CN101899503A - SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测miR-126的方法 - Google Patents

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测miR-126的方法 Download PDF

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Abstract

本发明是关于一种利用SYBR Green I荧光定量PCR检测miR-126的方法，该检测方法是提取细胞或组织总RNA或小分子RNA，经过自主设计的逆转录引物进行逆转录反应，再根据miR-126的相关核苷酸序列设计出了荧光定量PCR检测引物，来检测miR-126这种MicroRNA在不同标本中的表达差异。本检测方法由逆转录反应系统、PCR扩增反应系统和对应的逆转录引物、检测引物组成。本发明的检测方法具有实验操作简便、检测成本低、特异性好、灵敏度和自动化程度高，可以为MicroRNA的功能性研究提供可靠的实验基础。

Description

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测miR-126的方法
技术领域
本发明涉及一种利用SYBR Green I荧光定量PCR检测miR-126的方法。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类有21-25个核苷酸组成的非编码小分子RNA，其广泛存在于真核生物中，其主要功能为在转录后水平抑制基因表达；miRNA在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。目前在动物与植物基因组中已发现4000多种miRNA，估计人类基因组中含1000种以上miRNA。尽管这些miRNA的生物学功能及其靶基因仍不十分清楚，但可以确定他们调控着细胞分化、增殖与死亡等复杂的生物学行为。Wang等人的研究结果提示，miR-126能调节小鼠胚胎发育过程中的血管生成；Fish等人研究了鼠胚胎干细胞分化形成的内皮细胞中miRNA的表达情况，也证实miR-126与血管的形成密切相关，miR-126能够直接负调控SPRED1(Sprouty-related protein)和PIK3R2/p85β(phosphoinositol-3kinase regulatory subunit 2)的表达，从而促进血管形成的完整性；miR-126除了与血管完整性有关，还与内皮细胞分裂增殖和迁移能力有密切关系，对miR-126的表达检测，可以成为肿瘤检测的指标之一。
目前为止，对miRNA的检测方法主要有Northern Blot、原位杂交、基因芯片、荧光定量探针法，也有报道在miRNA 3’端进行加尾再进行逆转录的检测方法；但NorthernBlot检测方法敏感度低、耗时长且RNA的用量较大；荧光定量探针法检测灵敏度高，但检测费用昂贵；miRNA 3’端进行加尾再进行逆转录的检测方法不能很好的区分miRNA的前体与成熟体，特异性不高。要想建立一种特异性高，检测方便，实验操作环节少的检测方法，无疑会对MicroRNA的研究带来方便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SYBR Green I荧光定量PCR检测miR-126的方法，具有实验操作简便、检测成本低、特异性好、灵敏度和自动化程度高等优点，可以为MicroRNA的功能性研究提供可靠的实验基础。
本发明提供了一种SYBR Green I荧光定量逆转录引物，其核苷酸序列组成如下：
5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCAT3′。
另外，本发明还提供了一种SYBR Green I荧光定量检测引物，其根据上述逆转录引物成功对miR-126进行逆转录后得到的核苷酸序列，该荧光定量检测引物由上下游两条引物组成，上游引物由19个核苷酸序列组成，详细序列是5′AGTGCAGGGTCCGAGGTAT3′；下游引物由25个核苷酸序列组成，详细序列是5′GCCGCTCGTACCGTGAGTAATAATG3′。
本发明还提出了一种SYBR Green I荧光定量PCR检测miR-126的方法，该检测方法包括以下内容：
1)细胞或组织总RNA的提取纯化：采用分子生物学传统方法Trizol法提取细胞或组织总RNA，并用1％琼脂糖电泳鉴定提取的总RNA；
2)逆转录和检测引物设计：
依据microRNA专门序列登陆网站上报到的miR-126(MI0000471)的核苷酸序列，利用分子生物学软件Clone Manager Suite 7设计而成，经过实验鉴定引物可以对miR-126这种microRNA成功逆转录，得到逆转录引物序列；
自主设计的逆转录引物成功对miR-126进行逆转录后得到的核苷酸序列，利用分子生物学软件Clone Manager Suite 7设计并且经过实验鉴定引物可以成功检测miR-126在生物细胞或组织中的含量，得到荧光定量检测引物序列；
