CN114657182B - 一种miRNA及其特异性检测方法和应用 - Google Patents

一种miRNA及其特异性检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种miRNA及其特异性检测方法和应用。以本发明提供的miRNA核苷酸序列为基础，利用本发明提供的特异性引物和检测方法，可以对oar‑miR‑3965的转录水平进行快速、精确的定量。采用本发明提供的miRNA可以将处于繁殖季节和非繁殖季节(休情期)中的绵羊进行有效区分，为后续研究和生产提供检测方法。

Description

一种miRNA及其特异性检测方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种miRNA及其特异性检测方法和应用。
背景技术
miRNA(microRNA)是一组由基因组编码的长度约20～23个核苷酸的非编码RNA，类似于siRNA的分子，通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译。miRNAs在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA组织特异性和时序性决定了组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。
绵羊的繁殖季节是经过长期的自然选择逐渐演化而形成的，其主要决定因素是分娩时的环境条件要有利于初生羔羊的存活，同时，绵羊的繁殖季节因品种、地区、光照、气温、饲草饲料等条件而有差异。本领域多通过外部观察或试情等常规方式区分绵羊的繁殖时期，但存在一定误差。对于需要进行绵羊季节性繁殖研究的母羊，要求对样本母羊的繁殖时期进行准确区分和鉴定，因此miRNA为绵羊繁殖时期的鉴定提供了工具。
发明内容
本发明的目的在于提供一种miRNA及其特异性检测方法和应用，可以对miRNA的转录水平进行快速、精确的定量，从而有效判断绵羊所处的繁殖时期(繁殖季节或非繁殖季节)。
本发明提供了一种miRNA，所述miRNA的成熟序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种扩增上述技术方案所述的miRNA的特异性引物组，所述特异性引物组包括反转录茎环引物、上游引物和下游引物，所述茎环引物的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的miRNA的检测方法，利用所述的特异性引物组测定样品中所述miRNA的有无和/或表达量。
优选的，所述测定的方法包括荧光定量PCR。
优选的，所述荧光定量PCR的反应体系以20μL计，包括模板cDNA2.0μL，SYBR TaqTM10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，ROX染料Ⅱ0.4μL和水6μL；
所述模板cDNA包括将从待测样品中提取得到的RNA进行反转录后得到的cDNA。
优选的，所述荧光定量PCR的程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。
优选的，利用所述荧光定量PCR进行检测时，还包括内参基因，所述内参基因为U6snRNA。
优选的，所述待测样品包括绵羊下丘脑。
本发明还提供了上述技术方案所述的miRNA、miRNA特异性引物组或检测方法在动物分子遗传学中的应用。
优选的，所述应用包括鉴定绵羊所处的繁殖时期。
有益效果：
本发明提供了一种miRNA，将其命名为oar-miR-3965。以本发明提供的miRNA核苷酸序列为基础，利用本发明提供的特异性引物和检测方法可以对oar-miR-3965的转录水平进行快速、特异、精确的定量。
本发明还提供了所述miRNA(oar-miR-3965)在动物分子遗传学中的应用，采用本发明提供的miRNA可以将处于繁殖季节和非繁殖季节中的绵羊进行有效区分，为后续研究和生产提供检测方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例2中苏尼特羊oar-miR-3965荧光定量PCR反应的扩增曲线图；
图2为实施例2中苏尼特羊oar-miR-3965荧光定量PCR反应的熔解曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种miRNA，所述miRNA的成熟序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述SEQ ID NO.1的序列具体为：5’-ACUCAAACUGUGGGGGCACUUC-3’。
本发明所述的miRNA分离自哺乳动物下丘脑组织，所述哺乳动物优选为绵羊，更优选为苏尼特羊。
本发明所述“分离”优选指从其原始环境中分离出来，并保持其原有的生物特征和状态。本发明所述miRNA优选从miRNA前体序列加工而来，更优选在细胞内被剪切成成熟的miRNA分子。
为了方便对本发明所述的miRNA进行研究，优选将所述miRNA命名为oar-miR-3965。
本发明优选还提供了所述oar-miR-3965的前体序列，所述前体序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为5’-ACUCAAACUGUGGGGGCACUUCCGUUUUACGAAGGGAAGUGCCGCCAUGUUUUGAGUGU-3’。本发明所述oar-miR-3965是由所述前体序列加工而来，所述前体序列能够折叠成稳定的茎环结构。本发明所述前体序列优选通过天然或人工合成获得。
本发明所述miRNA优选通过高通量测序并在短光照繁殖季节和长光照非繁殖季节绵羊差异表达的miRNA中筛选得到。本发明所述高通量测序优选包括RNA分离、miRNA文库构建和测序。本发明所述RNA分离优选包括：将长度小于40个核苷酸的RNA从总RNA中分离出来，得到分离RNA。本发明对所述RNA分离的方式没有特殊限定，采用本领域常规RNA分离方法即可，如采用试剂盒，更优选为FlashPAGE fractionator(Ambion,Life Technologies,Paisley,UK)试剂盒。本发明对所述构建miRNA的方式没有特殊限定，采用本领域常规方式即可，如试剂盒，更优选为Illumina TruSeq Small RNA Sample Preparation kit。本发明对所述测序方式和平台没有特殊限定，采用本领域常规测序方式和平台即可。
