JP5188789B2 - 核酸の定量方法 - Google Patents
核酸の定量方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5188789B2 JP5188789B2 JP2007309089A JP2007309089A JP5188789B2 JP 5188789 B2 JP5188789 B2 JP 5188789B2 JP 2007309089 A JP2007309089 A JP 2007309089A JP 2007309089 A JP2007309089 A JP 2007309089A JP 5188789 B2 JP5188789 B2 JP 5188789B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- dna
- target dna
- standard dna
- standard
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
一定量のターゲットDNA試料に対する各ddNTP(ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP)の発光強度を予め測定し、それらの4種類の塩基間での発光強度比を決定しておく。
標準DNA試料は、以下のようにして調製する。まず、標準DNAを調製するためのプライマーセットを準備する。プライマーはターゲットDNAの5’側及び3’側にハイブリダイズする。これらプライマーで挟まれた領域が増幅領域である。プライマーの少なくとも片方は3’末端から3-10塩基目にターゲットDNAとは異なる塩基(置換塩基)を有し、この置換塩基より5’側のプライマー配列は少なくとも16塩基以上となるように設計する。ターゲットDNA試料の一部を分取し、上記プライマーを用いてPCR増幅することにより標準DNA試料を調製する。標準DNA試料は1本鎖として精製したのち吸光度からその量を定量する。定量した標準DNA試料の一定量をターゲットDNAに混合する。
置換塩基より3’側の配列を含まない(すなわち、標準DNA試料の調製に使用したプライマーよりも短く、置換塩基部分を含まない)プライマーを用いて、混合したターゲットDNA試料と標準DNA試料を同時にPCR増幅する。ターゲットDNAと標準DNAとは増幅対象領域において置換塩基部分以外は同じ配列であるため、PCR増幅率は同じである。
ターゲットDNAと標準DNAの増幅産物を精製したのち1本鎖化し、伸長用プローブとDNAポリメラーゼを加える。なお、増幅用のPCRプライマーが残存している可能性がある場合には、DNAポリメラーゼとddNTPを加えて相補鎖合成に寄与しうる3’末端をブロックしてから再度精製を行う。
4種のddNTPを順次加えて一塩基伸長を行い、ルシフェラーゼ反応による発光を計測する。なお、伸張用プローブは、一塩基置換部分の3’側にハイブリダイズするように設計しておく。これにより、一塩基伸長反応で取り込まれる核酸基質ddNTPの種類が異なることになる。一塩基伸長が起こり、ddNTPが取り込まれるとピロリン酸が生成し、これがATPに変換され、ルシフェラーゼ反応による発光をもたらす。すなわち、得られる発光強度は生成したピロリン酸量に比例する。ターゲットDNAと標準DNAでは取り込まれる塩基種が異なるため、発光量の比率と加えた標準DNA試料の量からターゲットDNAの量が定量できる。
ヒト大腸がんmRNA(201)から手順1にしたがってターゲットとなる領域を含む完全長cDNA(202)を調製した。cDNAは長いものであり、定量分析のターゲットとして解析したいDNA配列領域(203)を含む。ターゲット配列は配列表に示した配列番号1の配列である。この配列は図2に模式的に示したようにForwardプライマープライミング部位(205)、解析すべき増幅領域(203)、及びReverse プライマープライミング部位(204)からなる。
約106細胞程度のヒト大腸がん細胞(HCT116)から、RNeasy Midi Kit (QIAGEN社)を用いてトータルRNA(約400 ng/μL、25 μL、計10 μg)を抽出・精製した。氷上に置いたPCRチューブへ、トータルRNA 2.5 μL (約1 μg)、オリゴ(dT)20プライマー(50 μM) 1 μL、dNTP Mix (10 mM each) 1 μL、及び滅菌水8.5 μLを添加し、混合した。RNAの高次構造を崩し、オリゴ(dT)20プライマーをハイブリダイゼーションするため、サーマルサイクラー(ABI社)を用いて65℃で5分間加熱した。同じPCRチューブを再び氷上に置き、5xFirst Strand Buffer (250mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2) 4 μL、 DTT (0.1 M) 1 μL、RNase OUT(40 unit/μL、Invitrogen社) 1μL、及びSuper ScriptIII (200unit/μL、Invitrogen社) 1 μLを添加し、混合した。これをサーマルサイクラーで50℃ 50分間加熱し、逆転写反応を実施した。続いて、逆転写酵素を不活性化させる為に70℃ 15分間加熱させた。mRNAを除去してcDNAを1本鎖化するために、RNase H (2 unit/μL) 1μLを添加し、サーマルサイクラーで37℃ 20分間加熱した。これにより、ヒト大腸がん細胞由来トータルRNA (1 μg)から1本鎖cDNA 21 μLを得た。さらに、このcDNA 1μLを滅菌水で5x103倍希釈し、ターゲットDNA試料(5 mL)とした(トータルRNA10 pg由来cDNA/μL)。