3)逆转录反应及半定量RT-PCR反应：利用特异性逆转录引物来实现，使用约100ng总RNA为模板，按照逆转录酶试剂说明书配制逆转录反应体系合成cDNA；以及
4)SYBR Green I荧光定量上机检测，并对荧光定量检测结果进行扩增曲线以及熔解曲线分析，从而对实验数据的可靠性给予评价；最后由公式：MicroRNA的相对表达量＝2-ΔΔCT，计算生物细胞或组织中的MicroRNA的相对含量。
借由上述技术方案，本发明一种SYBR Green I荧光定量PCR检测miR-126的方法至少具有的有益效果是：本发明的检测方法是通过提取细胞或组织总RNA或小分子RNA，经过自主设计的逆转录引物进行逆转录反应，再根据miR-126的相关核苷酸序列设计出了荧光定量PCR检测引物，来检测miR-126这种MicroRNA在不同标本中的表达行差异；本方法具有实验操作简便、检测成本低、特异性好、灵敏度和自动化程度高，可以为MicroRNA的功能性研究提供可靠的实验基础。
附图说明
图1是各样品miR-126和β-actin基因扩增后的电泳图。
图2是β-actin内参基因扩增曲线a和基因的熔解曲线b的变化图。
图3是miR-126扩增曲线c和基因的熔解曲线d的变化图。
图4是相对正常组(1)，空载体转染组(2)和过表达载体转染组(3)miR-126的相对表达量柱状图。
具体实施方式
本发明是建立在荧光定量PCR技术基础上的一种利用荧光染料和特异性的逆转录引物来实现对目标MicroRNA的定量检测，发明技术内容包括如下几个方面：
1细胞或组织总RNA的提取纯化
采用分子生物学传统方法Trizol法提取细胞或组织总RNA，并用1％琼脂糖电泳鉴定提取的总RNA。
2逆转录和检测引物设计
2.1SYBR Green I荧光定量逆转录引物设计
本发明的荧光定量逆转录引物为发明者依据microRNA专门序列登陆网站(http://microrna.sanger.ac.uk)上报到的miR-126(MI0000471)的核苷酸序列，利用分子生物学软件Clone Manager Suite 7设计而成，且经过实验鉴定引物可以对miR-126这种microRNA成功逆转录，详细逆转录引物序列如下：5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCAT3′，此逆转录引物由49个核苷酸序列组成，对miR-126这种microRNA进行逆转录后得到的扩增产物为66个核苷酸序列。
2.2SYBR Green I荧光定量检测引物设计
本发明的荧光定量检测引物为发明者基于自主设计的逆转录引物成功对miR-126进行逆转录后得到的核苷酸序列，利用分子生物学软件Clone Manager Suite 7设计并且经过实验鉴定引物可以成功检测miR-126在生物细胞或组织中的含量，此引物由上下游两条引物组成，上游引物由19个核苷酸序列组成，详细序列是5′AGTGCAGGGTCCGAGGTAT3′，下游引物由25个核苷酸序列组成，详细序列是5′GCCGCTCGTACCGTGAGTAATAATG3′，此对引物的检测扩增片段为62个核苷酸序列。
3逆转录反应
本发明的逆转录反应过程是利用发明者设计的特异性逆转录引物来实现的，使用约100ng总RNA为模板，按照逆转录酶试剂说明书配制逆转录反应体系合成cDNA。
4半定量RT-PCR反应
半定量RT-PCR反应的目的是为荧光定量检测摸索必要的参数，比如引物的浓度及退火温度等；反应在普通的DNA扩增仪上进行，将DNA扩增产物进行琼脂糖电泳来评价扩增是否成功。
5SYBR Green I荧光定量上机检测
利用ABI公司的7300/7500等荧光定量PCR仪实施上机检测，结果可以实时的观测，检测曲线和数据都有仪器自动输出，检测反应的体系按照荧光定量试剂说明书操作即可。
6检测结果分析处理
对荧光定量检测结果进行扩增曲线以及熔解曲线分析，从而对实验数据的可靠性给予评价；最后由公式：MicroRNA的相对表达量＝2-ΔΔCT，计算生物细胞或组织中的MicroRNA的相对含量。
以下通过具体实施例分别介绍上述每个步骤的具体实验方法：
实施例
一.实验方法
1.根据miR-126(MI0000471)序列和管家基因β-actin(NM 001101)序列信息设计miR-126逆转录引物和荧光定量检测引物。序列如表1所示。
表1miR-126逆转录引物及荧光定量PCR检测引物
2.总RNA抽提
每孔细胞中加入lml Trizol，冰上放置5min，枪头吹打；将各孔裂解液吸到1.5ml EP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力振摇15s。15-30℃下孵育2-3min，离心(4℃，12,000g，15min)；离心后液体分为三层(上层-无色水样层为RNA，中层白色为DNA和底层红色为蛋白质)，小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中；加入等体积异丙醇，0.4-0.Sml，混匀，-20℃下孵育1h，离心(4℃，12,000g，10min)；去上清，沉淀加入75％乙醇1ml，漩涡振荡30s，离心(4℃，7,500g，5min)；小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。后每管加入20ul DEPC水溶解，-70℃冰箱保存；细胞总RNA的鉴定：1％琼脂糖电泳鉴定细胞总RNA，观察电泳条带及各条带亮度后，测其浓度，准备下步逆转录反应。
