JP2004033160A - Ｄｎａマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ｄｎａマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールｒｎａ - Google Patents
Ｄｎａマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ｄｎａマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールｒｎａ Download PDFInfo
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Abstract
【課題】サンプルＲＮＡの発現量とコントロールＲＮＡの発現量が著しく異なり既存のＤＮＡマイクロアレイの測定手法では両者の比を正確に検出することができない遺伝子等についても有効なデータを実測すること。
【解決手段】例えばヒト肝臓組織などのバイオプシー検体から抽出および増幅したサンプルＲＮＡに、逆転写酵素を用いてＣｙ３で標識し試料を調整する。また、例えばヒトの培養細胞等から抽出および増幅したコントロールＲＮＡに、スパイクＲＮＡ（サンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの両方に存在するＲＮＡであって、サンプルのシグナル強度がコントロールのシグナル強度に比べて高いもの、または、サンプルＲＮＡに存在するＲＮＡであって、コントロールＲＮＡにおいては存在が認められないもの）を加え、逆転写酵素を用いてＣｙ５で標識し試料を調整する。
【選択図】 図１
【解決手段】例えばヒト肝臓組織などのバイオプシー検体から抽出および増幅したサンプルＲＮＡに、逆転写酵素を用いてＣｙ３で標識し試料を調整する。また、例えばヒトの培養細胞等から抽出および増幅したコントロールＲＮＡに、スパイクＲＮＡ（サンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの両方に存在するＲＮＡであって、サンプルのシグナル強度がコントロールのシグナル強度に比べて高いもの、または、サンプルＲＮＡに存在するＲＮＡであって、コントロールＲＮＡにおいては存在が認められないもの）を加え、逆転写酵素を用いてＣｙ５で標識し試料を調整する。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡに関し、特に、競合的ハイブリダイゼーションによるサンプルとコントロールとの発現量比較による発現解析において、サンプルＲＮＡの発現量とコントロールＲＮＡの発現量が著しく異なり既存のＤＮＡマイクロアレイの測定手法では一方が測定至適範囲外として検出することができない遺伝子等がある場合にも両者の比を得るための有効なデータを実測することのできる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
スパイクＲＮＡはすでに広く利用されている。しかしそれらは例えばＬｕｃｙｄｅａ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ＳｃｏｒｅＣａｒｄ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）のように補正用の対照として用いるか、また二蛍光標識法においてスパイクＲＮＡを加え、実験の効率を検証する目的で用いられているにすぎない（ＤＮＡマイクロアレイを用いた実験例とその検証；峯野純一ら、「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社）ｐ３５−４２）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ここで、測定機器の一般的特性として、至適測定範囲以外での測定は誤差を生じやすいことが知られている。また、遺伝子プロファイリングでは、例えば二蛍光標識法のような競合的ハイブリダイゼーションによってコントロールＲＮＡ（例えば培養細胞からの抽出ＲＮＡ）との比で発現の増減を判断するのが一般的であるが、その場合はサンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの測定レンジが大きくかけはなれているもの、特にサンプルに比較してコントロールＲＮＡの値が極端に低いものは好ましくない。
【０００４】
即ち蛍光スキャナーでは測定対象の蛍光強度に合わせてレーザー強度を調整できるが、二蛍光標識法では最終的な判定がサンプルとコントロールとの比で得られるため、サンプルとコントロールのそれぞれのレーザー強度を変化させて得た値は意味のないものとなってしまうため、常に同一レーザー強度下で測定せざるを得ない。
【０００５】
しかし乖離度の高い組合せについて同一レーザー強度下で測定した値は、一方にとっては測定至適範囲外となり、必然的に誤差を生じることとなる。また両者の値が極端に異なる場合や、培養細胞では発現していない遺伝子については、対照の測定値がゼロとなり、まったく比がとれなくなる場合も生じる。
【０００６】
これらの問題は競合的ハイブリダイゼーションのような比較による発現解析に常に伴う問題である。
【０００７】
ここで、解析に用いられるコントロールＲＮＡは、データの比較のためにも各遺伝子の発現がテスト毎で一定している必要があり、そのためには安定して大量に供給できる材料が必要となる。この条件を満たすために、一般的には培養細胞からの抽出ＲＮＡを調整して使用している。
【０００８】
しかし培養細胞はもともと癌細胞に由来するものであり、ＤＮＡマイクロアレイによる解析の対象が癌細胞以外である場合は、その遺伝子発現の様相が異なることは当然である。
【０００９】
例えば肝炎患者の肝臓組織では炎症に関与する遺伝子の発現が促進され、それらの遺伝子については対象ＲＮＡでの発現とは大きく異なっている。そして、これらの促進された遺伝子発現こそが解析対象の中心であるべきはずなのであるが、実際の測定では上述のような困難が伴うことがしばしば起こっている。
【００１０】
本発明は上記問題点に鑑みてなされたもので、サンプルＲＮＡの発現量とコントロールＲＮＡの発現量が著しく異なり既存のＤＮＡマイクロアレイの測定手法では検出することができない遺伝子等がある場合、特にサンプルＲＮＡと比較してコントロールＲＮＡのシグナル強度の値が極端に低い場合についても有効なデータを実測することのできる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡを提供することを目的としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
このような目的を達成するため、請求項１に記載の競合的ハイブリダイゼーションの方法は、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析において、コントロールＲＮＡに複数種類の特定遺伝子のＲＮＡをそれぞれ一定量加えることを特徴とする。
【００１２】
この方法によれば、コントロールＲＮＡに複数種類の特定遺伝子のＲＮＡをそれぞれ一定量加えるので、競合的ハイブリダイゼーションによってサンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡ（例えば培養細胞からの抽出ＲＮＡ）との比で発現の増減を判断する場合に、サンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの測定レンジが大きくかけはなれているもの、特にサンプルに比較してコントロールＲＮＡの値が極端に低いものについても、コントロールＲＮＡの発現量を適切なレベルまで押し上げることにより両者の比を得るための有効なデータを取得することができるようになる。
