CN103131756A - 一种小核酸的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核酸的检测方法及其应用，尤其是双链小核酸的检测，其特征在于，所述的方法具体为设计与小核酸其中一条链互补的几条连续或不连续的封闭核酸，与小核酸另一条链的3’端互补的反转录茎环引物，以及用于定量PCR的正向引物和反向引物，通过变性、封闭、反转录和定量PCR的方法来检测小核酸。本发明操作简单、检测成本低，检测限可以达到飞克级，具有检测效率高、特异性强及敏感度高等优点。本发明可应用于小核酸药物的定量分析、定性分析、药代分析及小核酸分子的扩增、特异性鉴定和鉴别，尤其是在分子诊断、小核酸药物代谢及小核酸药物功能研究上有广泛的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种小核酸的检测方法及其应用，尤其是指一种双链小核酸的检测方法及其应用。
背景技术
RNA干扰（RNA interference，RNAi），是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。
随着RNAi研究的发展，RNAi已经成为目前基因功能研究，药靶发现以及药物开发的基础，RNAi药物将有望成为的一种更为高效快捷的疾病治疗途径，小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）作为RNAi的效应分子，其作为治疗药物的具有越来越广阔的前景。截至目前，已经有多种siRNA药物进入临床实验，预示着在不久的将来，将会出现商业化的siRNA药物，为攻克人类的各种疾病作出贡献。随着siRNA药物研究的发展，急需一种可以精确定量检测siRNA的技术，来帮助人们了解siRNA在体内的传递和药物代谢动力学特征。
因为siRNA序列比较短小，一般只有19~23bp；作为药物使用的siRNA，均是通过化学合成，且合成的siRNA带有的3’突出端；在siRNA药物开发过程中，为了提高siRNA的稳定性和穿透细胞的能力，会对其化学结构做不同修饰。目前还没有一种简便、快捷、精确的方法来进行siRNA的定量分析。之前的研究报道了多种定量方法，如包括Elsia分析（Kim EJ等，J Control Release， 2010，143(1):80-7.），放射标记杂交分析（Jin J等，Biotechniques. 2010 Jun; 48(6): xvii-xxiii.）等，这些方法耗时，成本昂贵，检测范围窄，检测限高等缺点。各种基于miRNA（一种短小的单链RNA）的PCR的方法，如末端加尾，磷酸接头连接，Stem-Loop PCR的方法（Chen C等，Nucleic Acids Res. 2005;33(20):e179.），因合成的siRNA与内源性siRNA结构的差异，均不能很好的解决siRNA的精确定量。
通常，我们把siRNA，miRNA及其它非编小RNA称之为小核酸。
锁核酸（locked nucleic acid，LNA）（Nielsen CB等，J Biomol Struct Dyn，1999；17(2)：175-91）是一种人工合成的反义寡核苷酸，其中核苷酸残基的核糖环的2’-氧和4’-碳通过亚甲基连接。其与靶核酸分子具有强的杂交能力，不易被酶降解，应用于抑制靶核酸功能的研究中。利用这类核酸可以增加引子或探针（probe）的熔解温度（Tm值），提高杂交产物的稳定性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测效率高、特异性强及敏感度高的双链小核酸的检测方法。
为了达到上述目的，本发明提供了一种双链小核酸的检测方法，其特征在于，包括设计与小核酸的一条链互补的封闭核酸和与小核酸另一条链3’端互补的反转录茎环引物以及用于定量PCR的正向引物和反向引物，制备小核酸待检测样品，通过变性、封闭、反转录和定量PCR的方法来检测小核酸。
所述的变性的具体步骤为：将小核酸高温加热使双链解开成单链。所述的封闭的具体步骤为：使用几条封闭核酸竞争性杂交小核酸其中一条链。所述的反转录的具体步骤为：用针对小核酸另一条链的反转录茎环引物反转录合成cDNA。所述的定量PCR的方法的具体步骤为：制备小核酸标准样品，用正向引物和反向引物定量PCR扩增待检测样品和标准样品，分析实验数据绘制标准曲线。
其中，所述的小核酸待检测样品的制备可以包括小核酸的纯化、提取、分离等，具体可以是从全血中分离血清样品，从组织中用RNA提纯试剂提纯总RNA样品。