3.逆转录反应
取100ng总RNA用MMLV-RT逆转录酶按照说明合成cDNA。具体是先在100ng总RNA中加入oligo dt(25μM)1μl，miR-126RT引物(25μM)1μl，10mM dNTPmix1μl，用DEPC处理过的灭菌水补足到15.5μl，混匀，65℃温育10min变性后置于冰上。依次加入RNA酶抑制剂0.5μl、MMLV-RT 2×Buffer 2μl、DTT 1μl、MMLV-RT SPCL1μl(200U/μl)16℃孵育30min，42℃孵育30min，70℃保温10min灭活逆转录酶，逆转录产物作为下步PCR模板。
4.半定量RT-PCR反应
引物溶解后使用普通PCR反应进行条件探索及优化，为上机荧光定量检测摸索必要的参数，比如引物的浓度及退火温度等。反应体系设计为25μl总体系，具体是10×PCRbuffer 2.5μl，10mM dNTPmix 1μl，上下游引物(10μM)各1μl，DNA聚合酶0.3μl(2.5U/μl)，样品模板2μl(约100ng)，用灭菌水补足25μl体系。反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃30s变性，β-actin基因用58℃退火30s(miR-126用60℃退火30s)，72℃延伸25s，PCR反应25个循环后72℃7min，然后4℃保存。
5.实时荧光定量PCR上机检测
按照试剂说明书配好反应体系，每个样本重复3次，上机进行RealTime PCR扩增和检测。反应体系为20μl总体系，具体是2×Mix SYBR Green I荧光反应液10μl，上下游引物(4μM)各1μl，样品模板1μl，用灭菌水补足20μl体系。反应条件95℃、2min预变性，循环内95℃、30s变性，60℃退火延伸35s，PCR反应设置40个循环，并在每个循环延伸末端点收集荧光信号，绘制扩增曲线；40个循环后设置(95℃、15s，60℃、30s，95℃、15s)一个绘制熔解曲线的程序，对60℃到95℃整个升温过程进行全程荧光信号收集，绘制熔解曲线。
6.检测结果分析处理
对检测结果进行扩增曲线以及熔解曲线分析，从而对实验数据的可靠性给予评价；基因相对表达量＝2-ΔΔCT。实验数据采用SPSS11.5软件进行统计学分析，配对定量数据用t检验进行统计学分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。
二.结果
1.半定量RT-PCR结果
用上述1.4步骤中的PCR反应条件分别扩增内参基因β-actin(163bp)和miR-126(163bp)，采用3％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，检测电泳图照片如图1所示，结果表明，引物设计较为成功，能扩增出特异性条带，最后确定了荧光定量PCR检测的退火温度为60℃。
(M：Marker100Ladder；1、2孔道分别为正常和转染空载体细胞；3、4、5孔道分别为转染过表达miR-126载体细胞三次重复；阴性对照为用水做模板的扩增。)
2.实时荧光定量PCR上机检测结果
采用1.3.5步骤检测条件，实时荧光定量PCR检测扩增曲线、熔解曲线如图2和3所示，其中a图为β-actin内参基因扩增曲线，b图为β-actin内参基因熔解曲线，c图为miR-126扩增曲线，d图为miR-126的熔解曲线。
3.检测结果分析处理
检测结果进行扩增曲线以及熔解曲线分析。由图2、3中的b、d变化曲线可知，两个基因的熔解曲线显示内参基因β-actin和miR-126PCR产物的Tm值分别为88.6℃、82.1℃，再次说明PCR扩增无非特异性扩增，其扩增是目的基因真实扩增；由基因相对表达量＝2-ΔΔCT，计算得出相对正常组(A)，空载体转染组(B)和过表达载体转染组(C)miR-126表达量分别为111％、812％；各组相对表达量柱状图如图4所示。
实验数据采用SPSS 11.5软件进行统计学分析，配对定量数据用t检验进行统计学分析，过表达载体转染组相对正常组和空载体转染组差异均有统计学意义(P＜0.05)，而正常组和空载体转染组相比差异无统计学意义(P＞0.05)，详细统计分析参见表2。
表2RT-QPCR数据统计分析
注：A组：正常对照组；B组：转染空载体组；C组：转染过表达miR-126载体组；β1，2，3：β-actin内参基因重复检测三次分别CT值；m1，2，3：miR-126重复检测三次分别CT值；Mean ReL Quant：各组miR-126平均相对表达量。
三.结论
本发明建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测miR-126的方法，具有实验操作简便、检测成本低、特异性好、灵敏度和自动化程度高等优点，可以为MicroRNA的功能性研究提供可靠的实验基础。
序列表
<110>广州博川生物科技有限公司
<120>SYBR Green I荧光定量PCR检测miR-126的方法
 