3’末端から7塩基目を鋳型であるターゲットの配列とは異なる塩基種へ置換させた3種類の5’末端BiotinラベルForwardプライマーA(配列番号2)、5’末端BiotinラベルForwardプライマーB(配列番号3)、5’末端BiotinラベルForwardプライマーC(配列番号4)、及びReverseプライマーD(配列番号5)を準備した。まず、3本のPCRチューブ(チューブA、B、及びC)を氷上に用意し、それぞれに滅菌水29 μL、x10 PCR Buffer 10 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 10 μL、x5 Q-solution 20 μL、ReverseプライマーD(10 μM)(配列番号5)10 μL、Taq DNA polymerase(5 unit/μL、QIAGEN社) 1 μL、及びターゲットDNA試料 10 μLを添加した。さらに、チューブAには5’末端BiotinラベルForwardプライマーA(10 μM)10 μLを、チューブBには5’末端BiotinラベルForwardプライマーB(10 μM)10 μLを、チューブCには5’末端BiotinラベルForwardプライマーC(10μM)10μLを添加し、各々をよく混合させた。これらをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→(94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間)x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行い、3種類の2本鎖PCR産物A、B、及びCを得た。続いて、試料中に残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社)で各PCR産物を精製した(50μL)。吸光度計で各DNA濃度を測定し、いずれも約1μg/μLであることを確認した。
氷上に置いたチューブに、一塩基置換のない配列であるターゲットDNA試料10 μL(301)、標準DNA(A)(302)、(B)(303)、及び(C)(304)を10 μLずつ添加して混合試料を調製した(305)。これに、滅菌水116 μL、x10 PCR Buffer 40 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 40 μL、x5 Q-solution 80μL、ForwardプライマーE(配列番号9)(10μM)(306)40 μL、5’末端BiotinラベルReverseプライマーF(10 μM)(配列番号5)(307)40μL、Taq DNA polymerase (5unit/μL、QIAGEN社) 4μLを混合させた。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→(94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間)x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行った。標準DNA(A)(B)(C)に含まれる人為的に導入された一塩基置換部位の外側に位置するプライマーでPCR増幅するため、混合試料中に存在する4種類の鋳型は同じ効率で増幅される。すなわち、PCR増幅後の試料内の4種類の鋳型比率は増幅前と同じに保たれる。PCR産物400 μLに残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification KitでPCR産物を精製した(500 μL)。吸光度計で各DNA濃度を測定し、約100 ng/μLであることを確認した。
得られたPCR産物に1x Binding & Washing Buffer 500 μLを添加した。また、Streptavidin coating磁気ビーズ500 μLを1.5 mLチューブに採取し、磁石をチューブに近接させることで磁気ビーズを捕捉し、上清を除去した。Binding & Washing Buffer 500 μLで磁気ビーズを3回洗浄後、同液500 μLに懸濁した。この磁気ビーズ懸濁液500 μLをPCR産物に添加し、ローター(600 rpm、室温)で60分間よく攪拌し、Streptavidin−Biotin結合を介して磁気ビーズ表面にPCR産物を結合させた。磁気ビーズに結合しなかった過剰なPCR産物を除去するため、磁石で磁気ビーズを捕捉して上清を除去し、Binding & Washing Buffer 500 μLで2回ビーズの洗浄を行った。続いて、0.1N NaOH 450 μLにPCR産物が結合した磁気ビーズをそれぞれ懸濁し、5分間室温にて静置した。磁石で磁気ビーズを捕捉し、新しいチューブへ上清を採取し、1M Tris (pH 7.5) 90 μL及び0.1% Tween (pH 7.5) 450 μLを添加して中和した。