所述的小核酸包括siRNA和miRNA模拟物（miRNA mimics，一种具有miRNA活性的双链miRNA模拟物），及其它双链结构的短链RNA。
在一个优选的实施方式中，上述双链小核酸是siRNA。
所述的封闭核酸的设计方法为：从小核酸一条链的3’端第一个碱基开始连续或间隔选取5~7个核苷酸（nucleotide，nt）长度的核苷酸。
所述的封闭核酸可以是RNA或DNA分子，或是含有修饰（如甲氧基修饰，或LNA修饰等）的RNA或DNA分子。
所述的反转录茎环引物的3’端的6~8个碱基与靶序列的3’端序列互补。
所述的小核酸待检测样品包括含小核酸的血液样品、含小核酸的组织匀浆液、总RNA样品或小核酸混合物。
本发明操作简单、检测成本低，检测限可以达到1pmol/L（飞克（fg）级），具有检测效率高、特异性强及敏感度高等优点。
本发明所述方法适合用于不同样品中的小核酸检测，本发明的用于小核酸的检测方法，可以应用于小核酸，尤其是双链小核酸，如siRNA药物的定量分析、定性分析、药代分析及siRNA分子的扩增、特异性鉴定和鉴别等，尤其是在分子诊断、小核酸药物代谢及其小核酸药物功能研究上有广泛的用途。
附图说明
图1是本发明技术流程示意图。
图2是鉴定封闭核酸在小核酸检测中的作用定量PCR扩增曲线图，其中，曲线1代表si-NC正义链（ssRNA）实验组；曲线2代表“si-NC（dsRNA）+ 封闭核酸”实验组，曲线3代表si-NC（dsRNA）实验组，曲线4代表“NTC + 封闭核酸”实验组。
图3是浓度为1～10-9μM的si-NC的定量PCR扩增曲线图，其中，曲线1~8分别表示ST1~7及“NTC + 封闭核酸”实验组。
图4是浓度为1～10-9μM的si-NC的定量PCR标准曲线图。
图5是浓度为10-1～10-8μM的si-NC的定量PCR扩增曲线图，其中，曲线1~7分别表示ST2~7及“NTC + 封闭核酸”实验组。
图6是浓度为10-1～10-8μM的si-NC的定量PCR标准曲线图。
图7是不同浓度的si-NC-M1的定量PCR扩增曲线图，其中，曲线1~8分别表示S1~7及“NTC + 封闭核酸”实验组。
图8是不同浓度的si-NC-M1的定量PCR标准曲线图。
图9是检测不同封闭核酸在si-NC定量中作用的标准曲线图，其中si-NC正义链为对照组。
图10是小核酸混合样品中si-NC的定量PCR检测标准曲线图，其中si-NC为对照组。
图11是总RNA样品中si-NC的定量PCR检测标准曲线图，其中si-NC为对照组。
图12是血清样品中si-NC的定量PCR检测标准曲线图，其中si-NC为标准品，用来绘制标准曲线。
具体实施方式
为方便起见，在下文中将本发明中提及的术语“实时定量PCR”简称为“定量PCR”。应当理解，它们表示的意思和范围相同。
本发明中，术语“小核酸”是指一类长度较短的非编码RNA分子，包括miRNA、siRNA及其它非编码RNA。
术语“封闭”是指封闭核酸与小核酸一条链之间退火形成双链或部分双链结构。
本发明所述的封闭核酸是指一类与小核酸一条链互补的长度为5~7nt的核酸分子集，可以是RNA或DNA分子，或是含有修饰（如甲氧基修饰，或LNA修饰等）的RNA或DNA分子，如与siRNA分子的一条链互补或部分互补的RNA分子集。
本发明所述方法适合用于不同样品中的小核酸检测，其具体步骤包括1）待检测样品制备：含小核酸的样品的纯化、抽提或分离等；2）变性：小核酸高温加热使双链解开成单链；3）封闭：几条封闭核酸竞争性杂交小核酸其中一条链；4）反转录：用针对小核酸另一条链的反转录茎环引物反转录合成cDNA；5）实时定量PCR检测：制备小核酸标准样品，用正向引物和反向引物定量PCR扩增待检测样品和标准样品，分析实验数据绘制标准曲线。
为了实现本发明的设计思想并对其验证，设计了如下实验方案（以检测siRNA为例）：
（1）设计与siRNA其中一条链互补的几条连续的封闭核酸，与siRNA另一条链的3’端互补的反转录茎环引物，以及用于定量PCR的正向引物和反向引物。
（2）制备不同的含小核酸的检测样品。
（3）实时定量PCR检测，绘制标准曲线。
下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。
实施例l
鉴定封闭核酸在小核酸检测中的作用
1 主要试剂、材料和仪器
1.1 si-NC正义链和反义链（序列见表1），由百奥迈科生物技术有限公司合成。将si-NC的正义链（single-strand RNA，ssRNA）和退火后的双链（double-strand RNA，dsRNA）分别稀释到浓度为1μM。
表1. si-NC序列
1.2 
