CN103529200A - 一种基于竞争杂交反应同时检测多种miRNA序列的比色方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于竞争杂交反应同时检测多种miRNA序列的比色方法，该方法是将氨基修饰的DNA组装在微孔板表面，然后将微孔封闭；生物素修饰的miRNA和靶点miRNA序列在微孔表面与固定的DNA探针发生竞争杂交反应；最后将亲和素标记的多聚辣根过氧化物酶衍生到微孔表面，多聚辣根过氧化物酶催化TMB和过氧化氢的显色反应。通过测定有色溶液的吸光度从而对靶点miRNA序列进行测定。该方法简单、快速、灵敏度高、选择性好，无需对实际样品进行标记，可直接用于多种miRNA序列的检测。

Description

一种基于竞争杂交反应同时检测多种miRNA序列的比色方法
技术领域
本发明涉及一种基于竞争杂交反应同时检测多种miRNA序列的比色方法，属于miRNA序列检测技术领域。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一组短的、不编码蛋白质的内源性小RNA分子，其长度约为17～25个核苷酸(nt)。miRNA在生物体内的产生是一个复杂的过程。首先，pri-miRNA(初级miRNA)在细胞核内在Drosha酶的作用下形成具有发夹结构的pre-miRNA(前体miRNA)；然后，pre-miRNA被转运到细胞质后在Dicer酶的作用下转变成含有17～25个核苷酸的成熟miRNA。现在已有1000多种miRNA序列被检测出，但大部分miRNA存在相似的序列以及功能。
目前，miRNA的检测主要是基于杂交和扩增的方法。定性和定量的检测技术主要有：Northern blotting印迹法、聚合酶链式反应(PCR)、微阵列芯片(microarray)、滚环扩增等，这些方法都是通过碱基互补配对原理进行杂交，然后结合分离、标记以及荧光、电化学等方法对miRNA进行分析检测。其中，Northern blotting印迹法是一种半定量的检测方法，步骤繁琐且耗时、灵敏度不高。PCR技术能够对miRNA进行高灵敏、高特异性的定量检测，但该方法步骤繁琐，需要对miRNA进行预处理。Microarray法虽然在短时间内能快速、高通量地检测大量miRNA序列，但其成本高，无法区分碱基相差很小的同族miRNA序列。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于同时检测多种miRNA序列的方法，该方法简单、快速、灵敏度高、选择性好，且无需对实际样品标记。
一种基于竞争杂交反应同时检测多种miRNA序列的比色方法，将多种氨基修饰的DNA序列分别组装到微孔板上，将微孔封闭；随后将与微孔中氨基修饰的DNA序列相匹配的生物素修饰的miRNA溶液和待测靶点miRNA序列溶液混合滴加在孔板表面并发生竞争杂交反应；最后将亲和素标记的多聚辣根过氧化物酶衍生到微孔表面，多聚辣根过氧化物酶催化过氧化氢氧化TMB的显色反应，从而对靶点miRNA序列定量。
所检测的三种存在于胶质瘤血清中的miRNA序列为：
miR-182：5'-UUU GGC AAU GGU AGA ACU CAC ACU-3'；
miR-185：5'-UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUGA-3'；
miR-381：5'-UAU ACA AGG GCA AGC UCU CUGU-3'。
miR-182对应的氨基修饰的DNA序列为
3'-AAA CCG TTA CCA TCT TGA GTG TGA TTT TT-(CH2)6NH2-5'；
miR-185对应的氨基修饰的DNA序列为
3'-ACC TCT CTT TCC GTC AAGGACT TTT TT-(CH2)6NH2-5'
miR-381对应的氨基修饰的DNA序列为
3'-ATA TGT TCC CGT TCG AGA GACA TTT TT-(CH2)6NH2-5'。
上述方法中微孔中分别滴加60μL的1nM的氨基修饰的DNA溶液，静置过夜，用PBS缓冲液冲洗。氨基修饰的DNA组装后在每个微孔中分别滴加180μL质量浓度为2%的BSA溶液，室温下静置2.5h后，用PBS缓冲液冲洗。生物素修饰的miRNA和待测靶点miRNA序列配制成的混合溶液中生物素修饰的miRNA182浓度为0.5nM，生物素修饰的miRNA381和miRNA185浓度均为1nM。所述的竞争杂交反应在37℃下反应2.5-3h。竞争杂交反应完成后在每个微孔中分别滴加SA-Poly-HRP溶液（每孔滴加60μL，SA-Poly-HRP购自RB-Sigma，货号S2438-250UG，采用PBS缓冲液按体积比为1:500进行稀释得到），室温下静置1h后，采用PBS缓冲液冲洗。将100μL0.1%TMB溶液和25μL0.03%的H2O2溶液先后加入到衍生后的微孔中，室温下反应10min后，再加入120μL2mol/L HCl溶液终止显色反应；最后将酶标板放入酶标仪中，在450nm下检测吸光度值。