【００１３】
すなわち、この方法によれば、サンプルＲＮＡの発現量とコントロールＲＮＡの発現量が著しく異なるため、既存のＤＮＡマイクロアレイの測定手法により同一レーザー強度下で蛍光強度を測定した場合には検出することができなかった遺伝子や、装置などの測定至適範囲外となり誤差が大きくなっていた遺伝子についても有効なデータを取得することができるようになる。
【００１４】
また、この方法によれば、特に、サンプルＲＮＡと比較してコントロールＲＮＡのシグナル強度の値が極端に低いためサンプルとコントロールとの比が正確に実測できない場合においても、コントロールＲＮＡ側に一定量のＲＮＡを加えることによって、このようなシグナル強度の乖離度の高い組合せの場合についても両者の比を得るための十分なデータを取得することができるようになる。
【００１５】
さらに、この方法によれば、培養細胞では発現していない遺伝子については、コントロール側の測定値がゼロとなるため、従来の手法ではサンプルとコントロールとの比がまったくとれなかった場合においても、両者の比を得るための十分なデータを取得することができるようになる。
【００１６】
また、請求項２に記載の方法は、請求項１に記載の方法において、上記競合的ハイブリダイゼーションが、二蛍光標識法であることを特徴とする。
【００１７】
これは競合的ハイブリダイゼーションの一例を一層具体的に示すものである。この方法によれば、二蛍光標識法を用いた競合的ハイブリダイゼーションを効率的に実行することができるようになる。
【００１８】
また、請求項３に記載の方法は、請求項１または請求項２に記載の方法において、上記複数種類の特定遺伝子のＲＮＡは、サンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの両方に存在するＲＮＡであって、サンプルのシグナル強度がコントロールのシグナル強度に比べて高いもの、または、サンプルＲＮＡに存在するＲＮＡであって、コントロールＲＮＡにおいては存在が認められないものから選択されたものであることを特徴とする。
【００１９】
これは複数種類の特定遺伝子のＲＮＡの一例を一層具体的に示すものである。この方法によれば、複数種類の特定遺伝子のＲＮＡは、サンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの両方に存在するＲＮＡであって、サンプルのシグナル強度がコントロールのシグナル強度に比べて高いもの、または、サンプルＲＮＡに存在するＲＮＡであって、コントロールＲＮＡにおいては存在が認められないものから選択されたものであるので、培養細胞では低い発現しか示さないＲＮＡまたは発現が認められないＲＮＡであって、バイオプシー検体では高い発現を示すＲＮＡについて、同一レーザー強度下で正確に実測を行うことができるようになる。
【００２０】
また、請求項４に記載の方法は、請求項１から請求項３のいずれか一つに記載の方法において、上記複数種類の特定遺伝子のＲＮＡは、コントロールＲＮＡの蛍光強度がサンプルＲＮＡの蛍光強度の１／３以下であるＲＮＡから選択されたものであることを特徴とする。
【００２１】
これは複数種類の特定遺伝子のＲＮＡの一例を一層具体的に示すものである。この方法によれば、複数種類の特定遺伝子のＲＮＡは、コントロールＲＮＡの蛍光強度がサンプルＲＮＡの蛍光強度の１／３以下（コントロールＲＮＡの蛍光強度が０の場合を含む）であるＲＮＡから選択されたものであるので、このようなＲＮＡの実測を効率化することができるようになる。
【００２２】
また、本発明は、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡに関するものであり、請求項５に記載のＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡは、請求項１から請求項４のいずれか一つに記載された上記複数種類の特定遺伝子のＲＮＡをそれぞれ一定量加えたことを特徴とする。
【００２３】
このコントロールＲＮＡによれば、従来の培養細胞から抽出および増幅したＲＮＡのみをコントロールＲＮＡとした場合と比べて、上述したような様々の利点を得ることができるようになる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明にかかるＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡの実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。特に、以下の実施の形態においては、本発明を、二蛍光標識法を用いたＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析手法に適用した例について説明するが、この場合に限られず、他の全ての競合的ハイブリダイゼーションを用いたＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析手法において、同様に適用することができる。
【００２５】
またＤＮＡマイクロアレイの支持体はスライドガラスが広く用いられているが、本発明の適用においては必ずしも平板状である必要はなく、例えばビーズのような粒子状のもの等、他の形状でも可能である。
【００２６】
［本発明の概要］
以下、本発明の概要について説明し、その後、本発明の構成および処理等について詳細に説明する。図１は本発明の基本原理を示す原理構成図である。
図１では、一例として、各種コントロールＲＮＡなどの内部標準物質を用いた二蛍光標識法を用いた競合的ハイブリダイゼーションを行い、更に検出データをコンピュータを用いて大量解析する手法により、測定の精度や再現性の向上を図る場合を一例に説明する。ここで、「二蛍光標識法」とは、二つのｍＲＮＡサンプルをそれぞれ異なる蛍光で標識し、同一マイクロアレイ上で競合的ハイブリダイゼーションを行って、両方の蛍光を測定・比較することで遺伝子発現の差を検出する手法である。
【００２７】
本発明は、概略的に、以下の基本的特徴を有する。
まず、例えばヒト肝臓組織などのバイオプシー検体から抽出および増幅したサンプルＲＮＡに、逆転写酵素を用いてＣｙ３で標識し試料を調整する。
【００２８】
また、例えばヒト癌細胞などの培養細胞から抽出および増幅したコントロールＲＮＡに、スパイクＲＮＡを加え、逆転写酵素を用いてＣｙ５で標識し試料を調整する。
【００２９】
ここで、コントロールＲＮＡに加えるスパイクＲＮＡは、サンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの両方に存在するＲＮＡであって、サンプルのシグナル強度がコントロールのシグナル強度に比べて高い（例えば、コントロールＲＮＡの蛍光強度がサンプルＲＮＡの蛍光強度の１／３以下）もの、または、サンプルＲＮＡに存在するＲＮＡであって、コントロールＲＮＡにおいては存在が認められないものである。
【００３０】
すなわち、スパイクＲＮＡは、もともとヒト遺伝子であり、マイクロアレイ上の解析対象遺伝子用スポットとして存在するものであるが、これらのＲＮＡは培養細胞では低い発現しか示さないか、発現が認められないものである。そのため、これらのＲＮＡをサンプルＲＮＡ用のＣｙ３の波長で測定したときはある程度のシグナル強度が測定できるが、コントロールＲＮＡ用のＣｙ５の波長で測定したときは非常に低いシグナル強度となるため測定誤差を生じたり、または、検出不能である場合が多い。従って、本発明によりスパイクＲＮＡとしてコントロールＲＮＡに加えることにより、コントロール側のシグナル強度の上げ底をすることにより、競合的ハイブリダイゼーションによりサンプルとコントロールとの比の増減をみるための有効なデータを収集することができるようになる。
【００３１】