1.3 si-NC的封闭核酸（DNA序列）：按5’-3’方向设计与si-NC反义链互补的封闭核酸，长度为7nt，序列见表2，由百奥迈科生物技术有限公司合成。
表2. si-NC的封闭核酸
| 封闭核酸名称 | 序列（5’-3’） | 长度（nt） |
| NC-B1 | AATTCTC（SEQ ID NO: 3） | 7 |
| NC-B2 | CGAACGT（SEQ ID NO: 4） | 7 |
| NC-B3 | GTCACGT（SEQ ID NO: 5） | 7 |
1.4 定量PCR检测引物，由百奥迈科生物技术有限公司合成。
正向引物：5’-TGCCCTTCTCCGAACGTGTC-3’ （SEQ ID NO: 6）；
反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ （SEQ ID NO: 7）；
反转录茎环引物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAACGTGA-3’ （SEQ ID NO: 8）。
1.5 试剂：EzOmicsTM One-Step qPCR kit（百奥迈科生物技术有限公司）等。
1.6 仪器：实时定量PCR仪（Bio-Rad公司）；离心机（Beckman公司），紫外分光光度计（Eppendorf公司）等。
2 方法
2.1 建立杂交竞争反应（退火混合物）
| 4.0μl | 小核酸样品 |
| 1.0μl | 封闭核酸混合物（各10 μM） |
| 1.0μl | 反转录茎环引物（6 μM） |
| 1.0μl | 正向引物（6 μM） |
| 1.0μl | 反向引物（6 μM） |
| 2.0μl | 无RNase水 |
| 12.0μl | 总体积 |
置于实时定量PCR仪上，90oC反应3min，4oC保持。
2.2 建立实时定量PCR反应体系
（按EzOmicsTM One-Step qPCR kit说明书操作）
| 12.0μl | 步骤2.1反应物 |
| 12.5μl | 2×Master Mix |
| 0.5μl | 50×SYBR Green I |
| 25.0μl | 总体积 |
置于实时定量PCR仪上，16oC/15min，42oC/30min；95oC/10min；40个循环95 oC/15sec，55oC/20sec，72 oC/20sec；熔解曲线分析。
3 结果分析
如图2、表3所示结果，用反转录茎环引物与si-NC正义链进行退火并反转录，其中si-NC反义链会与茎环引物竞争与si-NC正义链退火，产生抑制作用，会大大降低检测的灵敏度，如图2中扩增曲线3所示（其Ct值为19.48）。对于相同的si-NC样品，在加入封闭核酸后，明显降低了反义链的竞争抑制作用，如图中扩增曲线2所示（Ct值为13.78，提前了约5.7个Ct）。
相同浓度条件下，si-NC双链加入封闭核酸与si-NC单链相比，如图2中扩增曲线1和2所示，二者结果无明显差别，由此可以看出，靶向反义链的封闭核酸可以有效地抑制反义链的干扰作用。
表3. 实时定量PCR检测结果
*无扩增模板对照，即在杂交竞争反应中不加入小核酸样品，其余与其它实验组相同。
实施例2
双链小核酸的检测（以si-NC为例）
1 主要试剂、材料和仪器
1.1 si-NC的正义链和反义链序列（表1），由百奥迈科生物技术有限公司合成。
1.2 si-NC的封闭核酸（DNA序列）：按5’-3’方向设计与si-NC反义链互补的封闭核酸，长度为7nt，序列见表2，由百奥迈科生物技术有限公司合成。
1.3 定量PCR检测引物，由百奥迈科生物技术有限公司合成。
正向引物：5’-TGCCCTTCTCCGAACGTGTC-3’ （SEQ ID NO: 6）；
反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ （SEQ ID NO: 7）；
反转录茎环引物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAACGTGA-3’ （SEQ ID NO: 8）。
1.4 试剂：EzOmicsTM One-Step qPCR kit（百奥迈科生物技术有限公司）等。
1.5 仪器：实时定量PCR仪（Bio-Rad公司）；离心机（Beckman公司），紫外分光光度计（Eppendorf公司）等。
2 方法
2.1 标准品制备：
