法を用いる場合には、例えば比較的低いレベルの
バックグラウンドで明確な結果を与えるような十分なDN
Aが合成されたか否かを決定するために、そのPCR法の効
率を評価するのが望ましい。各種の試験法が知られてい
るが、本出願人の考えでは、本出願人が以前に報告した
固定化増幅核酸を検出するためのDIANAという固相法（P
CT/EP90/00454（WO90/11369））を用いるのが好まし
い。このDIANA法は、例えばその好ましい具体的態様で
は、インヴィトロで増幅されたDNAの比色検出に用いら
れる。このアッセイはビオチン化又はその他の手段で官
能化されたPCRプライマーの使用に基づくものであり、
このプライマーはインヴィトロ増幅物を例えばストレプ
トアビジン被覆磁性ビーズ上に捕捉するために用いられ
る。もう一方のPCRプライマーはlacオペレーター配列の
ような「ハンドル」部を有しており、Lac Iリプレッサ
ー−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を用いて捕捉
DNAの比色検定を行なうことができる。（Wahlberg,J.,L
undeberg,J.,Hultman,T.and Uhln,M.（1990）“Gener
al colorimetric method for DNA diagnostics allowin
g direct solid−phasegenomic sequencing of the pos
itive samples"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,6569−65
73参照）。この好ましい形の定性的DIANAアッセイは、P
CR方法の諸々の利点と、ビオチン−ストレプトアビジン
系の高い特異性及び安定性と、β−ガラクトシダーゼに
基づく比色検定の簡単さとを併せ持っている。ビオチン
とストレプトアジビンの強い相互作用（K_d＝10^-15
M^-1）は系の効率をより一層高める。固体担体としての
磁性ビーズの使用により、遠心処理、濾過処理或いは沈
殿処理は全く必要なくなる（T.Hultman,S.Sthl,E.Hor
nes and M.Uhln,Nucl.Acids Res.17,4937（198
9））。ただし、本発明の方法では、同一のPCRプライマ
ーを固定化手段として用いると同時にlacオペレーター
配列組込み用にも用いるのが好ましい。

特定のDNA配列に結合するタンパク質は多数知られて
おり、オペロンの作動や抑制などの様々な遺伝プロセス
に関与していることも多い。このようなタンパク質の一
つがlacリプレッサーのLac Iであり、これはlacオペレ
ーター（lacOP）と反応して転写を抑制する。したがっ
て、仮に認識部位がlacOPのDNA配列であれば、Lac Iタ
ンパク質を介して標識を結合させることができる。Lac
IのようなDNA結合タンパク質ともう一つのタンパク質と
の融合タンパク質を工夫して、後者のタンパク質が、例
えば色や蛍光や化学発光に基づく方法を用いた後段での
検出に利用できるようにすると特に好ましい。このよう
なタンパク質の具体例はβ−ガラクトシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどである。

標識としては、増幅DNAの末端に導入された21塩基対
のlacオペレーター配列を認識するようなLac Iリプレッ
サー−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を使用する
のが好ましい。このlacオペレーター配列は、PCRプライ
マー対を使用する場合にはそのプライマー対の一方（好
ましくは固定化プライマー）によって導入することもで
きるし、或いは、増幅ベクター内の、増幅試料DNAと一
緒に切り出すのに適した位置にこの配列が存在していて
もよい。この融合タンパク質はDNAのlacOP配列に結合
し、ONPG（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド）の添加によって発色するので、これを分光光度法で
測定することができる。この融合タンパク質とONPG（ｏ
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド）を使用する
と迅速で簡単な比色アッセイを行なうことができ、放射
性標識の使用に伴う安全性の問題は生じない。例えばIP
TG（ｎ−イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）を加えると、この融合タンパク質をDNAから解離さ
せることができる。

シグナル対ノイズ（S/N）比を高めるために、本出願
人の係属中の出願PCT/EP90/00454（WO90/11369）に記載
されているような二段階PCR法（ネステド（nested）プ
ライマーを使用）を用いてもよく、そうすることによっ
て、本発明の方法の感度を向上させることができる。こ
のような予備増幅によって、試料中に混在している可能
性のある他のDNAに比して標的DNAの濃度が大幅に増加す
るし、また、標的DNAの別の配列に特異的な少なくとも
１種類のプライマーを用いて第二段増幅を行なうと「バ
ックグラウンドノイズ」に比して標的DNAのシグナルが
顕著に増大する。

適当なポリメラーゼであればどんなものを用いてもよ
いが、Taqポリメラーゼのような好熱性酵素を用いるの
が好ましく、そうすれば、PCRの各サイクルごとに例え
ばクレノウフラグメントのようなポリメラーゼをわざわ
ざ追加しなくても上述の温度サイクルを繰返すことがで
きる。

PCRを一段階法又は二段階法のいずれで行なうにして
も、本発明はアリコート間のはっきりとした差異に基づ
くものであるのでPCRの効率はさほど重要ではない。た
だし、上述の通り、増幅DNAの有無をチェックするため
に最初に定量的DIANAを行なうのが好ましい。

１又はそれ以上のプライマーが担体に結合している場
合のように増幅DNAの固定化がPCR増幅の一部として起こ
るようにしてもよいし、或いは、PCRプライマーの１つ
又はそれ以上が後段での固定化を可能にするような官能
基（例えばビオチン又はチオール基）を有していてもよ
い。プライマーの５′末端を固定化すると、そのプライ
マーから伸長したDNA鎖を固体担体に結合させることが
でき、そのDNA鎖の３′末端が担体から遠く離れるよう
になるので、後段でのポリメラーゼによる鎖伸長反応に
利用できるようになる。