本发明首先在96孔微孔板表面修饰氨基DNA探针(NH2-DNA)，过夜后用牛血清蛋白(BSA)封闭，然后生物素标记的miRNA与靶点miRNA序列和表面固定的DNA探针在适宜条件下发生竞争杂交反应，随后生物素与亲和素之间的特异性相互作用将亲和素标记的多聚辣根过氧化物酶(SA-Poly-HRP)衍生到微孔表面，其中生物素标记的miRNA可被复合物SA-Poly-HRP识别，靶点miRNA不被复合物识别但与生物素标记的miRNA竞争微孔表面固定的DNA分子。多聚辣根过氧化物酶可催化过氧化氢(H2O2)氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的显色反应。反应一段时间后，加入盐酸终止反应，在酶标仪上读取吸光度值。通过吸光度与靶点miRNA浓度的对应关系，测得靶点miRNA的浓度。
本发明采用的DNA序列均购于上海生工生物工程有限公司，miRNA序列均购于上海吉玛公司。
本发明采用的亲和素标记的多聚辣根过氧化物酶复合物为市售的常规生物试剂(可购买于Sigma-Aldrich、上海生物工程有限公司、北京鼎国昌盛生物技术有限公司、上海强耀生物科技有限公司等)。
本发明采用的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)为市售的常规生物试剂(可购买于Sigma-Aldrich、上海生物工程有限公司、北京鼎国昌盛生物技术有限公司、上海强耀生物科技有限公司等)。本发明所用的PBS缓冲液的pH为7.2～7.4。
本发明中NH2-DNA溶液的配制方法是：将DNA以10000r/min的转速离心10min，然后按说明书要求加入缓冲液溶解，在振荡器上振荡10min，4℃下保存。
本发明中miRNA溶液的配制方法是：将miRNA以10000r/min的转速离心10min，然后按说明书要求加入DEPC水溶解，在振荡器上振荡10min，-20℃下保存。
本发明中亲和素标记的多聚辣根过氧化物酶(SA-Poly-HRP)复合物的稀释方法是：采用PBS缓冲液按体积比为1:500进行稀释，-20℃下保存。
本发明中TMB溶液的配制方法是：超声使TMB溶解于乙醇中，然后用pH5.0的PBS缓冲液稀释到所需浓度。
本发明中确定杂交温度和时间的方法是：
（1）在96孔酶标板的三组微孔表面分别滴加60μL浓度为1nM的三种氨基DNA溶液（序列与所测定的miRNA互补配对），静置过夜，用PBS缓冲液多次冲洗；
（2）在步骤（1）基础上在每个微孔中分别滴加180μL浓度为2%的BSA溶液，室温下静置2.5h后，用PBS缓冲液多次冲洗；
（3）设计不同条件下的杂交反应：
在步骤（2）基础上在各组微孔中分别滴加120μL与孔板表面固定的氨基DNA序列相匹配的生物素标记的miRNA溶液，浓度为1nM，分别置于25℃、30℃、37℃、45℃、50℃下，反应4h后，采用PBS缓冲液多次冲洗；
（4）在步骤（3）基础上在每个微孔中分别滴加60μL SA-Poly-HRP溶液，室温下静置1h后，采用PBS缓冲液多次冲洗；
（5）将100μL0.1%TMB溶液和25μL0.03%的H2O2溶液先后加入到经步骤（4）衍生的微孔中，室温下反应10min后，再加入120μL2mol/L HCl溶液终止显色反应。最后将酶标板放入酶标仪中，在450nm下检测吸光度值；
筛选出最佳杂交温度为37℃；
（6）重复（1）～（5）步骤，将（3）中杂交温度固定在37℃，杂交时间分别为1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h，其它条件不变；
筛选出最佳杂交时间为2.5h。
本发明中所检测的胶质瘤血清中三种miRNA序列为：miR-182，序列为5'-UUU GGC AAU GGUAGA ACU CAC ACU-3'；miR-185，序列为5'-UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUGA-3'；miR-381，序列为5'-UAU ACA AGG GCA AGC UCU CUGU-3'，具体测定方法如下：
（1）在96孔酶标板的三组微孔中分别滴加60μL浓度为1nM不同序列的氨基修饰的DNA溶液（序列分别与上述三种miRNA序列互补配对），静置过夜，用PBS缓冲液多次冲洗；
（2）在步骤（1）基础上，分别滴加180μL2%BSA溶液，室温下静置2.5h后，用PBS缓冲液多次冲洗；
（3）非竞争杂交反应和竞争杂交反应分两组实验依次进行：
（a）非竞争杂交反应：
（I）在步骤（2）基础上，在对应三组微孔中分别滴加与DNA序列相匹配的一系列不同浓度的生物素标记的miRNA溶液（120μL，biotin-miRNA，序列分别与靶点miRNA相同）。三组中，biotin-miRNA的浓度分别为0、0.1nM、0.2nM、0.5nM、0.8nM、1.0nM、2.0nM、5.0nM、10nM，置于37℃下反应2.5h，然用PBS缓冲液多次冲洗干净；
（II）在步骤（I）基础上，滴加60μL SA-Poly-HRP溶液，室温下静置1h后，用PBS缓冲液多次冲洗；
（III）将100μL0.1%TMB溶液和25μL0.03%的H2O2溶液先后加入到经步骤（II）衍生的酶标板微孔中，室温下反应10min后，再加入120μL2mol/L HCl溶液终止反应。最后将酶标板放入酶标仪中，在450nm下检测吸光度值；
得到最佳的biotin-miRNA浓度Coptimum；最佳bio-miRNA182浓度：0.5nM，最佳bio-miRNA381浓度：1nM；最佳bio-miRNA185浓度：1nM。
（b）竞争杂交反应：
（i）将biotin-miRNA溶液与一系列不同浓度的相对应的靶点miRNA溶液（10fM,0.1pM,1pM,2pM,5pM,10pM,0.1nM,1nM）混合均匀，使得bio-miRNA182浓度为0.5nM，bio-miRNA381浓度为1nM；bio-miRNA185浓度为1nM；分别取120μL加入到经步骤（2）处理的酶标板微孔中，置于37℃下反应2.5h，然用PBS缓冲液多次冲洗干净；
（ii）在步骤（i）基础上，滴加60μL SA-Poly-HRP溶液，室温下静置1h后，用PBS缓冲液多次冲洗；
（iii）将100μL0.1%TMB溶液和25μL0.03%的H2O2溶液先后加入到经步骤（ii）衍生的酶标板微孔中，室温下反应10min后，再加入120μL2mol/L HCl溶液终止反应。最后将酶标板放入酶标仪中，在450nm下检测吸光度值。
本发明的有益效果：发明人首次采用DNA为探针，通过生物素标记的miRNA和待测靶点miRNA与DNA探针的竞争杂交反应，以及生物素与亲和素间的特异性相互作用，将多聚辣根过氧化物酶(poly-HRP)衍生到微孔表面，再通过HRP催化TMB和H2O2的显色反应所产生的吸光度信号来对miRNA进行定量。本发明采用三种DNA探针来捕获与之序列对应的miRNA，通过多聚辣根过氧化物酶的催化反应，大大提高了测试的灵敏度。本发明所涉及的方法简单、快速、灵敏度高、选择性好、无需标记，且经过验证能够同时检测胶质瘤血清中三种miRNA序列，进而可以为其它多种miRNA进行定量检测打下坚实的基础。
附图说明
图1为比色法检测miRNA序列的实验原理图；
图2为非竞争杂交反应中生物素标记的miR-182的浓度与吸光度的关系曲线；
图3为非竞争杂交反应中生物素标记的miR-185的浓度与吸光度的关系曲线；
图4为非竞争杂交反应中生物素标记的miR-381的浓度与吸光度的关系曲线；
图5为竞争杂交反应中靶点miR-182的浓度与吸光度的关系曲线，其中，生物素标记的miR-182浓度固定为0.5nM；
图6为竞争杂交反应中靶点miR-185的浓度与吸光度的关系曲线，其中，生物素标记的miR-185浓度固定为1nM；
图7为竞争杂交反应中靶点miR-381的浓度与吸光度的关系曲线，其中，生物素标记的miR-381浓度固定为1nM。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明。
实施例1
杂交温度的影响（测定miRNA-182序列）：
（1）在96孔板的微孔中分别滴加60μL1nM的氨基DNA溶液（序列为3'-AAA CCG TTACCA TCT TGA GTG TGA TTT TT-(CH2)6NH2-5'），静置过夜，用PBS缓冲液多次冲洗；
（2）采用180μL2%的BSA溶液在室温下封闭2.5h，然后用PBS缓冲液多次冲洗；
（3）在上述步骤（2）基础上，分别滴加120μL浓度为1nM的生物素标记的miRNA-182溶液（序列为3'-UCA CAC UCA AGA UGG UAA CGG UUU-biotin-5'），分别置于25℃、30℃、37℃、45℃、50℃下，反应4h后，采用PBS缓冲液多次冲洗；
（4）在上述步骤（3）基础上，分别滴加60μL SA-Poly-HRP溶液，室温下静置1h后，采用PBS缓冲液多次冲洗；
（5）将100μL0.1%TMB溶液和25μL0.03%的H2O2溶液先后加入到经上述步骤（4）衍生的微孔中，室温下反应10min后，再加入120μL2mol/L HCl溶液终止反应。最后将酶标板放入酶标仪中，在450nm下检测吸光度。
最后确定最佳杂交温度为37℃。
杂交时间的影响（测定miRNA-182序列）：
参照杂交温度的影响实验，将（3）中杂交温度固定在37℃，杂交时间分别为1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h，其它条件不变。最后将酶标板置于酶标仪中，在450nm下检测吸光度。
最后确定最佳杂交时间为3h。
血清中miRNA-182（序列为3'-UCA CAC UCA AGA UGG UAA CGG UUU-5'）的含量检测实验：
不同浓度的生物素标记的miRNA序列（与miRNA-182的序列相同）的影响：
（1）在酶标板中滴加60μL1nM的氨基DNA溶液，静置过夜，用PBS缓冲液多次冲洗；
（2）采用180μL2%BSA溶液在室温下封闭2.5h，然后用PBS缓冲液多次冲洗；
（3）在步骤（2）基础上，分别滴加一系列120μL不同浓度的生物素标记的miRNA溶液，其浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0、10nM，置于37℃下反应2.5h，然后用PBS缓冲液多次冲洗干净；
（4）在步骤（3）基础上，分别滴加60μL SA-Poly-HRP溶液，室温下静置1h后，用PBS缓冲液多次冲洗；
（5）将100μL0.1%TMB溶液和25μL0.03%的H2O2溶液先后加入到经步骤（4）衍生的酶标板微孔中，室温下反应10min后，再加入120μL2mol/L HCl溶液终止反应。最后将酶标板放入酶标仪中，在450nm下检测吸光度，结果如图2所示。
最佳bio-miRNA浓度：0.5nM。
不同浓度的靶点miRNA-182的检测
参照不同浓度的生物素标记的miRNA序列的实验，将biotin-miRNA与一系列不同浓度的靶点miRNA-182的混合液，其中混合溶液中靶点miRNA-182的浓度分别为0、0.00001、0.0001、0.001、0.0015、0.002、0.02、0.1、1nM，bio-miRNA浓度：0.5nM；其它条件不变，最后将酶标板置于酶标仪中，在450nm下检测吸光度，结果如图5所示。
测定血清中miRNA-182的浓度时，将0.5nM biotin-miRNA与血清预先混合，其它步骤同上。结果与现有其他方法检测结果吻合。
实施例2
杂交温度与杂交时间的影响如实施例1；
血清中miRNA-185（序列为5'-UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUGA-3'）的含量检测实验：
不同浓度的生物素标记的miRNA序列（与miRNA-185序列相同）的影响：
（1）在酶标板中滴加60μL1nM的氨基DNA溶液，静置过夜，用PBS缓冲液多次冲洗；
（2）采用180μL2%BSA溶液在室温下封闭2.5h，然后用PBS缓冲液多次冲洗；
（3）在步骤（2）基础上，分别在微孔中滴加一系列120μL不同浓度的biotin-miRNA溶液，其浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0、10nM，置于37℃下反应2.5h，采用PBS缓冲液多次冲洗干净；
（4）在步骤（3）基础上，分别在微孔中滴加60μL SA-Poly-HRP溶液，室温下静置1h后，用PBS缓冲液多次冲洗；
（5）将100μL TMB溶液和25μL0.03%的H2O2溶液先后加入到经步骤（4）衍生的微孔中，室温下反应10min后，再加入120μL2mol/L HCl溶液终止反应。最后将酶标板放入酶标仪中，在450nm下检测吸光度，结果如图3所示。
最佳bio-miRNA185浓度：1nM。
不同浓度的靶点miRNA-185序列的检测：
参照不同浓度的生物素标记的miRNA序列的实验，将biotin-miRNA与一系列不同浓度的靶点miRNA-185的混合液，混合溶液中靶点miRNA-185的浓度分别为0、0.00001、0.0001、0.0005、0.001、0.002、0.02、0.1、1nM，bio-miRNA185浓度：1nM。其它条件不变，最后将酶标板置于酶标仪中，在450nm下检测吸光度，结果如图6所示。
实施例3
杂交温度与杂交时间的影响如实施例1；
血清中miRNA-381（序列为5'-UAU ACA AGG GCA AGC UCU CUGU-3'）的含量检测实验：
不同浓度的生物素标记的miRNA序列（与miRNA-381的序列相同）的影响：
（1）在酶标板中滴加60μL10nM的氨基DNA溶液，静置过夜，用PBS缓冲液多次冲洗；
（2）采用180μL2%BSA溶液在室温下封闭2.5h，然后用PBS缓冲液多次冲洗；
（3）在步骤（2）基础上，分别在微孔中滴加一系列120μL不同浓度的biotin-miRNA溶液，其浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0、10nM，置于37℃下反应2.5h，然用PBS缓冲液多次冲洗干净；
（4）在步骤（3）基础上，分别在微孔中滴加60μL SA-Poly-HRP溶液，室温下静置1h后，用PBS缓冲液多次冲洗；
（5）将100μL0.1%TMB溶液和25μL0.03%的H2O2溶液先后加入到经步骤（4）衍生的微孔中，室温下反应10min后，再加入120μL2mol/L HCl溶液终止。最后将酶标板放入酶标仪中，在450nm下检测吸光度，结果如图4所示。
最佳bio-miRNA381浓度：1nM；
不同浓度的靶点miRNA-381序列的检测：
参照不同浓度的生物素标记的miRNA序列的实验，将biotin-miRNA与一系列不同浓度的靶点miRNA-381的混合液，混合溶液中靶点miRNA-381的浓度分别为0、0.00001、0.0001、0.0005、0.0015、0.002、0.1、1nM，bio-miRNA381浓度：1nM；其它条件不变，最后将酶标板置于酶标仪中，在450nm下检测吸光度，结果如图7所示。
Figure IDA0000402371060000021

Claims (9)

1.一种基于竞争杂交反应同时检测多种miRNA序列的比色方法，其特征在于，将多种氨基修饰的DNA序列分别组装到微孔板上，将微孔封闭；随后将与微孔中氨基修饰的DNA序列相匹配的生物素修饰的miRNA溶液和待测靶点miRNA序列溶液混合滴加在孔板表面并发生竞争杂交反应；最后将亲和素标记的多聚辣根过氧化物酶衍生到微孔表面，多聚辣根过氧化物酶催化过氧化氢氧化TMB的显色反应，从而对靶点miRNA序列定量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所检测的三种存在于胶质瘤血清中的miRNA序列为：
miR-182：5'-UUU GGC AAU GGU AGA ACU CAC ACU-3'；
miR-185：5'-UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUGA-3'；
miR-381：5'-UAU ACA AGG GCA AGC UCU CUGU-3'。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，
miR-182对应的氨基修饰的DNA序列为
3'-AAA CCG TTA CCA TCT TGA GTG TGA TTT TT-(CH2)6NH2-5'；
miR-185对应的氨基修饰的DNA序列为
3'-ACC TCT CTT TCC GTC AAGGACT TTT TT-(CH2)6NH2-5'
miR-381对应的氨基修饰的DNA序列为
3'-ATA TGT TCC CGT TCG AGA GACA TTT TT-(CH2)6NH2-5'。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，微孔中分别滴加60μL的1nM的氨基修饰的DNA溶液，静置过夜，用PBS缓冲液冲洗。
5.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，氨基修饰的DNA组装后在每个微孔中分别滴加180μL质量浓度为2%的BSA溶液，室温下静置2.5h后，用PBS缓冲液冲洗。
6.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，生物素修饰的miRNA和待测靶点miRNA序列配制成的混合溶液中生物素修饰的miRNA182浓度为0.5nM，生物素修饰的miRNA381和miRNA185浓度均为1nM。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的竞争杂交反应在37℃下反应2.5-3h。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，
竞争杂交反应完成后在每个微孔中分别滴加SA-Poly-HRP溶液，室温下静置1h后，采用PBS缓冲液冲洗。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，
将100μL0.1%TMB溶液和25μL0.03%的H2O2溶液先后加入到衍生后的微孔中，室温下反应10min后，再加入120μL2mol/L HCl溶液终止显色反应；最后将酶标板放入酶标仪中，在450nm下检测吸光度值。
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