さらに、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1、v/v)1 mLを添加し、3分間ボルテックスした後、遠心(15000 rpm、5分間、室温)した(フェノール・クロロホルム精製)。分離溶液の上層を新しいチューブに採取し(約900μL)、QIAquick PCR Purification Kitを用いて、精製・濃縮した(約250 μL)。さらに、これら試料に酢酸ナトリウム(3M) 25 μL、エタノール(99.5%, -30℃) 625 μLを添加し、-80℃で15分間凍結後、遠心(15000 rpm、15分間、4℃)した。エタノール(70%, -30℃) 180μLを添加し、遠心(15000 rpm、5分間、4℃)して、上清を除去した(エタノール沈殿精製)。ペレットを乾燥させた後、滅菌水100 μLに懸濁し、 DNA濃度を吸光度計で測定し、約150 ng/μL(約5x1011分子/μL)であることを確認した。
一本鎖化したPCR増幅物8 μl(401、402、403、及び404)に対し、一塩基伸長用プローブ(50μM、配列番号10)(405)3 μl、及び10x Hybridization Buffer (100 mM Tris-acetate、20 mM Mg-Acetate、pH 7.75) 3 μl、滅菌水16 μlを混合した。混合溶液を、サーマルサイクラーで、92℃ 30秒間、50℃ 3分間加熱し、4℃に冷却した。この溶液4 μLに120 μLの発光試薬(0.065 U/μL Sequenase、100 mM Tricine、2 mM EDTA、20 mM Mg-Acetate、33.8 U/ml PPDK-E、523.0 GLU/ml Luciferase(LUC-H)、Apyrase 1.5 U/ml Grade VI、0.4 mM Luciferin、0.04 mM PEP、0.2 mM AMP、0.10% BSA、2 mM DTT, pH 7.75)を混合し、30℃ 1分間インキュベートした。30 μLずつ4連チューブに分注し、PPaseで予めPPiを分解したddNTP(100 μM)を0.5 μLずつ添加し、発光検出を行なった(測定時間:1分間)。次に、同量のddNTPを添加して、再度発光検出を行なった(測定時間:1分間)(図4)。
表面をストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ(直径1 μm、107個/μL、DYNAL社)をよく懸濁し、100 μL(磁気ビーズ109個を含む)を1.5 mLチューブに採取した。マグネットを1.5 mLチューブに近接させて磁気ビーズを捕捉し、上清を除去した。さらにBinding & Washing Buffer 100 μLで磁気ビーズを再懸濁し、マグネットで磁気ビーズを捕捉後、上清を除去することにより磁気ビーズを洗浄した。この洗浄操作を3回繰り返した。一方、5’末端にビオチン2分子を修飾し、続いてカーボン6つをスペーサー配列として含むオリゴ(dT)30(100 pmol/μL)6.67 μLへ、Binding & Washing Bufferを加えてオリゴ(dT)30希釈液400 μL(1.67 pmol/μL、4.0 x 1014分子含有)に調製した。このオリゴ(dT)30希釈溶液400 μLと、洗浄した磁気ビーズを混合し、ローターで60分間よく攪拌させ、ストレプトアビジン−ビオチン結合を利用して磁気ビーズ表面へオリゴ(dT)30を結合させた。磁気ビーズへ結合しなかった過剰なオリゴ(dT)30を取り除くため、マグネットで磁気ビーズを捕捉して上清を除去し、Binding & Washing Bufferで2回ビーズの洗浄を行った。さらにRNaseを取り除くため、溶液A(0.1N NaOH、0.05M NaCl、DEPC処理)で2回、溶液B(0.1M NaCl、DEPC処理)で1回洗浄後、100 μLの滅菌水を添加して、オリゴ(dT)30が固定した磁気ビーズ懸濁液(1 x 107個/μL、推定オリゴ(dT)30固定数:約2.0 x 105分子/磁気ビーズ1個)を調製した。
約106細胞程度のヒト大腸がん細胞(HCT116)から、RNeasy Midi Kit (QIAGEN社)を用いてトータルRNA(約400 ng/μL、25 μL、 計10 μg)を抽出・精製した。これを滅菌水で約100 pg/μLの濃度へ希釈した。氷上に置いたPCRチューブへ、トータルRNA 1 μL (約100 ng)、オリゴ(dT)30固定化磁気ビーズ1μL(1 x 107 個/μL)、dNTP Mix (10mM each) 1 μL、及び滅菌水20 μLを添加し、混合した。磁気ビーズ上のオリゴ(dT)30プライマーとmRNAポリAテールをハイブリダイゼーションするため、サーマルサイクラー(ABI社)を用いて70℃で55分間加熱した。同じPCRチューブを再び氷上に置き、5x First Strand Buffer (250mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15mM MgCl2) 6 μL、 DTT (0.1M) 1 μL、RNase OUT(40 unit/μL、Invitrogen社) 1 μL、及びSuper ScriptIII (200 unit/μL、Invitrogen社) 1 μLを添加し、混合した。これをサーマルサイクラーで50℃ 50分間加熱し、逆転写反応を実施した。続いて、逆転写酵素を不活性化する為に85℃ 3分間加熱した。mRNAを除去してcDNAを1本鎖化するために、RNase H (2unit/μL) 1μLを添加し、サーマルサイクラーで37℃ 20分間加熱した。PCRチューブに磁石を近接させ、cDNAが固定された磁気ビーズを捕捉し、残留試薬が含まれる上澄を除去した。さらに、洗浄液(10 mM Tris, 0.1% Tween20)50 μLでこの磁気ビーズを2回洗浄し、同液10 μLに再懸濁した。これにより、ヒト大腸がん細胞由来トータルRNA (100 pg)から、磁気ビーズ表面へ固定されたターゲットDNA試料(1本鎖cDNA)を得た。