本発明では特に有用なプライマーを用いるが、このプ
ライマーは、５′から３′方向へ向かって、当該プライ
マーが固定化できるような手段、DNA結合タンパク質の
結合する配列、並びに標的DNA鎖の５′末端もしくはそ
の近傍にハイブリダイズし得る配列を含んでなる。この
ようなプライマーを使用すると、固定化が可能になるだ
けでなく、重合工程において二本鎖DNAが実質的に固定
化部位に至るまで形成されたか否かを判定することがで
きる。固定化手段とDNA結合タンパク質の結合する配列
との間、或いはDNA結合タンパク質の結合する配列と標
的DNAにハイブリダイズし得る配列との間に、幾つかの
ヌクレオチドが介在してもよいことは明らかであろう。

固定化手段はビオチンであるのが好ましいが、その他
の官能基（例えばチオール基など）を使用してもよい。
しかし、ストレプトアビジンとのビオチンの強い相互作
用並びにビオチンはプライマーに比較的簡単に導入でき
ることから、ビオチンを用いるのが好ましい。DNA結合
タンパク質の結合する配列は、好ましくはlacオペレー
ターであり、これにはlac Iリプレッサータンパク質が
可逆的に結合する。

固体担体は、好適には、マイクロタイターウェル（従
来の８×12形式のものが都合がよい）の形でもディップ
スティック（dipstick）の形であってもよく、これらは
プライマーDNAと結合するような活性化ポリスチレンで
作製し得る（K.Almer,博士論文，王立工業大学（Royal
Institute of Technology），スウェーデン国ストック
ホルム,1988）。担体は、また、例えばアガロース、セ
ルロース、アルギン酸塩、テフロン（登録商標）又はポ
リスチレンなどで作られた粒子や繊維やキャピラリーで
あってもよい。担体は、磁性粒子、例えばDynal AS社
（ノルウェー国オスロ）製の超常磁性ビーズなどであっ
てもよい。

固体担体は、プライマーを結合するための、水酸基や
カルボキシル基やアルデヒド基やアミノ基のような官能
基又はアビジンやストレプトアビジンのような部分を保
有していてもよい。これらは一般に、かかる官能基のい
ずれかを有するポリマーの表面コーティングを与えるよ
うな処理を担体に施すことによって与えることができ、
例えば、ポリウレタンとポリグリコールを併用して水酸
基を与えたり、セルロース誘導体で水酸基を与えたり、
アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー又はコポリマー
でカルボキシル基を与えたり、或いはアミノアルキル化
ポリマーでアミノ基を与えたりすることができる。米国
特許第4654267号には、このような表面コーティングの
導入法が多数記載されている。

アッセイ技術は非常に簡単で迅速であり、したがって
多数の試料が迅速に分析できるようなロボット装置を用
いて自動化するのは簡単である。好ましい検出及び定量
は比色反応に基づいているので、視覚的な検査だけで判
定できる場合も多い。

標的DNAは試料中のmRNAから合成されたcDNAであって
もよく、本発明の方法はこうして特徴的なmRNAに基づく
診断にも応用できる。このような予備合成は逆転写酵素
による予備処理によって行なうことができるが、好適に
は、後段でPCRを行なう場合にはそのPCR段階で用いる緩
衝液及び塩基の系と同じ系の中で行なう。PCR操作は二
本鎖を解離させるための加熱処理を要するので、逆転写
酵素は最初のPCRサイクルにおいて失活するはずであ
る。mRNAが試料核酸である場合には、最初の試料（例え
ば血清試料）を固定化ポリdTオリゴヌクレオチドで処理
して、その末端ポリＡ配列を介してすべてのmRNAが回収
できるようにするのが有利である。別法として、特異的
RNA配列を介してRNAを回収するために、特異的オリゴヌ
クレオチド配列を用いることもできる。かかるオリゴヌ
クレオチドは、国際特許出願PCT/EP89/00304（WO89/092
82）に記載されているように、後でcDNAに対するプライ
マーとして役立てることができる。

標的DNAを最初に増幅する好ましい方法としてPCRにつ
いて述べてきたが、PCRと組合わせる代わりに別の方法
を用いてもよいことは当業者には明らかであろう。温度
サイクリングも耐熱性ポリメラーゼも必要としない近年
開発された増幅技術として、自続式配列複製（3SR）法
がある。3SR法はレトロウイルスの複製をモデルにした
もので、増幅に使用することができる（Gingeras,T.R.e
t al,PNAS（USA）87:1874−1878;並びにGingeras,T.R.e
t al,PCR Methods and Amplifications Vol.1,pp25−33
などを参照）。

伸長プライマーは、標的位置の直ぐ隣で固定化鎖と適
度なハイブリダイゼーションを起こす程度の十分な大き
さを有している一方で、不要な化学合成を避けるために
ある程度短いほうが都合がよい。Ｃ−Ｇ間の対合の方が
結合に関与する水素結合の数が多いので、プライマーの
大きさ並びにハイブリダイゼーションの安定性がＡ−Ｔ
塩基対のＣ−Ｇ塩基対に対する比率にある程度依存して
いることは当業者には明らかであろう。また、当業者で
あれば、当然に、伸長プライマーと増幅配列のその他の
部分との相同性並びにそれに応じた条件設定（ストリン
ジェンシー）を考慮するはずである。このようなルーチ
ン実験についての指針は、例えばSambrook,J.,Fritsch,
E.F.,and Maniatis,T.著のMolecular Cloning:a labora
tory manual（1989）などの文献に見出だすことができ
る。伸長プライマーは試料を４つのアリコートに分割す
る前に加えるのが好ましいが、各々のアリコートに個別
に伸長プライマーを加えてもよい。伸長プライマーはPC
Rプライマーと同一であってもよいが、系に追加的な特
異性の要素を導入するためには異なっているほうが好ま
しい。