本发明还提供了一种检测上述技术方案所述的miRNA的特异性引物组，所述特异性引物组包括反转录茎环引物、上游引物和下游引物，所述茎环引物的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明所述的反转录茎环引物核苷酸序列SEQ ID NO.5具体为：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAAGTGCC-3’。本发明所述反转录茎环引物上带有所述miRNA的一段序列，可以特异性将miRNA的转录本反转录出来，从而提高了特异性。本发明所述上游引物的核苷酸序列SEQ ID NO.3具体为：5’-CGACTCAAACTGTGGG-3’；所述下游引物的核苷酸序列SEQ ID NO.4具体为：5’-TGGTGTCGTGGAGTCGG-3’。基于本发明所述的特异性引物组，利用本领域常规的技术手段即可对所述miRNA进行扩增。本发明所述反转录茎环引物可以折叠成茎环结构的引物，通过与miRNA的3’端碱基互补进行反转录生成cDNA第一链，因而实现了目标miRNA的特异性富集和检测。
本发明还提供了上述技术方案中所述miRNA的检测方法，利用所述的特异性引物组测定样品中所述miRNA的有无和/或含量。本发明所述检测的方法优选包括荧光定量PCR。
本发明在进行所述荧光定量PCR前，优选还包括提取总RNA和反转录，得到cDNA模板。本发明所述总RNA优选提取自绵羊组织，更优选提取自绵羊的下丘脑组织。本发明对所述总RNA的提取方法没有特殊限制，采用本领域常规提取方法即可。
本发明所述反转录茎环引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示。
本发明所述荧光定量PCR检测的反应体系优选以20μL计，其优选的配置方式优选为：
本发明所述水优选为蒸馏水，更优选为灭菌蒸馏水。本发明对所述反应体系中的组分的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明所述荧光定量PCR检测的程序优选为95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。
本发明所述荧光定量PCR检测优选还包括内参基因，所述内参基因优选为U6snRNA。当所述内参基因为U6 snRNA时，本发明所述U6 snRNA的核苷酸序列优选如SEQ IDNo.6所示，具体为：5’-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTT-3’。本发明扩增所述U6 snRNA的引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，具体为：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，具体为：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。
本发明在进行所述荧光定量PCR检测后，优选还包括计算所述miRNA的表达量，所述表达量优选为相对表达量。本发明所述oar-miR-3965相对表达量的计算公式优选为：
oar-miR-3965的相对表达量＝2-(CT miRNA-CT control)；
在本发明所述的计算公式中，CT miRNA为oar-miR-3965的循环阈值；CT control为内参基因的循环阈值，当所述内参基因为U6 snRNA时，CTcontrol为CT U6 snRNA。
本发明还提供了上述技术方案中所述的miRNA、miRNA特异性引物组或检测方法在动物分子遗传学中的应用。本发明所述应用优选包括鉴定绵羊的所处的繁殖时期，所述繁殖时期优选包括繁殖季节或非繁殖季节。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明的实施例中，若未特别指明，实施例中所使用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
取新鲜的苏尼特羊下丘脑组织，在液氮中研磨，进行RNA分离，提取总RNA。利用FlashPAGE fractionator(Ambion,Life Technologies,Paisley,UK)试剂盒将长度小于40个核苷酸的RNA从苏尼特羊总RNA中分离出来，然后利用Illumina TruSeq Small RNASample Preparationkit构建miRNA文库，利用Illumina Hiseq 2000测序平台对文库进行高通量测序，最后从苏尼特羊不同繁殖状态的下丘脑中获得大量新的miRNA，oar-miR-3965为繁殖季节和非繁殖季节下丘脑之间的1个差异miRNA。其成熟序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
实施例2
(1)总RNA提取，步骤如下：
匀浆：取新鲜的苏尼特羊下丘脑组织(共两组，每组3个样品，其中，第一组的3个样品取自3只繁殖季节成年苏尼特母羊，第二组的3个样品取自3只非繁殖季节成年苏尼特母羊，两组苏尼特羊同岁且体重差异在1KG内)，利用经过DEPC处理和液氮预冷的研钵进行组织匀浆后，转移入1.5mL的EP管中，加入1mL TRIPURE试剂，振摇片刻。
RNA的分离：孵育匀浆样品5min，使核酸充分裂解游离出来，每毫升TRIPURE试剂添加0.2mL氯仿，盖上瓶盖，用手用力地摇晃EP管15sec，25℃下放置3min，1200g离心15min(4℃)分层：下层为酚-氯仿，上层为水相，RNA存在于水相中。水相体积应为总体积的60％。
RNA的沉淀：吸取上层水相到一新1.5mL的EP管内，留下有机相。用异丙醇沉淀RNA，与最开始加入TRIPURE量的比为2：1，25℃放置10min，1200g离心10min(4℃)。
RNA离心后可在管底或侧壁上形成类似凝胶的滴状物。
RNA漂洗：去上清，用75％的乙醇漂洗RNA沉淀，与最开始加入TRIPURE量的比为1：1。震荡混匀样品，2℃～8℃7500g离心5min。
干燥RNA：空气干燥或真空干燥5～10min。
重溶RNA：将RNA溶解在20μL无RNA酶的DEPC水中，吹打几下，置于55～60℃10min，使其尽量溶解，贮于-70℃冰箱待用。
(2)反转录，步骤如下：