ついで、両ターゲット溶液を混合し、ＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイゼーションを行い洗浄を行う。Ｃｙ３とＣｙ５で標識されたＲＮＡは、混合してＤＮＡマイクロアレイ上にのせるので、各スポットに対し競合的に反応（ハイブリダイズ）することになる。これを共焦点レーザー顕微鏡型スキャナー装置等を用いてＣｙ３またはＣｙ５のそれぞれの波長のレーザー光線（励起光線）を照射し発光させシグナル強度を測定し、スポット毎にＣｙ３とＣｙ５の測定値の比を得ることで、スポット差（例えば各スポットのＤＮＡ量）に関係なく、コントロールＲＮＡに対する測定対象のＲＮＡの増減が把握できる。
【００３２】
なお、スパイクＲＮＡとして用いたＲＮＡのスポットは、元々コントロールＲＮＡに含まれていたものとスパイクＲＮＡとして加えたものが合算されたシグナル強度になり、それらを個別に判別して求めるための手段はない。従って、加えるスパイクＲＮＡの量を常に一定にすることにより、その変動を正確に把握することができるようになる。すなわち、実測されるコントロールとサンプルのシグナル強度の比の値そのものには意味は無く、その比の変動のみが意味を持つことになる（例えば、正常組織とコントロール（＋スパイク）との比を、サンプル組織とコントロール（＋スパイク）の比と対比することができる）。
【００３３】
【実施例】
次に、本発明の具体例を説明する。
【００３４】
（実施例１）バックグラウンド等の検証
本発明は競合的ハイブリダイゼーションをより効果的に行うことを目的とするものであるが、ここではサンプルにスパイクを加えることにより予想される効果が得られるかどうかを検証するため、１種類の標識のみによる非競合的なハイブリダイゼーションを行った。
【００３５】
（１）コントロールＲＮＡの調整
ＨｅｐＧ２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）、ＨＥｐ３Ｂ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）、および、Ｈｕｈ７（理研セルバンクより入手）の３種類の培養細胞からＲＮｅａｓｙ ｐｒｏｔｅｃｔ ｍｉｎｉ キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて常法によりトータルＲＮＡ（以下Ｃ−ＲＮＡ）を抽出した。細胞や組織からのＲＮＡ抽出の方法は、例えば「新細胞工学実験プロトコール」（秀潤社）に記載されているように、周知技術であり、そのためのキットや試薬も販売されているので、容易に行うことができる。
【００３６】
そして、抽出した３種類のＲＮＡの等量を混合してコントロールＲＮＡとし、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ａＲＮＡ キット（Ａｍｂｉｏｎ社）の試薬を用い、当該プロトコールに従って増幅した。ＲＮＡ増幅の方法は周知であり、そのためのキットや試薬も販売されているので、容易に行うことができる。ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ａＲＮＡ キットは、Ｔ７プロモーターを含んだオリゴｄＴプライマーを用いてＲＮＡから二本鎖ＤＮＡを合成し、その後Ｔ７プロモーターを利用してＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡを増幅するものである。増幅したＲＮＡは吸光度測定によってその濃度を、また、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって品質をチェックした（以下Ｃ−ａＲＮＡ）。
【００３７】
（２）スパイクＲＮＡの調整
これまでのデータから、バイオプシー検体では強く発現し、一方培養細胞では低い発現を示す遺伝子をいくつか特定し、それらの遺伝子の一部をクローニングした。
【００３８】
具体的には２，５−ｏｌｉｇｏ−ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（２，５−ＡＳ）、ＣＩＳ３、ＩＬ−４ の遺伝子（すべてヒト遺伝子）の一部（約５００〜１２００ｂｐ）をそれぞれ市販のベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入した。このベクターにはあらかじめＴ７プロモーター配列が入っているため、大腸菌内で増殖したベクターを回収して、Ｔ７Ｍｅｇａｓｃｔｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、インビトロでのＲＮＡ転写（ＲＮＡ増幅）を簡単に行うことができる。Ｔ７ Ｍｅｇａｓｃｔｉｐｔキットは、上述のＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ａＲＮＡ キットと原理的に同様である。増幅したＲＮＡは、吸光度測定によってその濃度を、また、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって品質をチェックした。
【００３９】
（３）ＤＮＡマイクロアレイの作製
解析対象の遺伝子（遺伝子の一部、約２００−２０００ｂｐ）および対照用（例えばホタルルシフェラーゼ遺伝子の一部等）のクローンをＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲで常法により増幅した。これらのｄｓＤＮＡを精製後、アレイヤー（Ｇｅｎｅｑｓ Ａｒｒａｙｅｒ ２０００ ；カケンジェネックス社製、松戸市）に移してポリ−Ｌ−リジンコートしたスライドガラス上にスポッティングした。スポット数は各遺伝子３個づつとした。
【００４０】
その後スポット済みスライドグラスを８０℃の恒温槽で２時間ベーキングし、その後ＵＶクロスリンク機（ＳＰＥＣＴＲＯ ＬＩＮＫＥＲ， Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ社製）でＵＶを照射し、ＤＮＡを固定した。
【００４１】
（４）ＲＮＡの標識とハイブリダイゼーション
上記（１）（２）で調整したＲＮＡをＣｙ３で標識した。ＲＮＡの標識法は周知であり、例えば「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社）等に記載されている。本発明ではまず増幅したコントロールＲＮＡ（Ｃ−ａＲＮＡ）及び上記３種類のスパイクＲＮＡを等量混合したもの（ＳＰ−ａＲＮＡ）の２種類を対象として、ランダムプライマー（タカラ）とＣｙ３−ｄＵＴＰ（パーキンエルマー社）を用い、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）で標識を行った。標識によって得られた一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）により、製品のプロトコールに従って精製した。
【００４２】
標識ｓｓＤＮＡを表１の組み合わせで混合し、上記（３）で調整したＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの方法は周知であり、例えば「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社）等に記載されている。本発明においては、標識ＤＮＡをスライドに滴下し、カバーグラスをのせた後、６５℃の恒温槽で１４〜１８時間ハイブリダイゼーションを行った。洗浄後スライドスキャナー（Ｓｃａｎ Ａｒｒａｙ ５０００， ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製）でシグナルを取り込んだ。
【表１】
（マイクロアレイ１と２、３と４は同じものをデユープリケイトで行った）
【００４３】
（５）結果