ジデオキシヌクレオチド存在下でのポリメラーゼ反応
は、T7ポリメラーゼ、クレノウ又はSequenase Ver.2.0
（米国USB社製,Sequenaseは登録商標である。）など
の、ジデオキシヌクレオチドの取込みを行なうポリメラ
ーゼを使用して行なわれる。ただし、公知の通り、多く
のポリメラーゼがプルーフリーディング（校正）活性、
即ち、エラーチェッキング活性を有していて、鎖伸長に
利用される３′末端の１個もしくはそれ以上のヌクレオ
チドが時により消化されることがある。本発明の方法で
このような消化が起こると、バックグラウンドノイズが
増加する。この問題が起こらないように、例えばT7ポリ
メラーゼやSequenaseのような非プルーフリーディング
型ポリメラーゼを使用するのが好ましい。さもなけれ
ば、ポリメラーゼによる３′消化を抑制するフッ素イオ
ン又はヌクレオチド一リン酸を各アリコートに加えるの
が望ましい。

二本鎖DNA及び／又は非伸長DNAの同定は様々な方法で
行なうことができる。二本鎖DNAに関しては、鎖伸長反
応の際の放射標識の導入などの慣用技術で可能である
が、lacオペレーター配列を用いるのが好ましく、このl
acオペレーター配列は好ましくは上述の通り増幅時にDN
Aに組込む。鎖全体の伸長によって二本鎖DNA配列が生
じ、これにlac Iリプレッサー−β−ガラクトシダーゼ
融合タンパク質が結合する。結合した融合タンパク質は
上述の通り比色法で同定することができ、これによって
伸長反応の起こった３つのアリコートが同定され、残り
のアリコートに加えられたジデオキシ塩基が判明する。

プライマーの伸長がジデオキシヌクレオチドでブロッ
クされた非伸長DNAに関しても数多くの同定法が可能で
あり、当業者には容易に分かるであろう。好ましくは、
伸長プライマーの３′末端の下流にハイブリダイズする
プローブ、即ち、伸長プライマーのハイブリダイゼーシ
ョン部位と固定化鎖の５′末端の間の固定化鎖にハイブ
リダイズするプローブを用いる。プローブは標識の付い
ているもの或いは標識を結合するための手段を有してい
るものが適している。このようなプローブは一本鎖DNA
には結合するが、二本鎖DNAには結合しない。

所望により、二本鎖DNAと一本鎖DNAの両方を同定して
もよく、そうすると結果の正確性をさらにチェックする
ことができる。通常は、ジデオキシヌクレオチドを全く
含んでいない対照実験並びに４種類すべてのジデオキシ
ヌクレオチドの混合物を含んだ「ゼロ対照実験」を行な
うのが好ましい。

もう一つの同定手段は、本出願人の同一の出願日に係
る係属出願（PCT/EP93/01205（WO93/23564）に開示され
ている方法で、鎖伸長反応時に放出されるピロリン酸を
検出するというものである。各ヌクレオチドが取込まれ
る際に、ヌクレオチド三リン酸からピロリン酸が解離し
て、残ったヌクレオチド一リン酸が生長核酸鎖の末端に
取込まれる。終結ジデオキシヌクレオチドが鎖に取込ま
れていないアリコートでは、鎖伸長反応時にピロリン酸
の放出が盛んに起こる。このようなピロリン酸の放出は
ルシフェリンとルシフェラーゼを用いて測定することが
できる。ルシフェリン／ルシフェラーゼ系はピロリン酸
の存在量に実質的に正比例して光を発する。

例えば遺伝病のキャリヤーの遺伝的検査などの診断用
途においては、試料はヘテロ接合性の材料を含んでい
る。即ち、DNAの半分は標的位置に一つのヌクレオチド
を有しているが、もう半分は別のヌクレオチドを有して
いる。したがって、本発明の方法に用いられる４つのア
リコートのうち、２つは陽性シグナルを与え、２つは半
陽性シグナルを与えるであろう。したがって、各試料中
の検出標識量を定量的に決定するのが望ましい。ホモ接
合性試料の場合には、４つのアリコートのうち、３つが
陰性で１つが陽性シグナルを与えることは明らかであろ
う。