用无RNase水或焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）处理水（用DEPC-H2O表示）将si-NC的正义链（single-strand RNA，ssRNA）和退火后的双链（double-strand RNA，dsRNA）稀释至10μM。
按表4将si-NC进行10倍梯度稀释，每步稀释均需充分混匀。
表4. si-NC标准样梯度稀释方法
| 编 号 | 稀释方法 | 终浓度 |
| ST1 | 20 μl si-NC (10μM) + 180μl DEPC-H2O | 1μM |
| ST2 | 20 μl ST1 + 180μl DEPC-H2O | 100nM |
| ST3 | 20 μl ST2 + 180μl DEPC-H2O | 10nM |
| ST4 | 20 μl ST3 + 180μl DEPC-H2O | 1nM |
| ST5 | 20 μl ST4 + 180μl DEPC-H2O | 100pM |
| ST6 | 20 μl ST5 + 180μl DEPC-H2O | 10pM |
| ST7 | 20 μl ST6 + 180μl DEPC-H2O | 1pM |
2.2 建立杂交竞争反应
| 4.0μl | 小核酸样品 |
| 1.0μl | 封闭核酸混合物（各10 μM） |
| 1.0μl | 反转录茎环引物（6 μM） |
| 1.0μl | 正向引物（6 μM） |
| 1.0μl | 反向引物（6 μM） |
| 2.0μl | DEPC-H2O |
| 12.0μl | 总体积 |
置于实时定量PCR仪上，90oC反应3min，4oC保持。
2.3 建立实时定量PCR反应体系
（按EzOmicsTM One-Step qPCR kit说明书操作）
| 12.0μl | 步骤2.2反应物 |
| 12.5μl | 2×Master Mix |
| 0.5μl | 50×SYBR Green I |
| 25.0μl | 总体积 |
置于实时定量PCR仪上，16oC/15min，42oC/30min；95oC/10min；40个循环95 oC/15sec，55oC/20sec，72 oC/20sec；熔解曲线分析。
3 结果分析
如图3和图4所示，在1～10-9μM之间线性较好，检测限为1pM（约为14pg/ml）；如图5和图6所示，最佳的线性范围为10-1～10-8μM。由此可以看出，该方法可以很好地检测单链和双链小核酸。
实施例3
检测不同末端的小核酸
1 主要试剂、材料和仪器
1.1 si-NC正义链3’端是UU的si-NC-M1（表5），由百奥迈科生物技术有限公司合成。将正义链和反义链分别退火成双链并分别稀释到浓度为10μM。
表5. 修饰的si-NC序列
1.2 
1.3 si-NC的封闭核酸（DNA序列）：按5’-3’方向设计与si-NC反义链互补的封闭核酸，长度为7nt，序列见表2，由百奥迈科生物技术有限公司合成。
1.4 定量PCR检测引物，由百奥迈科生物技术有限公司合成。
正向引物：5’-TGCCCTTCTCCGAACGTGTC-3’ （SEQ ID NO: 6）；
反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ （SEQ ID NO: 7）；
反转录茎环引物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAACGTGA-3’ （SEQ ID NO: 8）。
1.5 试剂：EzOmicsTM One-Step qPCR kit（百奥迈科生物技术有限公司）等。
1.6 仪器：实时定量PCR仪（Bio-Rad公司）；离心机（Beckman公司），紫外分光光度计（Eppendorf公司）等。
2 方法
2.1 标准品制备：
用DEPC-H2O按表6将si-NC-M1进行10倍梯度稀释。
表6. si-NC标准样梯度稀释方法
| 编 号 | 稀释方法 | 终浓度 |
| S1 | 20 μl si-NC-M1 (10μM) + 180μl DEPC-H2O | 1μM |
| S2 | 20 μl S1 + 180μl DEPC-H2O | 100nM |
| S3 | 20 μl S2 + 180μl DEPC-H2O | 10nM |
| S4 | 20 μl S3 + 180μl DEPC-H2O | 1nM |
| S5 | 20 μl S4 + 180μl DEPC-H2O | 100pM |
| S6 | 20 μl S5 + 180μl DEPC-H2O | 10pM |
| S7 | 20 μl S6 + 180μl DEPC-H2O | 1pM |