Ａ．スパイクＲＮＡによる蛍光シグナルの上昇の確認
上の表のマイクロアレイ３、４、６について、加えた遺伝子（２，５−ＡＳ、ＣＩＳ３、ＩＬ−４）と同種類のＤＮＡスポット（各３スポット）上でのハイブリダイゼーションの結果をスキャナーによって読み取り、その平均値を比較した。結果は表２のとおりである。
【表２】
上記数字は１遺伝子につき３スポットを測定して得られた蛍光強度の平均値である。
【００４４】
上記表においては、ＣＩＳ３にややばらつきが見られたものの（マイクロアレイ１、２）、各遺伝子についてマイクロアレイ１、２では３、４のほぼ１０倍の値を示す良好な結果が得られた。またマイクロアレイ５は、必ずしもマイクロアレイ１、２と同値を示さなかったが、これは添加した培養細胞のＤＮＡによるブロッキングの効果がその一因であると推定された。
【００４５】
この結果から、コントロール用培養細胞で十分量発現していない遺伝子（マイクロアレイ６でのシグナル）については、スパイクＲＮＡを添加することにより、十分な蛍光強度が得られることが示された（マイクロアレイ１、２、３、４）。
【００４６】
Ｂ．バックグラウンドへの影響
スパイクＲＮＡのバックグラウンドへの影響を、対照スポットであるホタルルシフェラーゼ遺伝子とラムダファージｅａ２２遺伝子を用いて調べた。これらの遺伝子のスポットは、上記３種類のヒト遺伝子（２，５−ＡＳ、ＣＩＳ３、ＩＬ−４）とは理論上はハイブリダイズしないはずである。その結果を以下に示す。
【表３】
上記数字は１遺伝子につき３スポットを測定して得られた蛍光強度の平均値である。この結果では、ホタルルシフェラーゼ遺伝子のスポットの蛍光強度はマイクロアレイ１から５まで、スパイクＲＮＡを含まない６とほぼ同じで、スパイクＲＮＡによる影響を受けていないことがわかる。
【００４７】
一方ｅａ２２遺伝子のスポットでは、スパイクＲＮＡ１００ｐｇ（マイクロアレイ３、４）ではコントロールＲＮＡのみ（６）と変わらないが、１０００ｐｇではあきらかな上昇が見られ、また、スパイクＲＮＡのみでは顕著に蛍光強度が上昇した。スパイクＲＮＡのみでの上昇は、コントロールＲＮＡがｅａ２２ＤＮＡに対してある種のブロッキングの役割を果たしている可能性が考えられた。
【００４８】
上記の結果から、スパイクＲＮＡを添加する際には、解析対象となる各スポットについて、非特異的ハイブリダイゼーションの有無の確認や添加量の調整を慎重に行う必要があると考えられた。
【００４９】
（実施例２）サンプルへの応用
以上の結果を踏まえて、スパイクＲＮＡを二蛍光標識法に応用した。
【００５０】
（１）サンプルＲＮＡの調整
方法は実施例１の培養細胞と同様である。即ち、バイオプシーによる肝臓組織からＲＮｅａｓｙ ｐｒｏｔｅｃｔ ｍｉｎｉ キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて常法によりトータルＲＮＡを抽出した。その後ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ａＲＮＡ キット（Ａｍｂｉｏｎ社）の試薬を用い、当該プロトコールに従って増幅し、濃度と品質をチェックしてサンプルＲＮＡとした。
【００５１】
（２）ＤＮＡマイクロアレイの作製
ＤＮＡマイクロアレイは実施例１（３）で作製したものと同じものを用いた。
【００５２】
（３）ＲＮＡの標識とハイブリダイゼーション
方法は実施例１（４）と同様である。
上記（１）で調整した組織サンプルＲＮＡ４μｇをＣｙ３で、実施例１（１）（２）で調整したコントロールＲＮＡ４μｇとスパイクＲＮＡ１００ｐｇを混合したものをＣｙ５で標識した。精製後両方のｓｓＤＮＡを混合し、上記（２）のＤＮＡマイクロアレイにのせ、ハイブリダイゼーションを行った後洗浄した。スキャナーにより蛍光強度をとりこみ、スパイクＲＮＡの遺伝子のスポットについて得られた蛍光強度を、以前の結果と比較した。以下の表に示された数字は１遺伝子につき３スポットを測定して得られた蛍光強度の平均値である。
【００５３】
Ａ．スパイクＲＮＡなし
【表４】
サンプルに比較し、コントロールの値が低く、サンプルとコントロールを同じレーザーパワーでスキャニングすると、コントロールは感度の低い領域で測定せざるをえなく、最終的に得られた比は誤差が予想される。
【００５４】
Ｂ．コントロールＲＮＡにスパイクＲＮＡを加えた場合
【表５】
サンプルとコントロールの値が近づいており、測定範囲の相違によるスキャニングの誤差がＡより少なくなっていると考えられる。サンプルが異なるので（バイオプシーのサンプルでは１回の測定のみ可能）単純にＡの値と比較することはできないが、コントロールが至適測定範囲からはずれるという問題がスパイクＲＮＡ添加によって解決されることが示された。
【００５５】
［他の実施の形態］
さて、これまで本発明の実施の形態について説明したが、本発明は、上述した実施の形態以外にも、上記特許請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内において種々の異なる実施の形態にて実施されてよいものである。
【００５６】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明によれば、コントロールＲＮＡに複数種類の特定遺伝子のＲＮＡをそれぞれ一定量加えるので、競合的ハイブリダイゼーションによってサンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡ（例えば培養細胞からの抽出ＲＮＡ）との比で発現の増減を判断する場合に、サンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの測定レンジが大きくかけはなれているもの、特にサンプルに比較してコントロールＲＮＡの値が極端に低いものについても、コントロールＲＮＡの発現量を適切なレベルまで押し上げることにより両者の比を得るための有効なデータを取得することができる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡを提供することができる。
【００５７】
また、本発明によれば、サンプルＲＮＡの発現量とコントロールＲＮＡの発現量が著しく異なるため、既存のＤＮＡマイクロアレイの測定手法により同一レーザー強度下で蛍光強度を測定した場合には検出することができなかった遺伝子や、装置などの測定至適範囲外となり誤差が大きくなっていた遺伝子についても有効なデータを取得することができる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡを提供することができる。
【００５８】
また、本発明によれば、特に、サンプルＲＮＡと比較してコントロールＲＮＡのシグナル強度の値が極端に低いためサンプルとコントロールとの比が正確に実測できない場合においても、コントロールＲＮＡ側に一定量のＲＮＡを加えることによって、このようなシグナル強度の乖離度の高い組合せの場合についても両者の比を得るための十分なデータを取得することができる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡを提供することができる。
【００５９】
また、本発明によれば、培養細胞では発現していない遺伝子については、コントロール側の測定値がゼロとなるため、従来の手法ではサンプルとコントロールとの比がまったくとれなかった場合においても、両者の比を得るための十分なデータを取得することができる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡを提供することができる。
【００６０】
また、本発明によれば、二蛍光標識法を用いた競合的ハイブリダイゼーションを効率的に実行することができる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡを提供することができる。