上記のようにして磁気ビーズに固定化したターゲットDNA試料10 μLへ、手順2のようにして調製した標準DNA(A)(配列番号6)、標準DNA(B)(配列番号7)、及び標準DNA(C)(配列番号8)を10μLずつ添加して混合試料を調製した。この混合試料に、滅菌水 116 μL、x10 PCR Buffer 40 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 40 μL、x5 Q-solution 80 μL、ForwardプライマーE(配列番号9)(10μM)40μL、5’末端BiotinラベルReverseプライマーF(10μM)(配列番号5)40 μL、Taq DNA polymerase(5 unit/μL、QIAGEN社) 4 μLを添加し、混合した。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→(94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間)x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行った。標準DNA(A)(B)(C)に含まれる一塩基置換部位の外側に位置するように設計されたプライマーでPCR増幅するため、混合試料中に存在する4種類の鋳型は同じ効率で増幅される。すなわち、PCR増幅後の試料内の4種類の鋳型比率は増幅前と同じに保たれる。磁石をチューブに近接させてPCR産物が含まれる上澄を別チューブに採取した。残った磁気ビーズ上で合成されたPCR産物も採取するため、この磁気ビーズを0.1N NaOH 10μLで洗浄し、洗浄液を先程採取した上澄と混合した。このPCR産物410 μLに残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification KitでPCR産物を精製した(500 μL)。吸光度計で各DNA濃度を測定し、約100 ng/μLであることを確認した。手順4にしたがって、試料の一本鎖化を行った後、手順5のようにして、一塩基伸長による化学発光の測定を行い、ターゲットDNA試料の定量解析を行った。
まず、実施例2の手順6にしたがってオリゴ(dT)30固定化磁気ビーズを調製した。つぎに、手順7にしたがって、上記オリゴ(dT)30固定化磁気ビーズを用いた1本鎖cDNA試料(トータルRNA100pg由来cDNA)を調製した。続いて、磁気ビーズ固定化1本鎖cDNA懸濁液10 μLへ、滅菌水39 μL、x10 PCR Buffer 10μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 10μL、x5 Q-solution 20 μL、ForwardプライマーE(配列番号9)(10 μM)10 μL、Taq DNA polymerase (5 unit/μL、QIAGEN社) 1μLを添加し、混合した。これをサーマルサイクラーで、94℃1分間→(94℃ 30秒間、50℃ 30秒間、72℃ 3分間加熱して2ndストランドcDNAを合成した。チューブに磁石を近接させて磁気ビーズを捕捉し、反応に使用されなかった過剰プライマーを含む上澄を除去し、洗浄液100μLで2回磁気ビーズを洗浄した。95℃に加熱した滅菌水10 μLに磁気ビーズを懸濁し、磁石を用いて磁気ビーズを捕捉した後、上澄を採取した。この上澄には2ndストランドcDNAが含まれている。この操作を2回行い、ターゲットDNA試料である2ndストランドcDNA溶液20 μLを得た(20 μL)。
2nd ストランド cDNA20μLに手順2にしたがって調製した標準DNA(A)(配列番号6)、標準DNA(B)(配列番号7)、及び標準DNA(C)(配列番号8)を10 μLずつ添加し、混合試料を調製した。この混合試料50 μLへ、滅菌水106 μL、x10 PCR Buffer 40 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 40 μL、x5 Q-solution 80 μL、ForwardプライマーE(配列番号9)(10 μM)40 μL、5’末端BiotinラベルReverseプライマーF(10 μM)(配列番号5)40 μL、及びTaq DNA polymerase(5unit/μL、QIAGEN社) 4 μLを添加し、混合させた。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→(94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間)x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行った。