2.2 建立杂交竞争反应
| 4.0μl | 小核酸样品 |
| 1.0μl | 封闭核酸混合物（各10 μM） |
| 1.0μl | 反转录茎环引物（6 μM） |
| 1.0μl | 正向引物（6 μM） |
| 1.0μl | 反向引物（6 μM） |
| 2.0μl | DEPC-H2O |
| 12.0μl | 总体积 |
置于实时定量PCR仪上，90oC反应3min，4oC保持。
2.2.1 建立实时定量PCR反应体系
（按EzOmicsTM One-Step qPCR kit说明书操作）
| 12.0μl | 步骤2.2.1反应物 |
| 12.5μl | 2×Master Mix |
| 0.5μl | 50×SYBR Green I |
| 25.0μl | 总体积 |
置于实时定量PCR仪上，16oC/15min，42oC/30min；95oC/10min；40个循环95 oC/15sec，55oC/20sec，72 oC/20sec；熔解曲线分析。
3 结果分析
如图7、8所示si-NC-M1线性很好。由此可以看出，该方法可以用来检测3’端是RNA碱基结构的小核酸。
实施例4
LNA修饰的封闭核酸和未修饰的封闭核酸的作用
1 主要试剂、材料和仪器
1.1 si-NC的正义链和反义链（表1），由百奥迈科生物技术有限公司合成。
1.2 si-NC的封闭核酸（序列见表2），同时合成与表2序列相同的LNA修饰的封闭核酸，分别为NC-B1（LNA）、NC-B2（LNA）、NC-B3（LNA），由上海硕世生物技术有限公司合成。
1.3 定量PCR检测引物，由百奥迈科生物技术有限公司合成。
正向引物：5’-TGCCCTTCTCCGAACGTGTC-3’ （SEQ ID NO: 6）；
反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ （SEQ ID NO: 7）；
反转录茎环引物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAACGTGA-3’ （SEQ ID NO: 8）。
1.4 仪器：实时定量PCR仪（Bio-Rad公司）；离心机（Beckman公司），紫外分光光度计（Eppendorf公司）等。
2 方法
2.1 标准品制备：
用DEPC-H2O按表4的方法将si-NC进行10倍梯度稀释。
2.2 建立杂交竞争反应
| 4.0μl | 小核酸样品 |
| 1.0μl | 封闭核酸混合物（各10 μM） |
| 1.0μl | 反转录茎环引物（6 μM） |
| 1.0μl | 正向引物（6 μM） |
| 1.0μl | 反向引物（6 μM） |
| 2.0μl | DEPC-H2O |
| 12.0μl | 总体积 |
置于实时定量PCR仪上，90oC反应3min，4oC保持。
2.3 建立实时定量PCR反应体系
（按EzOmicsTM One-Step qPCR kit说明书操作）
| 12.0μl | 步骤2.2反应物 |
| 12.5μl | 2×Master Mix |
| 0.5μl | 50×SYBR Green I |
| 25.0μl | 总体积 |
置于实时定量PCR仪上，16oC/15min，42oC/30min；95oC/10min；40个循环95 oC/15sec，55oC/20sec，72 oC/20sec；熔解曲线分析。
3 结果分析
如图9所示，在si-NC样品中加入未修饰的封闭核酸与LNA修饰的封闭核酸，其Ct值绘制的标准曲线没有明显区别。其中以si-NC正义链作为对照实验组。由此可以看出修饰的封闭核酸可以用作为小核酸检测的封闭物，同样能很好地抑制另一条链的干扰作用。
实施例5
小核酸混合样品中小核酸的特异性检测
1 主要试剂、材料和仪器
1.1 si-NC的正义链和反义链（表1），由百奥迈科生物技术有限公司合成。将si-NC的正义链（single-strand RNA，ssRNA）和退火后的双链（double-strand RNA，dsRNA）分别稀释到浓度为1μM。
1.2 si-NC的封闭核酸（DNA序列）：按5’-3’方向设计与si-NC反义链互补的封闭核酸，长度为7nt，序列见表2，由百奥迈科生物技术有限公司合成。
1.3 定量PCR检测引物，由百奥迈科生物技术有限公司合成。
正向引物：5’-TGCCCTTCTCCGAACGTGTC-3’ （SEQ ID NO: 6）；
反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ （SEQ ID NO: 7）；