在用DEPC处理过的无Rnase的200μL PCR管中进行反转录。操作流程按照PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa，Cat RR037A)说明书进行。oar-miR-3965的反转录茎环引物为SEQ ID No.5所示的序列。
(3)荧光定量PCR反应，步骤如下：
20μL反应体系：2.0μL的cDNA(以1:4稀释)用于扩增，并与10μL SYBR TaqTM II(TaKaRa,Dalian,China)预混合，1.6μL的miRNA特异性引物组(上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4各0.8μL)，0.4μL的ROX染料II和6μL的水。扩增程序：95℃预变性30s，然后95℃变性5s、60℃退火34s，循环40次。选择的U6 snRNA作为内参基因，序列如。利用SEQID No.7所示的序列为上游引物，SEQ ID No.8所示的序列为下游引物对U6 snRNA进行扩增。
(4)基因的相对表达差异分析：
采用公式一计算oar-miR-3965的相对表达量。绘制扩增曲线图(见图1)和熔解曲线图(见图2)。
公式一：oar-miR-3965的相对表达量＝：2-(CT miRNA-CT U6snRNA)。
(5)结果：
1)绵羊oar-miR-3965荧光定量PCR反应的扩增曲线和熔解曲线。
由图1和图2的结果可以得知，所有个体的扩增曲线和熔解曲线较为一致；在oar-miR-3965的扩增过程中荧光定量PCR反应的熔解曲线仅见单独的峰，表明扩增的目的片段特异性良好。
2)不同繁殖状态绵羊下丘脑组织oar-miR-3965转录水平的差异。
通过实时荧光定量PCR的方法可知，oar-miR-3965在非繁殖季节绵羊下丘脑组织特异表达(P<0.01)，在繁殖季节绵羊下丘脑组织中不表达。结果见表1。
表1不同繁殖状态绵羊下丘脑组织oar-miR-3965转录水平的差异
组别 oar-miR-3965表达量(2-(CT miRNA-CT U6snRNA))
繁殖季节 0A
非繁殖季节 1B
通过以上结果可以看出，利用本发明所提供的特异性引物组，通过荧光定量PCR方法可以对组织样本中oar-miR-3965的表达情况进行快速、精确的分析，获得不同繁殖状态的绵羊下丘脑中oar-miR-3965的相对表达情况。本发明提供的miRNA在繁殖季节和非繁殖季节的绵羊的下丘脑组织中转录水平差异显著，为绵羊的分子遗传学研究和实际生产奠定了科学基础。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种miRNA及其特异性检测方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Ovis aries
<400> 1
acucaaacug ugggggcacu uc 22
<210> 2
<211> 59
<212> RNA
<213> Ovis aries
<400> 2
acucaaacug ugggggcacu uccguuuuac gaagggaagu gccgccaugu uuugagugu 59
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgactcaaac tgtggg 16
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggtgtcgtg gagtcgg 17
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgaggaag tgcc 44
<210> 6
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgctcgctt cggcagcaca tatactaaaa ttggaacgat acagagaaga ttagcatggc 60
ccctgcgcaa ggatgacacg caaattcgtg aagcgttcca tatttt 106
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (10)

1.一种miRNA，其特征在于，所述miRNA的成熟序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种扩增权利要求1所述的miRNA的特异性引物组，其特征在于，所述特异性引物组包括反转录茎环引物、上游引物和下游引物，所述反转录茎环引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.权利要求1所述miRNA的非疾病诊断目的的检测方法，其特征在于，利用权利要求2所述的特异性引物组测定样品中所述miRNA的有无和/或表达量。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述测定的方法包括荧光定量PCR。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应体系以20μL计，包括模板cDNA 2.0μL，SYBR TaqTM 10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，ROX染料Ⅱ0.4μL和水6μL；
所述模板cDNA包括将从待测样品中提取得到的RNA进行反转录后得到的cDNA。
6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。
7.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，利用所述荧光定量PCR进行检测时，还包括内参基因，所述内参基因为U6 snRNA；所述U6 snRNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品包括绵羊下丘脑。
9.权利要求1所述的miRNA、权利要求2所述的miRNA特异性引物组或权利要求3~8任一项所述的检测方法在非疾病诊断和治疗目的的动物分子遗传学中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括鉴定绵羊所处的繁殖时期。
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