標準DNA(A)(B)(C)に含まれる一塩基置換部位の外側にハイブリダイズするように設計されたプライマーでPCR増幅するため、混合試料中に存在する4種類の鋳型は同じ効率で増幅される。すなわち、PCR増幅後の試料内の4種類の鋳型比率は増幅前と同じに保たれる。このPCR産物400 μL内に残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification KitでPCR産物を精製した(500 μL)。吸光度計で各DNA濃度を測定し、約100 ng/μLであることを確認した。手順4にしたがって、試料の一本鎖化を行った後、手順5にしたがって、一塩基伸長による発光測定を行い、ターゲットDNA試料の定量分析を行った。
手順7に従い、オリゴ(dT)30固定化磁気ビーズを用いた1本鎖cDNA試料10 μL (トータルRNA100pg由来cDNA)の調製を行った。1本鎖cDNA試料10 μLへ、滅菌水39 μL、x10 PCR Buffer 10 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 10 μL、x5 Q-solution 20 μL、アンカー付きForwardプライマーG(配列番号11)(10μM)10 μL、及びTaq DNA polymerase(5 unit/μL、QIAGEN社) 1μLを添加し、混合させた。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間、55℃ 30秒間、72℃ 2分間加熱して1回のみの伸長反応を行った。氷上で1分間ほど冷却させた後、反応チューブに磁石を近接させ、反応に使用されなかった過剰プライマーなどを含む上澄を除去した。洗浄液100 μLで磁気ビーズを2回洗浄後、95℃に加熱した滅菌水10 μLに磁気ビーズを懸濁し、上澄を採取した。この操作を2回行い、熱変性によって、磁気ビーズ上で合成されたアンカー付きターゲットDNA試料を得た(20 μL)。
手順1と同様にして、大腸がん細胞由来cDNA試料(トータルRNA 10 pg由来cDNA/μL)を得た。上記で使用したアンカー付きForwardプライマーG(配列番号11)と、1塩基のみ異なる3種類のプライマー、すなわちアンカー付きForwardプライマーH(配列番号12)、アンカー付きForwardプライマーI(配列番号13)、アンカー付きForwardプライマーJ(配列番号14)を用意した。3本のPCRチューブ(チューブH、I、及びJ)を氷上に用意し、それぞれに滅菌水29 μL、x10 PCR Buffer 10 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 10 μL、x5 Q-solution 20 μL、5’末端BiotinラベルReverseプライマーF(10 μM)(配列番号5)10 μL、Taq DNA polymerase(5 unit/μL、QIAGEN社) 1 μL、及びターゲットDNA試料 10 μLを添加した。さらに、チューブHにはForwardプライマーH(10 μM)10 μLを、チューブIにはForwardプライマーI(10 μM)10 μLを、チューブJにはForwardプライマーJ(10 μM)10 μLを添加し、各々をよく混合した。これらをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→(94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間)x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行い、3種類の2本鎖PCR産物H、I、及びJを得た。続いて、試料中に残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社)で各PCR産物を精製した(50 μL)。吸光度計で各DNA濃度を測定し、いずれも約1μg/μLであることを確認した。
氷上に置いたチューブへ、手順12で調製したアンカー付きターゲットDNA試料(20μL)、標準DNA(H)、標準DNA(I)、及び標準DNA(J)を10 μLずつ添加して混合試料を調製した。これへ、滅菌水106 μL、x10 PCR Buffer 40 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 40μL、x5 Q-solution 80μL、ForwardプライマーK(配列番号18)(10 μM)40 μL、5’末端BiotinラベルReverseプライマーF(10 μM)(配列番号5)40 μL、Taq DNA polymerase (5 unit/μL、QIAGEN社) 4μLを混合させた。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→(94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間)x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行った。標準DNA(H)(I)(J)に含まれる一塩基置換部位の外側にハイブリダイズするように設計されたプライマーでPCR増幅するため、混合試料中に存在する4種類の異なる置換塩基を有するDNAは同じ効率で増幅される。すなわち、PCR増幅後の試料内の4種類のDNA比率は増幅前と同じに保たれる。PCR産物400μLに残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification KitでPCR産物を精製した(500 μL)。吸光度計で各DNA濃度を測定し、約100 ng/μLであることを確認した。手順4と同様にして、一本鎖化したPCR産物100 μL(約5x1011分子/μL)を得た。