<160>3
 
<210>1
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物miR126-RT
 
<400>1
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccgcat 49
 
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物miR126-R
 
<400>2
agtacagggt ccgaggtat 19
 
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物miR126-F
 
<400>3
 
gccgctcgta ccgtgagtaa taatg 25

Claims (4)

1.一种SYBR Green I荧光定量逆转录引物，其特征在于：该逆转录引物的核苷酸序列组成如下：
5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCAT3′。
2.一种SYBR Green I荧光定量检测引物，其特征在于：该荧光定量检测引物由上下游两条引物组成，上游引物由19个核苷酸序列组成，核苷酸序列是5′AGTGCAGGGTCCGAGGTAT3′；下游引物由25个核苷酸序列组成，核苷酸序列是5′GCCGCTCGTACCGTGAGTAATAATG3′。
3.一种SYBR Green I荧光定量PCR检测miR-126的方法，其特征在于其包括以下步骤：
1)细胞或组织总RNA的提取纯化；
2)逆转录反应：利用权利要求1所述的特异性逆转录引物，使用总RNA为模板，进行逆转录反应合成cDNA；
3)半定量RT-PCR反应：将权利要求2所述的荧光定量检测上下游两条引物作为引物，利用cDNA作为PCR模板，进行PCR反应；以及
4)SYBR Green I荧光定量上机检测：在反应体系中进行RealTime PCR扩增和检测，并对荧光定量检测结果进行扩增曲线以及熔解曲线分析，从而对实验数据的可靠性给予评价；最后由公式：MicroRNA的相对表达量＝2-ΔΔCT，计算生物细胞或组织中的MicroRNA的相对含量。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述逆转录引物是对miR-126这种microRNA进行逆转录后得到的扩增产物为66个核苷酸序列；所述检测引物是对引物的检测扩增片段为62个核苷酸序列。
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Address after: 510663 Guangdong province high tech Industrial Development Zone of Guangzhou Science City skim Springs Road No. 3, Guangzhou international business incubator D District No. D216 room

Applicant after: Guangzhou Bochuan Biotechnology Co., Ltd.

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Applicant before: Guangzhou Bochuan Biotechnology Co., Ltd.

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Granted publication date: 20130109

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