反转录茎环引物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAACGTGA-3’ （SEQ ID NO: 8）。
1.4 试剂：EzOmicsTM One-Step qPCR kit（百奥迈科生物技术有限公司）等。
1.5 仪器：实时定量PCR仪（Bio-Rad公司）；离心机（Beckman公司），紫外分光光度计（Eppendorf公司）等。
2 方法
2.1 样品稀释液制备：用表7的小核酸混合溶液作为稀释si-NC的稀释液。将表6中四种小核酸退火成双链后混合，配成各siRNA浓度为5μg/ml的混合溶液
表7. 四种小核酸序列
2.2 
2.3 标准品制备：用步骤2.1的稀释液按表4的方法将si-NC进行10倍梯度稀释。
2.4 建立杂交竞争反应
| 4.0μl | 小核酸样品（混有其它小核酸） |
| 1.0μl | 封闭核酸混合物（各10 μM） |
| 1.0μl | 反转录茎环引物（6 μM） |
| 1.0μl | 正向引物（6 μM） |
| 1.0μl | 反向引物（6 μM） |
| 2.0μl | DEPC-H2O |
| 12.0μl | 总体积 |
置于实时定量PCR仪上，90oC反应3min，4oC保持。
2.5 建立实时定量PCR反应体系
（按EzOmicsTM One-Step qPCR kit说明书操作）
| 12.0μl | 步骤2.2反应物 |
| 12.5μl | 2×Master Mix |
| 0.5μl | 50×SYBR Green I |
| 25.0μl | 总体积 |
置于实时定量PCR仪上，16oC/15min，42oC/30min；95oC/10min；40个循环95 oC/15sec，55oC/20sec，72 oC/20sec；熔解曲线分析。
3 结果分析
如图10所示，在不同序列的si-GL3、si-GL2、si-RL和si-Lamin A/C小核酸混合物样品中加入si-NC，用本发明方法同样可以检测出si-NC，且检测效率和检测限没有受到影响，由此可以看出该方法可以检测出小核酸混合样品中的某种小核酸。
实施例6
总RNA样品中小核酸的检测
1 主要试剂、材料和仪器：同实施例1。
1.1 si-NC的正义链和反义链序列（表1），由百奥迈科生物技术有限公司合成。将si-NC的正义链（single-strand RNA，ssRNA）和退火后的双链（double-strand RNA，dsRNA）分别稀释到浓度为1μM。
1.2 si-NC的封闭核酸（DNA序列）：按5’-3’方向设计与si-NC反义链互补的封闭核酸，长度为7nt，序列见表2，由百奥迈科生物技术有限公司合成。
1.3 定量PCR检测引物，由百奥迈科生物技术有限公司合成。
正向引物：5’-TGCCCTTCTCCGAACGTGTC-3’ （SEQ ID NO: 6）；
反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ （SEQ ID NO: 7）；
反转录茎环引物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAACGTGA-3’ （SEQ ID NO: 8）。
1.4 试剂：EzOmicsTM One-Step qPCR kit（百奥迈科生物技术有限公司）等。
1.5 仪器：实时定量PCR仪（Bio-Rad公司）；离心机（Beckman公司），紫外分光光度计（Eppendorf公司）等。
2 方法
2.1 样品稀释液制备：用RISO总RNA提取试剂盒（百奥迈科生物技术有限公司）提取人宫颈癌HeLa细胞的总RNA。测OD260，用DEPC处理水调整总RNA浓度至5μg/ml，此作为稀释siRNA-NC的稀释液。
2.2 标准品制备：用步骤2.1的稀释液按表4的方法将si-NC进行10倍梯度稀释。
2.3 建立杂交竞争反应
| 4.0μl | 小核酸样品 |
| 1.0μl | 封闭核酸混合物（各10 μM） |
| 1.0μl | 反转录茎环引物（6 μM） |
| 1.0μl | 正向引物（6 μM） |
| 1.0μl | 反向引物（6 μM） |
| 2.0μl | DEPC-H2O |
| 12.0μl | 总体积 |
置于实时定量PCR仪上，90oC反应3min，4oC保持。
2.4 建立实时定量PCR反应体系
（按EzOmicsTM One-Step qPCR kit说明书操作）
| 12.0μl | 步骤2.2反应物 |
| 12.5μl | 2×Master Mix |