好ましくは、本発明は、出願人の同一の出願日に係る
係属出願（PCT/EP93/01204（WO93/23563）に教示されて
いる発明と組合わせる。この係属出願に教示された発明
では、PCRを用いて、問題とするDNA鎖の３′末端側に永
久に結合したプライマーを与えるようなループ構造を導
入する。例えば、このような修正法では、二本鎖DNAの
うちの標的位置を含んでいる鎖の標的配列上に伸長プラ
イマーを３′末端ループ構造の一部として組込む。この
標的配列はその３′末端側に領域Ａを有していて、場合
によってはその領域Ａからさらに３′側に伸びたDNA領
域Ｂが存在しており、上記標的配列に相補的な配列の
３′末端側にハイブリダイズする第一のプライマーであ
って固体担体上に固定化されているか又は固体担体に結
合させるための手段を与えられている第一のプライマー
と、上記標的配列のＡ及び／又はＢの少なくとも一部分
にハイブリダイズする３′末端配列を有していてかつそ
の５′末端にはＡと実質的に同一の配列を有する第二の
プライマーとを使用したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
増幅処理に上記二本鎖DNAを付す。この増幅処理によっ
て、標的配列の３′末端に、領域Ａ・ループを形成し得
る領域・配列Ａに相補的な配列Ａ′を以上の順序で有す
る二本鎖標的DNAを生じさせる。しかる後に、増幅二本
鎖DNAを固定化形で二本鎖解離処理に付して、そうする
ことにより、固定化されていない標的鎖を遊離させ、領
域Ａ′を領域Ａに自然に或いは人為的にハイブリダイズ
させてループを形成させる。領域Ａ′の３′末端は標的
位置の直ぐ隣にハイブリダイズする。ジデオキシ反応及
び伸長反応では上記のハイブリダイズした部分をプライ
マーとして用いる。標的位置に組込まれた塩基はどのよ
うな方法で同定してもよいが、好ましくは、上記の係属
中の出願PCT/EP93/01205（WO93/23564）に教示されてい
るピロリン酸の放出による方法で同定する。

本発明は、また、通常な少なくとも以下の構成成分： （ａ） その検査に特異的な伸長プライマーであって、
標的位置がそのプライマーの３′末端の直ぐ隣になるよ
うに試料DNAにハイブリダイズする伸長プライマー； （ｂ） ポリメラーゼ； （ｃ） ジデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチ
ド；及び （ｄ） 任意成分としての固体担体 を含んだキットを包含する。

このキットを一次PCR増幅法で使用する場合には、キ
ットは通常は少なくとも以下の構成成分： （ｉ） 少なくとも一方のプライマーがそのプライマー
を固定化するための手段を有している一対のPCR用プラ
イマー； （ii） ポリメラーゼ、好ましくはTaq1ポリメラーゼの
ような耐熱性のポリメラーゼ； （iii） PCR反応用の緩衝液；及び （vi） デオキシヌクレオチド も含んでいる。

酵素標識を使用する場合には、キットはその酵素の基
質と検出系のその他の成分を含んでいるのが都合がよ
い。

好ましくは、上記プライマー対の一方はそのプライマ
ーを固定化するための手段とタンパク質の結合する配列
を共に含んでいる。好ましい形のプライマーは、（例え
ばストレプトアビジン被覆磁性ビーズへの）固定化用の
手段として機能するビオチンと、標識用の手段としての
lacオペレーターを含んでなる。上記のタイプの好まし
いプライマーを用いて本発明を実施するためのキット
は、lac Iリプレッサータンパク質と結合した酵素標識
を含んでいるのが好ましく、好ましい酵素標識はβ−ガ
ラクトシダーゼである。

以下、図面を参照しながら非限定的な実施例により本
発明を説明するが、図面について説明すると、 図１は、本発明の方法を用いて１か所の標的位置の塩
基を同定するためのプロトコールを示したものであり、 図２は、実施例１で使用したオリゴヌクレオチドプラ
イマーを増幅用の試料DNAと共に示したものであり、 図３は、実施例で使用した別のオリゴヌクレオチドプ
ライマーを試料DNAと共に示したものであり、そして 図４は、本発明の方法の実施例で得られた結果を示す
グラフである。

材料と方法 細菌株及び酵素 大腸菌（Escherichia coli）RRIΔM15株（Ｒther,
U.（1982）“pUR 250 which allows rapid chemical se
quencing of both strands of its inserts"Nucl.Acids
Res.,10,5765−5772）を細菌ホストとして使用した。
使用したプラスミドベクターはpRIT28（Hultman,T.,St
hl,S.,Moks,T.and Uhln,M.（1988）“Approaches t
o solid phase DNA sequencing"Nucleosides ＆ Nucleo
tides ７,629−638）であった。

オリゴヌクレオチドの合成 HIV逆転写酵素遺伝子（RT）の活性部位の一部をコー
ドする領域（塩基625〜1165;Myers,G.,Korber,B.,Berko
vsky,J.A.,Smith,R.F.and Pavlakis,G.N.,Human Retrov
iruses and AIDS 1991（Los Alamos National Laborato
ry,New Mexico 1991））に相補的な７種類のオリゴヌク
レオチドプライマー:RIT135、RIT321、RIT322、RIT33
1、RIT332及びRIT333（図2,図３参照）を、自動DNA合成
装置（スウェーデンのKABI−Pharmacia社製のGene Asse
mbler Plus（登録商標））上で製造業者の説明書通りホ
スホルアミダイト化学により合成した。RIT322はビオチ
ンホスホルアミダイト（米国カリフォルニア州のClonet
ech社製）を用いてビオチン化した。精製はpepRPC 5/5
逆相カラム（スウェーデン国のKABI−Pharmacia社製）
を用いて行なった。

酵素及びヌクレオチド 各種制限酵素、T4 DNAリガーゼ（KABI−Pharmacia社
製，スウェーデン）、T7 DNAポリメラーゼ（KABI−Phar
macia社製，スウェーデン）、Taq DNAポリメラーゼ（米
国カリフォルニア州のCetus社製）及びSequenase ver
2.0（米国のUSB社製,Sequenaseは登録商標）は業者の忠
告にしたがって使用した。デオキシヌクレオチド及びジ
デオキシヌクレオチドはドイツのBoehringer Manheim社
から入手した。

PCRクローニング HIV−１の患者から得られた臨床試料（スウェーデン
国ストックホルムのスウェーデン細菌学研究所（Swedis
h Bacteriology Laboratory;SBL））から、各5pmolのオ
リゴヌクレオチドRIT331とRIT333（図３）を用いた増幅
によってHIV RTフラグメントをクローニングした。RIT3
31とRIT333は共に、上流BamH I及び下流EcoR I認識部位
を導入するための「ハンドル」部を含んでいた。PCR反
応混液は、200μＭの各dNTP、20mMのTris−HCl（pH8.
7）、2mMのMgCl₂、0.1％のTween 20（Tweenは登録商
標）及び0.5ユニットのAmpliTaqを含んでいて、最終容
積は50μｌとした。温度プロフィールは、95℃で0.5分
間の変性段階、次いで55℃で0.5分間のプライマーアニ
ーリング段階、及び72℃で２分間の伸長段階にセットし
た。これらの段階を、Gene Amp PCR System PE 9600（P
erkin−Elmer社製，米国カリフォルニア州）を用いて30
回繰り返した。こえしてPCR増幅したHIV RTフラグメン
ト及びベクターpRIT28を共にBamH IとEcoR Iで制限し、
アガロースから切り出して精製した後、室温で１時間連
結反応を行なった。この構築物でコンピテントRRIΔM15
細胞を形質転換し、青／白選択（Langley,E.K.,Villare
jo,M.R.,Fowler,A.V.,Zamenhof,P.J.,and Zabin,I.（19
75）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72,1254−1257）ができ
るようにIPTG（ｎ−イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド）、Ｘ−gal（５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）及びアンピシ
リンを含んだTBAB（前出のSambrook,J.and Maniatis,T.
（1989）の文献）平板上に塗末接種した。固相配列決定
法（Hultman,T.,Bergh,S.,Moks,T.and Uhlend,M.（199
1）“Bidirectional solid−phase sequencing of in v
itro−amplified plasmid DNA"Bio Techniques 10,84−
93）により、５つの白色コロニーが正しいインサートを
もつプラスミドであることを確認した。これらのクロー
ンのうちの１つをpRIT−RTと名付け、以降の研究用とし
て選んた。このクローンはスウェーデン国ストックホル
ムの王立工業大学生化学科に保存してある。

DIANA検出ミニシーケンシング用鋳型の調製 pRIT28−RTを含むコロニーをバイアルに移して、10μ
ｌの20mM Tris−HCl（pH8.7）中で99℃で５分間溶菌し
た。次いで１μｌの溶菌液を、5pmolのRIT135及びRIT32
2（ビオチン化）、0.25pmolのRIT321、200μＭの各dNT
P、20mMのTris−HCl（pH8.7）、2mMのMgCl₂、0.1％のTw
een 20及び0.5ユニットのAmpliTaqのPCR混液に移して、
最終容積を50μｌとした。プライマーRIT322は、後段で
ストレプトアビジン被覆固体担体に結合させるための
５′ビオチンと、lacOP認識配列を規定する21塩基とか
らなる。増幅を上記の通り行ない、得られたPCR生成物
を、次に、予備洗浄ストレプトアビジン被覆常磁性ビー
ズ（Lea,T.,Vartdal,F.,Nustad,K.,et al.（1988）“Mo
nosized,magnetic polymer particles:and their use i
n separation of cells and subcellular components a
nd in the study of lymphocyte function in vitro"Jo
urnal of Molecular Recognition １,9−1 8）、即ち製
造業者の推奨する結合溶液で予備洗浄しておいたDynabe
ads M280ストレプトアビジン（ノルウェーのDynal AS社
製,Dynabeadsは登録商標）上に固定化した（Hultman,
T.,Sthl,S.,Hornes,E.and Uhln,M.（1989）“Direc
t solid phase sequencing of genomic and plasmid DN
A using magnetic beads as solid support"Nucl.Acids
Res.17,4937−4946）。固定処理化後、ビーズを50μｌ
の結合／洗浄溶液で洗って、結合DNAをアッセイした。D
NAの固定化されたビーズを50μｌの融合タンパク質lac
I−β−ガラクトシダーゼ（ノルウェーのDynal AS社
製）と混合し、20分間インキュベートした。ビーズをDI
ANA緩衝液（ノルウェーのDynal AS社製）で４回洗浄し
て過剰の融合タンパク質を除去し、壁の被膜によるバッ
クグラウンドを排除するために最終段階で新しいチュー
ブに変えた。100μｌのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトシド（ONPG,1.25mg/ml）を発色性基質として加
え、そして６分後に100μｌの1M Na₂CO₃を添加して反応
を停止した。上清の405nmの吸光度をEAR340AT ELISAプ
レートリーダー（SLT−Labinstruments,オーストリア）
で測定して分析した。20μｌの0.1M NaOHと５分間イン
キュベートして融解により二本鎖を解離させて、一本鎖
固定変DNA鋳型を生じさせ、これを再度50μｌの結合溶
液、50μｌの１×TEで洗浄した。1pmolのRIT332（図
２）を用い、8mM MgCl₂及び20mM Tris−HCl（pH7.5）中
で容積を13μｌとして、65℃に５分間加熱して次に室温
に10分間静置することによって、プライマーのアニーリ
ングを行なった。

ミニシーケンシング反応 適合ジデオキシヌクレオチドに関して、６つの別個の
伸長反応（１つはddATPのみで、１つはddCTPのみで、１
つはddGTPのみで、１つはddTTPのみで、１つは４種類す
べてのddNTPと共に、１つはddNTPを全く加えずに）は、
２μｌのアニーリング混液、17mM Tris−HCl（pH7.
5）、6mM MgCl₂、1mM DTT、１μＭの適合ジデオキシヌ
クレオチド及び0.13ユニットのSequenase Ver 2.0（Seq
uenaseは登録商標）を含んだ含量10μｌの中で行なっ
た。この実験の概略図を図１に示す。ジデオキシ取込み
反応は室温で５分間ない、20μｌの0.5M EDTAの添加に
より停止させた。しかる後に、ビーズを30μｌの10mM T
ris−HCl（pH7.5）で２回洗浄した。次の伸長段階で
は、20μＭのdNTP濃度を使用し、25mMのTris−HCl（pH
7.5）、12.5mMのMgCl₂、1mMのDTT及び0.13ユニットのSe
quenase（登録商標）と共に全量を10μｌとした。ジデ
オキシヌクレオチドが組込まれていないアリコートで
は、Sequenase（登録商標）による鎖の伸長が起こっ
て、完全な鎖長の二本鎖DNAがビーズに結合するように
なる。室温で５分間インキュベーションした後、20μｌ
の0.5M EDTAを加え、ビーズを40μｌのDIANA緩衝液（ノ
ルウェーのDynal AS社製）（0.1M Tris−HCl（pH7.5）,
015M NaCl,0.1％Tween 20,1mM MgCl₂及び10mM β−メル
カプトエタノール）で洗浄した。

DIANAによる検出 結果はDIANA法（Wahlberg,J.,Lundeberg,J.,Hultman,
T.and Uhln,M.（1990）“General colorimetric meth
od for DNA diagnostics allowing direct solid−phas
e genomic sequencing of the positive samples"Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,6569−6573）で検出した。DNA
の固定化されたビーズを50μｌの融合タンパク質lac I
−β−ガラクトシダーゼ（ノルウェーのDynal AS社製）
と混合し、20分間インキュベートした。ビーズをDIANA
緩衝液（ノルウェーのDynal AS社製）で４回洗浄して過
剰の融合タンパク質を除去し、壁の被膜によるバックグ
ラウンドを排除するために最終段階で新しいチューブに
変えた。100μｌのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラ
クトシド（ONPG,1.25mg/ml）を発色製基質として加え、
そして６分後に100μｌの1M Na₂CO₃を添加して反応を停
止した。上清の405nmの吸光度をEAR340AT ELISAプレー
トリーダー（SLT−Labinstruments,オーストリア）で測
定して分析した。その結果を図４に示す。このアッセイ
では、４種類すべてのジデオキシヌクレオチド（ddNT
P）を使用した場合とddATPのみを使用した場合に低いシ
グナルが得られた。配列決定用プライマーの３′末端の
次の相補塩基はジデオキシミチミジンであるので、上記
の結果は、このアッセイ法を使用してある特定の場所の
塩基配列を検出することができることを示している。

実施例２ 鋳型の調製 AZT耐性を示す患者から得たHIV逆転写酵素遺伝子フラ
グメント（Petterson,B.et al未発表データ）を、RIT33
1とRIT333のプライマー対を用いて、ベクターpRIT28にP
CRクローニングした。大腸菌RRIΔM15株を形質転換し
て、青／白選択法（前出のLangley,E.K.,et al（197
5））を用いて選択した。細菌コロニーを99℃の20mM Tr
is−Cl（pH8.7）10μｌ中で５分間溶菌して、PCR増幅を
行なった。次に、１μＬの溶菌液を、5pmolのプライマ
ーセットＡ、200μＭの各dNTP、2mMのTris−Cl（pH8.
7）、2mMのMgCl₂、0.1％のTween 20（Tweenは登録商
標）及び0.5ユニットのAmpliTaq DNAポリメラーゼ（米
国カリフォルニア州のCetus社製）に加えて、最終容積
を50μｌとした。温度プロフィールには、95℃での0.5
分間の変性段階、70℃での1.5分間のアニーリング／伸
長段階が含まれており、これらの段階を30回繰り返し
た。上述の細菌コロニーの溶菌並びに上記反応操作に
は、GeneAmp PCR System 9600（Perkin−Elmer社製，米
国カリフォルニア州）を用いた。PCR生成物を、ストレ
プトアビジンの共有結合した常磁性ビーズ（前出のLea,
T.（1988））であるDynabeads M280（Dynabeadsは登録
商標）上に固定化した。ビーズは製造業者（ノルウェー
のDynal AS社）の使用説明書通りに使用した。固定化PC
R生成物を0.10M NaOH中で10分間インキュベートした
後、上清を除去することにより、一本鎖DNAを得た。固
定化一本鎖DNAを、50μｌの10mM Tris−Cl（pH7.5）,1m
MEDTA,2M NaClで洗浄し、次いで50μｌの10mM Tris−Cl
（pH7.5）で洗浄した。洗浄後、20mMのTris−Cl（pH7.
5）、8mMのMgCl₂及び1pmolの配列決定用プライマーを加
えて全量を13μｌとした。混合液を65℃で５分間インキ
ュベートした後、室温に冷却した。

ミニシーケンシング ジデオキシヌクレオチド組込み反応は、常磁性ビーズ
上に固定化された鋳型／プライマー−フラグメント１μ
ｌ（50μl PCR増幅反応液の1/13）と、0.13ユニットのS
equenase version 2.0（米国のUnited States Biochemi
cal社製,Sequenaseは登録商標）と、0.5μｌの10μM dd
NTP（１種類）と、さらに25mM Tris−Cl（pH7.5）,12.5
mM MgCl₂,2.5mM DTTを含んだ緩衝液とからなる全量で10
μｌの混合液中で行なった。室温で５分間インキュベー
トした後、ビーズを、50μｌの10mM Tris−Cl（pH7.
5）,1mM EDTA,2M NaCl,1％Tween 20で洗浄し、次いで50
μｌの10mM Tris−Cl（pH7.5）,1mM EDTA,2M NaClで洗
浄し、最後に50μｌの10mM Tris−Cl（pH7.5）で洗浄し
た。10mM Tris−Cl（pH7.5）で容積を５μｌに調整し
た。対照フラグメントはddNTP非存在下で、ゼロ対照フ
ラグメントは全種類のddNTP存在下で、DNAポリメラーゼ
とインキュベートした。これら様々な試料を次にELIDA
で分析した。

ELIDA 上記のミニシーケンシングの各プレインキュベーショ
ン試料が完全なプライマー伸長をするか否かについてEL
IDA法でアッセイした。このアッセイは、LKB 1250ルミ
ノメーターと電位差記録計を用いて行なった。ルミノメ
ーターは内部標準光に対するレスポンスが10mVとなるよ
うに較正した。発光出力は既知量のATP又はppiを添加し
て較正した。反応は室温で行なった。標準アッセイ容積
は0.2mlであり、以下の成分:0.1M Tris−酢酸（pH7.7
5）,2mM EDTA,10mM酢酸マグネシウム,0.1％BAS,1mM DT
T,0.4mg/mlポリビニルピロリドン360000,2μM dNTP,100
mg/ml D−ルシフェリン（BioOrbit社製，フィンラン
ド）,4μg/ml L−ルシフェリン（BioOrbit社製，フィン
ランド）,0.3ユニット/ml ATP依存性スルフリラーゼ（S
igma,米国）及び精製ルシフェラーゼ標品（Enzymatix,
英国）を含んでいた。使用したルシフェラーゼの量は、
容積1mlで100pmolのATPに対して1Vのレスポンスを与え
るものであった。５分間のプレインキュベーションの
後、アデノシン５′−ホスホ硫酸とNaFとdNMPとをそれ
ぞれ最終濃度が２μM,5mM,0.4mMとなるように加えた。
ジデオキシ組込み試料から分取した５μｌの鋳型／プラ
イマー−フラグメントを添加した後、0.13ユニットのSe
quenase（登録商標）を添加して反応を開始した。反応
は５分以内に完了した。

結果 ミニシーケンシング法の原理 ミニシーケンシング法の原理を図１に概略図として示
す。この図では、残基Ｔの存在の有無を検査している。
問題とする特定DNAフラグメントを、プライマー対の一
方が５′末端がビオチン化されているようなPCR法で増
幅する。PCR増幅した問題のDNA断片をストレプトアビジ
ンの共有結合した磁性ビーズ上に固定化し、次いでNAOH
で洗浄して一本鎖形に変換し、この一本鎖DNAに１種類
のプライマーをアニールする。鋳型／プライマー−フラ
グメントを次に４つの異なるアリコートに分割し、これ
らをポリメラーゼ存在下にて４種類のddNTPの各々で別
々に処理する。反応後、得られたフラグメントを洗浄し
て、４種類すべてのdNTPの存在するプライマー伸長反応
の基質として用いる（図１参照）。DNA特異的重合反応
の進行をELIDA法でモニターする。最初の反応において
ジデオキシヌクレオチドが組込まれていると、次の「追
跡」反応の際にピロリン酸の生成が阻害される。対照的
に、ジデオキシヌクレオチドの組込みが起こっていなけ
れば、「追跡」反応時にピロリン酸が盛んに放出され
て、ELIDA反応により発光する。このELIDAの結果から、
プライマーの後に位置する最初の塩基が容易に推定され
る。４種類すべてのddNTPと共にインキュベートする陰
性対照並びにddNTPの非存在下でDNAポリメラーゼとイン
キュベートする陽性対照を含めてもよい。

特定DNAのミニシーケンシング あるddNTPの組込みは、ポリメラーゼ反応時にそれと
相補的なジデオキシヌクレオチド（ddNTP）が存在した
場合にのみ観察された。用いた条件下では、非相補塩基
の組込みは全く観察されなかった。「追跡」反応の際に
は、非相補塩基とインキュベートした場合にのみ、ppi
の生成がELIDA法で検出された。相補塩基が組込まれた
場合には、フリーな３′OH基を欠いているのでDNAの伸
長は不可能であった。ddNTP3種類を含んだ混合液を４種
類使ってDNAフラグメント（最初の段階において）をイ
ンキュベートした場合にも同じ結果が得られた（データ
は示さず）。明瞭な結果を得るためにはエキソヌクレア
ーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼを使用しなければなら
ない点を強調しておくが、ある種のポリメラーゼのエキ
ソヌクレアーゼ活性が例えばフッ素イオンなどによって
抑制できることが知られている。非相補塩基の組込みを
防止するために低濃度（0.05〜５μＭ）のヌクレオチド
を使用することも重要である。