一本鎖化したPCR合成物8 μlに対し、一塩基伸長用プローブ(50 μM、配列番号19)(405)3 μl、及び10x Hybridization Buffer (100 mM Tris-acetate、20 mM Mg-Acetate、pH 7.75) 3μl、滅菌水16 μlを混合する。混合溶液を、サーマルサイクラーで、92℃30秒間、50℃ 3分間加熱し、4℃に冷却した。この溶液4 μLに120 μLの発光試薬(0.065 U/μL Sequenase、100 mM Tricine、2 mM EDTA、20 mM Mg-Acetate、33.8 U/ml PPDK-E、523.0 GLU/ml Luciferase(LUC-H)、 Apyrase , 1.5 U/ml Grade VI、0.4 mM Luciferin、 0.04 mM PEP、0.2 mM AMP、0.10% BSA、2mM DTT, pH 7.75)を混合し、30℃ 1分間インキュベートした。30μLずつ4連チューブに分注し、PPaseで予めPPiを分解したddNTP(100 μM)を0.5 μLずつ添加し、発光検出した(測定時間:1分間)。次に、同量のddNTPを添加して、再度発光を検出した(測定時間:1分間)。
202 cDNA
203 解析すべきDNA増幅領域
204 Reverse プライマープライミング部位
205 Forward プライマー側プライミング部位
301 ターゲットDNA試料
302 標準DNA(A)
303 標準DNA(B)
304 標準DNA(C)
305 混合試料
306 ForwardプライマーE
307 5’末端BiotinラベルReverseプライマーF
401 PCR増幅後に一本鎖化したターゲットDNA試料
402 PCR増幅後に一本鎖化した標準DNA(A)
403 PCR増幅後に一本鎖化した標準DNA(B)
404 PCR増幅後に一本鎖化した標準DNA(C)
405 一塩基伸長用プローブ
501 最初にddNTPを投入したときに得られる発光強度のピーク
502 2回目にddNTPを投入したときに得られる発光強度のピーク
501 発光強度シグナル
601 3種類の標準DNA(A)(B)(C)から作成した検量線
602 ターゲットDNA試料に対応する分子数
配列番号3−プライマー
配列番号4−プライマー
配列番号5−プライマー
配列番号6−標準DNA(A)
配列番号7−標準DNA(B)
配列番号8−標準DNA(C)
配列番号9−プライマー
配列番号10−伸長用プローブ
配列番号11−プライマー
配列番号12−プライマー
配列番号13−プライマー
配列番号14−プライマー
配列番号15−標準DNA(H)
配列番号16−標準DNA(I)
配列番号17−標準DNA(J)
配列番号18−プライマー
配列番号19−プライマー
Claims (9)
- 以下の工程を含む核酸の定量方法:
1)ターゲットDNA試料に、前記ターゲットDNAの少なくとも一部に一塩基置換を導入した標準DNA試料の一定量を混合する工程
2)混合した試料を、前記一塩基置換部位を含む領域を増幅するように設計されたプライマーを用いて増幅する工程、
3)増幅した試料を一本鎖化し、前記一塩基置換部位の直前に結合するプローブをハイブリダイズさせ、ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTPを1種類ずつ順次加えて相補鎖合成反応を行う工程、
4)ルシフェラーゼ反応により前記相補鎖合成反応で生成するピロリン酸に由来する発光を検出する工程、
5)検出された発光量と前記標準DNA試料の量からターゲットDNAを定量する工程。 - 前記1)〜5)の工程を置換塩基の異なる複数の標準DNA試料について行なうことを特徴とする、請求項1に記載の核酸の定量方法。
- 前記1)〜5)の工程を濃度の異なる複数の標準DNA試料について行なうことを特徴とする、請求項1又は2に記載の核酸の定量方法。
- 前記プライマーがビオチンラベルされており、ストレプトアビジン結合ビーズを用いて増幅産物を精製する工程を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ターゲットDNA試料がcDNA試料である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ターゲットDNAに予めアンカー配列を付加しておき、このアンカー配列に一塩基置換を導入した配列を有するプライマーを用いて前記標準DNA試料を調製することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ターゲットDNA及び前記標準DNAはいずれも遊離の形態であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- ターゲットDNA及び標準DNAの少なくとも一方が固相表面に固定化されたものである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ターゲットDNA試料が磁気ビーズに固定化された試料である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007309089A JP5188789B2 (ja) | 2007-11-29 | 2007-11-29 | 核酸の定量方法 |