【００６１】
また、本発明によれば、複数種類の特定遺伝子のＲＮＡは、サンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの両方に存在するＲＮＡであって、サンプルのシグナル強度がコントロールのシグナル強度に比べて高いもの、または、サンプルＲＮＡに存在するＲＮＡであって、コントロールＲＮＡにおいては存在が認められないものから選択されたものであるので、培養細胞では低い発現しか示さないＲＮＡまたは発現が認められないＲＮＡであって、バイオプシー検体では高い発現を示すＲＮＡについて、同一レーザー強度下で正確に実測を行うことができる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の基本原理を示す原理構成図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡに関し、特に、競合的ハイブリダイゼーションによるサンプルとコントロールとの発現量比較による発現解析において、サンプルＲＮＡの発現量とコントロールＲＮＡの発現量が著しく異なり既存のＤＮＡマイクロアレイの測定手法では一方が測定至適範囲外として検出することができない遺伝子等がある場合にも両者の比を得るための有効なデータを実測することのできる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
スパイクＲＮＡはすでに広く利用されている。しかしそれらは例えばＬｕｃｙｄｅａ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ＳｃｏｒｅＣａｒｄ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）のように補正用の対照として用いるか、また二蛍光標識法においてスパイクＲＮＡを加え、実験の効率を検証する目的で用いられているにすぎない（ＤＮＡマイクロアレイを用いた実験例とその検証；峯野純一ら、「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社）ｐ３５−４２）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ここで、測定機器の一般的特性として、至適測定範囲以外での測定は誤差を生じやすいことが知られている。また、遺伝子プロファイリングでは、例えば二蛍光標識法のような競合的ハイブリダイゼーションによってコントロールＲＮＡ（例えば培養細胞からの抽出ＲＮＡ）との比で発現の増減を判断するのが一般的であるが、その場合はサンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの測定レンジが大きくかけはなれているもの、特にサンプルに比較してコントロールＲＮＡの値が極端に低いものは好ましくない。
【０００４】
即ち蛍光スキャナーでは測定対象の蛍光強度に合わせてレーザー強度を調整できるが、二蛍光標識法では最終的な判定がサンプルとコントロールとの比で得られるため、サンプルとコントロールのそれぞれのレーザー強度を変化させて得た値は意味のないものとなってしまうため、常に同一レーザー強度下で測定せざるを得ない。
【０００５】
しかし乖離度の高い組合せについて同一レーザー強度下で測定した値は、一方にとっては測定至適範囲外となり、必然的に誤差を生じることとなる。また両者の値が極端に異なる場合や、培養細胞では発現していない遺伝子については、対照の測定値がゼロとなり、まったく比がとれなくなる場合も生じる。
【０００６】
これらの問題は競合的ハイブリダイゼーションのような比較による発現解析に常に伴う問題である。
【０００７】
ここで、解析に用いられるコントロールＲＮＡは、データの比較のためにも各遺伝子の発現がテスト毎で一定している必要があり、そのためには安定して大量に供給できる材料が必要となる。この条件を満たすために、一般的には培養細胞からの抽出ＲＮＡを調整して使用している。
【０００８】
しかし培養細胞はもともと癌細胞に由来するものであり、ＤＮＡマイクロアレイによる解析の対象が癌細胞以外である場合は、その遺伝子発現の様相が異なることは当然である。
【０００９】
例えば肝炎患者の肝臓組織では炎症に関与する遺伝子の発現が促進され、それらの遺伝子については対象ＲＮＡでの発現とは大きく異なっている。そして、これらの促進された遺伝子発現こそが解析対象の中心であるべきはずなのであるが、実際の測定では上述のような困難が伴うことがしばしば起こっている。
【００１０】
本発明は上記問題点に鑑みてなされたもので、サンプルＲＮＡの発現量とコントロールＲＮＡの発現量が著しく異なり既存のＤＮＡマイクロアレイの測定手法では検出することができない遺伝子等がある場合、特にサンプルＲＮＡと比較してコントロールＲＮＡのシグナル強度の値が極端に低い場合についても有効なデータを実測することのできる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡを提供することを目的としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
このような目的を達成するため、請求項１に記載の競合的ハイブリダイゼーションの方法は、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析において、コントロールＲＮＡに複数種類の特定遺伝子のＲＮＡをそれぞれ一定量加えることを特徴とする。
【００１２】
この方法によれば、コントロールＲＮＡに複数種類の特定遺伝子のＲＮＡをそれぞれ一定量加えるので、競合的ハイブリダイゼーションによってサンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡ（例えば培養細胞からの抽出ＲＮＡ）との比で発現の増減を判断する場合に、サンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの測定レンジが大きくかけはなれているもの、特にサンプルに比較してコントロールＲＮＡの値が極端に低いものについても、コントロールＲＮＡの発現量を適切なレベルまで押し上げることにより両者の比を得るための有効なデータを取得することができるようになる。
【００１３】
すなわち、この方法によれば、サンプルＲＮＡの発現量とコントロールＲＮＡの発現量が著しく異なるため、既存のＤＮＡマイクロアレイの測定手法により同一レーザー強度下で蛍光強度を測定した場合には検出することができなかった遺伝子や、装置などの測定至適範囲外となり誤差が大きくなっていた遺伝子についても有効なデータを取得することができるようになる。
【００１４】
また、この方法によれば、特に、サンプルＲＮＡと比較してコントロールＲＮＡのシグナル強度の値が極端に低いためサンプルとコントロールとの比が正確に実測できない場合においても、コントロールＲＮＡ側に一定量のＲＮＡを加えることによって、このようなシグナル強度の乖離度の高い組合せの場合についても両者の比を得るための十分なデータを取得することができるようになる。
【００１５】
さらに、この方法によれば、培養細胞では発現していない遺伝子については、コントロール側の測定値がゼロとなるため、従来の手法ではサンプルとコントロールとの比がまったくとれなかった場合においても、両者の比を得るための十分なデータを取得することができるようになる。
【００１６】
また、請求項２に記載の方法は、請求項１に記載の方法において、上記競合的ハイブリダイゼーションが、二蛍光標識法であることを特徴とする。
【００１７】
これは競合的ハイブリダイゼーションの一例を一層具体的に示すものである。この方法によれば、二蛍光標識法を用いた競合的ハイブリダイゼーションを効率的に実行することができるようになる。
【００１８】
また、請求項３に記載の方法は、請求項１または請求項２に記載の方法において、上記複数種類の特定遺伝子のＲＮＡは、サンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの両方に存在するＲＮＡであって、サンプルのシグナル強度がコントロールのシグナル強度に比べて高いもの、または、サンプルＲＮＡに存在するＲＮＡであって、コントロールＲＮＡにおいては存在が認められないものから選択されたものであることを特徴とする。
【００１９】
これは複数種類の特定遺伝子のＲＮＡの一例を一層具体的に示すものである。この方法によれば、複数種類の特定遺伝子のＲＮＡは、サンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの両方に存在するＲＮＡであって、サンプルのシグナル強度がコントロールのシグナル強度に比べて高いもの、または、サンプルＲＮＡに存在するＲＮＡであって、コントロールＲＮＡにおいては存在が認められないものから選択されたものであるので、培養細胞では低い発現しか示さないＲＮＡまたは発現が認められないＲＮＡであって、バイオプシー検体では高い発現を示すＲＮＡについて、同一レーザー強度下で正確に実測を行うことができるようになる。
【００２０】
また、請求項４に記載の方法は、請求項１から請求項３のいずれか一つに記載の方法において、上記複数種類の特定遺伝子のＲＮＡは、コントロールＲＮＡの蛍光強度がサンプルＲＮＡの蛍光強度の１／３以下であるＲＮＡから選択されたものであることを特徴とする。
【００２１】
これは複数種類の特定遺伝子のＲＮＡの一例を一層具体的に示すものである。この方法によれば、複数種類の特定遺伝子のＲＮＡは、コントロールＲＮＡの蛍光強度がサンプルＲＮＡの蛍光強度の１／３以下（コントロールＲＮＡの蛍光強度が０の場合を含む）であるＲＮＡから選択されたものであるので、このようなＲＮＡの実測を効率化することができるようになる。
【００２２】
また、本発明は、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡに関するものであり、請求項５に記載のＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡは、請求項１から請求項４のいずれか一つに記載された上記複数種類の特定遺伝子のＲＮＡをそれぞれ一定量加えたことを特徴とする。
【００２３】
このコントロールＲＮＡによれば、従来の培養細胞から抽出および増幅したＲＮＡのみをコントロールＲＮＡとした場合と比べて、上述したような様々の利点を得ることができるようになる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明にかかるＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡの実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。特に、以下の実施の形態においては、本発明を、二蛍光標識法を用いたＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析手法に適用した例について説明するが、この場合に限られず、他の全ての競合的ハイブリダイゼーションを用いたＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析手法において、同様に適用することができる。
【００２５】
またＤＮＡマイクロアレイの支持体はスライドガラスが広く用いられているが、本発明の適用においては必ずしも平板状である必要はなく、例えばビーズのような粒子状のもの等、他の形状でも可能である。
【００２６】
［本発明の概要］
以下、本発明の概要について説明し、その後、本発明の構成および処理等について詳細に説明する。図１は本発明の基本原理を示す原理構成図である。
図１では、一例として、各種コントロールＲＮＡなどの内部標準物質を用いた二蛍光標識法を用いた競合的ハイブリダイゼーションを行い、更に検出データをコンピュータを用いて大量解析する手法により、測定の精度や再現性の向上を図る場合を一例に説明する。ここで、「二蛍光標識法」とは、二つのｍＲＮＡサンプルをそれぞれ異なる蛍光で標識し、同一マイクロアレイ上で競合的ハイブリダイゼーションを行って、両方の蛍光を測定・比較することで遺伝子発現の差を検出する手法である。
【００２７】
本発明は、概略的に、以下の基本的特徴を有する。
まず、例えばヒト肝臓組織などのバイオプシー検体から抽出および増幅したサンプルＲＮＡに、逆転写酵素を用いてＣｙ３で標識し試料を調整する。
【００２８】
また、例えばヒト癌細胞などの培養細胞から抽出および増幅したコントロールＲＮＡに、スパイクＲＮＡを加え、逆転写酵素を用いてＣｙ５で標識し試料を調整する。
【００２９】
ここで、コントロールＲＮＡに加えるスパイクＲＮＡは、サンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの両方に存在するＲＮＡであって、サンプルのシグナル強度がコントロールのシグナル強度に比べて高い（例えば、コントロールＲＮＡの蛍光強度がサンプルＲＮＡの蛍光強度の１／３以下）もの、または、サンプルＲＮＡに存在するＲＮＡであって、コントロールＲＮＡにおいては存在が認められないものである。
【００３０】
すなわち、スパイクＲＮＡは、もともとヒト遺伝子であり、マイクロアレイ上の解析対象遺伝子用スポットとして存在するものであるが、これらのＲＮＡは培養細胞では低い発現しか示さないか、発現が認められないものである。そのため、これらのＲＮＡをサンプルＲＮＡ用のＣｙ３の波長で測定したときはある程度のシグナル強度が測定できるが、コントロールＲＮＡ用のＣｙ５の波長で測定したときは非常に低いシグナル強度となるため測定誤差を生じたり、または、検出不能である場合が多い。従って、本発明によりスパイクＲＮＡとしてコントロールＲＮＡに加えることにより、コントロール側のシグナル強度の上げ底をすることにより、競合的ハイブリダイゼーションによりサンプルとコントロールとの比の増減をみるための有効なデータを収集することができるようになる。
【００３１】
ついで、両ターゲット溶液を混合し、ＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイゼーションを行い洗浄を行う。Ｃｙ３とＣｙ５で標識されたＲＮＡは、混合してＤＮＡマイクロアレイ上にのせるので、各スポットに対し競合的に反応（ハイブリダイズ）することになる。これを共焦点レーザー顕微鏡型スキャナー装置等を用いてＣｙ３またはＣｙ５のそれぞれの波長のレーザー光線（励起光線）を照射し発光させシグナル強度を測定し、スポット毎にＣｙ３とＣｙ５の測定値の比を得ることで、スポット差（例えば各スポットのＤＮＡ量）に関係なく、コントロールＲＮＡに対する測定対象のＲＮＡの増減が把握できる。
【００３２】
なお、スパイクＲＮＡとして用いたＲＮＡのスポットは、元々コントロールＲＮＡに含まれていたものとスパイクＲＮＡとして加えたものが合算されたシグナル強度になり、それらを個別に判別して求めるための手段はない。従って、加えるスパイクＲＮＡの量を常に一定にすることにより、その変動を正確に把握することができるようになる。すなわち、実測されるコントロールとサンプルのシグナル強度の比の値そのものには意味は無く、その比の変動のみが意味を持つことになる（例えば、正常組織とコントロール（＋スパイク）との比を、サンプル組織とコントロール（＋スパイク）の比と対比することができる）。
【００３３】
【実施例】
次に、本発明の具体例を説明する。
【００３４】
（実施例１）バックグラウンド等の検証
本発明は競合的ハイブリダイゼーションをより効果的に行うことを目的とするものであるが、ここではサンプルにスパイクを加えることにより予想される効果が得られるかどうかを検証するため、１種類の標識のみによる非競合的なハイブリダイゼーションを行った。
【００３５】
（１）コントロールＲＮＡの調整
ＨｅｐＧ２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）、ＨＥｐ３Ｂ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）、および、Ｈｕｈ７（理研セルバンクより入手）の３種類の培養細胞からＲＮｅａｓｙ ｐｒｏｔｅｃｔ ｍｉｎｉ キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて常法によりトータルＲＮＡ（以下Ｃ−ＲＮＡ）を抽出した。細胞や組織からのＲＮＡ抽出の方法は、例えば「新細胞工学実験プロトコール」（秀潤社）に記載されているように、周知技術であり、そのためのキットや試薬も販売されているので、容易に行うことができる。
【００３６】
そして、抽出した３種類のＲＮＡの等量を混合してコントロールＲＮＡとし、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ａＲＮＡ キット（Ａｍｂｉｏｎ社）の試薬を用い、当該プロトコールに従って増幅した。ＲＮＡ増幅の方法は周知であり、そのためのキットや試薬も販売されているので、容易に行うことができる。ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ａＲＮＡ キットは、Ｔ７プロモーターを含んだオリゴｄＴプライマーを用いてＲＮＡから二本鎖ＤＮＡを合成し、その後Ｔ７プロモーターを利用してＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡを増幅するものである。増幅したＲＮＡは吸光度測定によってその濃度を、また、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって品質をチェックした（以下Ｃ−ａＲＮＡ）。
【００３７】
（２）スパイクＲＮＡの調整
これまでのデータから、バイオプシー検体では強く発現し、一方培養細胞では低い発現を示す遺伝子をいくつか特定し、それらの遺伝子の一部をクローニングした。
【００３８】
具体的には２，５−ｏｌｉｇｏ−ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（２，５−ＡＳ）、ＣＩＳ３、ＩＬ−４ の遺伝子（すべてヒト遺伝子）の一部（約５００〜１２００ｂｐ）をそれぞれ市販のベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入した。このベクターにはあらかじめＴ７プロモーター配列が入っているため、大腸菌内で増殖したベクターを回収して、Ｔ７Ｍｅｇａｓｃｔｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、インビトロでのＲＮＡ転写（ＲＮＡ増幅）を簡単に行うことができる。Ｔ７ Ｍｅｇａｓｃｔｉｐｔキットは、上述のＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ａＲＮＡ キットと原理的に同様である。増幅したＲＮＡは、吸光度測定によってその濃度を、また、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって品質をチェックした。
【００３９】
（３）ＤＮＡマイクロアレイの作製
解析対象の遺伝子（遺伝子の一部、約２００−２０００ｂｐ）および対照用（例えばホタルルシフェラーゼ遺伝子の一部等）のクローンをＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲで常法により増幅した。これらのｄｓＤＮＡを精製後、アレイヤー（Ｇｅｎｅｑｓ Ａｒｒａｙｅｒ ２０００ ；カケンジェネックス社製、松戸市）に移してポリ−Ｌ−リジンコートしたスライドガラス上にスポッティングした。スポット数は各遺伝子３個づつとした。
【００４０】
その後スポット済みスライドグラスを８０℃の恒温槽で２時間ベーキングし、その後ＵＶクロスリンク機（ＳＰＥＣＴＲＯ ＬＩＮＫＥＲ， Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ社製）でＵＶを照射し、ＤＮＡを固定した。
【００４１】
（４）ＲＮＡの標識とハイブリダイゼーション
上記（１）（２）で調整したＲＮＡをＣｙ３で標識した。ＲＮＡの標識法は周知であり、例えば「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社）等に記載されている。本発明ではまず増幅したコントロールＲＮＡ（Ｃ−ａＲＮＡ）及び上記３種類のスパイクＲＮＡを等量混合したもの（ＳＰ−ａＲＮＡ）の２種類を対象として、ランダムプライマー（タカラ）とＣｙ３−ｄＵＴＰ（パーキンエルマー社）を用い、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）で標識を行った。標識によって得られた一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）により、製品のプロトコールに従って精製した。
【００４２】
標識ｓｓＤＮＡを表１の組み合わせで混合し、上記（３）で調整したＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの方法は周知であり、例えば「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社）等に記載されている。本発明においては、標識ＤＮＡをスライドに滴下し、カバーグラスをのせた後、６５℃の恒温槽で１４〜１８時間ハイブリダイゼーションを行った。洗浄後スライドスキャナー（Ｓｃａｎ Ａｒｒａｙ ５０００， ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製）でシグナルを取り込んだ。
【表１】
【００４３】
（５）結果
Ａ．スパイクＲＮＡによる蛍光シグナルの上昇の確認
上の表のマイクロアレイ３、４、６について、加えた遺伝子（２，５−ＡＳ、ＣＩＳ３、ＩＬ−４）と同種類のＤＮＡスポット（各３スポット）上でのハイブリダイゼーションの結果をスキャナーによって読み取り、その平均値を比較した。結果は表２のとおりである。
【表２】
【００４４】
上記表においては、ＣＩＳ３にややばらつきが見られたものの（マイクロアレイ１、２）、各遺伝子についてマイクロアレイ１、２では３、４のほぼ１０倍の値を示す良好な結果が得られた。またマイクロアレイ５は、必ずしもマイクロアレイ１、２と同値を示さなかったが、これは添加した培養細胞のＤＮＡによるブロッキングの効果がその一因であると推定された。
【００４５】
この結果から、コントロール用培養細胞で十分量発現していない遺伝子（マイクロアレイ６でのシグナル）については、スパイクＲＮＡを添加することにより、十分な蛍光強度が得られることが示された（マイクロアレイ１、２、３、４）。
【００４６】
Ｂ．バックグラウンドへの影響
スパイクＲＮＡのバックグラウンドへの影響を、対照スポットであるホタルルシフェラーゼ遺伝子とラムダファージｅａ２２遺伝子を用いて調べた。これらの遺伝子のスポットは、上記３種類のヒト遺伝子（２，５−ＡＳ、ＣＩＳ３、ＩＬ−４）とは理論上はハイブリダイズしないはずである。その結果を以下に示す。
【表３】
【００４７】
一方ｅａ２２遺伝子のスポットでは、スパイクＲＮＡ１００ｐｇ（マイクロアレイ３、４）ではコントロールＲＮＡのみ（６）と変わらないが、１０００ｐｇではあきらかな上昇が見られ、また、スパイクＲＮＡのみでは顕著に蛍光強度が上昇した。スパイクＲＮＡのみでの上昇は、コントロールＲＮＡがｅａ２２ＤＮＡに対してある種のブロッキングの役割を果たしている可能性が考えられた。
【００４８】
上記の結果から、スパイクＲＮＡを添加する際には、解析対象となる各スポットについて、非特異的ハイブリダイゼーションの有無の確認や添加量の調整を慎重に行う必要があると考えられた。
【００４９】
（実施例２）サンプルへの応用
以上の結果を踏まえて、スパイクＲＮＡを二蛍光標識法に応用した。
【００５０】
（１）サンプルＲＮＡの調整
方法は実施例１の培養細胞と同様である。即ち、バイオプシーによる肝臓組織からＲＮｅａｓｙ ｐｒｏｔｅｃｔ ｍｉｎｉ キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて常法によりトータルＲＮＡを抽出した。その後ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ａＲＮＡ キット（Ａｍｂｉｏｎ社）の試薬を用い、当該プロトコールに従って増幅し、濃度と品質をチェックしてサンプルＲＮＡとした。
【００５１】
（２）ＤＮＡマイクロアレイの作製
ＤＮＡマイクロアレイは実施例１（３）で作製したものと同じものを用いた。
【００５２】
（３）ＲＮＡの標識とハイブリダイゼーション
方法は実施例１（４）と同様である。
上記（１）で調整した組織サンプルＲＮＡ４μｇをＣｙ３で、実施例１（１）（２）で調整したコントロールＲＮＡ４μｇとスパイクＲＮＡ１００ｐｇを混合したものをＣｙ５で標識した。精製後両方のｓｓＤＮＡを混合し、上記（２）のＤＮＡマイクロアレイにのせ、ハイブリダイゼーションを行った後洗浄した。スキャナーにより蛍光強度をとりこみ、スパイクＲＮＡの遺伝子のスポットについて得られた蛍光強度を、以前の結果と比較した。以下の表に示された数字は１遺伝子につき３スポットを測定して得られた蛍光強度の平均値である。
【００５３】
Ａ．スパイクＲＮＡなし
【表４】
【００５４】
Ｂ．コントロールＲＮＡにスパイクＲＮＡを加えた場合
【表５】
【００５５】
［他の実施の形態］
さて、これまで本発明の実施の形態について説明したが、本発明は、上述した実施の形態以外にも、上記特許請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内において種々の異なる実施の形態にて実施されてよいものである。
【００５６】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明によれば、コントロールＲＮＡに複数種類の特定遺伝子のＲＮＡをそれぞれ一定量加えるので、競合的ハイブリダイゼーションによってサンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡ（例えば培養細胞からの抽出ＲＮＡ）との比で発現の増減を判断する場合に、サンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの測定レンジが大きくかけはなれているもの、特にサンプルに比較してコントロールＲＮＡの値が極端に低いものについても、コントロールＲＮＡの発現量を適切なレベルまで押し上げることにより両者の比を得るための有効なデータを取得することができる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡを提供することができる。
【００５７】
また、本発明によれば、サンプルＲＮＡの発現量とコントロールＲＮＡの発現量が著しく異なるため、既存のＤＮＡマイクロアレイの測定手法により同一レーザー強度下で蛍光強度を測定した場合には検出することができなかった遺伝子や、装置などの測定至適範囲外となり誤差が大きくなっていた遺伝子についても有効なデータを取得することができる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡを提供することができる。
【００５８】
また、本発明によれば、特に、サンプルＲＮＡと比較してコントロールＲＮＡのシグナル強度の値が極端に低いためサンプルとコントロールとの比が正確に実測できない場合においても、コントロールＲＮＡ側に一定量のＲＮＡを加えることによって、このようなシグナル強度の乖離度の高い組合せの場合についても両者の比を得るための十分なデータを取得することができる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡを提供することができる。
【００５９】
また、本発明によれば、培養細胞では発現していない遺伝子については、コントロール側の測定値がゼロとなるため、従来の手法ではサンプルとコントロールとの比がまったくとれなかった場合においても、両者の比を得るための十分なデータを取得することができる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡを提供することができる。
【００６０】
また、本発明によれば、二蛍光標識法を用いた競合的ハイブリダイゼーションを効率的に実行することができる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡを提供することができる。
【００６１】
また、本発明によれば、複数種類の特定遺伝子のＲＮＡは、サンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの両方に存在するＲＮＡであって、サンプルのシグナル強度がコントロールのシグナル強度に比べて高いもの、または、サンプルＲＮＡに存在するＲＮＡであって、コントロールＲＮＡにおいては存在が認められないものから選択されたものであるので、培養細胞では低い発現しか示さないＲＮＡまたは発現が認められないＲＮＡであって、バイオプシー検体では高い発現を示すＲＮＡについて、同一レーザー強度下で正確に実測を行うことができる、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析における競合的ハイブリダイゼーションの方法、および、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の基本原理を示す原理構成図である。
Claims (5)
- ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析において、コントロールＲＮＡに複数種類の特定遺伝子のＲＮＡをそれぞれ一定量加えることを特徴とする、競合的ハイブリダイゼーションの方法。
- 上記競合的ハイブリダイゼーションが、二蛍光標識法であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 上記複数種類の特定遺伝子のＲＮＡは、サンプルＲＮＡとコントロールＲＮＡの両方に存在するＲＮＡであって、サンプルのシグナル強度がコントロールのシグナル強度に比べて高いもの、または、サンプルＲＮＡに存在するＲＮＡであって、コントロールＲＮＡにおいては存在が認められないものから選択されたものであることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
- 上記複数種類の特定遺伝子のＲＮＡは、コントロールＲＮＡの蛍光強度がサンプルＲＮＡの蛍光強度の１／３以下であるＲＮＡから選択されたものであることを特徴とする、請求項１から請求項３のいずれか一つに記載の方法。
- 請求項１から請求項４のいずれか一つに記載された上記複数種類の特定遺伝子のＲＮＡをそれぞれ一定量加えた、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用いるコントロールＲＮＡ。
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