| 0.5μl | 50×SYBR Green I |
| 25.0μl | 总体积 |
置于实时定量PCR仪上，16oC/15min，42oC/30min；95oC/10min；40个循环95 oC/15sec，55oC/20sec，72 oC/20sec；熔解曲线分析。
3 结果分析
如图11所示，在总RNA样品中加入si-NC，用本发明方法可以检测出si-NC，且检测效率和检测限没有受到影响，由此可以看出该方法可以检测出总RNA样品中的某种小核酸。
实施例7
小核酸体内代谢后检测
通过小鼠尾静脉注射siRNA，在不同时间点眶下静脉取血，分离血清后进行Q-PCR检测siRNA在血液中的含量。
1 主要试剂、材料和仪器
1.1 实验动物：ICR小鼠（南通大学动物实验中心提供）。
1.2 si-NC的正义链和反义链序列（表1），由百奥迈科生物技术有限公司合成。将si-NC的正义链（single-strand RNA，ssRNA）和退火后的双链（double-strand RNA，dsRNA）分别稀释到浓度为1μM。
1.3 si-NC的封闭核酸（DNA序列）：按5’-3’方向设计与si-NC反义链互补的封闭核酸，长度为7nt，序列见表2，由百奥迈科生物技术有限公司合成。
1.4 定量PCR检测引物，由百奥迈科生物技术有限公司合成。
正向引物：5’-TGCCCTTCTCCGAACGTGTC-3’ （SEQ ID NO: 6）；
反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ （SEQ ID NO: 7）；
反转录茎环引物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAACGTGA-3’ （SEQ ID NO: 8）。
1.5 试剂：EzOmicsTM One-Step qPCR kit（百奥迈科生物技术有限公司）等。
1.6 仪器：实时定量PCR仪（Bio-Rad公司）；离心机（Beckman公司），紫外分光光度计（Eppendorf公司）等。
2 方法
2.1 样品采集：
2.1.1 通过尾静脉注射1mg/小鼠的si-NC（注射体积200μl）至小鼠体内。
2.1.2 分别在注射si-NC的5min、15min、30min、1h、6h、24h后行眶下静脉取血，并分离血清，血清即为检测样品。
2.2 标准品制备：用DEPC-H2O按表4将si-NC进行10倍梯度稀释。
2.3 建立杂交竞争反应
| 4.0μl | 小核酸样品/检测样品 |
| 1.0μl | 封闭核酸混合物（各10 μM） |
| 1.0μl | 反转录茎环引物（6 μM） |
| 1.0μl | 正向引物（6 μM） |
| 1.0μl | 反向引物（6 μM） |
| 2.0μl | DEPC-H2O |
| 12.0μl | 总体积 |
置于实时定量PCR仪上，90oC反应3min，4oC保持。
2.4 建立实时定量PCR反应体系
（按EzOmicsTM One-Step qPCR kit说明书操作）
| 12.0μl | 步骤2.2反应物 |
| 12.5μl | 2×Master Mix |
| 0.5μl | 50×SYBR Green I |
| 25.0μl | 总体积 |
置于实时定量PCR仪上，16oC/15min，42oC/30min；95oC/10min；40个循环95 oC/15sec，55oC/20sec，72 oC/20sec；熔解曲线分析。
3 结果分析
如图12所示，用si-NC作为标准品绘制标准曲线，根据定量PCR测得检测样品的Ct值即可换算出小核酸的浓度（表8），该方法可以用来检测体内实验中小核酸在血液中的代谢情况。
表8. 根据Ct值换算出小核酸浓度（ng/ml）
| 时间点 | Ct值 | 对应小核酸浓度 |
| 5min | 12.95 | 3.277E+06 |
| 15min | 15.87 | 8.014E+05 |
| 30min | 22.46 | 3.305E+04 |
| 1h | 24.42 | 1.282E+04 |
| 6h | 33.96 | 未检测到 |
| 24h | 33.32 | 未检测到 |
序 列 表
<110> 百奥迈科生物技术有限公司
<120> 一种小核酸的检测方法及其应用
<130> BIOMICS2011102
<140> BIOMICS20111002
<141> 2011-11-22
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 3