US12/292,800 US8389246B2 (en) | 2007-11-29 | 2008-11-26 | Method for nucleic acid quantitation |
CN2008101815517A CN101445828B (zh) | 2007-11-29 | 2008-11-27 | 核酸的定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007309089A JP5188789B2 (ja) | 2007-11-29 | 2007-11-29 | 核酸の定量方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009131176A JP2009131176A (ja) | 2009-06-18 |
JP5188789B2 true JP5188789B2 (ja) | 2013-04-24 |
Family
ID=40676114
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007309089A Expired - Fee Related JP5188789B2 (ja) | 2007-11-29 | 2007-11-29 | 核酸の定量方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8389246B2 (ja) |
JP (1) | JP5188789B2 (ja) |
CN (1) | CN101445828B (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4945279B2 (ja) * | 2007-03-23 | 2012-06-06 | 株式会社日立製作所 | Dna分析方法および分析装置 |
JP5227062B2 (ja) * | 2008-04-08 | 2013-07-03 | 株式会社日立製作所 | Dna分析装置 |
WO2016120970A1 (ja) * | 2015-01-26 | 2016-08-04 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸分離方法、及び装置 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IE61148B1 (en) * | 1988-03-10 | 1994-10-05 | Ici Plc | Method of detecting nucleotide sequences |
GB9210176D0 (en) * | 1992-05-12 | 1992-06-24 | Cemu Bioteknik Ab | Chemical method |
GB9620209D0 (en) * | 1996-09-27 | 1996-11-13 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
JP3638516B2 (ja) * | 2000-09-28 | 2005-04-13 | 株式会社日立製作所 | 核酸検出方法および核酸検出キット |
JP3829690B2 (ja) * | 2001-10-30 | 2006-10-04 | 株式会社日立製作所 | 核酸配列の検査方法 |
JP2004033160A (ja) | 2002-07-05 | 2004-02-05 | Jgs:Kk | Dnaマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、dnaマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールrna |
JP2005287447A (ja) | 2004-04-02 | 2005-10-20 | Hitachi High-Technologies Corp | プローブ及びプライマーおよびこれらを用いた核酸断片相補鎖合成法 |
JP5073967B2 (ja) * | 2006-05-30 | 2012-11-14 | 株式会社日立製作所 | 単一細胞の遺伝子発現定量方法 |
-
2007
- 2007-11-29 JP JP2007309089A patent/JP5188789B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-11-26 US US12/292,800 patent/US8389246B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-11-27 CN CN2008101815517A patent/CN101445828B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101445828A (zh) | 2009-06-03 |