感度 上記で紹介した実験では50μｌのPCR増幅反応液の1/1
3をELIDA試験に使用した。しかし、使用量はこれより少
なくても多くてもよい。161塩基長のDNAフラグメントの
プライマー伸長反応の際のppi生成の初速度と生成量をD
NA濃度の関数として求めた。ELIDAにおけるppi生成の初
速度と生成量は共に、（50μｌのPCR増幅反応液の1/130
から2/13まで）一定間隔で試験したDNA濃度に比例す
る。アッセイ時のシグナルを増大させるために、DNAの
量をさらに増やしてもよいし、固体担体の結合容量を増
やしてもよい。このアッセイ（全量200μｌ）の上限はp
pi生成量200pmolである。下限は、主として、使用したD
NAフラグメントの鎖長（シグナルはプライマー伸長反応
時に組込まれるヌクレオチドの量に比例するため）、用
いた容積、並びに異なる溶液中に混入した夾雑ppi、に
よって決まる。後者の二つの因子は所望により修正する
ことができる。

フロントページの続き (56)参考文献 特表 平３−503001（ＪＰ，Ａ) Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．208，Ｎｏ．１, ｐｐ．171−175（1993) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】DNA配列のある標的位置の塩基を同定する
   方法にして、試料DNAを増幅処理に付し、その増幅DNAを
   固定化した後で二本鎖解離処理に付して、非固定化鎖を
   取り除き、標的位置の直ぐ隣で固定化DNAにハイブリダ
   イズするような伸長プライマーを与え；固定化された一
   本鎖DNAの４つのアリコートの各々を１種類のジデオキ
   シヌクレオチド存在下でのポリメラーゼ反応に付し、そ
   の際、各アリコートについて異なるジデオキシヌクレオ
   チドを用いて標的位置の塩基に相補的なジデオキシヌク
   レオチドだけが組込まれるようにしておき；次に、４つ
   のアリコートを４種類すべてのデオキシヌクレオチドの
   存在下での伸長反応に付して、各アリコート中において
   ジデオキシヌクレオチドと反応していないDNAが伸長し
   て二本鎖DNAを形成する一方で、ジデオキシヌクレオチ
   ドでブロックされたDNAは非伸長鎖DNAとして残るように
   しておき；しかる後に、二本鎖及び／又は非伸長鎖DNA
   の同定を行なって、どのジデオキシヌクレオチドが導入
   されていて、したがってどの塩基が標的位置に存在して
   いるのかを明らかにすることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】請求項１記載の方法にして、固定化されて
   いるか或いは固定化用手段の備わっている第一のプライ
   マーを用いるインヴィトロ増幅反応によって、試料DNA
   を増幅することを特徴とする方法。
3. 【請求項３】請求項２記載の方法にして、前記第一のプ
   ライマーが、標識保有DNA結合タンパク質に対する認識
   部位を二本鎖形のときに含んでいる領域を有していて、
   鎖伸長反応による二本鎖DNAの形成を上記標識タンパク
   質への結合によって同定することを特徴とする方法。
4. 【請求項４】請求項２又は請求項３記載の方法にして、
   前記第一のプライマーが固定化用手段としてビオチンを
   有することを特徴とする方法。
5. 【請求項５】請求項２〜請求項４のいずれか１項記載の
   方法にして、前記インヴィトロ増幅に、前記標的DNAの
   ３′末端側の領域Ａ及び／又はその領域Ａからさらに
   ３′側に伸びた領域Ｂにハイブリダイズする第二のプラ
   イマーであって、上記標的配列の領域Ａ及び／又はＢの
   少なくとも一部分にハイブリダイズする３′末端配列を
   有していてかつその５′末端にはＡと実質的に同一の配
   列を有する第二のプライマーを使用し、この増幅処理に
   よって、標的配列の３′末端に、領域Ａ、ループを形成
   し得る領域、及び配列Ａに相補的な配列Ａ′を以上の順
   序で有する二本鎖標的DNAを生じさせ、しかる後に、増
   幅二本鎖DNAを固定化形で二本鎖解離処理に付して、そ
   うすることによって固定化されていない標的鎖を遊離さ
   せて、領域Ａ′を領域Ａに自然に或いは人為的にハイブ
   リダイズさせてループを形成させることを特徴とする方
   法。
6. 【請求項６】請求項１〜請求項５のいずれか１項記載の
   方法にして、二本鎖DNAの形成を、鎖伸長反応中に放出
   されたピロリン酸の検出又は推計によって同定すること
   を特徴とする方法。
7. 【請求項７】請求項６記載の方法にして、発光をピロリ
   ン酸のインジケーター又は指標とするルシフェリン／ル
   シフェラーゼ反応によって、ピロリン酸を検出又は推計
   することを特徴とする方法。
8. 【請求項８】請求項１記載の方法を実施するためのキッ
   トにして、少なくとも以下の構成成分： （ａ） その検査に特異的な伸長プライマーであって、
   前記標的位置がそのプライマーの３′末端の直ぐ隣にな
   るように試料DNAにハイブリダイズする伸長プライマ
   ー； （ｂ） ポリメラーゼ； （ｃ） ジデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチ
   ド；及び （ｄ） 任意成分としての固体担体 を含んでなることを特徴とするキット。
9. 【請求項９】請求項８記載のキットにして、さらに少な
   くとも以下の構成成分： （ｉ） 少なくとも一方のプライマーがそのプライマー
   を固定化するための手段を有している一対のPCR用プラ
   イマー； （ii） ポリメラーゼ、好ましくはTaq1ポリメラーゼの
   ような耐熱性のポリメラーゼ； （iii） PCR反応用の緩衝液；及び （iv） デオキシヌクレオチド をも含んでいることを特徴とするキット。