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aattctc 7
<210> 4
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgaacgt 7
<210> 5
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtcacgt 7
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgcccttctc cgaacgtgtc 20
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 8
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaaacgt ga 52
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
uucuccgaac gugucacguu u 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ucgaaguacu cagcguaagt t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cguacgcgga auacuucgat t 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ucgaaguauu ccgcguacgt t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aaacaugcag aaaaugcugt t 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cagcauuuuc ugcauguuut t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cuggacuucc agaagaacat t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
uguucuucug gaaguccagt t 21
Claims (10)
1.一种双链小核酸的检测方法，其特征在于，包括设计与小核酸的一条链互补的封闭核酸和与小核酸另一条链3’端互补的反转录茎环引物以及用于定量PCR的正向引物和反向引物，制备小核酸待检测样品，通过变性、封闭、反转录和定量PCR的方法来检测小核酸。
2.如权利要求1所述的双链小核酸的检测方法，其特征在于，所述的变性的具体步骤为：将小核酸高温加热使双链解开成单链。
3.如权利要求1所述的双链小核酸的检测方法，其特征在于，所述的封闭的具体步骤为：使用几条封闭核酸竞争性杂交小核酸其中一条链。
4.如权利要求1所述的双链小核酸的检测方法，其特征在于，所述的反转录的具体步骤为：用针对小核酸另一条链的反转录茎环引物反转录合成cDNA。
5.如权利要求1所述的双链小核酸的检测方法，其特征在于，所述的定量PCR的方法的具体步骤为：制备小核酸标准样品，用正向引物和反向引物定量PCR扩增待检测样品和标准样品，分析实验数据绘制标准曲线。
6.如权利要求1所述的双链小核酸的检测方法，其特征在于，所述的小核酸包括siRNA、miRNA模拟物或其它双链结构的短链RNA。
7.如权利要求6所述的双链小核酸的检测方法，其特征在于，所述的小核酸是siRNA。
8.如权利要求1所述的双链小核酸的检测方法，其特征在于，所述的封闭核酸的设计方法为：从小核酸一条链的3’端第一个碱基开始依次选取连续或不连续的核苷酸片段，其长度为5~7nt。
9.如权利要求1所述的双链小核酸的检测方法，其特征在于，所述的反转录茎环引物的3’端有6～8个碱基与小核酸一条链的3’端序列互补。
10.如权利要求1所述的双链小核酸的检测方法，其特征在于，所述的小核酸待检测样品来自含小核酸的血液样品、含小核酸的组织匀浆液、总RNA样品或小核酸混合物。
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-
2011
- 2011-11-24 CN CN201110378436.0A patent/CN103131756B/zh active Active
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