US8389246B2 (en) | 2013-03-05 |
CN101445828B (zh) | 2012-11-21 |
JP2009131176A (ja) | 2009-06-18 |
US20090142767A1 (en) | 2009-06-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6571895B1 (ja) | 核酸プローブ及びゲノム断片検出方法 | |
CN107429296B (zh) | 捕获、检测和定量小rna的方法、组合物与试剂盒 | |
US8329394B2 (en) | Methods and substances for isolation and detection of small polynucleotides | |
CN101952461B (zh) | 用于检测核糖核酸的组合物、方法和试剂盒 | |
CN105934523B (zh) | 核酸的多重检测 | |
CN1703521B (zh) | 基因表达的定量 | |
US20110189679A1 (en) | Compositions and methods for whole transcriptome analysis | |
US9175336B2 (en) | Method for differentiation of polynucleotide strands | |
JP4226476B2 (ja) | 環状化可能プローブを用いた複数の標的配列の分析と検出 | |
US20080045418A1 (en) | Method of labeling and profiling rnas | |
US9845495B2 (en) | Method and kit for detecting target nucleic acid | |
Mashimo et al. | Detection of small RNA molecules by a combination of branched rolling circle amplification and bioluminescent pyrophosphate assay | |
JP5188789B2 (ja) | 核酸の定量方法 | |
US8206905B2 (en) | Enzymatic time-resolved luminescent assay for nucleic acids quantitation | |
WO2018183621A1 (en) | Quantification of ngs dna by adapter sequence | |
WO2008066979A2 (en) | Methods for rapid, single-step strand displacement amplification of nucleic acids | |
US20230407390A1 (en) | Nucleic acid amplification method, primer set, probe, and kit for nucleic acid amplification method | |
WO2006084201A2 (en) | Method of isolating, labeling and profiling small rna and whole-genome transcripts | |
JP2019154310A (ja) | 核酸検出方法及び核酸検出装置、並びに、核酸検出キット | |
JP2010029146A (ja) | 塩基配列解析法 | |
KR101922125B1 (ko) | 표적 핵산을 표지하는 방법 | |
CN116904564A (zh) | 同时检测n种目标基因的荧光实时检测系统、方法、多重引物、试剂盒 | |
CN117143978A (zh) | 颈环寡核苷酸及其在含有z碱基的制备方法中的应用 | |
Spira | Current methods of gene expression analysis and quantification | |
CN113186261A (zh) | 基于单个探针的自引物恒温指数扩增方法在检测长链核酸中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20101007 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130108 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130123 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160201 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160201 Year of fee payment: 3 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |